KR101236285B1 - 실크 피브로인 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골 이식재 - Google Patents

Abstract

본 발명은 실크 피브로인(fibroin) 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골 이식재(bone graft)에 관한 것이다. 본 발명의 유효성분인 실크 피브로인 펩타이드의 조골세포(osteoblast)에 대한 영향을 최초로 규명한 것으로서, 상기 실크 피브로인 펩타이드는 조골세포에서 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, ALP), 타입 I 콜라겐-α1, 피브로넥틴 및 TGF-β1의 발현을 상향 조절하여 뼈의 재형성과 무기질화를 촉진하는 효능을 갖는다. 또한, 본 발명의 골 이식재는 뼈의 손상 또는 결손 부위에 적용되는 경우 뼈의 손상 및 결손 부위를 빠르게 재생시키는 효과가 우수하다.

Description

실크 피브로인 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골 이식재{Bone Graft Comprising Silk Fibroin Peptide as an Active Ingredient}

본 발명은 실크 피브로인(fibroin) 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골 이식재(bone graft)에 관한 것이다.

뼈(bone)는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호한다. 또한, 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질, 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다. 따라서 성장이 끝난 성인의 뼈는 멈추지 않고 죽는 날 까지 오래된 뼈는 제거되고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수 과정을 매우 역동적, 지속적으로 반복 재생 하면서 균형을 유지하게 된다. 이를 골재형성(bone remodeling) 이라고 한다(1). 오래된 뼈는 제거되고 새로운 뼈로 대체하는 뼈의 순환(turnover)은 성장과 스트레스에 의해서 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 적절히 뼈의 기능을 유지하는데 필수적이다(2).

뼈 재형성(bone remodeling)에는 크게 두 종류의 세포가 관여하는 것으로 알려져 있다. 두 세포 중 하나는 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast)이고, 다른 하나는 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)이다. 오래된 뼈의 흡수 또는 파괴는 혈액세포(조혈모세포)에서 생기는 파골세포에 의해 이루어지며 이는 뼈에 구멍을 내어 적은 양의 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지하는데 사용된다(3). 한편, 뼈세포에서 생성된 조골세포는 교원질로 구멍을 채우고 칼슘과 인의 침적물(hydroxyapatite)을 덮어서 단단한 새로운 뼈를 만들어 골격을 재건한다(4).

뼈 손상은 병리학적 병변 또는 외과적 수술로부터 발생될 수 있고, 이러한 뼈 손상을 복구하기 위해서는 자가성 골 이식재(autogenous bone graft)를 사용하여 치료할 수 있다. 그러나, 공여부위의 불건전성 및 오랜 기간의 수술시간 등으로 자가성 골 이식재의 이용에 제한이 있다.

누에인 가잠(Bombyx mori)에 의해 만들어지는 실크 단백질은 피브로인(fibroin) 및 세리신(sericin)으로 구성되는데, 이 피브로인과 세리신이 실크 단백질의 주성분이다. 이 중에서 실크 피브로인은 수증기와 산소에 대한 투과도가 좋고(5, 6), 혈액과의 친화성도 좋다(7).

일반적으로, 실크는 미국 FDA에 의해 생체물질로 사용이 승인되어 있고, 비생분해성 물질로 분류되어 있으며, 고분자량(300 kDa)의 천연 단백질 폴리머이다. 그러나, 실크는 곤충에 의해서 만들어지는 단백질 중의 하나이고, 효소에 의해 분해되어 장기간 동안 인 비보에서 흡수될 것이다. 최근, 몇 연구자들은 실크 물질의 분해는 실크 물질의 형태 및 처리 방법에 의존한다는 것을 보고하였다. 몇 가지 프로테아제는 실크 단백질을 37℃에서 15 일간 70 중량％ 이상을 분해하였다(8). 만일 실크가 생체 내에서 분해된다면 분해에 의해 세포활성에 영향을 미치는 소분자량의 단백질이 생성된다.

그러나, 이렇게 분해된 실크 피브로인 단백질의 생성물들이 조골세포(osteoblast)에 대해 어떠한 영향을 미치는지에 대해서는 이전까지 연구되어 있지 않았다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 뼈의 재형성 및 뼈의 무기질화를 촉진할 수 있는 물질로서 인체에 부작용 없이 안전하게 적용될 수 있는 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과 실크 피브로인 펩타이드가 조골세포에서 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, ALP), 타입 I 콜라겐-α1, 피브로넥틴 및 TGF-β1의 발현을 상향 조절하여 뼈의 재형성과 무기질화를 촉진하고, 뼈의 결손 부위에 충진되는 경우 뼈의 손상 및 결손 부위를 빠르게 재생시킴을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 골 이식재(bone graft)를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 실크 피브로인(fibroin) 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골 이식재(bone graft)를 제공한다.

본 발명자들은 뼈의 재형성 및 뼈의 무기질화를 촉진할 수 있는 물질로서 인체에 부작용 없이 안전하게 적용될 수 있는 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과 실크 피브로인 펩타이드가 조골세포에서 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, ALP), 타입 I 콜라겐-α1, 피브로넥틴 및 TGF-β1의 발현을 상향 조절하여 뼈의 재형성과 무기질화를 촉진하고, 뼈의 결손 부위에 충진되는 경우 뼈의 손상 및 결손 부위를 빠르게 재생시킴을 확인하였다.

본 발명의 골 이식재에서 유효 성분으로 이용되는 실크 피브로인 펩타이드는 실크에서 유래된 것이다. 본 명세서에서 용어 “실크”는 견사 곤충이 토사하여 만든 섬유를 의미하며, 바람직하게는 누에(Bombyx mori)가 토사하는 가잠사를 의미한다. 실크 단백질은 피브로인 및 세리신으로 이루어져 있고, 피브로인과 세리신은 각각 평균 75%와 25%의 비율로 존재한다. 피브로인 단백질은 특이하게 글리신 및 알라닌 함량이 매우 높은 반면, 세리신은 피브로인과 전혀 다른 아미노산 조성을 나타내고 있으며, 세린이 전체 구성 아미노산 중의 1/3 이상을 차지하고 있다. 본 발명에서는 실크 피브로인이 이용된다.

최근의 연구 결과에 의하면 실크 피브로인은 분자량 325 kDa의 중쇄(heavy chain) 및 분자량 25 kDa의 경쇄(light chain)가 S-S 결합으로 연결되어 있고, 당단백질인 P25(30 kDa)가 상기 두 사슬과 비공유 결합으로 연결된 구조를 하고 있으며, 각각 6:6:1의 몰 구성을 하고 있는 거대 단백질로 규명되어 있다. 실크 피브로인의 구조는 랜덤-코일/무정형 부위 또는 안티-패러럴 β-시트 구조로 추정된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 골 이식재의 포함되는 실크 피브로인 펩타이드는 거대 분자인 실크 단백질이 분해되어 생성된 중량 평균 분자량 100-4,000 Da의 저분자량의 펩타이드이고, 보다 바람직하게는 중량 평균 분자량 200-3,500 Da이며, 보다 더 바람직하게는 300-3,000 Da이고, 보다 더욱 더 바람직하게는 400-2,500 Da이며, 가장 바람직하게는 500-2,000 Da이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유효성분인 실크 피브로인 펩타이드는 실크에 알칼리성 용액을 처리하여 세리신을 제거하고 산(acid)으로 가수분해하여 제조된다.

상기 실크 단백질의 분해는 우선 실크 단백질을 구성하고 있는 세리신을 제거한 다음 실크 피브로인 단백질을 분해하여 저분자량의 실크 피브로인 펩타이드를 제조한다. 본 명세서에서 용어 “정련”은 피브로인 단백질을 둘러싸고 있는 세리신을 제거하는 공정을 의미하며, 상기 세리신의 제거(정련)는 알칼리성 수용액(예컨대, 마르세이유 비누, 탄산나트륨 등)에 넣고 끓이는 방식, 단백질 분해효소(예컨대, 아스파질러스 등)를 사용하는 정련방법 또는 고온고압솥을 이용하는 고온고압법 등이 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 실크 피브로인 단백질의 분해는 칼슘염 용액에서의 가수분해, 산에 의한 가수분해, 단백질 분해효소에 의한 가수분해 또는 상기 분해방법의 조합에 의해 실시될 수 있으나, 이들 방법으로 한정되는 것은 아니다.

상기 칼슘염 용액에서의 분해는 통상적으로 염화칼슘을 이용하는 데, CaCl₂ 에탄올을 이용한다. 상기 산에 의한 가수분해는 통상적으로 무기산, 예를 들어 염산을 이용하여 실시되고, 강산을 통상적으로 이용한다. 상기 단백질 분해효소에 의한 가수분해에서 효소는 아미노산 서열에 특이적 또는 비특이적으로 작용하여 무작위 가수분해를 촉매하는 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 키모트립신(chymotrypsin), 액티나아제(actinase) 및 카르복실라아제(carboxylase)와 같은 다수의 단백질 분해 효소가 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 조합에 의한 분해의 경우에는 예를 들어 1차적으로 칼슘염에 의한 분해 또는 약산 또는 알칼리에 의한 가수분해를 한 후 2차적으로 효소로 가수분해 하는 것이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유효성분인 실크 피브로인 펩타이드는 조골세포에서 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 콜라겐 타입 I-알파1, 피브로넥틴(fibronectin) 또는 형질전환 성장인자(TGF)-베타 1의 발현을 증가시켜 뼈의 재형성과 무기질화를 촉진할 수 있으며 뼈의 결손 부위에 충진되는 경우 뼈의 손상 및 결손 부위를 빠르게 재생시킨다.

ALP(alkaline phosphatase)는 체내 대부분의 장기에 존재하는 효소로 pH 9 전후에서 활발하게 작용하고, 혈중 ALP는 보통 간이나 뼈, 태반, 소장에서 유출되는 것으로 간을 경유하여 담즙으로 배설되는데, ALP를 측정하면 간에서 십이지장에 이르는 담즙의 유출경로에 이상이 있는가를 알 수 있고 뼈의 새로운 형성 상태나 간기능, 태반기능의 정상 여부를 알 수 있는 기준이 된다.

타입 I 콜라겐은 수산화인회석과 함께 뼈의 주성분으로서, 골기질 단백질에 있어 가장 근간이 되는 단백질로 전체 골기질의 90%를 이루고 있으며 그 중 하나가 콜라겐 타입 I-알파1이다. 피브로넥틴(fibronectin)은 세포 부착, 성장, 이동, 분화 그리고 상처 치유 및 배아 발달과 같은 과정에서 중요한 단백질이다. 형질전환 성장인자(TGF)-베타 1은 섬유아세포 및 평활근 세포의 증식을 촉진하고, 상피에서 유래한 세포에 억제인자로 작용하며, 골수 세포 분화 조절 및 골 형성을 촉진한다.

본 명세서에서 용어“뼈의 재형성”은 뼈가 파골세포에 의해 파괴 및 흡수되고 이어서 조골세포에 의해 뼈가 다시 형성되는 과정을 의미한다. 용어 “뼈의 무기질화”는 뼈 세포 또는 세포외 기질에 칼슘 등의 무기질이 침착되는 현상을 의미한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유효성분인 실크 피브로인 펩타이드는 골 이식재에 대하여 0.01-1000 ㎍/㎖의 농도로 포함되고, 보다 바람직하게는 0.1-600 ㎍/㎖이며, 보다 더 바람직하게는 0.5-300 ㎍/㎖이고, 가장 바람직하게는 1-100 ㎍/㎖이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유효성분인 실크 피브로인 펩타이드는 골 이식재의 총 중량에 대하여 0.01-40 중량%로 포함되고, 보다 바람직하게는 0.1-30 중량%이며, 가장 바람직하게는 1-20 중량%이다.

실크 피브로인 펩타이드의 함량이 0.01-40 중량%로 포함되는 경우에 조골세포에서 알카라인 포스파타아제, 콜라겐 타입 I-알파1, 피브로넥틴 또는 형질전환 성장인자(TGF)-베타 1의 발현을 증가시키는 효과가 우수하다.

본 명세서의 용어 “골 이식재”는 다양한 질환 또는 사고에 의해 뼈 조직의 일부가 손상되거나 결손된 경우, 이러한 부위를 대체하여 뼈 조직 내의 공간을 충진시키고, 뼈 신생을 촉진시키기 위하여 사용하는 이식재를 총칭하는 의미로 정의된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 골 이식재는 골 성장을 촉진하는 성장인자, 피브린, 골 형태 형성인자, 골성장제, 화학요법제, 항생제, 진통제, 비스포스포네이트, 스트론툼염, 불소염, 마그네슘염 및 나트륨 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 생물학적 활성물질을 추가적으로 포함하고, 보다 바람직하게는 피브린이며, 보다 더 바람직하게는 PRF(platelet-rich fibrin)이고, 가장 바람직하게는 Choukroun PRF이다. 특히, 본 발명에서 PRF는 실크 피브로인 펩타이드와 혼합되어 골 이식재로 적용되는 경우 뼈 흡수를 억제하고 뼈 신생 작용을 더욱 증대시킨다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 골 이식재는 골 이식재의 총 중량에 대하여 실크 피브로인 펩타이드 50-90 중량% 및 생물학적 활성 물질 10-50 중량%를 포함하고, 보다 바람직하게는 실크 피브로인 펩타이드 60-80 중량% 및 생물학적 활성 물질 20-40 중량%이다.

골 이식재의 총 중량에 대하여 실크 피브로인 펩타이드 50-90 중량% 및 생물학적 활성 물질 10-50 중량%로 포함된 경우에, 뼈의 손상 또는 결손 부위에서의 뼈의 신생 효과가 우수하다.

상기 성장인자로는 BMP(bone morphogenic protein), PDGF(Platelet-derived growth factor), TGF-beta(Transgenic growth factor), IGF-I(Insulin-like growth factor), IGF-II, FGF(Fibroblast growth factor) 및 BGDF-II(beta-2-microglobulin) 등을 이용할 수 있다. 상기 골 조직 형성 증진 펩타이드와 단백질로는 RGD 서열을 포함하는 각종 펩타이드와 콜라겐 및 피브로노젠과 같은 각종 단백질 등을 이용할 수 있다. 상기 골 형태 형성인자로는 오스테오칼신(osteocalcin), 본사이알로프로테인(bonesialo protein) 또는 오스테오제닌(osteogenin) 등을 이용할 수 있다. 상기 골 성장제는 인체에 무해하고 골 성장을 촉진하는 물질이라면 제한 없이 사용이 가능하며, 골 형성을 증진시키는 핵산, 골 형성을 억제하는 물질의 길항제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 골 이식재를 제형화하기 위한 화합물로서, 히알루론산(hyaluronic acid), 수산화인회석(hydroxyapatite), 콜라겐, 탄산칼슘, 인산칼슘, 황산칼슘, 모노칼슘인산, 트리칼슘인산 및 실리카로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 추가적으로 포함하고, 가장 바람직하게는 수산화인회석(hydroxyapatite)이다.

특히, 수산화인회석은 사람의 뼈 및 치아의 에나멜질과 동일한 성분으로 치아의 에나멜질의 결손부분에 대한 수복에 큰 효과가 있으며, 이 수복효과로 인해 치아의 원래 빛깔을 회복시켜주기 때문에 최근 치아 미백제로도 각광을 받고 있다.

본 발명의 골 이식재는 압착, 압축, 가압접촉, 패킹, 압박, 굳힘 등의 방법을 사용하여, 퍼티, 페이스트, 주형 가능한 스트립, 블록, 칩 등의 형태로 성형하여 사용할 수 있고, 상기 화합물을 이용하여 겔, 분말, 페이스트, 정제, 펠렛 등의 형태로 제형 하여 사용할 수 있으며, 분말 형태 그대로 사용하는 것도 가능하다.

본 발명의 골 이식재가 적용될 수 있는 뼈 부위는 특별히 한정되지는 않으며, 바람직하게는 본 발명의 골 이식재는 치과용 골 이식재이다.

본 발명의 골 이식재는 임플란트(implant) 주위의 빈 공간에 충진하거나 임플란트 표면을 상술한 본 발명의 골 이식재로 표면 처리한 상태로 골 손상 부위에 삽입하여, 뼈의 신생을 촉진함으로써 임플란트의 보다 견고한 고정을 유도할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 골 이식재를 표면 처리한 임플란트를 제공한다.

본 발명의 상술한 골 이식재를 임플란트 표면에 처리하는 경우에는 골 이식재를 다양한 제형, 예컨대 겔, 분말, 페이스트, 정제, 펠렛 등의 형태로 제형하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 분말 형태로 이용한다.

본 명세서에서 사용된 용어“표면 처리”는 임플란트의 표면을 개선시키기 위해서 당업계에 공지된 다양한 코팅 처리를 의미한다.

본 발명의 골 이식재를 임플란트 표면에 박막형태로 코팅하는 것으로서, 공지의 물리적, 화학적 박막증착법에 의해 코팅되며, 바람직하게는 펄스레이저증착법(PLD), 스파터링증착법(sputtering), 화학기상증착법(CVD), 딥코팅법(dip coating), 도금법(plating), 3차원 플라즈마건증착법(3D plasma gun deposition) 중에 하나의 방법에 의해 코팅된다. 상기 펄스레이저증착법(PLD), 스파터링증착법(sputtering), 화학기상증착법(CVD), 도금법(plating) 및 3차원 플라즈마건증착법(3D plasma gun deposition)에 의할 때는 임플란트를 회전시키거나 레이저, 스파터링건, 도가니 또는 플라즈마건을 회전시키면서 외주면에 고르게 코팅되도록 하며, 딥코팅법에 의할 때는 임플란트를 소정 용액에 담금으로써 코팅이 이루어지도록 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 임플란트는 당업계에 공지된 다양한 재질의 임플란트를 포함하고, 보다 바람직하게는 티타늄 또는 티타늄 합금을 이용한다. 티타늄 합금으로는 Ti-6Al-4V, Ti-6Al-7Nb 또는 Ti-13Nb-13Zr이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 실크 피브로인(fibroin) 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골 이식재(bone graft)를 제공한다.

(b) 본 발명의 유효성분인 실크 피브로인 펩타이드의 조골세포(osteoblast)에 대한 영향을 최초로 규명한 것으로서, 상기 실크 피브로인 펩타이드는 조골세포에서 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, ALP), 타입 I 콜라겐-α1, 피브로넥틴 및 TGF-β1의 발현을 상향 조절하여 뼈의 재형성과 무기질화를 촉진하는 효능을 갖는다.

(c) 또한, 본 발명의 골 이식재는 뼈의 손상 또는 결손 부위에 적용되는 경우 뼈의 손상 및 결손 부위를 빠르게 재생시키는 효과가 우수하다.

도 1a는 실시간 RT-PCR 결과를 보여주는 그래프이다. 배 비율(fold ratio)은 대조군과 비교한 상대 값이다. COL1A1, TGF-β1 및 ALP는 각각 타입 I 콜라겐 α1(type I collagen alpha1), 형질전환 성장인자(transforming growth factor)-β1 및 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)를 나타낸다.
도 1b는 ALP 분석 결과를 보여주는 그래프이다. 실크 피브로인 펩타이드는 1 μg/㎖, 10 μg/㎖ 및 100 μg/㎖의 농도로 처리하였다.
도 2는 웨스턴 블롯팅 결과를 보여주는 겔 사진이다.
도 3a는 실크 피브로인 펩타이드 분말의 스캐닝 전자현미경 이미지이다. 실크 피브로인 단백질 거대 분자가 산에 의해 무작위적으로 분해되었기 때문에, 각 입자의 크기는 상이하다.
도 3b는 각 래빗으로부터 혈액 샘플을 수득하는 과정을 보여주는 사진이다.
도 3c는 원심분리 후 래빗의 혈액을 3개의 층으로 분리한 것을 보여준다. 화살표는 각 층을 나타낸다.
도 3d의 래빗의 두개골 손상 부위의 왼쪽 편에는 실크 피브로인 펩타이드 분말과 PRF(platelet-rich fibroin)의 혼합물을 적용한 것을 보여주고(별표), 오른 편에는 적용하지 않고 빈 채로 둔 것을 보여주는 사진이다.
도 4는 현미경 컴퓨터 단층촬영결과를 보여주는 사진이다. 도 4의 패널 A는 수술 6주 후에 실험군(별표)에서의 손상된 뼈 부위가 대조군에 비해 더 작은 것을 보여주고, 도 4의 패널 B는 12주에 대부분의 뼈 손상부위가 채워진 것을 보여준다. 손상 부위의 상대적 크기가 실험군(별표)에서 더 작은 것을 알 수 있다.
도 5는 수술 후 6주에서 조직형태적 상태를 관찰한 결과를 보여주는 사진이다. 채워지지 않은 손상의 크기는 실험군(패널 B)에서 보다 대조군(패널 A)에서 더 크게 나타났다. 도 5의 패널 C는 대조군의 확대된 이미지를 보여준다(200배 확대). 도 5의 패널 D는 실험군에서 손상된 뼈의 중앙 부위에서 새로운 뼈의 생성을 보여준다(200배 확대). 막대 길이는 2 mm이다.
도 6은 수술 후 12주에서 조직형태를 관찰한 결과를 보여주는 사진이다. 채워지지 않은 손상부위의 크기는 실험군(패널 B)에서보다 대조군(패널 A)에서 더 크게 나타났다. 도 6의 패널 C에서 대조군의 확대된 이미지에 의해 밀집된 피브로인 조직을 확인할 수 있다(200배 확대). 도 6의 패널 D에서 실험군은 성긴 섬유로 채워져 있는 좁은 손상 부위를 가지는 것을 알 수 있다(200배 확대). 막대 길이는 2 mm.
도 7은 실험디자인을 개략적으로 보여준다. 도 7의 패널 A는 대조군으로서 임플란트는 단일의 피층에 고정되어 있고, 임플란트 목 부위 주위의 손상부위는 빈 공간으로 남아있는 상태이다. 도 7의 패널 B는 실험군으로서 실크 피브로인 펩타이드 분말 및 Choukroun PRF를 임플란트 주위 손상부위에 채워 넣었다.
도 8은 제거 토크 테스트의 결과를 보여주는 그래프이다. P < 0.05
도 9는 수술 후 8주에서 조직형태적 관찰 결과를 보여주는 사진이다. 대조군에서의 임플란트-뼈 접촉은 낮은 수준이었고(패널 A), 실험군에서는 피질 뼈가 상당한 양으로 재생되어 있음을 확인할 수 있었다(패널 B). 20배 확대도.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1 : 실크피브로인 펩타이드의 뼈 형성 유전자의 상향 조절

1-1. 실험재료 및 방법

(1) 실크 피브로인 펩타이드 분말

누에고치 또는 실크는 크게 피브로인과 세리신이라는 두 가지 물질로 구성되어 있다. 그 중에서 피브로인을 둘러싸고 있는 세리신을 제거하는 공정을 정련이라고 한다. 통상적인 정련방법에는 마르세이유 비누와 탄산나트륨을 등 알칼리성 수용액에 넣고 끓이는 방식, 아스파질러스 등의 단백질 분해효소를 사용하는 정련방법 또는 고온고압솥을 이용하는 고온고압법 등이 있다.

본 실험에서는 마르세이유 비누(fiber marseilles soap)와 탄산나트륨 혼합 용액으로 100℃에서 1 시간 동안 2회 처리한 후 충분하게 수세하여 세리신을 제거하였다. 세리신이 제거된 누에고치 또는 견 섬유를 건조하여 시험재료로 사용하였다(이하, 정련견이라 한다). 먼저, 정련견을 고온 고압하의 6 N 염산으로 처리한 후 수산화나트륨을 첨가하여 중화시켰다. 얻어진 실크용액에 생성된 염은 전기투석법 또는 컬럼 크로마토그라피법으로 제거하여 순수한 실크 피브로인 펩타이드 용액을 얻었다. 이렇게 하여 수득한 실크 피브로인 펩타이드 용액에서 실크 피브로인 펩타이드의 분자량은 약 0.5 내지 2.0 kDa의 범위에 있었으며 이로부터 계산되는 중량 평균 분자량은 1.0 kDa 이었고, 이를 동결 건조하여 순수한 피브로인 펩타이드 분말을 실험에 사용하였다.

(2) 세포 배양

In vitro 테스트는 MG63 세포(ATCC, 미합중국; 조골세포 유사세포)를 사용하여 행하였다. 세포를 5％ CO₂ 분위기 및 99％ 습도(humidity)하에서, 1％ 페니실린/스트렙토마이신(100X)을 포함하며, 10％ 우태아혈청(PAA, 캐나다)이 보충된 DMEM(Dulbecco Modified Eagle’s Medium)-고 포도당(PAA Laboratories, 오스트리아)내에서 80％의 컨플루언시에 도달할 때까지 배양하였다. 배지는 3일 마다 새로운 배지로 교환하였다.

(3) DNA 마이크로 어레이(DNA micro-array) 분석

배지를 제거하고 총 RNA를 easy-BLUE(intron biotechnology, Inc, 대한민국)를 사용하여 추출하였다. 후속 추출 프로세스는 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 총 RNA의 농도는 분광기(Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Inc. 미합중국)를 이용하여 측정하였다. cDNA의 합성은 추출한 총 RNA로부터 역전사 키트(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)를 사용하여 행하였고, 반응에서 3 μl의 올리고(dT) 및 1 μl의 10 mM dNTP 혼합물을 사용하였다. DEPC(diethylene pyrocarbonate) 처리된 3차 증류수를 첨가하여 총 반응 혼합물의 부피가 40 μl가 되도록 맞추었다. 반응은 65℃에서 5분간 행하고, 온도를 점진적으로 실온까지 낮추었다. 이어, 2 μl의 10x 1차 쇄(first-strand) 완충액, 4μl의 25 mM MgCl₂, 2μl의 0.1M DTT 및 1μl의 RNase 처리한 블록 리보뉴클레오타이드 개시제(RNased block Ribonucleotide inhibitor, 40 u/μl) 및 1μl RTase를 첨가하였다. 반응액의 총 부피를 50 μl로 맞추고 반응은 42℃에서 1시간 동안 행하였다. 상업적으로 시판되는 칩(chip)(Cat#: G4112A, Agilent technology, Santa Clara, CA)을 사용하였고, 제조자 지시의 프로토콜에 따라 후속 프로세스를 행하였다.

간략하게 설명하면, 사용한 칩은 타겟 유전자 전체의 전사물들을 가로지르는 보존된 엑손(exon)들을 커버하는 약 41,000(60-mer) 올리고뉴클레오타이드 프로브로 구성되어 있다. 이들 프로브들은 다수의 주요한 공공의 공급원으로부터의 특성이 잘 분석된 전장 및 부분적인 인간 유전자를 이용한 것으로서 현재까지 알려진 인간 지놈을 대표한다. 41k 칩(41,000 유전자) 중의 어떠한 칩이 평가에 적합한지 확인하기 위해, 결합된 대조군 풀의 평균에 대한 결합된 테스트 풀의 분석을 행하였다. 이는 정적인 압력이 적용된 그룹에서 일군의 유전자 그룹이 상향 또는 하향 조절되는 것을 보여주는 분산된 플롯을 생성하였다.

(4) 실시간( real time ) RT - PCR

현저하게 상향 또는 하향 조절되는 패턴을 보이는 2 개의 유전자를 무작위적으로 선별하고, 마이크로어레이 결과를 확인하기 위해서 실시간 RT-PCR을 행하였다. 실시간 PCR은 CYBR 그린 PCR 마스터 믹스(ABI, 미합중국) 및 프라이머 익스프레스 소프트웨어(ABI, 미합중국)로 디자인한 프라이머를 사용하여 관심 유전자의 mRNA의 수준에 대해 상대 정량 평가하였다. 각각의 PCR에서 2 ㎍의 총 RNA를 역전사하고, 200 ng의 cDNA를 주형으로 사용하였다. 25 ㎕의 CYBR 그린 PCR 마스터 믹스 및 1 ㎕의 10 pmol 특이 프라이머를 주형 및 물과 혼합하여 총 부피 50 ㎕를 제조하였다. 주형이 없는 음성 대조군을 각 분석에 포함시켰다. 프라이머 디자인을 아래 표 1에 나타내었다.

PCR 반응은, 95℃에서 10 분간(변성)을 수행하고, 95℃에서 30초, 60℃에서 30초 그리고 72℃에서 30초를 1 사이클로 하여 총 40 사이클 수행하였다. 실시간에서 형광 방출이 기저 방출 값 초과의 역치에 도달하는 PCR 사이클 수에 대응하는 사이클 역치(cycle threshold, C_t) 값을 측정하였다. C_t 값은 특정 웰에 지정되어서, 그 지정된 웰 내에서 반응 동안에 충분한 수의 앰플리콘(amplicon)이 축적되어 기저 수준을 초과하는 통계학적으로 의미 있는 시점이 되는 시점을 반영하였다. 상대적 발현은 β-액틴(β-actin)의 발현과 비교한 비율로 계산하였다. 측정값은 3회 측정하여 평균값을 비교에 사용하였다. 측정된 값은 대응하는 마이크로어레이 값과 비교하였다.

(5) 알카라인 포스파타아제 분석 및 웨스턴 블롯팅

알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, ALP)는 적합한 반응물(Sigma, 미합중국)을 사용한 37℃ 및 pH 10.2에서의 p-니트리페닐포스페이트으로부터 p-니트로페놀으로의 전환을 통해 평가하였고, 비반응성(specific activity)은 상업적으로 입수 가능한 발색에 의한 분석방법(Anaspec, 미합중국)을 사용하여 결정한 용해물의 단백질 농도에 대해 계산하였다. 웨스턴 블롯팅에 대한 샘플은 Laemmli(9)에 의한 방법에 따라 환원성의 SDS 완충액과 혼합하고, 이를 가열한 후에 10％ 폴리아크릴아마이드젤 상에서 전기영동을 수행하였다. 이어, 젤을 면역블롯팅 분석을 위해 폴리비닐리덴디플루오라이드(polyvinylidene difluoride, PVDF)상으로 전기 블롯팅을 행하였다. PBS/0.1％ Tween 20(PBST; Bio-Rad)내에서 5％ 비지방성 건조유로 1 시간 동안 블록킹한 후에, 블롯을 0.5％ 우유내에서 희석시킨 1차 항체를 사용하여 PBST 내에서 25℃에서 1.5 시간 동안 탐침한 다음, 1:50,000으로 희석된 HRP-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 또는 항-래빗 IgG으로 탐침하였다. 1차 항체의 구입처와 구체적인 내용은 다음과 같다: 피브로넥틴(fibronectin)(ab6328, Abcam, Cambridge), TGF-β1(sc-146, Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA), 및 GAPDH (ab9385-200, Abcam, Cambridge). 신호들은 ECL(electrogenerated chemiluminescence)을 사용하여 화학발광에 의해 검출하였다.

(6) 통계학적 분석

마이크로어레이 결과 분석을 위해, Cy3/Cy5 또는 Cy5/Cy3 값에서 2 배 이상의 변화를 보이는 유전자를 실크 피브로인의 적용에 의해 강하게 영향을 받는 유전자로 간주하였다. 실험군 및 대조군의 평균값 사이의 차이는 실시간 RT-PCR 및 ALP 분석에 대한 독립 샘플 t-테스트에 의해 평가하였다. 유의성 수준은 P<0.05로 정하였다.

1-2. 실험결과

마이크로어레이(microarray) 결과는 하기 표 1에 나타내었다: 알카라인포스파타아제(ALP), 콜라겐 타입I-알파1(Col1A) 및 TGF-β1의 발현이 현저히 증가하였다(배 비율 > 2.0, 표 1). 또한, FGFR-1(fibroblast growth factor receptor-1), 피브로넥틴 및 인터루킨 16의 발현도 크게 증가한 결과를 보였다(배 비율 > 2.0, 표 1).

유전자 명칭	GenBank	염색체	배 비율
알카라인 포스파타아제	NM_001632	2q37.1	2.055
콜라겐 타입 I, 알파 1	NM_000088	17q21.33	2.221
콜라겐 타입 V, 알파 3	NM_015719	19p13.2	2.054
섬유모세포 성장인자(FGF) 7	NM_002009	15q15-q21.1	3.945
섬유모세포 성장인자 수용체(FGFR) 1	NM_023110	8p11.2-p11.1	2.027
피브로넥틴 1	NM_054034	2q34	5.735
인슐린-유사 성장인자 2	NM_001007139	11p15.5	6.719
인터루킨 16	BC040272	15q26.3	3.348
TIMP metallopeptidase inhibitor 3	NM_000362	22q12.3	3.967
형질전환 성장인자(TGF)-베타 1	NM_000660	19q13.2; 19q13.1	3.072
골형성 단백질(BMP) 8b	NM_001720	1p35-p32	-2.300
인터루킨 7	NM_000880	8q12-q13	-2.053
MMP(matrix metallopeptidase) 3	NM_002422	11q22.3	-9.009

후속의 실시간 RT-PCR 및 ALP 분석결과에서, 실크 피브로인 단백질로부터 분해된 실크 피브로인 펩타이드는 ALP의 발현과 효소 활성을 증가시킴을 확인할 수 있었다(도 1a 및 도 1b). 비처리 대조군 세포와 비교하여, 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖의 농도의 실크 피브로인 펩타이드로 처리한 Mg-63 세포는 적용 후 48 시간 까지 ALP 활성의 증가를 보였다(도 1b). 특히, 10 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖의 실크 피브로인 펩타이드를 처리한 경우 각각의 대조군과 비교할 때, 적용 후 24 시간 및 48 시간에서 ALP의 활성이 눈에 띄게 증가하였다(p<0.05, 도 1b). 그러나, 적용 후 72 시간에서는 활성의 차이가 나타나지는 않았다(p>0.05, 도 1b).

결론적으로 작게 분해된 실크 피브로인 펩타이드가 ALP의 발현을 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다.

또한, 실크 피브로인 펩타이드는 콜라겐 타입I-알파1(Col1A)의 발현도 증가시켰다(표 1 및 도 1a). 타입 I 콜라겐은 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite, 수산화인회석)와 함께 뼈의 주성분이다. 실크 피브로인 펩타이드가 ALP 및 타입 I 콜라겐의 발현을 증가시킴으로써 새로운 뼈의 생성을 촉진시켰다(도 1a 및 도 1 b).

한편, 본 발명의 실험결과에서, 세포 부착에 관련되어 있는 피브로넥틴(fibronectin)의 발현이 실크 피브로인 펩타이드가 투여된 세포에서 증가하였다(표 1 및 도 2). 피브로넥틴은 세포 부착, 성장, 이동 및 분화에서 중요한 역할을 하고(10, 11), 상처 치유 및 배아 발달과 같은 과정에서 중요한 것으로 알려져 있다(12). 피브로넥틴의 발현, 분해 및 유기적 구조의 변화는 암 및 섬유증을 포함하여 다수의 병리 증상과 관련되어 왔다(13).

그리고 본 발명의 실험결과에서 실크 피브로인 펩타이드에 의해 TGF-β1의 발현이 증가하였다(표 1 및 도 2). 동일한 환자로부터 채취한 조골세포에서는 TGF-β1의 발현이 증가되고, 정상 조직과 비교하여 볼 때 골관절염 뼈 조직에서 TGF-β1의 발현이 증가되었다.

상기의 실험결과로부터 볼 때, 실크 피브로인 펩타이드는 ALP, 타입 I 콜라겐 및 피브로넥틴의 발현을 유도할 수 있었으며, 이러한 작용은 조골세포의 뼈 생성작용을 촉진할 것으로 판단된다.

실시예 2 : 실크 피브로인 펩타이드의 골 이식재로서의 효능 평가

2-1. 실험재료 및 방법

(1) 동물 및 실험재료

3 개월 연령의 평균체중 2.3 kg(2.0-2.5 kg 범위)을 갖는 뉴질랜드 화이트 래빗 10 마리를 실험에 사용하였다. 저분자량의 실크 피브로인 펩타이드(분자량 0.5-1.0 kDa) 분말은 실시예 1에서 기술된 방법과 동일한 방법으로 제조 준비하였다(도 3a). 본 실험에 사용된 실크 피브로인 펩타이드는 전체 이식재 중량의 70중량%를 차지하고 Choukroun PRF(platelet-rich fibrin)의 처리량은 30 중량%를 차지하였다.

(2) 외과적 수술 방법

0.4 mL 케타민(ketamine)(100 mg/mL; Ketara; Yuhan, Seoul, 대한민국)과 0.3 mL 자일라진(xylazine)(10 mg/kg body weight; Rompun; Bayer Korea, Seoul, 대한민국)의 조합물을 래빗에게 근육 내 투여하여 일반 마취를 유도하였다. 10 ㎖의 혈액샘플을 각 래빗의 귀 정맥으로부터 얻었다(도 3b). 이어, 샘플을 400 g로 12분간 원심분리하였다. 원심분리 후 혈액을 3개의 층으로 분리하였다(도 3c). 이들 중에서, Choukroun PRF(platelet-rich fibrin)층인 중간층을 수득하였다. 래빗의 두개골 부위를 제모하고, 포디딘-요오드(povidine-iodine)로 소독하였다. 두개골을 비골(nasal bone)로부터 후두융기(occipital protuberance)까지 종방향으로 절개하고, 골막내에서 정중선 절개를 행하였다. 날카로운 골막하 절개를 행하여 두개골막을 나타나게 하여 두정골을 노출시켰다. 다량의 염수를 흘려보내면서 치과용 관상톱(dental-trephine bur)을 사용하여 양쪽 부위에 전체-두께의 두개골 손상을 유도하였다. 정중선의 각 측면에 하나씩 2개의 9 mm 두께의 손상을 생성시켰다. Choukroun PRF와 혼합한 실크 분말을 왼쪽 두개골 손상부위에 가하였고(도 3d의 별표), 오른쪽 부위는 그대로 두었다(도 3d). 이어, 두개골막과 피부를 3-0 실크를 사용하여 봉합하였다.

상기와 같은 외과적 수술 후, 래빗을 젠타미신(gentamicin) 1 mg/kg (Kookje, Seoul, 대한민국)을 3 일간 1일 당 3회에 걸쳐 근육 내 주사하였다. 각 래빗을 케이지에 두고 먹이와 물을 공급하였다. 5 마리의 래빗을 6 주째 희생시키고 12 주째 5 마리를 희생시켰다. 두개골 표본의 크기는 양쪽 손상을 포함하여 최대 25 X 12 X 3 mm의 크기이었다. 이들을 10％ 포르말린으로 고정시키고 현미경 컴퓨터 단층촬영을 행하였다(μ-CT).

(3) 현미경 컴퓨터 단층촬영( Microscopic computerized tomography )

제조한 표본을 Explored Locus SP μ-CT 스캐너(GE Medical Systems, London, 캐나다)를 사용하여 μ-CT를 행하였다(도 4). 보정(calibration)을 행한 후에 두개골 표본을 0.05 mm 두께의 섹션 내에서 스캐닝하였다. 스캔한 이미지는 마이크로뷰 소프트웨어(GE Medical Systems)를 사용하여 재구성하였다. 보정한 3-차원 이미지는 표본의 그로스 프로파일(gross profile) 내에서 나타내었다. 초기 손상이 9.0 mm 직경을 갖는 원형의 형태이었기 때문에 관심 부위(region of interest, ROI)의 셋팅은 초기 손상 크기 및 형태로 간주하였다. 제조사에 의해 추천되는 바와 같이 뼈 표준의 25％의 역치 수준을 셋팅하였다. 각 표본의 ROI는 뼈 무기질 함량(bone mineral content, BMC) 및 뼈 무기질 밀도(bone mineral density, BMD)에 대해 분석하였다. 조직 무기질 함량(tissue mineral content, TMC)과 조직 무기질 밀도(tissue mineral density, TMD)는 적합한 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.

(4) 조직형태적 평가( histomorphometric evaluation )

방사선 밀도 측정 분석 후 두개골을 탈수시키고 봉밀하였다. 뼈는 에탄올 내에서 탈수시키고 5％ 포름산을 사용하여 2 주 동안 석회질을 제거하였다. 오른쪽 및 왼쪽 정수리 뼈는 정중선 시상봉합을 통해 분리시켰다. 양쪽 세그먼트는 봉밀하여 파라핀 블록 내에서 시상봉합 섹션이 보이도록 하였다. 이어, 섹션을 얇게 자르고 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색하였다(도 5). 가장 넓은 손상 부위를 보이는 섹션을 선택하였고, 전후 50 ㎛ 크기의 손상을 선택하였다. 선택된 섹션의 디지털 이미지는 디지털 카메라(DP-20; Olympus, Tokyo, 일본)를 사용하여 얻었다. 이미지는 시그마 스캔 프로(SPSS, Chicago, IL)를 이용하여 분석하였다. 새로운 뼈는 손상의 총 영역의 백분율로서 계산하였다.

(5) 통계 분석( statistical analysis )

Paired t 테스트를 사용하여 동일 동물로부터의 샘플을 비교하였다. 통계학적으로 유의한 수준은 P < 0.05로 하였다.

2-2. 실험결과

(1) 현미경 컴퓨터 단층촬영( Microscopic computerized tomography )

μ-CT 분석 결과는 아래 표 2에 나타내었다:

-	6 주			12 주
	대조군 (unfilled)	실험군 (Fibroin+PRF)	P value	대조군 (unfilled)	실험군 (Fibroin+PRF)	P value
BMC(mg)	159.57±25.50	181.01±3.91	NS	271.25±20.69	279.37±14.82	NS
BMD (mg/cm3)	1,059.66±166.69	1,202.46±28.99	NS	1,467.61±480.28	1,550.46±415.06	NS
TMC(mg)	60.19±20.26	72.80±3.40	NS	126.42±6.62	132.09±4.41	.011
TMD (mg/cm3)	1,867.98±147.12	1,989.24±117.30	NS	2,029.72±668.22	2,088.88±648.34	.013

PRF, 혈소판-풍부 피브린(platelet-rich fibrin); BMC, 뼈 무기질 함량(bone mineral content); BMD, 뼈 무기질 밀도(bone mineral density); TMC, 조직 무기질 함량(tissue mineral content); TMD, 조직 무기질 밀도(tissue mineral density); 및 NS, 유의성 없음;을 나타낸다.

수술 후 6주에서 측정된 모든 변수값들의 평균은 대조군에 비해 실험군에서 높게 나타났다(도 4의 패널 A). 그러나, 통계학적으로 의미 있지는 않았다(P > 0.05).

잔존 손상의 크기는 실험군에서 보다 대조군에서 보다 크게 나타났다(도 4의 패널 B). 수술 후 12 주에서 실험군의 TMC는 132.09± 4.41이었고, 대조군에서는 126.42± 6.62이었다(표 2 참조). 이러한 차이는 통계학적으로 의미 있는 차이 이었다(P=0.011). 수술 후 12주에서 실험군의 TMD는 2,088.88± 648.34 이었고, 대조군에서는 2,029.72± 668.22 이었다(표 2). 이 결과는 통계학적으로 의미 있는 차이였다(P=0.013). 그러나 다른 변수들은 통계학적으로 의미 있는 차이를 보여주지 못하였다.

(2) 조직형태적( histomorphometry ) 관찰

조직형태적 결과는 하기 표 3에 나타내었다: 수술 후 6주에서 대조군의 새로운 뼈의 총 생성은 36.59± 6.11％이었고(도 5의 패널 A 및 C), 실험군에서는 44.38± 17.00％이었다(도 5의 패널 B 및 D). 그러나, 이러한 차이는 통계학적으로 의미가 있지는 않았다(P>0.05). 수술 후 12주에서 대조군의 새로운 뼈의 총 생성은 49.86± 7.49％이었고(도 6의 패널 A 및 C), 실험군에서는 59.83± 10.92％이었다(도 6의 패널 B 및 D). 이와 같은 차이는 통계학적으로 의미가 있었다(P=0.021).

-	6 주			12 주
	대조군 (unfilled)	실험군 (Fibroin+PRF)	P value	대조군 (unfilled)	실험군 (Fibroin+PRF)	P value
새로운 뼈 총 생성(%)	36.59±6.11	44.38±17.00	NS	49.86±7.49	59.83±10.92	.021

실시예 3 : 실크피브로인 펩타이드의 임플란트 이식 부위의 뼈 생성 효능 평가

3-1. 실험재료 및 방법

(1) 동물 및 실험재료

4 개월 연령의 평균체중 2.7 kg (2.5-3.0 kg 범위)을 갖는 뉴질랜드 화이트 래빗을 실험에 사용하였다. 저분자량의 실크 피브로인 펩타이드(분자량 0.5-1.0 kDa) 분말은 실시예 1에서 기술된 방법과 동일한 방법으로 제조 준비하였다.

(2) 외과적 수술 방법

0.4 ㎖의 케타민(ketamine)(100 mg/mL; Ketara; Yuhan, Seoul, 대한민국)과 0.3 ㎖의 자일라진(xylazine)(10 mg/kg body weight; Rompun; Bayer Korea, Seoul, 대한민국)의 조합물을 래빗에게 근육 내 투여하여 일반 마취를 유도하였다. 10 ㎖의 혈액샘플을 각 래빗의 귀 정맥으로부터 얻었다. 이어, 샘플을 400 g로 12분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 혈액을 3개의 층으로 분리하였다. 이들 층 중에서, Choukroun PRF(platelet-rich fibrin)층인 중간층을 수득하였다.

정강이뼈(tibia) 부분을 제모하고 포비딘-요오드(povidine-iodine)로 소독하였다. 이어, 골막을 절개한 후 골막하부도 절개하여 정강이뼈를 노출시켰다. 관상톱을 사용하여 뼈에 2개의 직경 7.0 mm의 구멍을 생성시켰다. 2개의 구멍의 간격은 5 mm이었다. 임플란트(직경 3.0 mm, 길이 10.0 mm: MSP30103R; Osstem, Seoul, 대한민국)를 각각의 구멍에 설치하고, 대향의 코텍스(cortex)에 고정하였다. 왼쪽의 대조군은 충진하지 않은 상태로 남겨 두었다(도 7의 패널 A). 임플란트 주위의 공간(gap)은 각각 2 mm 정도이었다. 실크 피브로인 펩타이드 분말과 Choukroun PRF의 조합을 실험군의 임플란트 주위 공간 안으로 충진하였다(도 7의 패널 B). 임플란트 설치 자리는 평편하게 분포된 곳으로 정하였다. 대조군 샘플의 절반은 말단부위에 설치하였고, 다른 절반은 반대편 말단부위에 설치하였다. 골막과 피부를 3-0 실크를 사용하여 층으로 봉합하였다. 수술 후 래빗에 젠타미신(gentamicin) 1 mg/kg(Kookje, Seoul, 대한민국)을 3일 동안 1일 3회 근육 내 투여하였다. 각각의 래빗을 케이지에 두고 물과 먹이를 제공하였다. 8주 후에 10마리의 동물을 희생시켰다. 5 마리 동물로부터 10개의 임플란트를 제거 토크(removal torque) 값을 측정하는데 사용하였다. 피크 제거 토크는 디지털 토크 측정기를 사용하여 측정하였다. 5 마리 동물로부터의 임플란트는 10％ 포르말린에 고정하였고 조직 형태를 측정하는데 사용하였다.

(3) 조직형태 측정

조직을 제조하는 공정은 이미 공지된 방법(14)에 따라 실시하였다. 샘플은 Villanueva 뼈 염색 용액 내에서 7일간 염색하였다. 탈수과정에 이어서, 각 샘플을 메틸메타크릴레이트 레진 내에서 봉밀하였다. 저속 회전 다이아몬드 휠을 사용하여 임플란트의 장축을 따라서 섹션 슬라이스를 제조하였다. 마지막으로, 섹션을 30 ㎛의 두께로 제조하였다. 디지털 이미지는 디지털 카메라(DP-20; Olympus, Tokyo, 일본)를 사용하여 수득하였다. 이미지를 시그마 스캔 프로(SPSS, Chicago, IL)를 이용하여 분석하였다. 접합부로부터의 최초 3개의 가닥을 이미지 분석에 이용하였다. 새로운 뼈의 총량은 각각의 가닥간의 총 부위의 백분율에 따라서 계산하였다. 뼈-임플란트 접촉은 임플란트 가닥에 대한 뼈 접촉의 백분율에 의해 계산하였다.

(4) 통계학적 분석

Paired t 테스트를 사용하여 동일한 동물에서의 샘플간의 측정치를 비교하였다. 통계학적으로 의미있는 수준은 P<0.05로 정하였다.

3-2. 실험결과

(1) 토크 테스트( torque test )

토크 테스트의 결과는 도 8에 나타내었다. 수술 후 8주에서 측정한 모든 변수값의 평균값은 대조군에서 보다 실험군에서 더 높았다. 실험군에서의 제거 토크값은 30.34± 5.06 Nㆍcm인 반면에, 대조군에서의 제거 토크 값은 21.86± 3.39 Nㆍcm 이었다. 2개 군 간의 차이는 통계학적으로 의미 있는 값이다(P=0.010).

(2) 조직형태적 평가

임플란트와 뼈 간의 접촉은 대조군에서 낮았다(도 9의 패널 A). 그러나, 실험군에서 피층에서의 뼈는 재생성(regeneration)이 매우 높게 나타났다(도 9의 패널 B). 이러한, 조직형태적 결과는 아래 표 4로부터 확인할 수 있다. 새로운 뼈의 형성 평균값은 실험군에서 51.93± 27.90％이었고, 대조군에서 11.67± 15.12％이었다. 각 군간의 차이는 통계학적으로 의미가 있었다(P=0.003). 평균 뼈-임플란트 접촉은 실험군에서 43.07± 21.96％이었으며, 대조군에서는 15.37± 23.84％이었다. 이러한 차이는 통계학적으로 의미 있는 것이었다(P=0.002).

-	대조군 (unfilled)	실험군 (Fibroin+PRF)	P value
새로운 뼈 총 생성(%)	11.67±15.12	51.93±27.90	.003
뼈-임플란트 접촉(%)	15.37±23.84	43.07±21.96	.002

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고문헌

1. Yamaguchi A. et al., Tanpakushitsu Kakusan Koso., 50(6Suppl):664-669(2005).

2. Cohen-Solal M. et al., Therapie., 58(5):391-393(2003).

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Claims (12)

1. 실크에 알칼리성 용액을 처리하여 세리신을 제거하고 산(acid)으로 가수분해하여 제조되는 중량 평균 분자량 100-4,000 Da의 실크 피브로인(fibroin) 펩타이드 50-90 중량% 및 PRF(platelet-rich fibrin) 10-50 중량%를 유효성분으로 포함하는 치과용 골 이식재(bone graft); 상기 실크 피브로인 펩타이드는 분말형태이다.
   
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4. 제 1 항에 있어서, 상기 실크 피브로인 펩타이드는 조골세포에서 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 콜라겐 타입 I-알파1, 피브로넥틴(fibronectin) 또는 형질전환 성장인자(TGF)-베타 1의 발현을 증가시키는 것을 특징을 하는 골 이식재.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 실크 피브로인 펩타이드는 골 이식재에 대하여 0.01-1000 ㎍/㎖의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 골 이식재.
   
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10. 제 1 항에 있어서, 상기 골 이식재는 히알루론산(hyaluronic acid), 수산화인회석(hydroxyapatite), 콜라겐, 탄산칼슘, 인산칼슘, 황산칼슘, 모노칼슘인산, 트리칼슘인산 및 실리카로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 골 이식재.
    
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12. 상기 제 1 항, 제 4 항, 제 5 항 및 제 10 항 중 어느 한 항의 골 이식재를 표면 처리한 임플란트.

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