JP7118161B2 - 勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法 - Google Patents
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Description
1)特定の低温における正確な部分的な脱灰処理は、骨マトリックス材料の空隙率及びその表面コラーゲンの露出度を拡大させ、効果的に成長因子を放出させ、細胞への材料の粘着度をよりよく増加させ、細胞再生に関連する遺伝子とタンパク質のアップレギュレーションを調節する。
2)一方、特定の程度のミネラル富化(Ca2+、PO4-3など)は天然の骨ECM足場のバイオメカニクスの特性と三次元ミクロ構造を十分に保持するだけではなく、より重要なことは、骨形成、血管新生及び骨折初期(血腫の組織化段階)のコラーゲンの鉱化に対して積極的な役割を果たし、細胞の定着付着を増加させ、細胞の分化誘導を促進する。
3)天然組織由来の勾配鉱化された(90%と60%の鉱化の程度)骨の細胞外マトリックス材料は、非脱灰または完全脱灰された骨マトリックス材料よりも間葉系幹細胞の分化と骨形成を促進する面でより大きな可能性を示す。
1)新鮮なブタの肩甲骨を取り、滅菌生理食塩水で4回洗浄し、6mmのドリルで海綿骨を取り出し、メスで高さ約2mmの円筒形の骨ブロックに切る。
2)材料が得られたら、滅菌生理食塩水で2時間洗浄した後、照射センターに送り、25Wの照射量で照射滅菌を行う。
3)20KIU/mlのプロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水で各回10分間ずつ3回すすぎ、血液、脂肪組織及びその他の不純物を除去する。
4)500mlの脱イオン水を含む高温滅菌した1Lガラス瓶及び20個の包埋カセットを準備する。滅菌操作台で滅菌手袋を装着し、3つの滅菌後の骨ブロックを分けて包埋カセットに入れ、15%のアセトンを含む脱イオン水溶液10mlに入れ、10℃で2時間恒温振とうする。
5)包埋カセットを、2%のリン酸トリブチルを含有する脱イオン水溶液5mlに入れ、10℃で4時間恒温振とうする。
6)包埋カセットを、プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水溶液中に入れ、4℃で、シェーカーを使用して50rpmで24時間振とうした後、液体窒素で3サイクル(-80℃/37℃)凍結融解する。
7)包埋カセットを5mLの2%Triton X-100に入れ、10℃の恒温シェーカーに入れ、100rpmで24時間振とうする。
8)包埋カセットを、5%のSDSを含む脱イオン水に入れ、10℃の恒温シェーカーを使用して、100rpmで36時間振とうする。
9)0.5Mの塩化カリウムを含むPBS緩衝液において、4℃で、シェーカーを使用して100rpmで6時間振とうする。
10)1Mのヨウ化カリウムを含むPBS緩衝液において、4℃の温度で、シェーカーを使用して100rpmで6時間振とうし、脱細胞化された骨ECM材料を得る(図1A)。
11)脱灰溶液(脱イオン水1750ml+EDTA-2Na 450g+NaOH 35g)を調製する。骨ブロックを取り出し、250kHz,4℃の条件下で、脱灰装置において、それぞれ4、8、12、24時間の脱灰を行う。
12)ステップ(4)~(11)において、各ステップが完了した後、ステップ間はいずれも脱イオン水で6時間すすぐ。
13)骨ブロックを取り出し、100%、90%、60%、0%の鉱化の程度の骨ECM材料を得る(図1B)。材料を25wで再度照射滅菌する。
1)新鮮なブタの肩甲骨を取り、滅菌生理食塩水で4回洗浄し、6mmのドリルで海綿骨を取り出し、メスで高さ約2mmの円筒形の骨ブロックに切る。
2)材料が得られたら、滅菌生理食塩水で2時間洗浄した後、照射センターに送り、40Wの照射量で照射滅菌を行う。
3)10KIU/mlのプロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水で各回20分間ずつ3回すすぎ、血液、脂肪組織及びその他の不純物を除去する。
4)500mlの脱イオン水を含む高温滅菌した1Lガラス瓶及び20個の包埋カセットを準備する。滅菌操作台で滅菌手袋を装着し、3つの滅菌後の骨ブロックを分けて包埋カセットに入れ、15%のアセトンを含む脱イオン水溶液10mlに入れ、10℃で4時間恒温振とうする。
5)包埋カセットを、2%のリン酸トリブチルを含有する脱イオン水溶液5mlに入れ、10℃で4時間恒温振とうする。
6)プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水溶液において、4℃で、シェーカーを使用して100rpmで24時間振とうした後、液体窒素で3サイクル(-80℃/37℃)凍結融解する。
7)包埋カセットを5mLの2%Triton X-100に入れ、10℃の恒温シェーカーに入れ、100rpmで24時間振とうする。
8)包埋カセットを、5%のSDSを含む脱イオン水に入れ、10℃の恒温シェーカーを使用して、100rpmで36時間振とうする。
9)0.5Mの塩化カリウムを含むPBS緩衝液において、4℃で、シェーカーを使用して100rpmで6時間振とうする。
10)1Mのヨウ化カリウムを含むPBS緩衝液において、4℃の温度で、シェーカーを使用して100rpmで6時間振とうし、脱細胞化された骨ECM材料を得る(図1A)。
11)脱灰溶液(脱イオン水1750ml+EDTA-2Na 450g+NaOH 35g)を調製する。骨ブロックを取り出し、250kHz,4℃の条件下で、脱灰装置において、それぞれ4、8、12、24時間の脱灰を行う。
12)ステップ(4)~(11)において、各ステップが完了した後、ステップ間はいずれも脱イオン水で6時間すすぐ。
13)骨ブロックを取り出し、100%、90%、60%、0%の鉱化の程度の骨ECM材料を得る(図1B)。材料を25wで再度照射滅菌する。
14)脱細胞化処理後、材料のDNA含有量の検出量は非常に少ない(図1C)。
15)100%、90%、60%、0%の鉱化の程度の骨ECM材料の鉱化含有量(カルシウムイオンの含有量を例とする)を検出する。具体的には、90%の鉱化の程度の骨ECM材料(4時間の脱灰処理)グループは4.58±0.01mmol/mgで、60%の鉱化の程度の骨ECM材料(8時間の脱灰処理)グループは3.26±0.38mmol/mgで、0%の鉱化の程度の骨ECM材料(12時間の脱灰処理)にはカルシウムイオンがほとんど含まれていない(100%の鉱化の程度の骨ECM材料(即ち、脱灰前の材料)におけるカルシウムイオンの含有量は4.99±0.22mmol/mgである)(図1D)。
16)100%、90%、60%、0%の鉱化の程度の骨ECM材料の空隙率を測定する。脱灰時間の増加に伴い、空隙率が増加する(図3A)。
17)100%、90%、60%、0%の鉱化の程度の骨ECM材料の剛性を測定する。剛性とは、圧力、変形に対する耐性の指標であって、鉱化の程度の減少に伴い対応する鉱化の程度の材料の剛性は順に減少し、90%、60%、0%の鉱化の程度の骨ECM材料(脱灰4時間、8時間、12時間)の剛性はそれぞれ5.71±0.46N/mm、3.68±0.18N/mm、及び2.53±1.62N/mmである(100%の鉱化の程度の骨ECM材料(即ち、脱灰前の材料)の剛性は21.55±1.62N/mmである)(図3B)。
1)新鮮なブタの肩甲骨を取り、滅菌生理食塩水で4回洗浄し、6mmのドリルで海綿骨を取り出し、メスで高さ約2mmの円筒形の骨ブロックに切る。
2)材料が得られたら、滅菌生理食塩水で2時間洗浄した後、照射センターに送り、5Wの照射量で照射滅菌を行う。
3)50KIU/mlのプロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水で毎回10分間ずつ2回すすぎ、血液、脂肪組織、及びその他の不純物を除去する。
4)500mlの脱イオン水を含む高温滅菌した1Lガラス瓶及び20個の包埋カセットを準備する。滅菌操作台で滅菌手袋を装着し、3つの滅菌後の骨ブロックを分けて包埋カセットに入れ、10%のアセトンを含む脱イオン水溶液10mlに入れ、10℃で1時間恒温振とうする。
5)包埋カセットを5%のリン酸トリブチルを含有する脱イオン水溶液5mLに入れ、10℃で3時間恒温振とうする。
6)プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水溶液中において、4℃で、シェーカーを使用して50rpmで36時間振とうした後、液体窒素で2サイクル(-80℃/37℃)凍結融解する。
7)包埋カセットを5mLの2%Triton X-100に入れ、10℃の恒温シェーカーに入れ、100rpmで24時間振とうする。
8)包埋カセットを、5%のSDSを含む脱イオン水に入れ、10℃の恒温シェーカーを使用して、100rpmで36時間振とうする。
9)0.5Mの塩化カリウムを含むPBS緩衝液において、4℃で、シェーカーを使用して100rpmで6時間振とうする。
10)1Mのヨウ化カリウムを含むPBS緩衝液において、4℃の温度で、シェーカーを使用して100rpmで6時間振とうし、脱細胞化された骨ECM材料を得る(図1A)。
11)脱灰溶液(脱イオン水1750ml+EDTA-2Na 450g+NaOH 35g)を調製する。骨ブロックを取り出し、250kHz,4℃の条件下で、脱灰装置において、それぞれ4、8、12、24時間の脱灰を行う。
12)ステップ(4)~(11)において、各ステップが完了した後、ステップ間はいずれも脱イオン水で6時間すすぐ。
13)骨ブロックを取り出し、100%、90%、60%、0%の鉱化の程度の骨ECM材料を得る(図1B)。材料を25wで再度照射滅菌する。
14)走査型電子顕微鏡(SEM)の観察により、100%、90%、60%、0%の鉱化の程度の骨ECM材料の超微細構造の特徴を得る。他のグループと比較して、100%と90%の鉱化の程度の骨ECM材料(即ち、脱灰0及び4時間)の表面はより粗く、空隙はより小さい。また、4つのグループ間のコラーゲン線維の構造と配列にも差異が存在する。100%の鉱化の程度の骨ECM材料(即ち、脱灰前の材料)のグループにおいては、ほとんどのコラーゲン線維は表面に覆われているが、90%と60%の鉱化の程度の骨ECM材料(脱灰4時間及び8時間)の表面は、コラーゲン線維の露出が多く、配列規則が良好で、細胞のためにより多くの接着滞留位置が形成されている。しかしながら、0%の鉱化の程度の骨ECM材料(脱灰12時間)は、コラーゲン原線維の構造がより無秩序で、緻密性がより悪く、細胞の滞留に不利である(図2A)。
15)原子間力顕微鏡法(AFM)も、同じく、100%、90%、60%、0%の鉱化の程度の骨ECM材料における表面露出コラーゲンがより多いことを示している(図3C~D)。
16)免疫組織化学的染色は、90%と60%の鉱化の程度の骨ECM材料の表面におけるBMP-2の発現量が増加することを示している(図2B)。
17)EDS法によって、100%、90%、60%、0%の鉱化の程度の骨ECM材料の特定の領域におけるC、P、Ca(炭素、リン、カルシウム)の比率を測定した(図1E、F)。Cをレファレンスとして、選択性電極法で測定されたCa濃度によれば、材料の鉱化の程度が減少するに伴い、Ca密度はより分散される。また、リン含有量の変化はカルシウムの変化と一致し、鉱化の程度が減少するに伴い、分散度は増加する。AFMにより、100%、90%、60%、0%の鉱化の程度の骨ECM材料の超微細機械的特性を評価した。天然の骨ECM由来の材料の鉱化の程度の違いにより、我々は、90%と60%の鉱化の程度の骨ECM材料は、より多くの原線維が表面に露出し、細胞粘着のために多くのRGDリガンドを提供していることが見いだされた。
1)新鮮なブタの肩甲骨を取り、滅菌生理食塩水で4回洗浄し、6mmのドリルで海綿骨を取り出し、メスで高さ約2mmの円筒形の骨ブロックに切る。
2)材料が得られたら、滅菌生理食塩水で2時間洗浄した後、照射センターに送り、25Wの照射量で照射滅菌を行う。
3)20KIU/mlのプロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水で各回10分間ずつ3回すすぎ、血液、脂肪組織及びその他の不純物を除去する。
4)500mlの脱イオン水を含む高温滅菌した1Lガラス瓶及び20個の包埋カセットを準備する。滅菌操作台で滅菌手袋を装着し、3つの滅菌後の骨ブロックを分けて包埋カセットに入れ、15%のアセトンを含む脱イオン水溶液10mlに入れ、10℃で2時間恒温振とうする。
5)包埋カセットを、2%のリン酸トリブチルを含有する脱イオン水溶液5mlに入れ、10℃で4時間恒温振とうする。
6)プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水溶液において、4℃で、シェーカーを使用して24時間振とうした後、液体窒素で3サイクル(-80℃/37℃)凍結融解する。
7)包埋カセットを5mLの2%Triton X-100に入れ、10℃の恒温シェーカーに入れ、100rpmで24時間振とうする。
8)包埋カセットを、5%のSDSを含む脱イオン水に入れ、10℃の恒温シェーカーを使用して、100rpmで36時間振とうする。
9)0.5Mの塩化カリウムを含むPBS緩衝液において、4℃で、シェーカーを使用して100rpmで6時間振とうする。
10)1Mのヨウ化カリウムを含むPBS緩衝液において、4℃の温度で、シェーカーを使用して100rpmで6時間振とうし、脱細胞化された骨ECM材料を得る(図1A)。
11)脱灰溶液(脱イオン水1750ml+EDTA-2Na 450g+NaOH 35g)を調製する。骨ブロックを取り出し、250kHz,4℃の条件下で、脱灰装置において、それぞれ4、8、12、24時間の脱灰を行う。
12)ステップ(4)~(11)において、各ステップが完了した後、ステップ間はいずれも脱イオン水で6時間すすぐ。
13)骨ブロックを取り出し、100%、90%、60%、0%の鉱化の程度の骨ECM材料を得る(図1B)。材料を25wで再度照射滅菌する。
14)特定の鉱化の程度の骨ECM材料の浸出液(90%と60%の鉱化の程度の骨ECM材料からの浸出液)で骨間葉系幹細胞を1~5日間培養したところ、その結果、細胞の成長が良好であることが示された。それは、材料の安全性、無毒性が高いことを示す(図5A)。
15)骨髄間葉系幹細胞を100%、90%、60%、0%の鉱化の程度の骨ECM材料に移植した三日後、共焦点顕微鏡の視野で、細胞が足場に粘着されていることが観察された(図4A)。走査型電子顕微鏡の1000倍の視野で、鉱化の程度が100%の骨髄ECM材料に比較して、90%と60%の鉱化の程度の骨ECM材料の骨髄間葉系幹細胞がより多いことが観察され、それは本特許に係る材料は細胞粘着定着及び細胞増殖を効果的に促進できることを示している。図4Bに示すように、0%の鉱化の程度の骨ECM材料の細胞の数も比較的に少ない。
16)その後、100%、90%、60%、0%の鉱化の程度の骨ECM材料に定着された骨髄間葉系幹細胞における骨形成遺伝子の相対的な発現状況を比較した(図5B)。ALPとは、骨髄間葉系幹細胞の早期の最も重要な骨形成指標の1つである。その結果、90%の鉱化の程度の骨ECM材料で1週間培養された細胞内におけるALPが非脱灰グループより17倍アップレギュレートされていることが示された。Col-1α1も同じ傾向である。培養の2週目と4週目に、90%と60%の鉱化の程度の骨ECM材料、特に90%の鉱化の程度の骨ECM材料における細胞のBMP-2発現レベルが高くなった(図6A)。また、MAPKシグナル経路はCa2+仲介の骨形成と分化を促進する過程において役割を果たし、その結果、100%及び0%の鉱化の程度の骨ECM材料骨グループに比較して、90%と60%の鉱化の程度の骨ECM材料におけるMEK-1発現がアップレギュレートされていることを見いだした(図6B)。要約すると、100%及び0%の鉱化の程度の骨ECM材料に比較して、90%と60%の鉱化の程度の骨ECM材料、特に90%の鉱化の程度の骨ECM材料は、骨髄間葉系幹細胞の骨形成と分化を促進するより良い効果を示した。
1)新鮮なブタの肩甲骨を取り、滅菌生理食塩水で4回洗浄し、6mmのドリルで海綿骨を取り出し、メスで高さ約2mmの円筒形の骨ブロックに切る。
2)材料が得られたら、滅菌生理食塩水で2時間洗浄した後、照射センターに送り、25Wの照射量で照射滅菌を行う。
3)20KIU/mlのプロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水で各回10分間ずつ3回すすぎ、血液、脂肪組織及びその他の不純物を除去する。
4)500mlの脱イオン水を含む高温滅菌した1Lガラス瓶及び20個の包埋カセットを準備する。滅菌操作台で滅菌手袋を装着し、3つの滅菌後の骨ブロックを分けて包埋カセットに入れ、20%のアセトンを含む脱イオン水溶液10mlに入れ、10℃で4時間恒温振とうする。
5)包埋カセットを、1%のリン酸トリブチルを含有する脱イオン水溶液5mlに入れ、10℃で1時間恒温振とうする。
6)プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水溶液中において、4℃で、シェーカーを使用して、300rpmで48時間振とうした後、液体窒素で6サイクル(-80℃/37℃)凍結融解する。
7)包埋カセットを0.5%Triton X-100 5mlに入れ、10℃の恒温シェーカーに入れ、100rpmで24時間振とうする。
8)包埋カセットを、5%のSDSを含む脱イオン水に入れ、10℃の恒温シェーカーを使用して、100rpmで36時間振とうする。
9)0.5Mの塩化カリウムを含むPBS緩衝液において、4℃で、シェーカーを使用して、100rpmで2時間振とうする。
10)1.2Mのヨウ化カリウムを含むPBS緩衝液において、4℃の温度で、シェーカーを使用して、100rpmで12時間振とうし、脱細胞化された骨ECM材料を得る(図1A)。
11)脱灰溶液(脱イオン水1750ml+EDTA-2Na 450g+NaOH 35g)を調製する。骨ブロックを取り出し、250kHz,4℃の条件下で、脱灰装置において、それぞれ4、8、12、24時間の脱灰を行う。
12)ステップ(4)~(11)において、各ステップが完了した後、ステップ間はいずれも脱イオン水で6時間すすぐ。
13)骨ブロックを取り出し、100%、90%、60%、0%の鉱化の程度の骨ECM材料を得る(図1B)。材料を25wで再度照射滅菌する。
14)ウサギの大腿骨上顆の両側の欠損モデルを確立し、100%、90%、60%、0%の鉱化の程度の骨ECM材料を埋め込み、それらの治療効果を評価した。
15)マイクロCT分析(図9A~B)により、移植術の4週間後、90%と60%の鉱化の程度の骨ECM材料グループの骨欠損部位はほとんど新生骨小柱で充填されたが、非脱灰および完全脱灰材料グループの充填効果は小さいことが示された。100%、90%、60%、0%の鉱化の程度の骨ECM材料は、それぞれ1.23±0.14/mm、2.16±0.03/mm、1.57±0.21/mm、0.94±0.22/mmで、骨小柱の厚さは、それぞれ0.16±0.03μm、0.24±0.04μm、0.18±0.01μm、0.14±0.02μmであった。90%と60%の鉱化の程度の骨ECM材料による生体自身の新生骨小柱の成長を促進する効果は他のグループより優れていた(図9C)。
16)H&E染色後(図10A~B)、明らかな炎症または炎症性細胞が見い出せなかった。これは、材料の安全性を示している。
17)移植術の4週間後、90%と60%の鉱化の程度の骨ECM材料は、部分的に分解され、新生骨が成長した。新生骨組織におけるコラーゲン線維の鉱化は、多くは未熟な状態の鉱物材料の表面コラーゲンである(図7A、B)。
1)新鮮なブタの肩甲骨を取り、滅菌生理食塩水で4回洗浄し、6mmのドリルで海綿骨を取り出し、メスで高さ約2mmの円筒形の骨ブロックに切る。
2)材料が得られたら、滅菌生理食塩水で2時間洗浄した後、照射センターに送り、25Wの照射量で照射滅菌を行う。
3)20KIU/mlのプロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水で各回10分間ずつ3回すすぎ、血液、脂肪組織及びその他の不純物を除去する。
4)500mlの脱イオン水を含む高温滅菌した1Lガラス瓶及び20個の包埋カセットを準備する。滅菌操作台で滅菌手袋を装着し、3つの滅菌後の骨ブロックを分けて包埋カセットに入れ、15%のアセトンを含む脱イオン水溶液10mlに入れ、10℃で2時間恒温振とうする。
5)包埋カセットを、5%のリン酸トリブチルを含有する脱イオン水溶液5mlに入れ、10℃で4時間恒温振とうする。
6)プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水溶液において、4℃で、シェーカーを使用して24時間振とうした後、液体窒素で3サイクル(-80℃/37℃)凍結融解する。
7)包埋カセットを5mLの2%Triton X-100に入れ、10℃の恒温シェーカーに入れ、100rpmで24時間振とうする。
8)包埋カセットを、10%のSDSを含む脱イオン水に入れ、10℃の恒温シェーカーを使用して、100rpmで36時間振とうする。
9)0.1Mの塩化カリウムを含むPBS緩衝液において、4℃で、シェーカーを使用して、100rpmで12時間振とうする。
10)1Mのヨウ化カリウムを含むPBS緩衝液において、4℃の温度で、シェーカーを使用して100rpmで2時間振とうし、脱細胞化された骨ECM材料を得る(図1A)。
11)脱灰溶液(脱イオン水1750ml+EDTA-2Na 450g+NaOH 35g)を調製する。骨ブロックを取り出し、250kHz,4℃の条件下で、脱灰装置において、それぞれ4、8、12、24時間の脱灰を行う。
12)ステップ(4)~(11)において、各ステップが完了した後、ステップ間はいずれも脱イオン水で6時間すすぐ。
13)骨ブロックを取り出し、100%、90%、60%、0%の鉱化の程度の骨ECM材料を得る(図1B)。材料を25wで再度照射滅菌する。
14)血管形成を促進する面においては、新生血管が骨小柱の間に分布していることが観察され、移植術の2週間後、ほとんどは未熟な新生血管が形成された。その中で、100%、90%、60%、0%の鉱化の程度の骨ECM材料の新生血管の数は、それぞれ5.5±1.3/500μm2、8.0±1.6/500μm2、8.0±1.8/500μm2、及び5.0±1.6/500μm2で、血管面積はそれぞれ23.92±7.25μm2、38.95±8.12μm2、45.54±8.70μm2、及び18.86±9.43μm2であった。その中で、90%と60%の鉱化の程度の骨ECM材料グループの新生血管の厚さは、それぞれ4.86±0.15μm、5.07±0.20μmで、100%の鉱化の程度の骨ECM材料(4.29±0.38μm)と0%の鉱化の程度の骨ECM材料グループ(4.41±0.26μm)より高かった。移植術の4週間後、主に成熟した新生血管が形成され、100%、90%、60%、0%の鉱化の程度の骨ECM材料の数は、それぞれ3.5±0.6/500μm2、5.8±1.0/500μm2、5.0±0.8/500μm2、及び2.8±1.5/500μm2で、血管面積はそれぞれ41.26±5.69μm2、69.92±11.26μm2、60.76±8.66μm2、及び24.87±8.18μm2であった。厚さは、移植術の2週間時点と比較して、各グループはいずれも増加しており、その中で、90%の鉱化の程度の骨ECM材料(12.18±0.54μm)及び60%の鉱化の程度の骨ECM材料(12.18±0.32μm)グループは、依然として100%の鉱化の程度の骨ECM材料グループ(11.83±0.49μm)と0%の鉱化の程度の骨ECM材料グループ(9.68±1.83μm)より高かった。90%と60%の鉱化の程度の骨ECM材料グループは、他の2つのグループと比較して、新生血管、微小血管の変性、大血管の安定した成長が速くなっていることを示すとともに、欠陥組織における血管内皮増殖因子A(VEGFA)の分布はアップレギュレートされ、より良い修復効果があった(図8A~E)。
1)新鮮な牛の肩甲骨を取り、滅菌生理食塩水で4回洗浄し、6mmのドリルで海綿骨を取り出し、メスで高さ約2mmの円筒形の骨ブロックに切る。
2)材料が得られたら、滅菌生理食塩水で2時間洗浄し、照射センターに送り、25Wの照射量で照射滅菌を行う。
3)50KIU/mlのプロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水で毎回5分間ずつ2回すすぎ、血液、脂肪組織及びその他の不純物を除去する。
4)残りの後続の操作は、実施例1の方法を参照して実行し、勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料を得る。
1)新鮮な豚の肋骨を取り、滅菌生理食塩水で4回洗浄し、6mmのドリルで海綿骨を取り出し、メスで高さ約2mmの円筒形の骨ブロックに切る。
2)材料が得られたら、滅菌生理食塩水で2時間洗浄し、照射センターに送り、25Wの照射量で照射滅菌を行う。
3)10KIU/mlのプロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水で毎回5分間ずつ5回すすぎ、血液、脂肪組織及びその他の不純物を除去する。
4)残りの後続の操作は、実施例1の方法を参照して実行され、勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料を得る。
1)新鮮なブタの肩甲骨を取り、滅菌生理食塩水で4回洗浄し、6mmのドリルで海綿骨を取り出し、メスで高さ約2mmの円筒形の骨ブロックに切る。
2)材料が得られたら、滅菌生理食塩水で2時間洗浄した後、照射センターに送り、25Wの照射量で照射滅菌を行う。
3)20KIU/mlのプロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水で各回10分間ずつ3回すすぎ、血液、脂肪組織及びその他の不純物を除去する。
4)500mlの脱イオン水を含む高温滅菌した1Lガラス瓶及び20個の包埋カセットを準備する。滅菌操作台で滅菌手袋を装着し、3つの滅菌後の骨ブロックを分けて包埋カセットに入れ、10%のアセトンを含む脱イオン水溶液10mlに入れ、10℃で1時間恒温振とうする。
5)包埋カセットを、2%のリン酸トリブチルを含有する脱イオン水溶液5mlに入れ、10℃で4時間恒温振とうする。
6)プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水溶液において、4℃で、シェーカーを使用して24時間振とうした後、液体窒素で3サイクル(-80℃/37℃)凍結融解する。
7)包埋カセットを、5mlの2% Triton X-100に入れ、10℃の恒温シェーカーに入れ、100rpmで24時間振とうする。
8)包埋カセットを、5%のSDSを含む脱イオン水に入れ、10℃の恒温シェーカーを使用して、100rpmで36時間振とうする。
9)0.5Mの塩化カリウムを含むPBS緩衝液において、4℃で、シェーカーを使用して、100rpmで6時間振とうする。
10)1Mのヨウ化カリウムを含むPBS緩衝液において、4℃の温度で、シェーカーを使用して、100rpmで6時間振とうし、脱細胞化された骨ECM材料を得る(図1A)。
11)脱灰溶液を調製する(脱イオン水1750ml+EDTA-2Na 450g+NaOH 10g)。骨ブロックを取り出し、350kHz、4℃で、脱灰装置でそれぞれ4、8、12、24時間脱灰する。
12)残りの後続の操作は、実施例1の方法を参照して実行し、勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料を得る。
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Claims (9)
- 天然組織由来の骨組織に対して免疫原性の除去処理を行い、即ち脱細胞化を行い、得られた脱細胞化骨に対して勾配脱灰処理を行い、勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料を得ることを特徴とする勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法であって、
哺乳動物の全身の任意の骨組織からドリルで取り出された骨から更にメスで切り取られた円筒形の骨ブロック材料を、滅菌生理食塩水で2時間洗浄してから照射滅菌を行い、前記照射の照射量は5~40wであるステップ1と、
プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水ですすぎ、血液、脂肪組織及びその他の不純物を除去するステップ2であって、前記プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水において、プロテアーゼ阻害剤の濃度は10~50KIU/mlであり、脱イオン水での洗浄回数は2~6回で、毎回の洗浄時間は3~20分であるステップ2と、
骨ブロックを分けて包埋カセットに入れ、包埋カセットを、アセトンを含む脱イオン水溶液に入れ、1~4時間振とうするステップ3であって、前記アセトンを含む脱イオン水溶液において、アセトンの脱イオン水に対する体積割合は10~20%であるステップ3と、
包埋カセットを、リン酸トリブチルを含む脱イオン水溶液に入れ、1~4時間振とうするステップ4であって、前記リン酸トリブチルを含む脱イオン水溶液において、リン酸トリブチルの脱イオン水に対する体積割合は1%~5%であるステップ4と、
包埋カセットを、プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水溶液に入れ、4℃で、シェーカーにて24~48時間振とうした後、液体窒素で2~6サイクル凍結融解するステップ5であって、各サイクルは-80℃~37℃で、シェーカー速度は50~300rpmであるステップ5と、
包埋カセットをTriton X-100を含む緩衝液に入れ、恒温シェーカーにて24時間振とうし、前記Triton X-100の濃度は0.5~5%であるステップ6と、
SDSを含む緩衝液において、恒温シェーカーにて36時間振とうし、前記SDSの濃度は0.5~10%であるステップ7と、
塩化カリウムを0.1~1Mの濃度で含むPBS緩衝液において、4℃の温度で、シェーカーを使用して100rpmで2~12時間振とうするステップ8と、
ヨウ化カリウムを含むPBS緩衝液において、4℃の温度で、シェーカーを使用して100rpmで2~12時間振とうし、脱イオン水における前記ヨウ化カリウムの濃度は1~1.5Mであるステップ9と、
EDTA2NaとNaOHを含む緩衝液において、4℃~10℃の条件下で、それぞれ4、8、12、24時間の勾配脱灰処理を行い、100%、90%、60%、0%の鉱化の程度の骨ECM材料を取得するステップ10と、
得られた材料を再度照射滅菌するステップ11と、を含み、
ステップ3~ステップ10において、各ステップが完了した後、ステップ間はいずれも脱イオン水で6時間すすぐ、ことを特徴とする勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法。 - 前記プロテアーゼ阻害剤を含む脱イオン水において、プロテアーゼ阻害剤の濃度は20~40KIUであることを特徴とする請求項1に記載の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法。
- 前記アセトンを含む脱イオン水溶液において、アセトンの脱イオン水に対する体積割合は13%~18%であることを特徴とする請求項1に記載の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法。
- 前記リン酸トリブチルを含む脱イオン水溶液において、リン酸トリブチルの脱イオン水に対する体積割合は2%~5%であることを特徴とする請求項1に記載の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法。
- シェーカー速度は30~180rpmであることを特徴とする請求項1に記載の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法。
- 前記Triton X-100の濃度は0.5~3%であることを特徴とする請求項1に記載の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法。
- 前記SDSの濃度は0.5~5%であることを特徴とする請求項1に記載の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法。
- 脱イオン水における前記塩化カリウムの濃度は0.3~1Mであることを特徴とする請求項1に記載の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法。
- 脱イオン水における前記ヨウ化カリウムの濃度は1~1.4Mであることを特徴とする請求項1に記載の勾配鉱化された骨の細胞外マトリックス材料の調製方法。
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