CN103480036A - 一种多孔纳米复合骨组织工程支架材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学复合材料，具体涉及多孔纳米复合骨组织工程支架材料的制备方法。本发明方案包括以下步骤：将Nano-HA和PLLA材料在50～70℃下混合，超声波震荡，然后电磁搅拌至Nano-HA完全分散均匀得到凝胶；然后将凝胶转入-5～-3℃下进行低温成型并填入生物材料即得多孔纳米复合骨组织工程支架材料。本发明的方法将Nano-HA和PLLA复合制备三维多孔的Nano-HA/PLLA人工骨，该三维多孔的人工骨支架材料综合了Nano-HA和PLLA两者的优点，提高柔韧性和生物降解性，改善生物力学性能，更加有利于骨细胞的粘附生长和血管化，极大地提高骨缺损处移植人工骨的愈合速度及效果。

Description

一种多孔纳米复合骨组织工程支架材料的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学复合材料，具体涉及一种多孔纳米复合骨组织工程支架材料的制备方法。 

背景技术

骨组织工程的研究和发展为临床上骨缺损的修复和治疗提供了崭新的思路，并逐渐引起研究者的兴趣。其中，三维多孔支架材料是骨组织工程的重要基础，它不仅起支撑作用，保持原有组织的形状，而且还起到模板作用，为细胞提供赖以寄宿、生长、分化和增殖的场所，从而引导受损组织的再生和控制再生组织的结构。但目前骨组织工程支架的研究和应用仍面临着许多问题，如材料体内降解不可控，细胞繁殖效率低，降解产物引起炎性反应，细胞去分化等。尤其是在力学性能方面，单一的使用聚合物或陶瓷材料作为支架材料存在强度弱或脆性大的问题，都无法满足承力骨修复的要求。 

羟基磷灰石(Hydroxy-apatite,简称HA）是最常见的一种生物活性材料，它具有与人体骨组织相似的无机成分，是目前公认的具有较好生物相容性和骨传导性的生物活性陶瓷材料。但HA人工骨仍存在着力学性能差、不能承重、缺乏骨诱导活性、骨渗入深度有限、不能完全降解等较多缺点。目前已有纳米羟基磷灰石（Nano-HA）应用于临床骨缺损的修复。但因骨骼本身是一种具有很高韧性和硬度的天然纳米复合材 料，它主要由纳米级的片状羟基磷灰石结晶分散在骨胶原骨架中组成，而骨胶原和羟基磷灰石本身都不能作为结构材料，因此以Nano-HA作为单一成分的人工骨仍然不能满足理想人工骨的要求。 

聚乳酸(Polylactic acid,简称PLLA)是目前组织工程研究和应用最为广泛的一类材料，这类材料无毒，无抗原性，具有良好的可降解吸收性、生物安全性和力学强度，可以通过控制成份含量来调节材料的降解速度，使产品性质的重复性和力学性能达到较高水平。除了作为手术缝合线和药物缓释载体外，PLLA也用作医疗缝合补强材料、骨折内固定材料和组织工程材料。 

发明内容

本发明的目的是为了解决目前骨组织工程支架存在的缺陷，满足支架的性能要求，将Nano-HA与PLLA进行复合，提供一种新的多孔纳米复合骨组织工程支架材料的制备方法。 

本发明的方法创造性地使用低温快速成型的技术，将Nano-HA和PLLA复合制备三维多孔的Nano-HA/PLLA人工骨，该三维多孔的人工骨支架材料综合了Nano-HA和PLLA两者的优点，使其在良好骨传导性和生物相容性的基础上，提高柔韧性和生物降解性，改善生物力学性能，更加有利于骨细胞的粘附生长和血管化，极大地提高骨缺损处移植人工骨的愈合速度及效果，是一种理想的新型纳米复合人工骨材料。 

本发明的方案为： 

一种多孔纳米复合骨组织工程支架材料的制备方法，包括以下步 骤： 

将Nano-HA和PLLA材料在50～70℃下混合，超声波震荡，然后电磁搅拌至Nano-HA完全分散均匀得到凝胶；然后将凝胶转入-5～-3℃下进行低温成型并填入生物材料即得多孔纳米复合骨组织工程支架材料。 

另一优选方案，包括以下步骤： 

（1）将PLLA溶解于有机溶剂里，60℃水浴中搅拌形成PLLA/有机溶剂的均相溶液；将不同质量比的Nano-HA加入上述溶液中，超声波震荡各15min、电磁搅拌至Nano-HA完全分散均匀制得凝胶； 

（2）将凝胶转入低温冷冻快速成型仪中-4℃条件下进行低温快速成型,通过RIPF工艺成形具有一定间隔的平行的冰线，将配制好的生物材料填入冰线间的间隔，将填了生物材料后的表面刮平，使得冰线和生物材料交替排列；在正交方向成形下一层冰线，重复以上步骤； 

（3）成形后，将冰和生物材料构成的实体拿到冷藏室，冰融化后再将产品置于真空冷冻干燥机去除有机溶剂；风干后即得多孔纳米复合骨组织工程支架材料。 

另一优选方案，所述步骤（1）中有机溶剂是1,4-二氧六环。 

另一优选方案，所述Nano-HA通过如下方法制得： 

将硝酸钙与磷酸铵的水溶液进行化学合成，合成过程中，加入氨水调整溶液的pH值为8～13，添加分散剂，搅拌使其沉淀完全，然后经洗涤、过滤，将沉淀物在80～120℃干燥，再在600～800℃温度下烧结2～3小时，得到Nano-HA粉末。 

另一优选方案，所述PLLA通过如下方法制得： 

①丙交酯的制备：取乳酸与ZnO粉末，逐渐升温使乳酸脱水变为丙交酯；然后升温抽真空蒸出淡黄色丙交酯单体，再以乙酸乙酯为溶剂反复洗涤、重结晶提纯，抽滤，真空干燥，得纯净丙交酯单体； 

②PLLA的合成：纯净丙交酯单体，加入辛酸亚锡引发剂，常温下真空干燥一定时间后，在硅油浴中浸泡3～5min，密封反应瓶，升温至单体刚熔化时反复摇动反应瓶至混合均匀，聚合完成后取出反应瓶； 

③PLLA的纯化：粗制PLLA中加入二氯甲烷使其完全溶解，过滤，滤液中加入甲醇至沉淀完全，再过滤，甲醇洗涤，真空干燥，得到白色纯PLLA。 

本发明方法制备的多孔纳米复合骨组织工程支架材料，一方面可提高材料韧性，满足骨替换植入材料的机械强度要求，另一方面聚乳酸的酸性降解产物可被HA缓冲，同时HA的骨传导性可提供良好的骨细胞粘附生长环境，复合物的多孔结构则为细胞生长、组织再生及血管化提供条件，符合骨组织工程的生物学要求。 

由于Nano-HA或PLLA单独使用时都难以满足骨支架材料的需要，通过对两类材料进行复合，实现优势互补，得到强度韧性俱佳、具备良好生物相容性、骨传导性的理想的可降解骨支架材料：①羟基磷灰石材料具有相对较慢的生物降解率，与聚乳酸复合后可以通过改变两者在材料中的比例达到对生物降解率的控制，使之适应骨折的愈合速度，保持良好的力学性能；②羟基磷灰石在降解过程中释放出的Ca、P等离子重新循环于骨折局部的修复过程中，加速了骨折的愈合，与此同时也中和 聚乳酸材料降解过程中释放出来的酸性分解物，保持局部微环境的稳定，减少酸性产物导致的组织反应。③Nano-HA的微结构类似天然骨基质，骨与植入材料间成骨细胞作用显著，生物活性优于HA，易吸收；Nano-HA骨传导作用较强，其支架材料上成骨细胞内ALP的合成，细胞的分化、增殖、钙盐的沉积均较非纳米材料组活跃。④复合材料降解速度减慢，避免PLLA降解过快，在短期内释放大量酸性产物引起无菌性炎性反应。⑤复合材料中的PLLA降解时产生的乳酸对骨折愈合有抑制作用，HA在酸性环境中溶解度增加,可改变局部pH值,溶解释放的Ca²⁺、PO₃离子可能参与局部骨基质的钙化，对新骨的形成和骨结合有促进作用。 

具体实施方式

以下提供本发明优选的具体实施方式，以助于进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不仅限于这些实施例。 

本实施例多孔纳米复合骨组织工程支架材料的制备方法技术方案如下： 

1.采用溶胶-絮凝法合成Nano-HA。 

2.采用开环聚合法合成PLLA。 

3.采用低温快速成型技术合成多孔纳米复合支架材料。 

其中，所述Nano-HA的合成方法如下： 

将硝酸钙与磷酸铵的水溶液进行化学合成，合成过程中，加入一定量的氨水，调整溶液的pH值为8～13，添加分散剂，搅拌使其沉淀完全， 然后经洗涤、过滤，将沉淀物在80～120℃干燥，在600～800℃温度下烧结2～3小时，得到粉末粒径小于100nm、与人体骨组织成份相似的Nano-HA粉末。 

其中，所述PLLA的合成方法如下： 

①丙交酯的制备：取乳酸与ZnO粉末，逐渐升温使乳酸脱水变为丙交酯；然后升温抽真空蒸出淡黄色丙交酯单体，再以乙酸乙酯为溶剂反复洗涤、重结晶提纯，抽滤，真空干燥，得无色片状纯丙交酯晶体。 

②PLLA的合成：纯净丙交酯单体，加入辛酸亚锡引发剂，常温下真空干燥一定时间后，在硅油浴中浸泡3-5min，密封反应瓶，升温至单体刚熔化时反复摇动反应瓶至混合均匀，然后聚合完成后取出反应瓶。 

③PLLA的纯化：粗制PLLA中加入二氯甲烷使其完全溶解，过滤，滤液中加入甲醇至沉淀完全，再过滤，甲醇洗涤，真空干燥，得到白色纯PLLA。 

④PLLA分子量的测定：称取一定量的PLLA溶解于三氯甲烷中，用乌氏粘度法测定，计算相对粘均分子质量。 

其中，所述多孔纳米复合支架材料的合成方法如下： 

将不同质量比例的Nano-HA和块状PLLA材料共2g，使Nano-HA在复合材料中的比例分别为(0、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％)，采用低温快速成型技术制作成立方体状多孔支架材料。具体步骤如下： 

①将PLLA溶解于1,4-二氧六环，并于60℃水浴中搅拌配制 PLLA/1,4-二氧六环均相溶液；将不同质量比的Nano-HA加入上述溶液中，超声波震荡各15min、电磁搅拌12小时后至Nano-HA完全分散均匀制得凝胶。 

②成型后的凝胶转入低温冷冻快速成型仪中-4℃条件下进行低温快速成型,通过RIPF工艺成形具有一定间隔的平行的冰线，将配制好的生物材料填入冰线间的间隔，将填了生物材料后的表面刮平，使得冰线和生物材料交替排列。在正交方向成形下一层冰线，重复以上步骤。 

③成形后，将冰和生物材料构成的实体拿到冷藏室，冰融化剩下的空间即为骨组织支架所需的纵横交错、彼此连通的大孔。 

④得到的样品置于真空冷冻干燥机去除有机溶剂；风干2天后取出样品，有机溶剂升华后支架材料留下了大量更为微细的孔洞，表面喷金后经电镜扫描，并测量孔隙率。 

1、多孔纳米羟基磷灰石/聚乳酸（Nano-HA/PLLA）人工骨的生物力学测试，采用三点抗弯法在生物力学测试机上测定各个比例的多孔纳米羟基磷灰石/聚乳酸（Nano-HA/PLLA）人工骨材料的压缩强度、抗弯强度和弯曲模量见表1： 

表1多孔Nano-HA/PLLA人工骨力学性能比较

2、多孔纳米羟基磷灰石/聚乳酸（Nano-HA/PLLA）人工骨的扫描电镜观察，各个比例的Nano-HA/PLLA人工骨的扫描电镜结果（5000×）：多孔网状结构，孔内壁粗糙,孔间以微孔相通。其中按表1中各质量比所得的材料扫描电镜结果依次为：A：孔径1-2μm，孔隙率95%；B：孔径2-3μm，孔隙率94%；C：孔径3-5μm，孔隙率93%；D：孔径2-3μm，孔隙率92%；E：孔径1-3μm，孔隙率91%；F：孔径3-5μm，孔隙率89%；G：孔径2-3μm，孔隙率86%；H：孔径2-3μm，孔隙率83%。 

3、多孔纳米羟基磷灰石/聚乳酸（Nano-HA/PLLA）人工骨的生物降解性实验 

以磷酸盐缓冲液(PBS)作降解介质，研究了PLLA和Nano-HA/PLLA人工骨材料在PBS的降解过程中发生的吸水率、失重率、PBS的pH值的变化以及材料的力学性能变化。 

PLLA和Nano-HA/PLLA材料的吸水率和失重率均随着降解时间的延长逐渐变大；同一时期，浸有Nano-HA/PLLA材料的PBS溶液pH值要比浸有PLLA材料的PBS溶液pH值高。随着降解时间的延长，PLLA和Nano-HA/PLLA材料的力学强度均逐渐降低，Nano-HA/PLLA材料的降解速度比PLLA材料要慢，在降解14周之前，Nano-HA/PLLA材料降解很小，力学强度损失也较小，能保持较高的力学强度，为新生骨组织提供良好 的支撑作用。 

4、多孔纳米羟基磷灰石/聚乳酸（Nano-HA/PLLA）人工骨的细胞相容性 

4.1细胞增殖度测定 

将兔骨髓间充质干细胞（rBMSCs）与Nano-HA/PLLA人工骨材料浸提液共培养，测定rBMSCs的增殖能力。结果提示Nano-HA/PLLA人工骨材料浸提液对rBMSCs细胞增殖无明显影响。 

表2各组细胞培养不同时间点吸光度值、相对增殖度及毒性分级(n=6) 

4.2细胞形态及生长状况 

根据细胞形态学标准，Nano-HA/PLLA人工骨材料无细胞毒性，具有很好的细胞相容性。 

4.2.1材料浸提液与细胞共培养结果：3d后细胞突充分伸展，呈多角形（200×）；5d后细胞间隙减少，细胞呈多角形，梭形（200×）；7d后细胞间隙进一步减少，相互接触，细胞呈多角形，梭形（200×）。 

4.2.2材料与细胞共培养结果，倒置显微镜下观察（100×）：随着培养时间增加，支架材料周围细胞正常分裂增长，并规则排列。 

4.2.3材料与细胞共培养1、3、5天后，扫描电镜检测结果：1天 （1000×）；3天（2000×）；3天（5000×）；5天（1000×），随着培养时间增加，支架材料上附着细胞逐渐增多，并可见孔隙内细胞突触，5天后材料表面已完全被细胞覆盖。 

本发明所述制备的多孔纳米复合支架材料是通过低温快速成型技术制备的一种新型的复合人工骨支架材料，经对其进一步的生物力学测试，生物降解性能测试，生物相容性研究可得出这是一种具有良好性能的新型多孔纳米复合骨组织工程支架材料。 

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (5)

1.一种多孔纳米复合骨组织工程支架材料的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

将Nano-HA和PLLA材料在50～70℃下混合，超声波震荡，然后电磁搅拌至Nano-HA完全分散均匀得到凝胶；然后将凝胶转入-5～-3℃下进行低温成型并填入生物材料即得多孔纳米复合骨组织工程支架材料。

2.根据权利要求1所述多孔纳米复合骨组织工程支架材料的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）将PLLA溶解于有机溶剂里，60℃水浴中搅拌形成PLLA/有机溶剂的均相溶液；将不同质量比的Nano-HA加入上述溶液中，超声波震荡各15min、电磁搅拌至Nano-HA完全分散均匀制得凝胶；

（2）将凝胶转入低温冷冻快速成型仪中-4℃条件下进行低温快速成型,通过RIPF工艺成形具有一定间隔的平行的冰线，将配制好的生物材料填入冰线间的间隔，将填了生物材料后的表面刮平，使得冰线和生物材料交替排列；在正交方向成形下一层冰线，重复以上步骤；

（3）成形后，将冰和生物材料构成的实体拿到冷藏室，冰融化后再将产品置于真空冷冻干燥机去除有机溶剂；风干后即得多孔纳米复合骨组织工程支架材料。

3.根据权利要求2所述多孔纳米复合骨组织工程支架材料的制备方法，其特征是，所述步骤（1）中有机溶剂是1,4-二氧六环。

4.根据权利要求1、2或者3所述多孔纳米复合骨组织工程支架材料的制备方法，其特征是，所述Nano-HA通过如下方法制得：

将硝酸钙与磷酸铵的水溶液进行化学合成，合成过程中，加入氨水调整溶液的pH值为8～13，添加分散剂，搅拌使其沉淀完全，然后经洗涤、过滤，将沉淀物在80～120℃干燥，再在600～800℃温度下烧结2～3小时，得到Nano-HA粉末。

5.根据权利要求1、2或者3所述多孔纳米复合骨组织工程支架材料的制备方法，其特征是，所述PLLA通过如下方法制得：

①丙交酯的制备：取乳酸与ZnO粉末，逐渐升温使乳酸脱水变为丙交酯；然后升温抽真空蒸出淡黄色丙交酯单体，再以乙酸乙酯为溶剂反复洗涤、重结晶提纯，抽滤，真空干燥，得纯净丙交酯单体；

②PLLA的合成：纯净丙交酯单体，加入辛酸亚锡引发剂，常温下真空干燥一定时间后，在硅油浴中浸泡3～5min，密封反应瓶，升温至单体刚熔化时反复摇动反应瓶至混合均匀，聚合完成后取出反应瓶；

③PLLA的纯化：粗制PLLA中加入二氯甲烷使其完全溶解，过滤，滤液中加入甲醇至沉淀完全，再过滤，甲醇洗涤，真空干燥，得到白色纯PLLA。