CN109221031A - 一种适宜药用僵蚕生产的接种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种适宜药用僵蚕生产的接种方法，它包括如下步骤：a、前期养殖：以桑叶为食料，通过人工饲养鳞翅目经济昆虫家蚕Bombyx mori Linnaeus；定时给桑，每日给桑3～4次；加网除沙；眠前处理；b、接种：用含0.05％吐温80无菌水(23～28℃)配制白僵菌工作液(1×106～1×108个/mm2)，接种。本发明药用僵蚕生产的接种方法，家蚕僵死重大，活蚕数少，且产量高，且易于标准化操作，适合工业化大生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种适宜药用僵蚕生产的接种方法，属于动物药养殖领域。
背景技术
僵蚕来源于蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori Linnaeus 4～5龄的幼虫感染白僵菌Beauveria assiana(Bals.)Vuillant而致死的干燥体，是常用大宗中药材之一，主要用于治疗用于肝风夹痰，惊痫抽搐，小儿急惊，破伤风等疾病。传统医用僵蚕来源于丝茧养殖过程中少量家蚕感染白僵菌产生的副产物，但对于蚕茧生产，白僵病又是主要防治对象，导致僵蚕产量受限，难于满足中药材市场对僵蚕需求，实行人工规模化生产是解决僵蚕来源的有效办法，而接种技术是生产僵蚕的关键之一。
杨琼，等，药用白僵蚕的人工培养研究，广东蚕业44(4)：34-38公开了白僵蚕的人工培养方法，对菌种筛选、最佳接种剂量、适宜蚕品种等研究，当其接种浓度控制在105个/mL～106个/mL时，蚕体发病集中，在2d内基本达到90％以上发病死亡。申请号：201710507501.2，发明名称：一种规模化养殖僵蚕的施菌方法，公开了一种规模化养殖僵蚕的施菌方法，包括以下步骤，接种准备：将健康的蚕饲养在养殖房内，养殖房的墙壁和顶棚中均要设置隔热层，在给健康的蚕接种白僵菌前将养殖房密封；加湿施菌：将白僵菌粉与25-30℃的纯净水混合均匀加入振动补湿机中，通过振动补湿机向养殖房内释放含有白僵菌的水雾；接种环境控制：通过振动补湿机将养殖房内的湿度调整在75-90％，通过电加热器将养殖房内的温度调整在24-26℃，持续15-25分钟关闭振动补湿机和电加热器；接种后通风：振动补湿机和电加热器关闭后，打开养殖房的通风装置对养殖房内通风，使养殖房内的湿度和温度快速恢复到接种准备前的状态，最后对蚕给叶供食正常饲养。申请号：201510431732.0，发明名称：一种僵蚕的培养方法，公开了一种僵蚕的培养方法，包括下列步骤：a、制备孢子混悬液：取白僵菌孢子，制备孢子混悬液；b、侵染：饲养幼蚕，在幼蚕第四次休眠苏醒后12～24h，喷洒接种步骤a所得孢子混悬液，置于温度为23～25℃、湿度为95％以上的条件下饲养，4h之后重复喷洒接种一次；c、继续饲养：将步骤b经侵染后的幼蚕置于温度为23～25℃、湿度大于95％的条件下饲养48h，再在自然环境中饲养至家蚕成熟，收获，干燥处理，即得。申请号：201410421851.3，发明名称：一种改进的白僵蚕高效培养方法，公开了一种改进的僵蚕高效培养方法，该方法包括以下步骤：饲养家蚕，在四龄眠蚕蜕皮后的0-2h内，往家蚕体表喷洒白僵菌孢子悬液，5-6天后家蚕发病死亡，拣出死蚕进一步僵化，最后晒干或烘干后获得僵蚕。
目前报道的僵蚕接种方法，多凭技术员经验，接种方式多样，家蚕处理随机，接种时间不一，接种后温湿度不加控制，导致家蚕接种效果不理想，家蚕僵死时间不齐，产量较低，品质不稳定，不利于标准化生产，影响药农创收及安全用药。
发明内容
本发明的技术方案是提供了一种适宜药用僵蚕生产的接种方法。
本发明提供了一种适宜药用僵蚕生产的接种方法，它包括如下步骤：
a、前期养殖：以桑叶为食料，通过人工饲养鳞翅目经济昆虫家蚕Bombyx moriLinnaeus；定时给桑，每日给桑3～4次；加网除沙；眠前处理；
b、接种：
用含0.05％吐温80无菌水(23～28℃)配制白僵菌工作液(1×106～1×108个/mm2)，接种。
其中，b步骤所述的接种前饲喂桑叶1次，待食尽后接种。进一步地，所述的饲喂量为：每10g蚁的五龄蚕给桑量40kg。
其中，b步骤所述的接种前不饲喂，起蚕后8小时内接种。
其中，所述的接种时间为0-6小时。
其中，b步骤所述的接种方式为喷雾接种、浸润接种、饲喂接种。
其中，所述的接种方式为：喷雾接种。
其中，所述的接种次数是3次。
其中，a步骤所述的养殖温度26±2℃，湿度70±5％RH。
本发明一种适宜药用僵蚕生产的接种方法，采用喷雾接种法，不影响家蚕接种，且易于标准化操作，适合工业化大生产；本发明针对生产中滚动式养蚕，起蚕不一，无法及时完成接种的情况，通过不同接种时间优选，保证不同批家蚕接种成功率，同时设置接种前饲喂处理，不仅有效保证家蚕僵死率，增加产量，同时所得僵蚕药材符合现行药典规定，质量可靠。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1接种前饲喂次数对僵蚕重量的影响
具体实施方式
实施例1僵蚕接种前饲喂方法
1、实验材料
蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori Linnaeus 5龄的幼虫，白僵菌Beauveria assiana(Bals.)Vuillant，吐温-80。
2、试验设计
用含0.05％吐温80无菌水(23～28℃)配制白僵菌原液，采用血球计数板测定孢子浓度，将白僵菌原液稀释成1×108个/mm2。设置4个饲喂次数，接种前饲喂0次，饲喂1次，饲喂2次，饲喂3次，每组3个重复，共计12个处理区。饲喂温度26±2℃，湿度70±5％RH，光照/黑暗(10：14)环境，给桑量以充分饱食为度。
3、结果与分析
3.1接种前饲喂对家蚕生长指标的影响
饲喂次数增加,僵死时间延长，僵蚕增重倍数越小,产量较低。由图1和表1可知，接种前饲喂次数增加，家蚕鲜重增长越大,可能是饲喂增大接种前家蚕鲜重,导致家蚕抵抗力增加,接种效果减弱,仅抵抗力较差的家蚕感染白僵病,因此产量较低。
表1接种前饲喂次数对僵蚕生长指标的影响
注：同一列不同小写字母表示p<0.05差异显著
3.2接种前饲喂对僵蚕接种效果的影响
由表2可知，饲喂次数增加，家蚕僵死率降低，所余活蚕增加，病死家蚕减少，表明饲喂不利于家蚕接种。由3.1可知，饲喂增强家蚕抵抗力，减少家蚕因接种带来的疾病，因此需要综合考虑僵蚕产量和接种效果。饲喂1次后接种，家蚕僵死率超过90％，家蚕僵死重较大，活蚕数较少，且产量较高，因此接种前可饲喂家蚕1次。
表2接种前饲喂次数对接种效果的影响
注：同一列不同小写字母表示p<0.05差异显著
3.3接种前饲喂对僵蚕质量的影响
由表3可知，饲喂次数增加，僵蚕浸出物呈上升趋势，可能是家蚕抵抗力增强，导致内部物质积累增加。白僵菌素亦呈上升趋势，可能是因为家蚕发育为白僵菌生殖生长提供足够营养，次生代谢产物升高。因此家蚕接种白僵菌有两种选择，第一，五龄家蚕起蚕后不饲喂，直接完成接种；第二，五龄家蚕起蚕后饲喂1次桑叶再完成接种。
表3接种前饲喂次数对僵蚕质量的影响
注：同一列不同小写字母表示p<0.05差异显著
实施例2僵蚕接种方法
1、实验材料
蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori Linnaeus 5龄的幼虫，白僵菌Beauveria assiana(Bals.)Vuillant，吐温-80。
2、试验设计
2.1接种方式筛选
选取健康的五龄家蚕幼虫进行接种。用含0.05％吐温80无菌水(23～28℃)配制白僵菌原液，采用血球计数板测定孢子浓度，将白僵菌原液稀释成1×108个/mm2。设置空白组和实验组，空白组不接种，实验组采用3种接种方式，方式1(浸润)、方式2(喷雾)、方式3(饲喂)，每组3个重复，共计12个处理区。接种后环境温度24～26℃，湿度90±5％RH，控制1小时后给桑量，以充分饱食为度。养殖温度26±2℃，湿度70±5％RH，操作详情见表4。
表4实验及接种操作详情
2.2接种次数筛选
选取健康的五龄家蚕幼虫进行接种，设置空白组和实验组，空白组接种含0.05％吐温80无菌水，实验组接种等量白僵菌工作液，设置4个接种次数，接种1次、接种2次、接种3次、接种4次，每组3个重复，共计15个处理区。接种后环境温度24～26℃，湿度90±5％RH，控制1小时后给桑量，以充分饱食为度。养殖温度26±2℃，湿度70±5％RH。
3、结果与分析
3.1接种方式筛选结果
表5接种方式对接种效果的影响
注：同列与浸染组比较*p<0.05
表6接种方式对僵蚕产量的影响
注：同列与浸染组比较*p<0.05，“-”表示未测得数据
表7接种方式对药材质量的影响
注：同列与浸染组比较*p<0.05，“-”表示未测得数据
由表5～6可知，空白组僵死率为2.75％，病死率为0.51％，活蚕率为95.41％，增长倍数最大为3.8，表明家蚕生长良好，环境无白僵菌等致病菌感染。
从僵死效果出发，浸染组和喷雾组僵死率均高于90％，但浸染组显著高于喷雾组和饲喂组，病死率差异不显著，表明浸染组接种效果更好，但浸染组不宜于工业大生产，操作繁琐。从产量出发，浸染组和喷雾组显著高于饲喂组。由表7可知，各接种方式所得僵蚕药材均达到《中国药典》2015年版规定的标准，但浸染组浸出物、白僵菌素含量显著低于喷雾组和饲喂组，浸染接种导致家蚕早期僵死，内含物质积累不高。考虑到规模化生产，接种方式采用喷雾接种。
3.2接种次数筛选结果
根据3.1试验结果，选择喷雾接种开展接种次数筛选。由表8可知，空白组僵死率为2.25％，病死率为1.89％，增长倍数最大为3.74，表明此家蚕生长良好，环境无白僵菌等致病菌感染。从生长状况出发，与喷雾1次对比，仅喷雾4次增长较慢，表明喷雾均匀度对家蚕生长有影响。从僵死效果出发，喷雾次数越多，僵死率越高，喷雾1次与4次相差12.11％，表明喷雾均匀度对家蚕接种效果影响显著。综合考虑接种效果和产量，同时生产中可操作性，喷雾次数选择3次。
表8喷雾次数对接种效果的影响
注：同列与喷雾1次比较*p<0.05，“-”表示未测得数据
表9喷雾次数对僵蚕产量的影响
注：同列与喷雾1次比较*p<0.05，“-”表示未测得数据
实施例3僵蚕接种时间选择方法
1、实验材料
蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori Linnaeus 5龄的幼虫，白僵菌Beauveria assiana(Bals.)Vuillant，吐温-80。
2、试验设计
根据实施例1结果，由于家蚕饲喂1次所用时间不同，实际生产中不易控制，因此选择接种前不饲喂进行试验。
2.1接种时间初探
用含0.05％吐温80无菌水(23～28℃)配制白僵菌原液，采用血球计数板测定孢子浓度，将白僵菌原液稀释成1×108个/mm2。分别于起蚕第0h，第2h，第4h，第6h接种白僵菌工作液，每组3个重复，共计12个处理区。饲喂温度26±2℃，湿度70±5％RH，光照/黑暗(10：14)环境，给桑量以充分饱食为度。
2.2接种时间优化
用含0.05％吐温80无菌水(23～28℃)配制白僵菌原液，采用血球计数板测定孢子浓度，将白僵菌原液稀释成1×108个/mm2。分别于起蚕第0h，第8h，第16h，第24h、第32h接种白僵菌工作液，每组3个重复，共计15个处理区。饲喂温度26±2℃，湿度70±5％RH，光照/黑暗(10：14)环境，给桑量以充分饱食为度。
3、结果与分析
3.1接种时间初探试验结果
由表10和表11可知，五龄起蚕后，家蚕体壁较薄，容易感染，考察接种时间对家蚕接种效果的影响。从生长状况出发，0～6h相隔2小时接种，其鲜重、增重倍数、僵死重、产量差异不显著，表明该时间段内接种时间对家蚕生长无显著影响。僵死效果显示，接种时间延后，其僵死率均超过90％，表明该时间段内接种成功率较高，但活蚕率和病死率差异显著，时间2活蚕率较高、病死率较低，其综合低于5％，可能是家蚕自身差异引起，对家蚕生长影响不显著。综合考虑，0～6h相隔2h接种，家蚕生长和僵蚕产量差异不显著，因此五龄起蚕后需要在0～6h完成接种。
表10接种时间对僵蚕生长指标的影响
注：同一列不同小写字母表示p<0.05差异显著
表11接种时间对接种效果的影响
注：同一列不同小写字母表示p<0.05差异显著
3.2接种时间优化试验结果
由表12和表13可知，从生长状况出发，随着接种时间延后，家蚕鲜重、增重倍数、僵死重、产量显著降低，尤其时间5接种，产量只有0.68kg·m-2，表明接种时间延后不利于家蚕生长，且导致僵蚕生产产量降低。僵死效果显示，接种时间延后，其病死家蚕显著升高，僵死家蚕显著减少，表明接种时间会影响接种效果。综合考虑，接种时间延后影响家蚕生长状况，使家蚕抵抗力降低，导致其它病菌致死家蚕，同时不利于白僵菌接种成功，因此选择五龄起蚕0～8h完成接种。
表12接种时间对僵蚕生长指标的影响
注：同一列不同小写字母表示p<0.05差异显著
表13接种时间对接种效果的影响
注：同一列不同小写字母表示p<0.05差异显著
试验例4一种适宜药用僵蚕生产的环境控制方法
1、实验材料
蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori Linnaeus 5龄的幼虫。
实验方法
2.1接种方法
用含0.05％吐温80无菌水(23～28℃)配制白僵菌原液，采用血球计数板测定孢子浓度。将白僵菌原液稀释成1×107个/mm2。选取食桑旺盛五龄家蚕，接种白僵菌工作液，喷施3次，以蚕体见露珠为度。保持温度25±2℃，湿度90±5％RH，控制2小时后饲喂桑叶。
2.2养殖环境控制实验设计
本实验选取4个养殖条件，高湿环境、控温控湿环境、自然环境(24～30℃，55％～85％RH)、高温环境，具体信息如下：
表14养殖环境控制方法
实验结果与分析
3.1实验结果与分析
采用IBM SPSS Statistics V21软件对生长指标进行分析，结果见表15。
表15不同养殖条件对僵蚕生长指标的影响
注：同一列不同小写字母表示p<0.05差异显著
表16不同养殖条件对僵蚕质量指标的影响
注：同一列不同小写字母表示p<0.05差异显著
家蚕接种白僵菌后，其养殖条件对僵蚕生产非常重要。由表可知，相比于自然环境的粗放养殖条件，选择对温度和湿度进行控制，家蚕僵死率、四丝腺环得率显著提高，病死率、患病僵蚕率、产量显著降低，表明控温和控湿环境下所得僵蚕质量较好。家蚕初鲜重差异不显著，增重倍数顺序为自然环境>高湿环境＝控温控湿>高温环境，但高温环境产量最低为0，其次为控温控湿环境。可能是高温环境抑制白僵菌繁殖，使家蚕无法僵化，导致家蚕死后黑化腐烂；饲喂管理存在差异，导致高湿环境和控温控湿环境产量存在差异；自然环境下白僵菌生长周期延长，家蚕的食桑量增加，导致产量较高。综合产量和质量考虑，养殖条件选择控温控湿环境。
Claims (8)
1.一种适宜药用僵蚕生产的接种方法，它包括如下步骤：
a、前期养殖：以桑叶为食料，通过人工饲养鳞翅目经济昆虫家蚕Bombyx moriLinnaeus；定时给桑，每日给桑3～4次；加网除沙；眠前处理；
b、接种：
用含0.05％吐温80无菌水(23～28℃)配制白僵菌工作液(1×106～1×108个/mm2)，接种。
2.根据权利要求1所述的接种方法，其特征在于：b步骤所述的接种前饲喂桑叶1次，待食尽后接种。
3.根据权利要求2所述的接种方法，其特征在于：所述的饲喂量为：每10g蚁的五龄蚕给桑量40kg。
4.根据权利要求1所述的接种方法，其特征在于：b步骤所述的接种前不饲喂，起蚕后8小时内接种。
5.根据权利要求4所述的接种方法，其特征在于：所述的接种时间为0-6小时。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的接种方法，其特征在于：b步骤所述的接种方式为喷雾接种、浸润接种、饲喂接种。
7.根据权利要求6所述的接种方法，其特征在于：所述的接种方式为：喷雾接种。
8.根据权利要求6或7所述的接种方法，其特征在于：所述的接种次数是3次。
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