CN106178098A - 一种细胞膜片及其制备方法与应用 - Google Patents

一种细胞膜片及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可用软组织修复的细胞膜片，其由定向静电纺丝纤维膜和经生物活性玻璃离子产物活化的成纤维细胞及内皮细胞组成。本发明还公开了该细胞膜片的制备方法及应用，此方法制备的细胞膜片中细胞能分泌更多的成血管生长因子和蛋白以及细胞外基质蛋白。此细胞膜片可应用于创面以及心肌等软组织修复，能够加速创面部位的胶原蛋白合成和血管再生，从而对组织修复有促进作用。

Description

一种细胞膜片及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物材料、组织工程和再生医学领域，具体涉及一种细胞膜片及其制备方法与应用。
背景技术
皮肤创伤是临床高发疾病，可以分为急性创伤或者慢性创伤。人体对于创面有一定的自我修复能力，但是当创面面积过大或者创面局部环境紊乱例如血管被破坏，血供不足时，创面便无法正常修复，甚至造成长期难以愈合、反复发作的创口。
已有广泛的文献报道了组织工程中运用人自身的细胞来修复人体组织的研究进展，利用细胞来进行组织修复已经取得了一些成果，这是利用外加细胞自身参与到修复过程中，利用其生长因子和蛋白等来进行组织的修复，但是其修复能力有限，且需要合适的支架材料作为细胞载体。
定向静电纺丝纤维膜具有与细胞外基质相似的结构和尺寸，在组织再生及修复领域有广泛的应用。定向静电纺丝纤维膜被证实能够影响细胞的定向排列及生长，但是仅作为支架材料而未涉及生物活性成份，其组织再生修复能力有限。此外，在皮肤创面修复领域，其常被用作保护创面的敷料，并不具备生物活性或修复能力。
生物活性玻璃是一种硅基无机材料，在组织修复领域获得了很多应用。生物活性玻璃被证明可以促进体内外血管化，临床上也出现了基于生物活性玻璃粉末的创面修复产品。但是由于它粉末的性质，很难固定在创面位置，且其产生的局部碱性化学环境，会造成病人的不适。
发明内容
鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种具有良好再生修复能力的细胞膜片及其制备方法与应用，其具体技术方案如下：
本发明提供了一种细胞膜片，所述细胞膜片由定向静电纺丝纤维膜和经生物活性玻璃离子产物活化的成纤维细胞及内皮细胞组成。
进一步地，所述定向静电纺丝纤维膜由聚己内酯/外消旋聚乳酸(PCL/PDLLA)组成。
进一步地，所述定向静电纺丝纤维膜的纳米纤维尺寸与细胞外基质相似。
进一步地，所述生物活性玻璃含有CaO、P2O5和SiO2，所述生物活性玻璃的浸提液含有Ca、P和Si离子。
本发明还提供了上述细胞膜片在制备创面保护辅料中的应用，及其在制备心肌修复材料中的应用。
本发明还提供了上述细胞膜片的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、利用高速旋转滚筒收集聚己内酯/外消旋聚乳酸(PCL/PDLLA)电纺丝得到定向静电纺丝纤维膜；
步骤2、将生物活性玻璃粉体分别加入无血清成纤维细胞培养液和无血清内皮细胞培养液中培养，无菌过滤收集生物活性玻璃浸提液，分别用所述无血清成纤维细胞培养液和所述无血清内皮细胞培养液等比例稀释后以1：1体积比混合，得到稀释的生物活性玻璃浸提液；
步骤3、将所述定向静电纺丝纤维膜裁剪成适宜大小，灭菌处理后置于培养板，加入成纤维细胞悬浮液，用所述稀释的生物活性玻璃浸提液培养1d，移除培养液，加入脐静脉内皮细胞悬浮液，用所述稀释的生物活性玻璃浸提液培养3d，移除培养液；
步骤4、取出所述定向静电纺丝纤维膜，制备得到由所述定向静电纺丝纤维膜和经生物活性玻璃离子产物活化的成纤维细胞及内皮细胞组成的所述细胞膜片。
进一步地，所述高速旋转滚筒的转速为2000r/min。
进一步地，所述稀释的生物活性玻璃浸提液中的主要离子浓度如下：Ca：65.05±0.35μg/ml，P：28.55±0.22μg/ml，Si：1.01±0.07μg/ml。
进一步地，每平方厘米所述定向静电纺丝纤维膜上加入的成纤维细胞和脐静脉内皮细胞的数量分别为3x 104-4x 104和4x 104-5x 104。
本发明的有益效果在于：
本发明不需额外使用特殊培养皿或技术手段，利用定向静电纺丝纤维膜通过一般培养方法制备得到微结构和生物材料活化的细胞膜片，该膜片具有很高的生物活性，能够分泌成血管相关的生长因子和蛋白如血管内皮生长因子(VEGF)，血管内皮生长因子受体(KDR)，内皮型一氧化氮合酶(eNOS)以及一系列细胞外基质蛋白如胶原蛋白(Collagen)、弹性蛋白(Elastin)、纤连蛋白(Fibronectin)来促进创面修复。在实际运用中，利用该膜片能够促进动物全切创面处胶原蛋白沉积和血管再生，并且能促进创面收缩，明显地提高创面修复速度，其对慢性创伤的修复尤其具有良好的修复效果。
以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。
附图说明
图1示出了本发明的一个较佳实施例的创面修复效果；
图2示出了本发明的一个较佳实施例的创面收缩率结果；
图3示出了本发明的一个较佳实施例的修复过程中血管再生情况；
图4.示出了本发明的一个较佳实施例的胶原蛋白I在创面位置沉积情况。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制发明的范围。
实施例1
1.制备定向静电纺丝纤维膜，将质量比为1:1的PCL和PDLLA以4.8％的质量体积比溶解于体积比为4：1的DMF和THF中，利用静电纺丝设备以10kv电压、0.02ml/min流量和12cm接收距离的条件进行电纺丝，以2000r/min旋转的高速滚筒接收得到定向静电纺丝纤维膜。
2.制备生物活性玻璃浸提液，分别将1g生物活性玻璃粉体加入5ml无血清成纤维细胞培养液及5ml无血清内皮细胞培养液，培养24h后无菌过滤收集，并分别用成纤维细胞培养液及内皮细胞培养液以1/128比例稀释，将稀释后浸提液以1：1体积比混合；
3.定向静电纺丝纤维膜剪裁成2.5cm x 2.5cm大小，并于75％酒精中浸泡30分钟进行灭菌处理，灭菌并洗净的定向静电纺丝纤维膜置于培养板并加入2x 105个成纤维细胞悬浮液，用稀释的生物活性玻璃浸提液培养24小时，然后移除培养液并加入3x 105个脐静脉内皮细胞悬浮液，用稀释的生物活性玻璃浸提液培养3天，移除培养液，取出电纺膜，制备得到由微结构和生物材料活化的细胞膜片待用；
4.在裸鼠背部制造两个直径1cm的创面，将制备的细胞膜片施加到创面，并设置空白组和施加0.1g rhEGF凝胶的阳性对照；
5.裸鼠静脉注射Depomedrol(20mg/kg BW)延缓创面愈合，2d、7d、14d后处死裸鼠，收集创面样本做切片分析。
实施例2
根据实施例1所示的方法，对不同时间点裸鼠背部的创面直径进行测量，通过公式：创面收缩％＝100×(初始创面面积—目前创面面积)/初始创面面积，对创面收缩率进行统计，结果示于图2。
实施例3
根据实施例1所示的方法，对收集的创面样本进行CD31免疫组织化学染色，观察到由微结构和生物材料活化的细胞膜片修复的创面有大量的血管再生，结果示于图3a。图3b示出了其定量统计结果。
实施例4
根据实施例1所示的方法，对收集的创面样本进行Collagen I免疫组织化学染色，观察到由微结构和生物材料活化的细胞膜片修复的创面有大量的胶原蛋白沉积，结果示于图4。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种细胞膜片，其特征在于，所述细胞膜片由定向静电纺丝纤维膜和经生物活性玻璃离子产物活化的成纤维细胞及内皮细胞组成。
2.根据权利要求1所述的细胞膜片，其特征在于，所述定向静电纺丝纤维膜由聚己内酯/外消旋聚乳酸(PCL/PDLLA)组成。
3.根据权利要求1所述的细胞膜片，其特征在于，所述定向静电纺丝纤维膜的纳米纤维尺寸与细胞外基质相似。
4.根据权利要求1所述的细胞膜片，其特征在于，所述生物活性玻璃含有CaO、P2O5和SiO2，所述生物活性玻璃的浸提液含有Ca、P和Si离子。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的细胞膜片在制备创面保护辅料中的应用。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的细胞膜片在制备心肌修复材料中的应用。
7.根据权利要求1所述的细胞膜片的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
步骤1、利用高速旋转滚筒收集聚己内酯/外消旋聚乳酸(PCL/PDLLA)电纺丝得到定向静电纺丝纤维膜；
步骤2、将生物活性玻璃粉体分别加入无血清成纤维细胞培养液和无血清内皮细胞培养液中培养，无菌过滤收集生物活性玻璃浸提液，分别用所述无血清成纤维细胞培养液和所述无血清内皮细胞培养液等比例稀释后以1：1体积比混合，得到稀释的生物活性玻璃浸提液；
步骤3、将所述定向静电纺丝纤维膜裁剪成适宜大小，灭菌处理后置于培养板，加入成纤维细胞悬浮液，用所述稀释的生物活性玻璃浸提液培养1d，移除培养液，加入脐静脉内皮细胞悬浮液，用所述稀释的生物活性玻璃浸提液培养3d，移除培养液；
步骤4、取出所述定向静电纺丝纤维膜，制备得到由所述定向静电纺丝纤维膜和经生物活性玻璃离子产物活化的成纤维细胞及内皮细胞组成的所述细胞膜片。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述高速旋转滚筒的转速为2000r/min。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述稀释的生物活性玻璃浸提液中的主要离子浓度如下：Ca：65.05±0.35μg/ml，P：28.55±0.22μg/ml，Si：1.01±0.07μg/ml。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，每平方厘米所述定向静电纺丝纤维膜上加入的成纤维细胞和脐静脉内皮细胞的数量分别为3x 104-4x104和4x 104-5x 104。
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