JPH05500516A - 効能ある組織治療のための選択された量の血小板から放出された物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 効能ある組織治療のための選択された量の血小板から放出された物［技術分野］ 本発明は、効能ある組織治療のための血小板から放出される物の量選択に関する 。

［背景技術］ 組織修復又は”創傷治癒”は、静止した結合組織及び表面細胞を迅速に分裂し、 迅速に動く細胞へと変える、多くの細胞的並びに生化学的反応を含む。この変化 は、走化性（細胞の運動）、有糸分裂（細胞分裂）、及びタンパク質合成の増加 を含む。表面細胞、繊維芽細胞、及び毛管内皮細胞が新組織の形成に関与する。

表面細胞は組織修復の部位に移動して分裂し、新しい皮膚（上皮）を形成し；繊 維芽細胞は移動して分裂し、修復部位（肉芽部位）を満たすマトリックスを生産 し：毛管内皮細胞は移動して分裂し、繊維芽／コラーゲンマトリックスを脈管再 生する新しい毛管を生産する。

細胞の移動及び分裂は、いくつかの生化学的作因に制御されている。これらの部 分的に作用する作因が、各種細胞に作用してその移動及び分裂を指示する。

これらの各生化学的作因は、（１）走化的（即ち、化学誘引剤）で、ある種の細 胞の移動（走化性）を引き起こす；　（２）分裂促進的（即ち、マイトジェン） で、ある種の細胞の分裂（有糸分裂）を引き起こす：及び／又は（３）血管形成 促進的（即ち、血管形成誘導因子）で、新しい毛管の形成（毛管上皮細胞の移動 及び分裂）を引き起こす、生化学的作因の走化的、分裂促進的又は血管形成促進 的性質は、一般に走化性、分裂促進性及び血管形成促進性を試験する各種の公知 アッセイによって決定される。これらのアッセイのいくつかについては以下に記 載する。同じ特徴を目的とするが、各性質の存在をより明瞭に定義又は測定する ことのできる、他のアッセイ法の開発が将来期待される。

血小板由来増殖因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａ ｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）は、繊維芽細胞、平滑筋細胞及びダリア細胞に対する有糸 分裂及び化学誘引的活性を有する、よく性質を知られた３０，０００ダルトンの 二量体糖タンパク質である。ＰＤＧＦの存在下に、繊維芽細胞は修復を必要とす る組織の領域に移動し、創傷部位自体において分裂するように刺激される。低濃 度のＰＤＧＦ　（約０．５５−１ｎ／ｍｌ）にさらされた細胞は移動するように 刺激され、高濃度のＰＤＧＦを有する環境に移動したときに、分裂するように刺 激される。

新派管形成又は毛管形成促進（新宅管形成）の過程は、毛管形成促進因子によっ て刺激される。血小板から回収される毛管形成促進因子（ＰＤＡＦ）は、毛管上 皮細胞に対する分裂促進的活性を有しない純粋化学誘引剤であり、毛管形成促進 因子源の方向へグラジェント的に移動するように毛管上皮細胞を刺激する。毛管 細胞がいったん親毛管から移動し始めると、分裂を始める。多分この分裂は、か つて塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）種の中に見いだされた、上皮細胞によ って生産される自己分泌増殖因子によって制御される。

繊維芽細胞の移動及び有糸分裂と、上皮細胞の移動及び有糸分裂との組み合わせ が肉芽細胞を生産する。肉芽組織はまた、補体活性化からのＣ５Ａ及び血小板か らのトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−Ｂ）の存在によって修復部 位に運ばれてくる好中球及び単球中にも豊富にある。これら食細胞の存在が汚染 を減少し、感染を防ぐ。

ＴＧＦ−Ｂは、フィブリン−コラーゲンの合成に機能を有する２５，０００ダル トン（１１２アミノ酸）のポリペプチドである。ＴＧＦ−Ｂは繊維芽細胞の分裂 を阻害し、そのマトリックス生産を増加する。ＴＧＦ−Ｂが分裂を刺激するのか 、阻害するのかは、組織中に作用する全成長因子の機能による。ＰＤＧＦの存在 下では、ＴＧＦ−Ｂは通常分裂を刺激し、一方上皮増殖因子（後述）の存在下で は通常分裂を阻害する。

肉芽組織の形成後、表面細胞は切断皮膚端（ｃｕｔ　５ｋｉｎ　ｅｄｇｅ）から 肉芽組織に移動し、新しい皮膚層を形成し、次いでこれが正常な皮膚に成熟する 。この細胞活性は、表面細胞に対する化学誘引剤である血小板由来上皮増殖因子 （ＰＤＥＧＦ）によって少なくとも部分的に制御されている。

要約すると、組織修復又は”創傷治癒”の過程は、少なくとも４つの成長因子： ＴＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ、ＰＤＡＦ及びＰＤＥＧＦによって制御されている。修復 されるべき組織中におけるこれらの成長因子の存在は、繊維芽細胞の移動及び有 糸分裂、上皮細胞の移動及びそれに続く有糸分裂、及び表面細胞の移動及び有糸 分裂をもたらす。その結果、創傷部位が肉芽組織で満たされ、次いで再上皮化及 び皮膚成熟化が起こる。

組織の自然治癒のためのこれらの因子の２つの主要な源は血小板とマクロファー ジである。体内で組織が損傷されると、凝析過程の活性化によって生産されるト ロンビンの存在によって、血小板が放出される。これらの血小板は次いでＰＤＧ Ｆ、ＰＤＡＦ、ＰＤＥＧＦ、ＴＧＦ−Ｂ及び血小板因子４　（ＰＦ−４は好中球 及び単球に対する化学誘引剤である）を放出し、補体Ｃ５Ａの放出を刺激する。

ＰＤＧＦＳＰＤＡＦ、ＰＤＥＧＦ及びＰＦ−４は、それ自体上記したように創傷 を直接治癒するのに寄与するが、一方ＴＧＦ−Ｂ及びＣ５Ａは損傷部位にマクロ ファージを誘引する。マクロファージもまた、いったん組織修復部位に集められ ると、同じか或いは同様のマイトジェン、化学誘引性、及び毛管形成促進性因子 を放出する。しかしながら、今日までマクロファージはＥＧＦ一様活性を産出す ることが知られていない。

非冶癒性創傷を改善することができない共通の理由は、感染、乏しい細胞充実性 、少ない繊維芽細胞、新しい毛管の不存在及び乏しい炎症性細胞である。一方、 治癒性創傷は、単核及びマクロファージ細胞浸潤物、分裂性繊維芽細胞及び多数 の毛管を特徴とする。

Ｋｎｉｇｈｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、Ｓｕｒ、　１９８６．２０４＋３ ２２−３３０　（参照することによりここに包含される）は、慢性の非治癒性皮 膚潰瘍を有する患者４９名を、微品質コラーゲン軟膏中の向知性血小板由来創傷 治癒処方（Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ｄｅｒｆｖｅｄ　Ｗｏｕｎｄ　Ｈｅａｌｉｎｇ　 Ｆｏｒｍｕｌａ：ＰＤＷＨＦ）を用いて治療した。慣例的治療と共に、創傷を平 均１９８週治療した。１００％上皮化への平均期間は１０．６週間であり、１０ ０％治癒は、最初の創傷サイズとＰＤＷＨＦ治療の開始とに直接的関係を有して いた。異常な組織形成、ケロイド又は肥大廠痕は何も報告されていない。

二重盲検法において、Ｋｎｉｇｈｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｒ ｅｐａｉｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ａｔ　ＴａｒｐｏｎＳｐｒｉｎｇｓ、　Ｆｌ ｏｒｉｄａ、　Ｍａｙ　１９８７　（参照することによりここに包含される）は 、コラーゲン基質中のＰＤＷＨＦを用いる創傷治癒をプラセボと比較した。２４ 名のの治癒を得た。一方、プラセボグループの１１名の！者は、１３例の創傷の うち、２例のみが１００％上皮化に達した。ブラセボ非治癒創傷を次いてＰＤＷ ＨＦで治療したところ、平均７．１週間で治癒した。ＰＤＷＨＦ非治唸患者にＰ 　ＤＷＨＦを継続したところ、さらに治療平均５．８週間で１００％上皮化を得 た。

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ　Ｗｏｕｎｄ　ＣａｒｅＣｌ 　１ｎｉｃにおける患者群の前治療記録が切断、糖尿病性足治療（ｄｉａｂｅｔ ｉｅ　ｆｏｏｔ　ｃａｒｅ）及び心臓外科分野における３人の全国的な権威者に 提供された。７３名の患者の１３６例の創傷を１から６の重篤度［部分的厚み（ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）から壊厄を伴う全厚みまで］に分類した。ＰＤＷＨＦ治切 断の必要有りと評価された肢（ｎ＝９）の救済率は８６％であった。毎日創傷に ＰＤＷＨＦを適用することにより、肉芽組織形成と表面細胞成長刺激を促進した 。慢性非治癒性創傷は、十分に機能的な皮膚に治癒された。

創傷治療に関する以前の研究において、ＰＤＷＨＦ製剤は最終審ｎ１ｍ１当たり １０９個の血小板を媒質に放出した。ドナーによる変動、又は特定のドナーのた めの時間による変動やこのような血小板から放出する物に含まれる創傷治療因子 の能力を補正するために、血小板放出物の量を調節する試みは何らなされてこな かった。放出物中に含まれる治癒因子の能力の変動を考慮しながら、組織の効能 ある治療のための血小板放出物の量を選択することが本発明の目的である。

［発明の開示］ 本発明によれば、選択された量の血小板放出物を含む血小板放出物製品を局所的 に適用することにより組織が治療される。好ましくは血小板放出物製品は、所望 する場合には、繊維芽細胞、毛管上皮細胞及び／又は表面細胞の移動及び／又は 分裂を引き起こし、この細胞の分裂又は移動が治療領域における肉芽組織、毛管 及び／又は上皮の形成に寄与するのに十分な量で、治療すべき組織に適用される 。

本発明は、組織の治療に用い得る血小板放出物製品の製造法を提供する。血小板 放出物サンプル中に存在する成分の量を示すアッセイを、血小板放出物サンプル に実施する。”成分”は、好ましくは創傷治癒因子であり、その量は血小板放出 物中に存在する所望の創傷治癒因子の量と関係する。アッセイはこのような成分 の量又は存在を検出するイムノアッセイであり、又はＨＰＬＣの使用のような成 分の量又は存在を決定する他のいかなる方法でもありうる。アッセイの結果に基 づいて、選択された量の血小板放出物を含む血小板放出物製品が製造される。

血小板放出物サンプル中の成分の量と、放出物製品中に含まれる同一成分のあら かじめ定められた量の範囲とを比較することにより量を選択する。本発明は更に 、前記放出物製品を組織に局所的に適用することによる組織の治療法を提供する 。

血小板放出物製品を製造する他の方法、及びかかる製品の組繊への局所的適用は 、血小板放出物サンプルの活性量を示すアッセイを血小板放出物サンプルに実施 することを含む。

血小板放出物製品及び血小板物放出サンプル中に含まれる血小板放出物は、同じ 血小板のドロー（ｄｒａｗ）から得ることが好ましい。若しくは、血小板放出物 製品及び血小板放出物サンプル中に含まれる血小板放出物は、同じ動物又はヒト 由来の血小板の異なるドローから得ることもできる。更にまたは、血小板放出物 製品及び血小板物放出サンプル中に含まれる血小板放出物は、単一の動物又はヒ ト由来の、或いは複数の動物又はヒトドナー由来の、単−又は複数のドローから 得た血小板のプールから得ることもできる。

血小板放出物製品中に含むべき成分の量の範囲は、該血小板製品中に含まれる血 小板放出物の選択された量が、選択された治療パーセントで組織治療の実質的効 能を引き起こすのに十分なように、あらかじめ定められる。例えば、治療した創 傷の５０％以上において、少なくともグレード２の機能性評価スコア（後はど定 義する）を得るためのこのような治療効能が選択される。若しくは、血小板放出 物製品の活性量の範囲は、同様に組織治療の所望する効能に基づ（。

このような効能のために量があらかじめ定められる成分とは、ベータートロンボ グロブリン（”Ｂ−ＴＧ”）　、ＰＤＧＦ、ＰＤＡＦＳＰＥ−４、塩基性ＦＧＦ 、酸性ＦＧＦ、ＴＧＦ−σ、ＴＧＦ−Ｂ、ＰＤＥＧＦ及びフィブロネクチンであ る。

活性とは、繊維芽細胞有糸分裂活性（−ＦＭＡ”）、上皮細胞走化性活性（”Ｅ ＣＣＡ”）、ウサギ角膜アッセイ活性（”ＲＣＡ　Ａ”）又は角化細胞走化性活 性（”ＫＣＣＡ”）でありうる。

最後に、血小板放出物は、かかる血小板放出物のための医薬的に許容し得る担体 又は希釈剤と組み合わせて血小板放出製品を製造することができる。更に、製品 は実質的に血液又は血漿汚染物を含んでおらず、また血小板中には含まれている が、血小板によって放出されない血小板ゴーストや他の物質を含んでいない。

”治療”は、創傷治癒、美容、又は治療すべき組織の領域における血管形成性、 有糸分裂性、又は走化性活性を促進することが望ましい他の全ての過程を含む。

組織への治療の適用は、表１に記載するものを含むが、これに限定されない。こ のような治療は、組成物を領域表面又は組織体に適用するという意味において局 所的であるが、系統的に適用されない。

表１ 組織治療の適用可能性 工、慢性の非治癒性皮膚創傷の治療 Ａ１虚血性創傷 １、糖尿病性創傷 ２、アテローム性動脈硬化症による虚血性創傷３、細動脈脈管炎による創傷 Ｂ、静脈？血創傷 １、静脈炎後症候群 ２、外傷後静脈を血 Ｃ１褥癒 １、仙骨褥癒 ２、座骨褥癒 ３、踵および課の褥癒 ４、他の圧力部分の褥瘉 Ｄ１持続性皮膚外傷による創傷 ■、急性創傷の局所的治療 Ａ１分離性厚み（ｓｐｌ　ｉｔ　ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）創傷１、皮膚移植ドナ一 部位 ２、自動車事故などに由来する剥離 Ｂ１全厚み皮膚喪失 １、剥離性（ｄｅｇｌｏｖｉｎｇ）損傷２、外傷性皮膚喪失 ３、外傷性皮膚壊死 ■、火傷 Ａ、分離性厚み皮膚移植ドナ一部位修復Ｂ、肉芽組織形成の促進及び初期挫滅組 織除去及び皮膚移植Ｃ１第２度の火傷の再上皮化促進 Ｄ、慢性拘縮の予防による皮膚移植における美容的効果の改善■、無傷の皮膚の 再脈管化 Ａ、糖尿病性頚脂肪性壊死 Ｂ１照射誘導性皮膚虚血 Ｃ１フエンフイガスブルガリス（ｐｈｅｍｐｈｉｇｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）■ 、美容的適用 Ａ１毛髪成長 Ｂ、皮膚新生準備 Ｃ１皺治療 ■、急性外科創傷の治療 Ａ、緩和的放出性の生物分解性投与系と組み合わせると、遅滞期を短くすること によって組成物は通常の創傷修復率を増強することができる。この運搬システム は組成物を局所的に任意の外科的創傷、または皮膚の裂目、または体内器官に適 ■、内部外科的適用 Ａ１組成物は内部外科的又は外傷的創傷の修復を速めることができ、これは肝臓 裂傷、腎臓裂傷、膵臓裂傷、及び腸、結腸又は胆嚢樹枝状構造（ｂｉｌｉａｒｙ ｔｒｅｅ）のような吻合術を含むが、これに限定されない。

Ｂ１肝臓及び膵臓の外傷的創傷のような内部創傷への局所的投与０１組成物は腹 腔内膜瘍に適用して修復を速めることができる。例えば、腹腔内膜瘍を経皮的に ドレンして、ドレンをその場に保持するときには、その可能性のある部位の修復 を速めるために、腹腔表面に組成物が局所的に適用されるように、ドレンを通し て組成物を注入することができる。

■、獣医的適用 Ａ１外科修復促進 Ｂ１ウマなどの慢性、非治癒性創傷の修復促進Ｃ１ウマ長骨骨折の修復促進 Ｄ、家畜に収縮過程が起きて、孔管が閉鎖するのを抑えるために、家畜の創傷治 療のための組成物投与系を考案することができる。

■、眼科的適用 Ａ、角膜潰瘍の治癒促進 Ｂ、角膜移植の治癒促進 Ｃ１その他の眼科的手術の治癒促進 Ｘ、整形外科的適用 Ａ、通常の骨折治癒促進 Ｂ、癒着欠如の修復刺激 Ｃ１骨移植治癒の容易化 Ｄ１糖尿病性骨髄炎後の修復刺激 Ｅ、組織の成長を促進するために、組成物を補綴物質（関節置換体など）と組み 合わせることができる Ｂ１健及び靭帯の修復促進 Ｇ、人工膜の取り込み刺激 ＸＩ、ＥＮＴ適用 Ａ、乳様突起切開術創傷の修復促進 （慢性の非治癒性創傷に対するのと同様の局所的投与を伴うことができる）Ｂ、 人工補綴（鼓膜、鼓膜管、又は人工オイスタヒイ管など）との組み合わせ■、整 形的適用 Ａ、組繊改造制御（組織の損傷を新しい組織で充填する）Ｂ１補綴（例えば、胸 部充填）への内部成長を刺激Ｃ１皮膚弁における修復促進を刺激 Ｄ、組成物の局所的投与によって得られる痘痕は、刺激を受けない痘痕よりもは るかに美容的に満足できるものなので、これを融痕改善に局所的に使用できるＢ １手などの腿の損傷の修復促進 Ｘ■、歯科 Ａ１乾燥ソケットの修復促進 Ｂ１通常のソケット修復促進 Ｃ１歯科移植物の内部成長促進 Ｄ１歯骨ラインにおける歯肉成長の促進ＸＩＶ、胃腸管的適用 Ａ１スクラルフェート（Ｓｕｃｒａｌｆａｔｅ）のような医薬を組み合わせると 、組成物は胃及び十二指腸潰瘍の修復を促進Ｂ、浣腸として投与すると、組成物 は結腸における１ＩＩＩｆｓ性大腸炎の修復を促進Ｃ１緩和性放出物質中で経口 投与すると、組成物は肉芽性大腸炎の修復を促進ＸＶ、心臓外科 Ａ１人工移植物と組み合わせると、組成物（特に血管形成誘導因子）は新しい血 管形成を刺激して、毛管の内部成長から移植物を再上皮化するＸＶＩ、人工内分 泌器官 Ａ１血管形成誘導因子は再毛管の内部成長を刺激して、体内に移植できる人工内 分泌器官のチューブを形成するのに使用できる。チューブを通して毛管が成長を 刺激され、全く異種移植の内分泌系の使用を可能にするために、細胞又は小島（ ｉｓｌｅｔｓ）がチューブの外側に成長する。

Ｘ■、狭窄形成 Ａ、現在食道、胆嚢樹枝状構造、尿道及び尿管に使用されているステントと組み 合わせて、血管形成促進及び再狭窄形成率を減少するステント化チューブ構造の 治癒の刺激に用いることができる。組成物がステント周囲の組織表面に局所的に 適用されるように、緩和性放出形態で組成物をステントに投与する。

本発明の組成物の使用は表ＩＡの１に記載したちの全てを含むが、これに限定さ れるものではない。

表ＩＡ 本発明の組成物の更に可能な適用 １１心筋梗塞の脈管再生 Ａ、組成物は、緩和性放出系を用い、核磁気共鳴イメジングで導きながら心臓カ テーテル化又は経皮的に、心筋梗塞の中心部に注入し、梗塞修復を促進するＢ、 抗−変性コラーゲン抗体で覆ったリポソームで組成物を標的化し、創傷又は心筋 梗塞部位に移動するように静脈内投与する■、神経損傷の脈管再生 Ａ、組成物は緩和性放出系で脳梗塞又はを髄に注入されて修復を促進Ｂ１上記Ｉ と同様に、組成物を乗せた標的リポソームを抗−変性神経抗体を用いて、神経損 傷部位に移動するように静脈内投与する化学物質がここで記載する血管形成性、 有糸分裂性、及び走化性の対応するアッセイ、又は当業界で適用され、或いは将 来開発される同様なアッセイにおいて正の応答を示すとき、本明細書並びに請求 の範囲において該化学物質は”走化活性”、”有糸分裂活性”又は”血管形成促 進活性”を有するという。

［図面の簡単な説明〕 図１は、フロリダでの研究における、血小板放出抽出物中のＢ−ＴＧ　（ｎｇ／ ｍｌ）と機能性評価との関係を表す図である。

図２は、カンサスシティ−での研究における、血小板放出抽出物中のＢ−ＴＧ（ ｎｇ／ｍｌ）と機能性評価との関係を表す図である。

図３は、ミネソタでの研究における、血小板放出抽出物中のＢ−ＴＯ（ｎｇ／ｍ ｌ）と機能性評価との関係を表す図である。

図４は、血小板放出抽出物中のＰＦ−４とＢ−ＴＧとの関係を表す図である。

図５は、血小板放出抽出物中のＰＤＧＦとＢ−ＴＧとの関係を表す図である。

図６は、血小板放出抽出物中のＦＭＡ活性とＢ−ＴＧとの関係を表す図である。

［発明の詳細な説明］ 組織治療の効能は慢性の非治癒性皮膚創傷について定義されてきた。機能性評価 グレード１−４は、以下の評価に基づいて創傷治癒成熟度を測定する：（１）１ ００％以下の上皮化：ドレン有り；ドレッシング（包帯などによる外傷保護）を 要する。

（２）１００％上皮化；ドレン有り：ドレンのコントロールのためのドレッシン グを要する。

（３）１００％上皮化：少量のドレンを伴う成熟性皮膚、保護的ドレッシングの みを要する。

（４）１．００％上皮化：１００％成熟機能性皮膚ニドレッシングを要しない。

慢性の非冶癒性皮膚創傷の治療のための好ましい手順は、１日１回、毎日同じ時 間に、血小板放出物製品を適用することを含む。製品は、それを洗い落とす前に 少なくとも８時間創傷上に留まるべきである。製品が創傷上にない残りの１２時 間については、食塩水で湿潤するか、或いは乾いたドレッシングを創傷部位に適 用するべきである。

創傷治療を目的とする血小板放出物製品は患者自身の血液から直接調製すること が好ましいが、その他の出所の血液又は古い（ｏｕｔｄａｔｅｄ）血小板を用い ても本発明の利点は得られる。患者自身の血液を用いると、貯蔵血液から肝炎、 ＡＩＤＳ、又はその他の汚染を受ける可能性を避けることができるので、これを 開示する。患者自身の血液を用いると外来血液に対するほとんどのアレルギーを 排除することもできる。しかし、製品の代替的原料としては、血統の判明してい る血液（即ち、肝炎、ＡＩＤＳなどの検査をした人からの血液）、又は古いヒト 血小板であり、単一の、又は複数の出所から得ることができる。他の種からの血 液もヒトに適用することができる。最後に、４その動物自身、同じ種に属する他 の動物、又は他の種の動物に由来する血小板を用いて、血小板製品を獣医的用途 に用いることができる。

［実施例コ 実施例１ クエン酸デキストロース（ａｃｉｄ　ｃｉｔｒａｔｅ　ｄｅｘｔｒｏｓｅ）抗− 凝血物質（以後ＡＣＤという）６ｍｌ中の原料、又は全血１０ｍ１当たり１ｍｌ のＡＣＤで全血６０ｍ１を得た。シリンジを逆さにして回転させて血液をＡＣＤ とよく混合した。抗−凝血化血液サンプルを次の操作に用いるまで氷上に保存し た。

抗−凝血化血液を２本の滅菌、シリコン加工した５０ｍ１の円錐底遠心管に移し 、管にサンプルを平均に分散させた。次いで管を約４℃で２０分間、１３５Ｘｇ で遠心した。遠心サイクル終了時にローターを停止するまで回転させておいた。

ブレーキはかけなかった。血小板に富む血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ　ｐ Ｉ　ａ　ｓｍａ　：以後ＰＲＰという）である、遠心サンプルの上澄み層を滅菌 ピペットで他の滅菌、シリコン加工した遠心管に注意深く移した。１回に４−５ ｍ１ずつのみを吸い上げることにより、赤血球細胞汚染によるＰＲＰのロスを最 小にすることができた。次いで、当業界で公知の方法を用いて、ＰＲＰの血小板 数をカウントした。

ＰＲＰを約４℃で１０分間、７５０ｘｇで遠心した。血小板のベレットを移動さ せないように注意しながら、上澄みを捨てた。滅菌ピペットを用いて、０．０５ Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−ｎ−２−エタンスル ホン酸）、領　０３Ｍ　デキストロース、０．００４Ｍ　ＫＣＩ、０．１．Ｍ　 ＮａｃＩ、を含み、２８℃でｐＨを約６．５に調製した緩衝液（以後血小板緩衝 液という）を吸い上げて押し出すことにより、懸濁液１ｍｌ当たり約１０９個の 血小板の濃度になるようにペレットを再懸濁した。

得られた血小板懸濁液を次いで精製トロンビンで活性化した。好ましくは、血小 板懸濁液１．ｍｌ当たり約１ユニツトのトロンビンを血小板懸濁液に加えて混合 した。血小板とトロンビンを室温で約１０分間インキュベージコンした。インキ ュベーション後、懸濁液を滅菌ピペットで吸い上げて押し出すことにより、得ら れた血小板凝集体を破壊した。

若しくは、血小板にその中身を放出させるような他の活性剤で活性化することも できる。他の活性剤とは、１０％血小板、好ましくは緩衝液中に２−１０ｕモル のＡＤＰ、好ましくは緩衝液中に２５−４５０ｕモルのエピネフリン、及び好ま しくは緩衝液中に３５−５０ｕモルのアラキドン酸を含む緩衝液１．ｍ１当たり 、好ましくは６　１１００ｕのモノマーコラーゲンである、コラーゲンを含む。

更に他の態様として、ＰＲＰは遠心前にトロンビンで活性化することもできる。

活性化ＰＲＰは以下に記載するように、液体又はペースト調製物中に取り込ませ ることもできる。

好ましい態様においては、得られた上澄みを約４℃で約５分間、９５０ｘｇで遠 心して、懸濁液中に含まれる放出された血小板ゴーストやフィブリンを除去した 。この遠心で形成されたペレットを、上澄み抽出後に捨てた。

血小板ゴースト及びフィブリンを除去した後、残る上澄みは血小板緩衝液中の血 小板放出物からなり、これを血小板放出抽出物と呼ぶ。該抽出物を貯蔵用に４ｍ １で凍結するか１、或いはアッセイ用に直ちに使用するか、或いは以下に記載す るように液体又はペースト製品を製造する。

実施例２ 血液銀行又はその他の出所から得た血小板から血小板放出抽出物を調製すること ができる。フェレシス（ｐｈｅｒｅｓｉｓ）血小板濃縮物が血液銀行から得られ 、即座に処理される３、血小板１ユニツトはＰ　Ｒ，Ｐ約２００ｎ口となるであ ろう。

ＰＲＰを約４℃で１０分間、７５０ｘｇで４回遠心し、各遠心後に血小板ペレッ トを血小板緩衝液中に再懸濁する点を除いて、抗−凝集化された患者血液サンプ ルを上記のように処理したのと同様の方法で、濃縮物を処理して活性化血小板腎 濁液を得ることができる。４回目の遠心後、血小板ペレットを血小板緩衝液中に 再懸濁して、約１０９血小板／′ｍ１の濃度にする。

血小板懸濁液を上記のように活性化して、約４℃で１０分間、９５０ｘｇで遠心 する。上澄みを抽出し、約４℃で１５分間、１０．０００ｘｇで遠心して残留血 小板及び全てのフィブリンを除去する。上澄みを抽出した後、ペレットを捨てる 。血小板放出抽出物である上澄みを貯蔵用に４ｍｌで凍結するか、或いは以下に 記載する液体又はペースト調製物を製造するために直ちに使用する。

血液銀行血小板から製造する更に他の方法として、銀行血小板から製造したＰＲ Ｐを遠心前に直接活性化することができる。

実施例３ 血小板放出物製品は好ましくは液体製剤で患者に投与される。血・ｊ＼板放出抽 出物、即ち、血小板緩衝液中の凍結血小板放出物は、室温に溶かすことができる 。

室温で測定した容量の抽出物を遠心管に加えて、血小板緩衝液を遠心管に加λて 好ましい希釈度となるようにする。血小板緩衝液を加える前に、リドカ、イン０ ゜５ｍｌを加えてもよい。この場合、緩衝液は担体として作用する。また、ある 場合には抽出物は更に希釈することなく使用することもできる。

実施例４ その他の態様として、血小板放出物製品は、生物的に矛盾がなく、かつ上澄み中 の活性成分の一時的な“蓄積質（ｄｅｐｏｔ）”として作用する担体物π中の抽 出物からなる、ペースト製剤として適用することもできる。微晶質コラ−・ケン （例えば、Ａｌｃｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、、Ｆｏｒｔ、ｈ　 Ｗｏｒｔｈ、ＴＸから市販されている。Ａｖｉｔｅｎｅ！ブランドの微晶質コラ −・ケン）のような大分子の物質が適当な担体である。

ペースト状血小板放出物製品を製造するには、抽出物を溶かして液体製剤と同様 に希釈した。適量の抽出物を、Ａｖｉｔｅｎｅ微晶質コラーゲンのビンに滅菌ピ ペットで入れ、均一な濃度とする。若しくは、抽出物を微晶質コラーゲンと混合 してもよい。

得られるペースト状血小板放出製品を含むビンは、蓋をして患者に適用するまで の間、氷と共にプラスティック袋に入れるか、或いは凍結して輸送又は貯蔵する 。

実施例５ １０２例の非治癒性皮膚創傷を含む、フロリダ、ｔＪ、Ｓ、　Ａ　での創傷治療 研究において、自己認識性（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）血小板放出物製品を用いて 上記の手順に従って創傷を治療した。血小板放出物製品は、以下のようにして製 造した・実施例１の方法によって製造した血小板放出抽出物を更に１　：　１０ ０に希釈して血小板放出物製品を製造した。血小板放出物製品を局所的に適用す る前に、ＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ　Ｂ−ＴＧとしてＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ　Ｓ ｔａｎｇｏ、Ａｓｎ１ｅｒｅｓ−８ｕｒ−Ｓｅｉｎｅ、Ｆｒａｎｃｅから市販さ れている、ベータートロンボグロブリンのためのイムノアッセイを、血小板放出 抽出物に対応する製品について実施して、抽出物自体に含まれているＢ−ＴＧの 量を測定した。治療終了後に、機能性評価のために創傷をグレード分けした。血 小板放出物サンプル（この場合は抽出物）中に含まれるＢ−ＴＧの量は、以下の 機能性評価によって測定した、血小板放出物製品による治療の成功と関連してい た：変数：　Ｂ−ＴＧ対ＦＡ サンプル数＝　１０２ スピアマン　Ｒ：　０．２４２７ Ｔ−値：　２．５０２３ ２−テイル　Ｐ：、０１４ 図１は、データの代表的プロットを示す。

実施例６ 自己認識性血小板放出物製品で治療した８６例を含む、カンサスンティー、Ｕ。

Ｓ、　Ａ、での創傷治療研究で、前記の実施例を繰り返した。血小板放出物サン プル中に含まれるＢ−ＴＧの量は、以下の機能性評価と関連していた：変数：　 Ｂ−ＴＧ対Ｆ、Ａ サンプル数、８６ スピアマン　Ｒ：　０．３５０８ Ｔ−値：　３．４３２８ ２−テイル　Ｐ・　０．０ｆ）０９ 図２は、得られたデータの代表的プロットを示す。

実施例７ 自己認識性血小板放出物製品で治療した３２例を含む、ミネソタ、Ｕ、Ｓ、　Ａ 。

での創傷治療研究で、実施例５を繰り返した。血小板放出サンプル中に含まれる Ｂ−ＴＧの量は、以下の機能性評価と関連していた：変数：　Ｂ−ＴＧ対ＦＡ サンプル数、３２ スピアマン　Ｒ：　０．３６２９ Ｔ−値：　２．１３２９ ２−テイル　Ｐ：　０．０４１２ 図３は、得られたデータの代表的プロットを示す。

創傷治療の前記実施例に基づいて、創傷治療の成功は製品を製造するために用い られた抽出物中に含まれるＢ−ＴＧの量と関連していた。従って、血小板放出物 製品は、好ましくは製品中にあらかじめ定められた範囲の量のＢ−ＴＧを含むよ うに製造されるべきである。製品は血小板放出抽出物の希釈物を含むので、抽出 物製剤中、又は製品を構成するのに用いる血小板放出物の量を調節して、放出抽 出物に含まれるＢ−ＴＧ量を明瞭にするべきである。放出物中のＢ−ＴＧ量はド ナーによって、また特定ドナーについては時間によっても変化するが、この製造 工程は製品中に所望量のＢ−ＴＧを含むようにすることができる。

図１から３に示すように、もしも２又はそれ以上の平均ＦＡグレードを所望する 場合には、Ｂ−ＴＧ量は、製品１．ｍ１当たり少なくとも約２５　ｎ　ｇである 。１もちろん、製品１ｍｌ当たり６６ｎｇ以上のＢ−ＴＧ量が、本研究で試験し たＢ−ＴＧ量の範囲内で最適の治癒を与える。

若しくは、最小又は最適量の血小板放出物を含む血小板放出物製品を製造するた めに、血小板放出物の他の成分を用いることもできる。これらの成分は、ＰＤＧ Ｆ、ＰＤＡＦ、ＰＦ−４、塩基性ＦＧＦ、酸性ＦＧＦ、ＴＧＦ−２、ＴＧＦ〜Ｂ 、ＰＤＥＧＦ及びフィブロネクチンを含むが、これに限定されない。実施例８か ら９は、Ｂ−ＴＧとＰＦ−４とＰＤＧＦとの関係を示す。

実施例８ ４１個の自己認識性血小板放出物ヅンブルを用いて、上記Ｂ、−ＴＧイムノ゛ｒ ツセイによってＢ−ＴＧをアッセイし、またＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ　Ｓｔａｇ 。

からＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ　ＰＦ−４として市販されているＰＦ−４イムノア ツセイによってＰＦ−４をアッセイした。血小板放出物サンプル中のＢ−ＴＧ量 は、以下に示すようにＰＦ−４と関連していた：変数：　Ｂ−ＴＧ対ＰＦ−４ サンプル数＝４１ スペアマン　Ｒ：　０．９１４８ Ｔ−値・　１４．１４４９ ２−テイル　Ｐ：　＜ｏ、０００１ 図４は、データの代表的プロットを示す。

実施例９ ４１個の自己認識性血小板放出サンプルを上記のＢ−ＴＧアッセイに従ってアッ セイし、また以下のアッセイ手順に従ってＰＤＧＦをアッセイした；１、ブロッ ク反応プレート（Ｒ）（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　１ｍｍ−１，丸底）ａ）１ウエル当 ｆ＝すＰＴ−２０（ＰＢＳ　ＴＷＥＥＮ−２０，０５％）１５０ｕｌ添加 ｂ）Ｒ−プレートをカバーして３７℃で６０分間、インキュベーションｃ）Ｒ− プレートを吸引及び乾燥、工程３に進む２、コート定量化（Ｃｏａｔ　Ｑｕａｎ ｔｉｔａｔｉｏｎ）プレート（Ｑ）（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　ｌｍｍ−２、平底） ａ）１５０ｕｌ／ウエルのＰＤＧＦｃｓ　ｉ　ｓ　（コーティング緩衝液中４０ ｎｇ／ｍ１）添加 ｂ）ジップロックの袋中、カバーして４℃で一夜、Ｑ−プレートをインキュベａ ）ポＩＪ−７’Ｏピレンｆ　ユーブヲ用いて、ＰＢＡ−Ｔ／２０　（ＰＢＳ＋１ ％ＢＳＡ＋、Ｑ５％Ｔ−２０）中でサンプル希釈を実施。よく混合する４、Ｒ− プレートにサンプル添加 ａ）６０ｕｌ／ウエルのヤギ抗−ＰＤＧＦ　（ＰＢＡ−Ｔ−２０中に希釈）を２ ｕｇ／ｒｎ＋で添加 ｂ）６０ｕｌ／ウエルの希釈サンプル又は標準を添加Ｃ）袋中、カバーして４℃ で一夜、Ｒ−プレートをインキュベーション第２日： １、Ｑ−プレート吸引 ａ）Ｑ−プレートを吸引 ｂ）１５０ｕｌ／ウエルのＰＴ−２０でＱ−プレートをブロック（１−２時間、 ３７℃） Ｃ）吸引、３回洗浄、風乾 ２、Ｒ−プレート移動 ａ）Ｒ−プレートの内容物をＱ−プレートに移動（１００ｕｌ）ｂ）Ｑ−プレー トを室温で３００分間インキュページジン）吸引及び洗浄 ３、色反応 ａ）１００ｕｌ／ウエルのラット抗−ヤギーパーオキシダーゼ（ｌｕｇ／ｍｌ） 添加 ｂ）室温で１時間インキュベーション Ｃ）吸引及び洗浄 ｄ）１００ｕｌ／ウエルの基質（テトラメチルベンジジン）を添加ｅ）プレート を読む 血小板放出物サンプル中に含まれるＢ−ＴＧの量は、以下のようにＰＤＧＦの量 と関連していた： 変数：　Ｂ−ＴＧ対ＰＤＧＦ サンプル数＝４１ スペアマン　Ｒ：　０．８１０３ Ｔ−値：　８．６３５９ ２−テイル　Ｐ：　＜０．００１ 図５は、データの代表的プロットを示す。

更に他の態様として、最小又は最適量の血小板放出物を含む血小板放出物製品を 製造するための基礎として、血小板放出物の活性を用いることができる。これら の活性は、繊維芽細胞分裂促進活性（”ＦＭＡ”）、上皮細胞走化活性（”ＥＣ ＣＡ”）、ウサギ角膜アッセイ活性（“ＲＣＡ、　Ａ”）及びケラ千ノサイト細 胞走化活性（”ＫＣＣＡ”）を含むが、これに限定されない。実施例９は、Ｂ− ＴＧとＦＭＡとの関連を示し、実施例１．０−１２は、追加的活性を定義するア ッセイを開示する。

実施例９ ４１個の自己認識性血小板放出物サンプルを、上記のＢ−ＴＧイムノアッセイに よってＢ−ＴＧをアッセイし、また以下のＦＭＡ手順によってＦＭＡをアッセ１ 、試験すべきＦＭＡサンプルに必要なマイクロタイタープレートの数を決定する （１枚のプレートは、必要なコントロールを“含めて２４個の４重サンプル、又 は３２個の３重サンプルを収容する）。

２．１０％熱−不活性化ウシ血清（１０％ＨＴ−Ｃ３）を含むダルベツコの改変 イーグル培地（ＤＭＥＭ）を、１プレート当たり約２０ｍ１用意する。、更に４ ０ｍ１　ＤＭＥＭ／１．０％　ＨＮ−Ｃ８を用意する（細胞調製に使用）。

３、液体窒素中で凍結貯蔵しておいた、適当な数の３Ｔ３　（Ａ３１）繊維芽細 胞のチューブを３７℃水浴中で溶かず（チューブ当たりの収率は凍結バッチによ って異なる。１マイクロタイタープ！ノート当たり約２．０００．０００個の生 存できる細胞を要する）。

４．２０ｍ１　（５−１０ｍｌ）のＤＭＥＭ／１０％　Ｈｌ−Ｃ８を含む滅菌し た５０ｍ１培養チユーブ（液体量を少なくして１２ｍ１又は１５ｍ１チユーブも この目的に用い得る）に細胞を無菌的に移動する。”よく懸濁“して、室温中、 １０分間、４５０ｘｇで遠心（シールドされたスイ：／グパケットローターを備 えたＭｉｓｔｒａｌ　３０００ｉ中で１４０Ｏｒｐｍ）する。上澄みを捨て、細 胞ベレットを滅菌した１２ｍ１培養チユーブに移して、１０ｍ１　ＤＭＥＭ／１ ０％ＨＩ〜Ｃ８中に再懸濁する。遠心を繰り返す。

５、細胞ベレットを約２−５ｍ１　ＤＭＥＭ／１０％　Ｈｌ−Ｃ５中に再懸濁す る。細胞カウントを行う。

６、ＤＭＥＭ／１０％　Ｈｌ−ＣＳ中に細胞を希釈して、１ｍｌ当たり約２００ ゜０００細胞の濃度を得る（各プレートにつき１０１０−１ｌが必要）。

７．８又は１２のマルチーチャンネルビペンターと滅菌ボートリザバーを用いて 、９６ウエルのマイクロタイタープレートに１ウエル当たり１００ｕｌを添加す る。

細胞−＠濁を適切に維持するために、１列当たり少なくとも１回ピペッタ−の懸 濁液を吸引、押し出しして確実なものとする。

８、各ウェルに１００ｕ２　ＤＭＥＭ／１０％　Ｈｌ−Ｃ３を添加する（合計１ ウエル当たり２００ｕ１の液体量となる）。

９、細胞系及びプレート調製の日付をプレートにラベルする。プレートを３７℃ 、５％　ＣＯ２で３日間、又は繊維芽細胞が集密的になるまでインキュベーショ ンする。

培地交換／第３日 マイクロタイタープレートを開始してから３日後に、培地を０．　８％　Ｈｌ− Ｃ３／ＤＭＥＭに交換して継続する必要がある。

１、題微鏡下でプレートを検査して、繊維芽細胞が集密的に成長したかどうかを 決定する（細胞間にギャップがあってはならない）。もしも細胞が集密的であっ たならば、継続する。もしも細胞が集密的でなかったならば、更に１日成長させ るか、或いは廃棄する。

２．１６ｍ１／プレート　０，８％　ＨＩ−Ｃ３／ＤＭＥＭを調製する。

３、フード下に、１／ｉ菌バリア（ｂａｒｒｉｅｒ）シートを広げて置く。１度 に１個ずつプレートをンンクに取り出し、注意深く、やさしく動かしてプレート の液体を全て１度に出す。直ちに再カバーをする。

４、滅菌フードに素早く戻し、滅菌バリア上で開いたプレートをやさしく吸い取 って過剰の液体を除去する。

５．８又は１２のチャンネルピペッタ−を用いて、１ウエル当たり１５０ｕｌの ０．８％　ＨＩ−Ｃ８／ＤＭＥＭを素早く、かつやさしく添加する。出来る隔り 集密細胞を乱さないように注意しなければならない。工程３がら５を次のプレー トに繰り返す。

６、プレートを３７℃、５％　ＣＯ２で６時間インキュベーションする。

７、過剰の０８％　Ｈｌ−Ｃ５を希釈用に取って置（。

細胞刺激／培地交換後６時間 １０％から０．　８％のＨＩ−Ｃ８に培地交換をした６時間後に、細胞は刺激さ れる状態になっている。

１、試験すべき各コントロール及びサンプルのための各マイクロタイタープし− トの概略及び配置を決める。

２、上部左の隅から始めて、最初の３又は４ウエルには５０ｕ１の０．　８％　 Ｈｌ−Ｃ８／ＤＭＥＭのみを入れる（これはプレートのバックグランドコントロ ールとして働く）。

３、次の３又は４ウエルには（水平方向に進む）、１ウエル当たり２０ｕ　Ｉの 非希釈ＨＩ−Ｃ３及び３０ｕ　Ｉの０．８％　ＨＩ　−ＣＳを入れる（従って最 終希釈度＝１０％　Ｈｌ−Ｃ３）。

４１．次の３又は４ウエルには、５０ｕ　Ｉの血小板緩衝液コントロール（１０ ｍ　ｌ血小板緩衝液＋５０ｕｌ）ロンビン）を入れる。

５．５０ｕ１の試験／コントロールサンプルを添加する。

６、プレートを３７℃、５％　ＣＯ２で１８時間インキュベーションする（時間 の一貫性が重要である）。

放射性標識 試験及びコントロールサンプルで刺激した１８時間後に、ＦＭＡマイクロタイタ ープレートを放射性チミジンで標識し、分裂促進活性を試験する。

１、放射性核種使用中の事故もれを吸収するために、作業場表面−帯を使い捨て のベーパーライナーで覆う。保護手袋を使用のこと。

２、以下のように１０ｕＣｉの［３Ｈ〕−チミジン／ｍｌ　ＤＭＥＭ溶液を調製 する。領　５ｃｃの［３Ｈ］−チミジン（ＮＥＮ　ｃａｔ　ｎｏ、ＮＥＴ−０２ ７，６，７Ｃｉｍｍｏ１．１ｍＣ１／ｍｌ）を４９．５ｍｌ　ＤＭＥＭに滅菌的 に移す（１／１００希釈）。

３、各ウェルに５０ｕ１の［３Ｈ］−チミジン／ＤＭＥＭ溶液を添加。次回のた めに残りの放射性溶液を冷蔵庫に保存する。

４、ピペット先端、手袋、少量の標識培地を有する分配容器、及びペーパーラ・ イナーを放射線用ごみ箱に正しく廃棄する。

５、プレートに放射性とラベルして、もれを吸収するための１−シー中で３７℃ 、５％　ＣＯ２で６時間インキュベーションする。

四μ ｍ、ＮＵＮＣイムノウオッンユを用いて、放射性培地を注意深く吸引する。吸引 先端が細胞と接触することを防ぐために、添付の゛持ち」−げピン（ｒａｉｓｅ ｐｉｎ）“を必ず使用する。

２、多チャンネルピペッタ−で２００ｕｌ　ＰＢＳを加えて細胞を洗浄する。Ｎ ＵＮＣイムノウォッシュで吸引する。

３、各ウェルに２００ｕ　Ｉの０．２５％トリトリス／ＨＢＳＳ　（Ｃａ、Ｍｇ を含まない）を添加する。３７℃、５％　ＣＯ２で３０分間インキュベーション する。

４．５ｋａｔｒｏｎ　Ｃｏｍｂｉ　Ｃｅ１ｌ　Ｈａｒｖｅｓｔｏｒを用いてプレ ートをガラスフィルターベーパー・上に回収する。

５．５ｋａｔｒｏｎ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ器具を用いて、湿ったフ ィルターペー、パーディスクをシンチレーションバイアル（Ｐａｅｋａｒｄ　Ｐ ｉｃｏ　Ｐｒｏ　Ｖｉａｌｓ）に直ちに移す。

６、フィルターディスクを一夜、或いは乾燥オーブン中で１−２時間乾燥させる 。

シンチレーション準備 １、各バイアルに４ｍｌのシンチレーションカクテル（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｒｅａ ｄｙ−５ａｆｅ）を添加する。

２、バイアルに堅く蓋をして数回ｉｔｔバ振って、フィルターをカクテルに完全 にさらし、また気泡があるときはこれを抜く。

カウント １、バイアルをＢｅｃｋｍａｎ　ＬＳ１７０１の緑のラックに左から右の順に置 く。

２．１８番目の位置にＯＮＥバイアルを有する空の緑のラックからなる“プログ ラムラック”をまずカウンターに置き、器械にプログラムＮＯ３１を使用するよ う指示する。

３、プログラムＮ０１１は以下のようにプログラムされる。

−繰り返し、　３ 一カウント時間：　２分 一データ計算：　ＣＰＭ −３ＣＲ：　Ｙｅｓ −ＲＣＭ：　Ｙｅｓ 〜バイアルサイズ：　ミニ 一カウントブランク；Ｎ。

４、まず右側で”終わりから始めへ（ｂａ、ｃｋ　ｔｏ　ｆｒｏｎｔ）“、次い で左側で”始めから終わりへ”動かしながら、残りのラックをカウンターに置く 。

常に赤のストップラックで終わる。

５、同時に”ＲＥＳＥＴ”ボタンを押す。

６、ＲＥＳＥＴが終了し、プリンターに十分紙があることをチェックしたら、５ ＴＡＲＴボタンを押してカバーを再びかける。

７、最初のプリントアウトを見て、プログラムが正しく使われているかを確認す る。

１／ＥＤ−５０のユニットは、繊維芽３Ｔ３細胞において分裂促進活性の５０％ 刺激をもたらす血小板放出サンプルの希釈度を表す。例えば、もしもサンプルの ０．２５又は１：４希釈が５０％刺激を与えるならば、１／ＥＤ−５０は４ユニ ツトである。同様に、１，８の希釈度は１／ＥＤ−５０８ユニツトを与える。

血小板放出物サンプル中のＢ−ＴＧ量は、以下のようにＦＭＡ活性と関連してい た： 変数：　Ｂ−ＴＧ対ＦＭＡ サンプル数　４１ スペアマン　Ｒ：　ｏ、７６７４ Ｔ−値：　６．１９２７ ２−ティル　Ｐ：　＜ｏ、０００１ 図６は、データの代表的プロットを示す。

酵例１Ｉ ＥＣＣＡ活性は以下の手順で決定される。

槻腹！型 １．３−４個のＰｒｉｍａｒｉａ（Ｆａｒｃｏｎ　＃３８２４）７５ｃｍ２７ラ スコで、ウサギ創傷毛管内皮（Ｒａｂｂｉｔ　Ｗｏｕｎｄ　Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ：ＲＷＣＥ）を６０−８５％”集密的”に成長させる。

２、走化性の約２０−２４時間前に、培地を除去してＨＢ　Ｓ　Ｓ　（Ｃａ／Ｍ ｇを含まない、６ｍ１／フラスコ）でフラスコを２回（２Ｘ）洗う。

３、最後のＨＢＳＳ洗液を除去して、各フラスコに１２−１５ｍ１（−貫して） の培地１９９中の０．２％ラクトアルブミンを添加する（これは最少栄養を提供 し、血清誘導化刺激を減少するので、細胞は誘因物質に応答する準備ができてい る）。フラスコの培地交換の時間を記録する。

４、翌日、以下のものを準備する： ａ）Ｍ１９９　（ＬＡ−Ｍ１９９）中の５０５０−１Ｏ００，２％ラクｈアルブ ミン ｂ）９ｍｉ　ｌ１ＢＳＳ中に１ｍｌ、ＥＣ２（ＩＯＸ）を希釈することによる− １２０−３０ｍｌ　（５ｒｎｌ／７５ｃｍ”フラスコ）のＬレザイムカクテルＮ ｏ、２（Ｅ　Ｃ２−Ｉ　Ｘ’） ５．０，２％　ＬＡ−Ｍ１９９を除去しテフラスコを６−１０ｍ１　ＨＢＳＳＴ 洗う。直ちに５ｍｌ　ＥＣ２（ＬＸ）を加えて、室温で正確に１４分間インキュ ベーションする。

６、酵素の不活性化を助長するために、少なくとも２ｍ１／フラスコの０．　２ ％ＬＡ−Ｍ１９９を含む５０ｍのポリプロピレンチューブにフラスコからのＥＣ ２をプールする。直ちに各フラスコに５ｍｌの０２％　ＬＡ−Ｍｌ、９９を加え る。

７、滅菌細胞スクレーバー（Ａｒｎｅｒｉｃａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒ 。

ｄｕｃｔｓ　Ｃａｔ、　＃Ｔ４２０６−１）で底から細胞をそっとかき出す。

８、ＥＣ２プールに細胞／培地を加える。最終リンス用として、１個のフラスコ に１０ｍ１の０．２％　ＬＡ、−Ｍ１９９を加える。リンス液をフラスコからフ ラスコへ移して、細胞と共にプールする。

９、もしも最終容量が４０ｍ１を越す場合には、遠心のために細胞を２つのチュ ー２１：ｍ分＋ｔル。細胞を室温、１４００ｒｐｍ（Ｍｉｓｔｒａ１３０００遠 心器Ｃ約４５０ｇ）で１０分間遠心する。

１０、素早く注ぎ出すことにより上澄みを捨てる。ベレツトを合計８ｍｌの０２ ％　ＬＡ−Ｍ１９９に再懸濁（もし、も分けた場合にはプールする）し、１．５ ｍｌの遠心管に移す。更に２ｍ、ｌの培地で管を洗浄し、再懸濁した細胞に加え る。

室温、１４００ｒｐｍで１０分間遠心する。

１１、細胞をカウントするために、２−５ｍ１の０．　２％　ＬＡ−Ｍ１９９（ 再遠心を避けるために、ペレットサイズ及び予測した細胞収率に容量を調整する ）中に再懸濁する。

１２、細胞のカウント。

ａ）細胞懸濁液３０　ｕ　１をトリバンブルー３０ｕ　ｌに加える。

ｂ）血球計数器の両側にのせる。

Ｃ）１０倍の倍率で、８個の１ｍｍ２中の細胞をカウントする。生存細胞（ブル ー）の数を記録する。異常なサイズや形の細胞をカウントしないこと。

ｄ）生存細胞数に２．５ｘ１０３をかけた数が１ｍｌ当たりの細胞数である。

１３、細胞濃度を０．７５ｘｌＯ’細胞／ｍＩ　ＬＡ−Ｍ１９９　（即ち、３３ ゜７５０細胞／４５ｕｌのウェル）に調整する。約２．２５ｍ１／チヤンノく− が必要である。

ａ）例：１ｍｌ当たり１．５ｘｌＯ細胞が３ｒｎｌあるとする。この場合、最終 的には以下の容量に調整すべきである゛従って、最終濃度０１７５ｘ１０’を得 るためには、０４２％　ＬＡ−Ｍ１９９を２．９５ｍ１加える。簡単に言うと、 ３３．７５０細胞／４５ｕｌ　０．２％ＬＡ−Ｍ１９９／ウェルの濃度での細胞 ／チャンバー値で４５ウエルを準備する。

＊提案される容量 フラスコサイズ　０４２％ＬＡ−Ｍ１９９　１−■（ＳＳ　ＥＣ２（ＩＸ）フイ ルターの準備 ■、凍結ストックから２０ｍ１のｌｕｇフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ　＃Ｆ４ ７５９）／１ｍｌ　ＨＢＳＳ　（ＦＮ／ＨＢＳＳ）を調製する。コノ調製ノタメ ニのみポリプロピＩノン製チップとチューブを用いる。（例：凍結ストック＝１ ｎｇ／ｍｌ　ｄＨ２０−ＨＢＳＳ０従って、ＨＢ　Ｓ　Ｓ　］−９，８ｍ　ｌに ストック２００ｕｌを希釈する。）使用時まで氷上に保存。

２．１チヤンバー当たり１個のＮｕｃｌｅｐｏｒｅポリプロピレンフィルター（ ８，Ｏｕｍ　ｐｏｒｅｓ、ＰＶＰＦ、Ｎｅｕｒｏ　Ｐｒｏｂｅ　Ｉｎｃ、、３０ １−２２９−８５９８）を使用。

を切り取る。フィルターの取り扱いは、決して手ではなく、ピンセットで行い、 かつ端のみを持つこと。

４、滅菌ペトリ皿の中央にＦＮ／ＨＢＳＳ　３−４ｍ１を入れる。光っている側 を下にして、ＦＮ／ＨＢＳＳの上にフィルターを置き、ＦＮ／ＨＢＳＳをフィル ターの下に広がらせるようにし：フィルター上にＦＮ／ＨＢＳＳを全くのせない ようにする。

５、ペトリ皿の蓋をして室温で３０分間装（。

６、ＦＮ／ＨＢＳＳを注意深く注ぎ出しくフィルターをくっつかせたまま、中身 を片側に傾け、完全に注ぎ出す）、フィルターを持ち上げて、新しいＦ　Ｎ／Ｈ Ｂ５５３−４ｍ１を中央に入れて、フィルターの他の側について（曇っている側 を下にする）同様に繰り返す。

７、これでコーティングは完了し、フィルターは使用可能になる。

＊注　ａ）一貫性を得るために、底部チャンバーの充填時が、フィルターの第２ の側のコーティング完了と一致するように、フィルターを直ちに使用する。

ｂ）２枚のフィルターを準備するときは、同時に両方を充填するために急がな（ でもよいように、第２のチャンバーを充填する前に第１のチャンバーを充填でき るよう、コーティング時間を１５分間ずらすことを勧める。

チャンバーの準備 １、蒸留＊　（ｄＨ２０）保存浴からＮｅｕｒｏ　Ｐｒｏｂｅの４８ウエル走化 性チヤンバーを取り出す。きれいなｄＨ２０でよく洗浄する。頂部部品とガスケ ット（ｇａｓｋｅｔ）をティッシュで乾燥して、底部部品をきれいな窒素ガスで 吹き付は乾燥する。

２、チャンバー底部にのせる試験サンプルを準備する。各ウェルは約溶液２６０ −２６．５ｕｌを有している。

３、下のチャンバーにあるウェルにサンプル（約２６．１−２６．５ｕｌ）を加 える。

＊注、ａ）所望の″ポジティブな液体面の凹凸（ｍｅｎｉｓｃｕｓ）”を得るた めに、液体でやや“上部を除去”することが必要である。これは、残りのチャン バーを充填する間に起きる乾燥を中和する働きをする。泡の生成を避けること。

ｂ）最良の一貫性を得るためには、ポジティブな置換ピペットを使用する。

両チャンバー端における４個のウェルの最初と最後のカラム（Ａ、、Ｌ）は走化 性には用いないので、これらをＨＢ　Ｓ　Ｓで充填する。従って、上のチャンバ ーの同じ列もＨＢＳＳで充填し、細胞を充填しない。

４、フィルターの準備ができたら、上記した方法でＦＮ／ＨＢＳＳを注ぎ出す。

ペトリ皿から注意深くフィルターを持ち上げる。いずれの側も皿の端に触れては ならない。フィルターをゆっくりと持ち上げることにより、フィルター上の残り のＦＮ／ＨＢＳＳは少なくなる。この時点でフィルターを不注意に落としたり、 これに触れてはならない。

５、ピンセットでフィルターの両端を持ち上げて、フィルターの中央をチャンバ ー中央におろし、次いで底部ウェルを覆う。フィルターは光っている側を上にす るように！ ＊注：常にチャンバー７／フイルターの一貫性を保持すること：即ち、常にチャ コ／バーの商標を保持して、フィルターの」−左隅の部分を切り取ること。

６、必要な場合にのみ、フィルターを正しい位置に置くために匹調節する。

７、フィルターのすぐ上にガスケットを置くが、触れないようにする。

８、チャンバーの上半分をガスケットの頂部に置き、両者を一緒に下に押す３． スクリューに気を付けながら、皇二５八点下ど！！丈。

９、チャンバーをチェックし、ウェルを見渡してフィルター上ないかを再度確認 する：泡は走化性を妨害するので、あればこれを記録する。

１０、両端（Ａ、Ｉ、）の４個のウェルにＨＢＳＳ４５ｕｌを加える。

１１、次いで細胞懸濁液４５ｕｌ（即ち、１ｍｌ当たり０．７５ｘｌＯ’個の細 １抱）を、残りのウェルに加える。

＊注：底部の空気を捕捉しないようにピペットの先端を一定の角度にして細胞を 加える。もしも泡ができたら、注意深く液体を出して、再度充填する。充填後は 、すべてのウェルが均一に見えるようにする。そうでない場合には、捕捉空気を 疑い、やり直すこと。

１２、チャンバーをガラス又はポリプロピレンのトレイにのせて、水に浸したガ ーゼ片を置いて（これは湿度を増し、蒸発を防ぐ）、アルミニウムホイルでゆる やかにカバーする。

１３．３７℃、５％　ＣＯ２で４時間インキュベーションする。

フィルターの除去及びふき取り １、スライドガラスの一方の端に日付とチャンバー番号を刻む。アルコールでよ く清潔にし、乾燥する。

２、頂部プレートを下に持って残りのゴミを除く。

３、商標が上左隅になるように、ペーパータオル上にチャンバーを置く。

４、水平軸に沿って全チャンバーをペーパータオル上に逆さにする。

５、頂部プレートの四隅を押して、これが下へ落ちて底部プレートと平行になる ようにする。フィルターはガスケットに付いていなければならない。

６、底部プレートを除去して直ちにテルガジム（Ｔｅｒｇａｚｙｍｅ）溶液（テ ルガジム１／４ティースプーン／ｄＨ２０１００１００Ｏ中に浸す。

７、”移動した細胞”がここで現れてくる。ここからはフィルターの面を乱して はならない。

訳ピンセットでフィルターの一番右端をつまみ、左端はそのままの状態で、フィ ルターを少し右に引っ張り、端だけが縁にかかるようにする。

９、プラスティッククリップでこの端をつかみ、フィルターをガスケットから持 ち上げる。他の端に素早くもう１個のクリップをつける。チャンバーの頂部部品 を直ちにテルガジム中に入れる。

１０、細胞側を上にして（常に）非移動側をＰＢＳ中で湿らせる。”移動細胞” をＰＢＳで湿らせてはならない。

１１、フィルターをぴんと張り、ワイパーブレードに対して非移動側を引＜（一 方向のみに、一方の端から他方へ）。

１２、この工程を４−５回繰り返す。湿潤とふき取りの間の時間を最小にして、 非移動細胞が乾燥／固着して不完全な除去になることを防ぐ。各ふき取りの前に ワイパーブレードを常に乾燥する。

１３、適当な刻んだスライド上に、刻んだ方と同じ端に切り取った隅がくるが、 ただし反対側になるように、フィルターを置く。−夜乾燥させる。

１４、テルガジムに入れて置いたチャンバ一部品をｄＨ２０で洗浄し、チャンバ ーをきれいにするまで新しいｄＨ２０中に保存する。

フィルタ・−の染色 染色後、直ちにフィルターを読めるようにデンシトメーター（ＬＫＢ）の用意を しておく。

１、切り取った隅を持つ乾燥フィルター／スライドの端に、小さい黒のクリップ を置く。

２．３つの溶液の各々に、順次５回、各回に５秒ずつ浸すことにより、Ｌｅｕｋ ｏＳｔａｔ染色（Ｆｉｓｈｅｒブランド）する。溶液ごとに過剰の染料をペーパ ータオル又はガーゼでふき取る。

３．５回目の後、第３の染料に更に３０秒間フィルターを浸ける。

４、ｄＨ２０中でフィルターを洗浄する（ｄＨ２０を２回取り替える）。過剰の ｄＨ２０をふき取る。

５、他のきれいなガラススライド（マークなし）をフィルター上に直接のせて、 注意深く、しかししっかりと−緒に押し付けて空気の泡を追い出す。

６、デンシトメーターを読む。

染色フィルターのデンシトメーター読み取り１．１０−２０分間デンシトメータ ー（ＬＫＢ）を暖めてお（。

２、染色した、湿ったスライドを読み取りテーブルに置き、以下の正しいセツテ ィングにする： カラム　Ｘポジション　“　トラック”その他のデンシトメーターセツティング ３、スライドを並べる。カラムポジションを確認する。

４ｉ、スライドを動かさずに下にスライドを留める。

５、各列での“Ｙ”セツティングを確認する。

６、ルーラ−を”ｈｏｍｅ”に送る。”Ｅｃｓ”７、蓋を閉じる。

８、テ゛、／シトメーターを“Ｅｎｔｅｒ”　（コンピューター上で）にし、次 いで”６″（又は”Ｒｕｎ”）にする。

９、ＬＫＢの”ＧＳＸＬ″プログラムを用いて、デン・シトメーターからのピー ク面積を計算する。

チャンバーの掃除 以下の手順は、走化性チャンバー及びガスケットから残渣タンパク質などを除去 するのに用いる（出典　Ｔｅｒｒｉ　５ｕｐｅｒｄｏｃｋ、　１１ｇ：６１．２ ／２１／８９）。

１、汚れたガスケット及びチャンバーを脱イオン水でよく洗浄する。対応するガ スケットとチャンバーを１Ｔリツトルのプラスティックビーカー中に入れる（２ セツト／ビーカー）。

２．０．７５％テルガノム溶液（７，５ｇｍテルガジム／１リットルｄＨ２０； ５００−７５０ｍｌ／２チヤンバー）を５０℃に加熱する。５０℃を越えてはな らない。

３、チャンバーとカスケラトを５０℃テルガジムで覆う。

４、ビーカーを５０℃水浴中に入れる。水浴をカバーして２時間インキュベーシ ョンする。

＊がスケットの掃除については工程１０及び１１を参照されたい。

５、チャンバーのみを取り出し、ｄＨ２０でよく洗浄する。チャンバーを１リツ トルのプラスティックビーカー（１０００ｍｌ）中に入れる；２−３チヤンバー ／ビーカー）。

６、チャンバーを室温、ＩＭ　ＮａＯＨ（６００−７００ｍｌ／ビーカー）で覆 う。ビーカーをフォイルでカバーする。

７、ビーカーを５０℃のカバーした水浴中で３０分間インキュベーションする。

８、チャンバーをｄＨ２０で非常によく洗浄する。チャンバー及び大きな撹拌棒 を深いプラスティックタブに入れる。撹拌棒の回転を妨げないようにチャンバー （頂部及び底部）の向きを整える。タブを流しのそばのマグネティックスターラ ーに乗上る。

９、タブにｄＨ２０を満たし、２時間流しっばなし４にする。水が正しく循環し ているかヲ確認し、オ・−ハーフローしないようにタブ中に入れたザイフォンを 流しに導く。

１０、ガスケットを０７５％テルガジムをへ第１たビーカー中に人ねて、３０分 間超音波処理する４、 １１、ｄＨ２０でよく洗浄し、ガスケットを１リツトルのｄＨ２０中に入れる。

３０分毎に水を変えて、２時間超音波処理する。

１２、チャンバーとガスケットを組み立てて（スクリューで軽く留める）、新し いｄＨ２０を満たした平らなポリプロピレンのパンに入れる。アルミニウムホイ ルでカバーし、１週間に１回水を取り替える。

１３、使用前にチャンバー及びガスケットを新しいｄ、Ｂ２０でよく洗浄する。

実施例１２ ＫＣＣＡ活性は以下の手順によって定義される。

細胞の調製 王、正常ヒト表面上皮角化細胞（Ｎｏｒｍａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ｅｐｉｄｅｒｍａ Ｉ　Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ：ＮＨＥＫ）のＴ　−、−２５フラスコ中の増殖 細胞、ＫＧＭ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｓｕ ｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　Ｓｅｒｕｍ　Ｆｒｅｅ）の５００ｍ１ビン、Ｋ 　Ｂ　Ｍ（Ｋ、ｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ　Ｂａ５ａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）の５００ ｍ１ビン、及び、ＨＥＰＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ　５ｏｌｕｔｉ ｏｎ　Ｔｒｙｐｓｉｎ　［（０，００２５％　Ｗ／Ｖ）／ＥＤＴＡ　（０，０１ ％　Ｗ／Ｖ）］溶液、トリプシン中和溶液からなる継代培養試薬を含むＥｐｉＰ ａｅｋをＣ１゜ｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、 Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａから得る。

２、到着後、これを開き、３７℃、５％　ＣＯ２で、封をしたＴ−２５フラスコ を平衡化温度にインキュベーションする。

３、滅菌容器にＫＧＭ５ｍｌを暖める。

４、滅菌フィールド（バイオフード）下でＴ−２５フラスコを７０％イソプロピ ルアルコールで徹底的に拭う。

５、培地を除去する；少量の漂白剤を含む容器に捨てて、暖めたＫＧＭ５ｍｌで 置換する。キャップをねじって蓋をするが、あまり固くしない。

６．３７℃のインキュベーションに戻し、継代培養用に５％　ＣＯ２で２４−４ ８時間湿潤化する。細胞培養物を集密的にしてはならない。

Ｔ−２５フラスコからの細胞継代培養 １、バイオフード下に、培地を除去（少量の漂白剤を含む容器に捨てる）して、 ＨＥＰＥＳ緩衝液２緩衝液２胞ｌ洗浄する。

２、ＨＥＰＥＳを捨てて、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液２ｍ、１を加え、２分間お く。

３、トリプシン化 管中に入れる。フラスコのギャップをして顕微鏡下で観察する。

４、細胞が分離して丸くなるのを観察する。更に３分後に、フラスコを一方の手 のひらで１回と、他方の手のひらで１回たたく。顕微鏡下で細胞が浮遊するのを 観察する。トリプシン化のため、４分以上にはならないこと。

スコを洗浄して、遠心管に入れる。

６、顕微鏡下でフラスコをチェックする：キャップを閉じて細胞が残っていない か観察する。

７、もし大量の細胞が残っていたら、工程１から全工程を繰り返して、遠心倶に 加える。もし全く残っていないか、或いは少量だけなら、遠心工程に進む。

８．２５℃、２２０ｘｇで１０分間細胞を遠心して、上澄みを捨てる。

９、細胞ベレットを暖めたＫＧＭ５ｍｌに再懸濁して、血球計数器でカウントす る。

１０、所望の密度で新しいフラスコに接種する。

Ｔ−７５フラスコからの細胞継代培養（−７０−８０％集密的）１、以下の量を 用いる以外はＴ−２５フラスコと同様の手順に従う：ａ、ＨＥＰＥＳ緩衝液５ｍ １ ｂ、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液７ｍ１ Ｃ，トリプシン中和溶液７ｍｌで細胞をフラスコから洗いだし、ブルーマックス チューブに移す。

ｄ、フラスコをトリプシン中和溶液３ｍｌで再び洗浄し、ブルーマックスチュー ブに入れる。

２．２５℃、２２０ｘｇで１０分間遠心する。上澄みを捨てる。

３、細胞ペレットをＫＢＭ５ｍｌに再懸濁して、遠心管中に入れる。

４、遠心し、上澄みを捨てて、ＫＢＭ２ｍｌに再懸濁して血球計数器でカウント する。

５、走化性アッセイを実施し、新しい密度をセントする。

注・１、走化性の目的のためには、ベレットをＫＢＭに再懸濁する。

２、新しい細胞密度をセットするための細胞継代培養にのみＫＧＭを使用する。

３、新しいＫＧＭ　Ｍ、Ｗ、Ｆを細胞に与える。

Ｔ−７５７ラスー）用＝１５ｍｌ　ＫＧＭＴ−２５フラスコ用＝５ｍｌ　ＫＧＭ 走化性のための細胞調製 １、Ｔ−７５フラスコからの細胞継代培養のところで記載した手順に従って細胞 をトリプシン化し、遠心する。

２、細胞をＫＢＭに再懸濁して、血球計数器でカウントする。合計細胞数−（平 均カランＪ・）ｘ　（ｍｌ　ＫＢＭ）ｘ　Ｏリバンブルー希釈）ｘ　（１ｘｌＯ ’）３、最終的細胞希釈度を５．５６ｘｌＯ’細胞／ｍｌ（又は２５．０００細 胞７／′４５ｕ　Ｉ）にする。

必要時まで細胞を氷上に保存する。

フィルターの調製 １．５ｕｇ／ｍ＋フィブロネクチン　２０ｍ１　（Ｓｉｇｍａ　＃Ｆ４７５９） を凍結ストックから調製する。調製にはポリプロピレン滅菌チ・ノブ及びチュー ブを用いる。（例、凍結スＩ・ツク−０，１ｍｇ／ｍｌ　ｄＨ２−ＨＢＳＳ０従 ってストック１，０００ｕｌをＨＢＳＳ１９．Ｏｍ、ｌに希釈する）使用時まで 水上に保存する。

２、】チャンバー当たり１個のＮｕｃ　１ｅｏｐｏｒｅポリプロピレンフイルタ ー（８，Ｏｕｍ　ｐｏｒｅｓ、ＰＶＰＦ、Ｎｅｕｒｏ　Ｐｒｏｂｅ　Ｉｎｃ、、 ３０３−２２９−８５９８）を使用する。

３、フィルター＊の方向性を与えるために、フィルターの光っている側の上左隅 を切り取る。フィルターの取り扱いは、決して手ではなく、ビンセットで行い、 かつ端のみを持つこと。

４、滅菌ペトリ皿の中央にＦＮ／ＨＢＳＳ　３−４ｍ１を入れる。光っている側 を下にして、ＦＮ／ＨＢＳＳの上にフィルターを置き、ＦＮ／ＨＢＳＳをフィル ターの下に広がらせるようにし：フィルター上にＦＮ／ＨＢＳＳを全くのせない ようにする。

５、ベトリ皿の蓋をして室温で３０分間置く。

６、ＦＮ／ＨＢＳＳを注意深く注ぎ出しくフィルターをくっつかせたまま、中身 を片側に傾け、完全に注ぎ出す）、フィルターを持ち上げて、新しいＦ　Ｎ／Ｈ Ｂ５５３−４ｍ１を中央に入れて、フィルターの他の側について（曇っている側 を下にする）同様に繰り返す。

７、これでコーティングは完了し、フィルターは使用可能になる。

＊注：ａ）一貫性を得るために、底部チャンバーの充填時が、フィルターの第２ の側のコーティング完了と一致するように、フィルターを直ちに使用する。

ｂ）２枚のフィルターを準備するときは、同時に両方を充填するために急がなく てもよいように、第２のチャンバーを充填する前に第１のチャンバーを充填でき るよう、コーティング時間を１５分間ずらすことを勧める。

チャンバーの準備 １、蒸留水（ｄＨ２０）保存浴からＮｅｕｒｏ　Ｐｒｏｂｅの４８ウエル走化性 チヤンバーを取り出す。きれいなｄＨ，ｏでよ（洗浄する。頂部部品とガス炉・ ソトをティッンユで乾燥して、底部部品をきれいな窒素ガスで吹き付は乾燥する 。

２、チャンバー底部にのせる試験寸ンブルを準備する。各ウェルは約溶液２６゜ ０−２６．５ｕｌを有している。

３、下のチャンバーにあるウェルにサンプル（約２６．１−２６．５１１１）を 加える。

＊注：ａ）所望の”ポジティブな液体面の凹凸”を得るために、液体でやや”上 部を除去“することが必要である。これは、残りのチャンバーを充填する間に起 きる乾燥を中和する働きをする。泡の生成を避けること。

ｂ）最良の一貫性を得るためには、ポジティブな置換ピペットを使用する。

両チャンバー端における４個のウェルの最初と最後のカラム（Ａ、、Ｌ）は走化 性には用いないので、これらをＨＢＳＳで充填する。従って、上のチャンバーの 同じ列も）ＩＢＳＳで充填し、細胞を充填しない。

４、フィルターの準備ができたら、上記した方法でＦＮ／ＨＢＳＳを注ぎ出す。

ベトリ皿から注意深くフィルターを持ち上げる；いずれの側も皿の端に触れては ならない。フィルターをゆっくりと持ち上げることにより、フィルター上の残り のＦＮ／ＨＢＳＳは少な（なる。この時点でフィルターを不注意に落としたり、 これに触れてはならない。

５、ビンセットでフィルターの両端を持ち上げて、フィルターの中央をチャンバ ー中央におろし、次いで底部ウェルを覆う。フィルターは光っている側を上にす るように！ ＊注：常にチャンバー／フィルターの一貫性を保持すること；即ち、常にチャン バーの商標を保持して、フィルターの上左隅の部分を切り取ること。

６、必要な場合にのみ、フィルターを正しい位置に置くために＋ｐ調節する。

７、フィルターのすぐ上にガスケットを置くが、触れないようにする。

８、チャンバーの上半分をガスケットの頂部に置き、両者を一緒に下に押す。ス クリューに気を付けながら、きっちりと下に押す。

９、チャンバーをチェックし、ウェルを見渡してフィルターの下に泡ができてい ないかを再度確認する：泡は走化性を妨害するので、あればこれを記録する。

１０、両端（Ａ、Ｌ）の４（ＩＩのウェルにＨＢＳＳ４５ｕｌを加える。

１１、次いで細胞懸濁液４５ｕｌ　（即ち、１ｍｌ当たり０．７５ｘｌＯ’個の 細胞）を、残りのウェルに加える。

＊注：底部の空気を捕捉しないようにピペットの先端を一定の角度にして細胞を 加える。もしも泡ができたら、注意深く液体を出して、再度充填する。充填後は 、すべてのウェルが均一に見えるようにする。そうでない場合には、捕捉空気を 疑い、やり直すこと。

１２、チャンバーをガラス又はポリプロピレンのトレイにのせて、水に浸したガ ーセ片を置いて（これは湿度を増し、蒸発を防ぐ）、アルミニウムホイルでゆる やかにカバーする。

１３．３７℃、５％　ＣＯ２で４時間インキュベーションする。

フィルターの除去及びふき取り １、スライドガラスの一方の端に日付とチャンバー番号を刻む。アルコールでよ （清潔にし、乾燥する。

２、頂部プレートを下に持って残りのゴミを除く。

３、商標が上左隅になるように、ペーパータオル上にチャンバーを置く。

４、水平軸に沿って全チャンバーをペーパータオル上に逆さにする。

５、頂部プレートの四隅を押して、これが下へ落ちて底部プレートと平行になる ようにする。フィルターはガスケットに付いていなければならない。

６、底部プレートを除去して直ちにテルガジム溶液（テルガジム１／４ティース プーン／　ｄ　Ｈ２０１０００ｍ　ｌ　）中に浸す。

７、”移動した細胞”がここで現れてくる。ここからはフィルターの面を乱して はならない。

８、ビンセットでフィルターの一番右端をつまみ、左端はそのままの状態で、フ ィルターを少し右に引っ張り、端だけが縁にかかるようにする。

９、プラスティッククリップでこの端をつかみ、フィルターをガスケットから持 ち上げる。他の端に素早くもう１個のクリップをつける。チャンバーの頂部部品 を直ちにテルガジム中に入れる。

１０、細胞側を上にして（常に）非移動側をＰＢＳ中で湿らせる。″移動細胞“ をＰＢＳで湿らせてはならない。

１１、フィルターをぴんと張り、ワイパーブレードに対して非移動側を引＜（一 方向のみに、一方の端から他方へ）。

１２、この工程を４−５回繰り返す。湿潤とふき取りの間の時間を最小にして、 非移動細胞が乾燥／固着して不完全な除去になることを防ぐ。各ふき取りの前に ワイパーブレードを常に乾燥する。

１３、適当な刻んだスライド上に、刻んだ方と同じ端に切り取った隅がくるが、 ただし反対側になるように、フィルターを置く。−夜乾燥させる。

１４、テルガシムに入れて置いたチャンバ一部品をｄＨ２０で洗浄し、チャンバ ーをきれいにするまで新しいｄＨ２０中に保存する。

フィルターの染色 染色後、直ちにフィルターを読めるようにデンシトメーター（ＬＫＢ）の用意を しておく。

１、切り取った隅を持つ乾燥フィルター／スライドの端に、小さい黒のクリップ を置く。

２．３つの溶液の各々に、順次５回、各回に５秒ずつ浸すことにより、Ｌｅｕｋ ｏＳｔａｔ染色（Ｆｉｓｈｅｒブランド）する。溶液ごとに過剰の染料をペーパ ータオル又はガーゼでふき取る。

３．５回目の後、第３の染料に更に３０秒間フィルターを浸ける。

４、ｄＨ２０中でフィルターを洗浄する（ｄＨ２０を２回取り替える）。過剰の ｄＨ７Ｏをふき取る。

５、他のきれいなガラススライド（７−りなし７）をフィルター上に直接のせて 、注意深く、しかししっかりと−緒に押し付けて空気の泡を追い出す。

６、デンシトメーターを読む。

染色フィルターのデンシトメーター読み取り１．１０−２０分間デンシトメータ ー（ＬＫＢ）を暖めておく。

２、染色した、湿ったスライドを読み取りテーブルに置き、以下の正しいセツテ ィングにする カラム　Ｘポジション　”　トラック”その他のデンシトメーターセツティング ３、スライドを並べる。カラムポンシミンを確認する。

４、スライドを動かさずに下にスライドを留める。

５、各列での”Ｙ”セツティングを確認する。

６、ルーラ−を”　ｈｏｍｅ”に送る。”Ｅｃｓ−７、蓋を閉じる。

８、デンシトメーターを”Ｅｎｔｅｒ”　（コンピューター上で）にし、次いで ′６”　（又は”Ｒｕｎ”）にする。

９、ＬＫＢの”ＧＳＸＬ”プログラムを用いて、デンシトメーターからのピーク 面積を計算する。

チャンバーの掃除 以下の手順は、走化性チャンバー及びガスケットから残渣タンパク質などを除去 するノニ用いる（出典：Ｔｅｒｒｉ　５ｕｐｅｒｄｏｃｋ、　１１８：６１．２ ／２１／８９）。

１、汚れたガスケット及びチャンバーを脱イオン水でよく洗浄する。対応するガ スケットとチャンバーを１リツトルのプラスティックビーカー中に入れる（２セ ツト／ビーカー）。

２．０．７５％デルガジム溶液（７，５ｇｍテルガジム／１リットルｄＨ２０； ５００−７５０ｍｌ／２チヤンバー）を５０６Ｃに加熱する。５０℃を越えては ならない。

３、チャンバーとガスケットを５０’Ｃテルガジムで覆う。

４、ビーカーを５０°Ｃ水浴中に入れる。水浴をカバーして２時間インキュベー ションする。

＊カスケラトの掃除については工程１０及び］−１を参照されたい。

５、チャンバーのみを取り出し、ｄ　Ｈ２０でよく洗浄する。チャンバーを１す ・ソトルのプラスティックビーカー（１０００ｍｌ）中に入れる；２−３チヤン バー／ビーカー）。

６、チャンバーを室温、ＬＭ　ＮａＯＨ（６００−７００ｍｌ／ビーカー）で覆 う。ビーカーをフォイルでカバーする。

７、ビーカーを５０℃のカバーした水浴中で３０分間インキュベーションする。

８、チャンバーをｄＨ２０で非常によ（洗浄する。チャンノく−及び大きな撹拌 棒を深いプラスチインクタブに入れる。撹拌棒の回転を妨げないようにチャンバ −（頂部及び底部）の向きを整える。タブを流しのそばのマグネテ什ンクスクー ラーに乗せる。

９、タブにｄＨ２０を満たし、２時間流しっばなしにする。水が正しく循環して いるかを確認し、オーバーフローしないようにタブ中に入れたサイフオンを流し に導く。

１０、ガスケットを０．７５％テルガジムを入れたビーカー中に入れて、３０分 間超音波処理する。

１１、ｄＨ２０でよく洗浄し、ガスケットを１リツトルのｄ）Ｔ２Ｏ中に入れる 。３０分毎に水を変えて、２時間超音波処理する。

１．２、チャンバーとガスケットを組み立てて（スクリューで軽く留める）、新 しいｄＨ２０を満たした平らなポリプロピレンのパンに入れる。アルミニウムホ イルでカバーし、１週間に１回水を取り替える。

１３、使用前にチャンバー及びガスケットを新しいｄＨ２０でよく洗浄する。

実施例１３ ＲＣＡＡ活性は以下の手順で定義される。

血管形成促進活性を試験するための各サンプル用として、２〜４個のポリマーペ レットを作製する。Ｈｙｄｒｏｎ＠ポリマーとして入手可能な、タイプＮＣＣ。

細胞培養グレード（ＨｙｄｒｏＭｅｄ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓ ｗｉｃｋ、ＮＪ　０８９０１から市販されている）の１０％　ｖ　／　ｖポリマ ー溶液１．７０％　Ｖ／Ｖエタノール中の１％　Ｖ、／Ｖポリエチレングリコー ルを準備する（これ１′ｌ後ポ１ツマ−溶液と呼ぶ）。ポリマー溶液を試験サン プルと１コＩＶ　／　Ｖで混合する。プラスティックのオートクレーブバッグの 一片を、ビンと張られていることを確認しながら、平らな表面にテープ付けする 。次いでこの表面をアルコールでふき取り、乾燥させる。１：１混合物２０ｕｌ をプラスティック上に滴下する。次いでポリマーペレットを減圧下で２時間、又 は乾燥するまで、乾燥させる。

角膜移植アッセイを４−６ボンドのＮｅｗ　Ｚｅａｌ、ａｎｄシロウサギ上で実 施する。Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｒ１ｓｔｏｌ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｉｅｓ、５ｙｒａｃｕｓｅ、ＮＹ　１３２０１からＫｅｔａｓｅｔｌ ｌとして市販されている、塩酸ケタミン１００ｍｇ／ｍｌとＡ、ｖｅｃｏ　Ｃｏ 、。

Ｉｎｃ、、Ｆｏｒｔ　Ｄｏｄｇｅ、ＩＡ　５０５０１からＰ　ｒ　ｏｍａ　ｃ　 ｅ＠として市販されているアセプロマシンマレエート１０ｍｇ／ｍｌとを同じシ リンジ中で１：１ｖ／ｖで混合することによって、麻酔を調製する。各ウサギに つき４−５ｃｃを用いる。２３ゲージの針を用いて、麻酔剤を臀筋又は腓腹筋に 注射して、注射後その部分をやさしくもむ。ウサギが我慢できずに上向きに横た わったら、正しく麻酔されたことになり、これには通常１０−１５分を要する。

ウサギを滅菌ドレープに置く。Ａｌｌｅｒｇａｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ ｓｓ、Ｉｎｃ、、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ　９２７１３から０ｐｈｔｈｅｔｉｃ＠と して市販されている０　５％塩酸プロバラシン３−５滴を、部分麻酔として冬目 に適用する。試験中に目が乾燥したときにはいっても、必要に応じて麻酔溶液を 用いる。

小さい組織用ピンセットを用いて眼窩を引き出す。ビンセットをゆっくりと目の 内隅に動かして、視神経を締め付けないように注意しながら、少量の組織をつま み、作業中に目がこの位置に止まっていることを確認する。

Ｂｅａｖｅｒ　Ｓｕｒｇｉｃａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ０ ２１５４から市販されているＢｅａｖｅｒ　ｅｙｅ　ｂｌａｄｅ　Ｎｏ、５２１ ０のスケ−ベル（ｓｃａｐｅｌ）を角膜に沿って静かに引き、約３．Ｑｍｍ長さ の切片を切り取る。眼房水をしみ出させる角膜穿孔を引き起こすことがある３゜ もしもこれが起きた場合には、動物を殺してしまわねばならない。

Ｕ、Ｍｕｅｌ　ｌｅｒ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ　６０６４８から市販されている 製品＃０Ｐ−２０４０のＥｌｓｃｈｎｉｇ毛様体剥離スパーチル（１ｍｍ幅、Ｉ Ｑｍｍ長さ）を用いて、角膜を通って毛細管床の方向にそっと管を作り、毛細管 床から約２ｍｍのところで止める。探針の先端を左右に動かしてポリマーベレッ トのための”ボケッピを作るが、ペレットが毛細管床から１ｍｍよりも近（なら ないように、探針を進め過ぎないよう注意する。ビンセットでポリマーペレット をプラスティックから持ち上げて、眼の切片の場所に貢ぐ。スパーチルを用いて 、ペレットを管に沿ってポケットまで押し込む。この領域を潤滑化し、ベレ、。

ト挿入を容易にするために麻酔溶液数滴を用いる。ペレットはポケット内に濃縮 されねばならない。角膜の外側にある管に沿ってスパーチルを引くことにより、 ポケットから捕捉空気を押し出す。

次いでビンセットを緩める。まぶたをそっと引き上げて手で開くと、目は正常の 位置に戻る。感染の可能性を抑えるために、Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ　Ｗｅｌｌｃｏ ｍｅ　Ｃｏ、、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｔｒｉａｎｇｌｅ　Ｐａｒｋ、ＮＣ２７７０ ９からＮｅｏｓｐｏｒｉｎ＠眼科溶液として市販されている抗菌溶液３ｍを冬目 に投与する。

試験すべき各サンプルにつきウサギ１匹を用いる（即ち、ウサギ１匹につき同じ サンプルを２ベレツト、冬目につき１個用いる）。

３．５及び７日目に、ペレット方向に毛細管が直接成長しているかについて、目 を観察して、Ｇｉｍｂｒｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ 　丁ｎｓｔ、　５２：４１３−４２７（１９７４）及びＢａｎｄａ　ｅｔ　ａｌ ｌ、　Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、　４．５０３．０３８　（いずれもその 内容全てを参照することにより、ここに包含される）の方法に従ってグレート分 けする。毛細管の成長を記録するために７日目に目の写真を撮る。従って、本発 明はその精神又は本質的特質を逸脱することなく、他の特殊な態様で実施するこ とが可能である。

これまでの記載から、本発明の精神又は範囲を逸脱することなく、上述した方法 や手段の各種変更が可能であることが当業者には自明であろう。

ｏｌ で 口Ｉ 瞳 鳩１ 国際調査報告 ＢＥＴＡ　ＦＯ＞、／、：）’ｒＬプンン　（、ｕｇ／ｍｌ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、血小板から放出された物をサンプル中に存在する成分の量を示唆するアッセ イを血小板から放出された物のサンプルについて実施し：そして選択された量の 血小板から放出された物を含む血小板放出物製品を製造し、該量は血小板から放 出された物のサンプル中の成分の量と、血小板放出物製品中に含まれるべき同一 成分のあらかじめ定められた範囲の量とを比較することによって選択される、 ことからなる血小板放出物製品の製造方法。 ２、選択された量の血小板から放出された物を含む血小板放出物製品を局所的に 適用することからなり、該量は血小板から放出された物のサンプル中の成分の量 と、血小板放出物製品中に含まれるべき同一成分のあらかじめ定められた範囲の 量とを比較することによって選択される、ことからなる組織の治療方法。 ３、血小板放出物製品及び血小板から放出された物のサンプル中に含まれる血小 板から放出された物が、血小板の同じドローから得られる、請求の範囲第１項又 は第２項記載の方法。 ４、血小板放出物製品及び血小板から放出された物のサンプル中に含まれる血小 板放出物が、同じ動物又はヒトに由来する血小板の異なるドローから得られる、 請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 ５、血小板放出物製品及び血小板から放出された物のサンプル中に含まれる血小 板放出物が、動物又はヒトドナー群に由来する血小板ドローからの血小板プール から得られる、請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 ６、血小板から放出された物のサンプル中に存在する成分が、ベータートロンボ グロブリン（ｂｅｔａ−ｔｈｒｏｍｂｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、血小板由来増殖因 子（ｐｌａｔｅｌｅｔ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、血小 板由来血管形成誘導因子（ｐＩａｔｅｌｅｔ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ａｎｇｉｏｇｅ ｎｅｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ）、血小板因子４（ｐｌａｔｅｌｅｔ　ｆａｃｔｏｒ 　４）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒ ｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａｃｉｄｉｃ　ｆｉｂｒ ｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、トランスフォーミング成長因子 アルファ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ａｌｐｈ ａ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒ ｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｂｅｔａ）、血小板由来上皮増殖因子（ｐｌａｔｅｌ ｅｔ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）及 びフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）からなる群から選択される、請 求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 ７、血小板から放出された物のサンプル中に含まれる成分がベータートロンボグ ロブリンである、請求の範囲第６項記載の方法。 ８、血小板放出物製品が、血小板放出物製品１ミリリットル中に約２５ナノグラ ムよりも高い濃度でベータートロンボグロブリンを含む、請求の範囲第７項記載 の方法。 ９、血小板から放出された物のサンプル中に含まれる成分が血小板由来増殖因子 である、請求の範囲第６項記載の方法。 １０、血小板放出物製品が、血小板放出物製品１ミリリツトル中に約０．２ナノ グラムよりも高い濃度で血小板由来増殖因子を含む、請求の範囲第９項記載の方 法。 １１、血小板から放出された物のサンプル中に含まれる成分が血小板因子４であ る、請求の範囲第６項記載の方法。 １２、血小板放出物製品が、血小板放出物製品１ミリリットル中に約１０ナノグ ラムよりも高い濃度で血小板因子４を含む、請求の範囲第１１項記載の方法。 １３、血小板から放出された物のサンプル中に含まれる成分が、血小板由来血管 形成誘導因子である、請求の範囲第６項記載の方法。 １４、選択された量の血小板から放出された物が、組織治療の実質的効能性をも たらすのに十分である、請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 １５、効能性が少なくとも機能性評価スコアのグレード２と同等である、請求の 範囲第１４項記載の方法。 １６、組織が哺乳動物組織である、請求の範囲第２項記載の方法。 １７、組織がヒト組織である、請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、血小板が哺乳動物血小板である、請求の範囲第３項記載の方法。 １９、血小板がヒト血小板である、請求の第１８項記載の方法。 ２０、動物が哺乳動物である、請求の範囲第４項記載の方法。 ２１、動物が哺乳動物である、請求の範囲第５項記載の方法。 ２２、血小板から放出された物のサンプルの活性量を示唆するアッセイを血小板 放出された物のサンプルについて実施し；そして選択された量の血小板放出物を 含む血小板放出物製品を製造し、該量は血小板から放出された物のサンプルの活 性量と、血小板放出物製品の同一活性のあらかじめ定められた範囲の量とを比較 することによって選択される、ことからなる血小板放出物製品の製造方法。 ２３、選択された量の血小板からの放出物を含む血小板放出物製品を局所的に適 用することからなり、該量は血小板から放出された物のサンプルの活性量と、血 小板放出物製品の同一活性のあらかじめ定められた範囲の量とを比較することに よって選択される、 ことからなる組織の治療方法。 ２４、血小板放出物製品及び血小板から放出された物のサンプル中に含まれる血 小板放出が、血小板の同じドローから得られる、請求の範囲第２２項又は第２３ 項記載の方法。 ２５、血小板放出物製品及び血小板から放出された物のサンプル中に含まれる血 小板放出物が、同じ動物又はヒトに由来する血小板の異なるドローから得られる 、請求の範囲第２２項又は第２３項記載の方法。 ２６、血小板放出物製品及び血小板から放出された物のサンプル中に含まれる血 小板放出物が、動物又はヒトドナー群に由来する血小板ドローからの血小板プー ルから得られる、請求の範囲第２２項又は第２３項記載の方法。 ２７、血小板から放出された物のサンプルの活性が、繊維芽細胞分裂促進活性（ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）、内皮細胞走 化性活性（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ　ａｃｔ ｉｖｉｔｙ）、ウサギ角膜アッセイ活性（ｒａｂｂｉｔ　ｃｏｒｎｅａｌ　ａｓ ｓａｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）及び角化細胞走化性活性（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔ ｅ　ｃｅｌｌ　ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）からなる群から選択 される、請求の範囲第２２項又は第２３項記載の方法。 ２８、血小板から放出された物のサンプルの活性が繊維芽細胞分裂促進活性であ る、請求の範囲第２７項記載の方法。 ２９、血小板放出物製品が、血小板放出物製品１ミリリットル中に約２．５　ｌ ／ＥＤ−５０ユニットよりも高い繊維芽細胞分裂促進活性を有する、請求の範囲 第２８項記載の方法。 ３０、組織が哺乳動物組織である、請求の範囲第２３項記載の方法。 ３１、組織がヒト組織である、請求の範囲第３０項記載の方法。 ３２、血小板が哺乳動物血小板である、請求の範囲第２４項記載の方法。 ３３、血小板がヒト血小板である、請求の第３２項記載の方法。 ３４、動物が哺乳動物である、請求の範囲第２５項記載の方法。 ３５、動物が哺乳動物である、請求の範囲第２６項記載の方法。 ３６、選択された量の血小板から放出された物が、組織治療の実質的効能性をも たらすのに十分である、請求の範囲第２２項又は第２３項記載の方法。 ３７、効能性が少なくとも機能性評価スコアのグレード２と同等である、請求の 範囲第３６項記載の方法。 ３８、（ｉ）血小板放出サンプル中の成分の量と、血小板放出物製品中に含まれ るべき同一成分のあらかじめ定められた範囲の量とを比較することによって選択 される、選択された量の血小板から放出された物；及び（ｉｉ）該血小板放出物 のための医薬的に受容し得る担体又は希釈剤からなる血小板放出物製品。 ３９、組成物が、血液又は血漿汚染物、及び血小板に含まれるが、血小板によっ て放出されない血小板ゴーストや他の物質を実質的に含まない、請求の範囲第３ ８項記載の方法。 ４０、（ｉ）血小板から放出された物のサンプルの活性量と、血小板放出物製品 の同一活性のあらかじめ定められた範囲の量とを比較することによって選択され る、選択された量の血小板放出物；及び（ｉｉ）該血小板放出物のための医薬的 に受容し得る担体又は希釈剤からなる血小板放出物製品。 ４１、組成物が、血液又は血漿汚染物、及び血小板に含まれるが、血小板によっ て放出されない血小板ゴーストや他の物質を実質的に含まない、請求の範囲第４ ０項記載の方法。