NL8520384A - Wondhelende middelen. - Google Patents

Description

N.o. 34025 8 5 2 0 3 8 4

Wondhelende middelen.

Gebied van de uitvinding

Deze uitvinding heeft betrekking op wondhelende middelen, in het bijzonder angiogene faktoren en groeifaktoren, op de produktie daarvan uit bloed en op het gebruik daarvan ter bevordering van het genezen van 5 wonden.

Achtergrond van de uitvinding

Angiogenese, de proliferatie en gerichte groei van capillair endo-theel, vormt met fibroplasie en collageensynthese de integrale componenten van de respons van een gastheer op wondvorming. De activering 10 van bloedplaatjes en de stollingscascade behoren tot de eerste reacties op verwonding.

Door trombine geactiveerde bloedplaatjes geven een mitogeen, of groeifaktor, voor fibroblasten en gladde spiercellen af en stimuleren een verhoogde collageensynthese door gladde spiercellen in vitro. Het 15 mitogeen, (de van bloedplaatjes afgeleide groeifaktor, in het vervolg aangeduid met PDGF) is samengesteld uit twee polypeptiden. Een artikel waarin PDGF werd beschreven werd in 1982 gepubliceerd door G.R. Grotendorst, T. Chang, H.E.J. Seppa, H.K. Kleinman en G.R. Martin in het Journal of Cellular Physiology onder de titel "Platelet-Derived Growth 20 Factor is a Chemoattractant for Vascular Smooth Muscle Cells", vol.

113, biz. 261-266. Het artikel is hierin door verwijzing opgenomen.

Door met trombine geactiveerde bloedplaatjes wordt ook een niet-mitogene stof, angiogene faktor genaamd, geproduceerd en deze stimuleert de haarvatgroei. Er zijn verscheidene angiogenesefaktoren bekend 25 waaronder tumor-, netvlies- en wondvocht-angiogenesefaktoren. Het is niet bekend of alle angiogenesefaktoren een gemeenschappelijk werkingsmechanisme op capillaire endotheelcellen hebben.

Angiogenesefaktoren werden geïsoleerd en door M.S. Banda, D.R. Knighton, T.K. Hunt en Z. Werb beschreven in Proc. Nat‘1. Acad.

30 Sci. U.S.A. (7773-7777, december 1982) in een artikel met de titel "Isolation of a nonmitogenic angiogenesis factor from wound fluid", waarvan het geopenbaarde door verwijzing hierin is opgenomen.

Angiogenese en van bloedplaatjes afgeleide groeifaktoren worden beschreven door D.R. Knighton, T.K. Hunt, K.K. Thakral en W.H. Goodson 35 III in "Role of Platelets and Fibrin in the Healing Sequence", Annals of Surgery 196: 379-388 (1982), waarvan het geopenbaarde door verwijzing hierin is opgenomen. In dit artikel wordt de geslaagde behandeling van een niet-genezende wond bij een patiënt beschreven waarin een en- 8520384 2 kele, uit tien eenheden bestaande bloedplaattransfusie werd gegeven. De wond genas in drie weken.

Uit een recente studie is gebleken, dat wanneer het normale genezingsproces van het lichaam functioneert, dit slechts met een effecti-5 viteit van 50% geschiedt.

Een menselijke angiogene faktor werd geproduceerd uit menselijke voorhuidfibroblasten volgens het Amerikaanse octrooi schrift 4.273.871 van Tolbert et al. Een publiek beschikbare cellijn van voorhuidfibrobl asten wordt gebruikt voor het produceren van een angiogene faktor.

10 In het Amerikaanse octrooi schrift 4.479.896 van Antoniades dat dat verwijzing hierin is opgenomen, worden van bloedplaatjes afgeleide groeifaktoren gekarakteriseerd en geëxtraheerd voor bestudering met behulp van gelelektroforese.

Beknopte beschrijving van de uitvinding 15 Door thrombine geactiveerde bloedplaatjes hebben het vermogen om angiogenese, verhoogde collageensynthese en celdeling en cel groei te stimuleren. Gevonden is dat monsters vol bloed kunnen worden gebruikt voor de bereiding van een met bloedplaatjes verrijkt plasma dat, wanneer het wordt geactiveerd door trombine, angiogenese- en groeifaktoren 20 bevat die kunnen worden gebruikt om het genezingsproces van wonden te versnellen.

Voor het verkrijgen van een plasma dat rijk is aan bloedplaatjes wordt bloed gestabiliseerd en gecentrifugeerd. Het bloed wordt gestabiliseerd door mengen met citraat-fosfaat-dextrose in een verhouding van 25 1:5 (20% oplossing). Het plaatjesrijke plasma (hierna genoemd PRF) wordt bij voorkeur nogmaals gecentrifugeerd totdat een hoge concentratie plaatjes is verkregen. De bloedplaatjes worden dan in een plaatjes-buffer gebracht. De concentratie plaatjes dient tenminste 1.000.000 plaatjes per milliliter te zijn. Bij voorkeur is de concentratie in de 30 orde van 1.000.000.000 plaatjes per milliliter.

Aan het PRP wordt trombine toegevoegd teneinde de plaatjes te activeren. Bij voorkeur worden per milliliter PRP ongeveer 1 tot ongeveer 10 eenheden trombine gebruikt. De met trombine geactiveerde bloedplaatjes geven van plaatjes afgeleide groeifaktoren (PDGF) en van plaatjes 35 afgeleide angiogenesefaktoren (hierna PDAF genoemd) af. De bloedplaatjes en het trombine worden bij kamertemperatuur ongeveer 5 tot 10 minuten geïncubeerd.

Het geactiveerde PRP met daarin PDGF en PDAF wordt bij voorkeur toegevoegd aan een biologisch geschikte macromoleculaire stof die als 40 drager fungeert. Eerst worden de plaatjes bij ongeveer 950 x g gecen- 8520584 3 trifugeerd en wordt de bovenstaande vloeistof zonder plaatjes gemengd met de drager. Bij voorkeur wordt een microkristallijn collageen zoals een collageen van het merk Aviten^, verkrijgbaar bij FMC Corp.,

Avicel Dept., Marcus Hook, PA 19061, gebruikt als biologisch verenigba-5 re drager. Microkristallijne collagenen zijn biologisch verenigbaar met het lichaam. Er wordt voldoende drager toegevoegd om al het uit het bloed verkregen plaatjesrijke plasma op te zuigen. Een bloedmonster van 40 ml vereist bijvoorbeeld doorgaans ongeveer 25 ml drager na verrijking. De aldus verkregen pasta wordt bij voorkeur op ijs of in een 10 koelkast bewaard.

De bij Pharmacia Fine Chemicals, Ine., Piscataway, New Jersey onder het handelsmerk Debrisan verkrijgbare farmaceutische preparaten voor gebruik als wondbehandelingsmiddel zijn geschikte dragers.

Het geactiveerde PRP in de drager kan dan op de wond worden aange-15 bracht. De sterk verrijkte en werkzame PDGF en PDAF daarin bevorderen de genezing door het verspreiden en richten van de groei van capillair endotheel, het verdubbelen van de snelheid van collageensynthese en het teweegbrengen van leukocytchemotaxis. De mitogene activiteit leidt tot celdeling en cel groei ter vervangen van verloren gegaan weefsel.

20 Dagelijks opbrengen van het geactiveerde PRP op wonden stimuleert en versterkt het genezingsproces. De uit 40 ml bloed bereide hoeveelheid PRP is voldoende voor zeven dagen applicatie. Het materiaal wordt in een vrijwel uniforme dikte, ongeveer 2 mm dik, over de gehele wond aangebracht. Granulatie, contractie en epitheelvorming kunnen worden 25 gestart door het gebruik van geactiveerd PRP wanneer de eigen repara-tiesignalen van het lichaam ontoereikend zijn om een goede genezing te bevorderen.

Telkens wanneer hierin trombine wordt gebruikt, wordt er trombine als biologisch vrijmakingsmiddel voor het vrijmaken van bloedplaatjes 30 mee bedoeld. Andere in de techniek bekende biologische vrijmakingsmiddel en zoals collageen, ADP en serotonine kunnen in plaats van of naast trombine worden gebruikt om bloedplaatjes te activeren, hoewel trombine de voorkeur heeft.

Uitvoerige beschrijving van de uitvinding 35 Bloed dat is verkregen van het individu dat met de wondhelende faktoren volgens de uitvinding moet worden behandeld wordt in gesiliconi seerde buizen met daarin zuur-citraat-dextrose (0,15M citraat, 2% glucose, pH 4,2) (hierna aangeduid met CPD) gestabiliseerd en gecentrifugeerd teneinde het plaatjesrijke plasma daaruit af te scheiden. Daar-40 toe worden 40 tot 60 ml bloed, gecombineerd met 4-6 ml CPD, gedurende 8520384 4 20 minuten gecentrifugeerd bij 135 x g bij ongeveer 4°C ter verkrijging van plaatjesrijk plasma. Het plaatjesrijke plasma wordt overgebracht in een andere steriele buis van 50 ml. Vervolgens wordt een telling van de plaatjes uitgevoerd. De CPD wordt gebruikt om activering van de stol-5 lingscascade door contact van het bloed met de kunststof in de injectiespuit te verhinderen. De CPD is al in de injectiespuit aanwezig wanneer het bloed uit de patiënt wordt gehaald. Het bloed wordt voortdurend gemengd met de CPD ter voorkoming van coagulatie. Het plaatjesrijke plasma in de buis wordt dan bij 4°C gedurende 10 minuten bij 750 x g 10 gecentrifugeerd.

Het plaatjesvrije plasma wordt verwijderd. Het bloedplaatjessediment wordt gesuspendeerd in een hoeveelheid plaatjesbuffer totdat uiteindelijk 1 ml is verkregen. Een lagere concentratie van ongeveer een miljoen plaatjes per ml is bruikbaar maar heeft minder de voorkeur. De 15 gebruikte buffer voor de plaatjes bevat 0,05M HEPES (N-2-hydroxyethyl-piperazine-2-ethaansulfonzuur), 0,03M glucose, 0,004M KC1, 0,1M NaCl en ongeveer 0,35% menselijk serumalbumine met een pH ingesteld op ongeveer 6,5. Een monster wordt bij ongeveer -20°C ingevroren met het oog op een latere test op mitogene activiteit. Een ander monster wordt als een 20 steriliteitsproef uitgestreken op bloedagar.

Het plaatjesrijke plasma is de enige in de werkwijzen en samenstellingen volgens de uitvinding gebruikte bloedfractie. Het PRP wordt vervolgens geactiveerd met gezuiverd trombine in een verhouding van ongeveer 1 tot ongeveer 10 eenheden trombine per ml PRP. Bij voorkeur 25 wordt ongeveer 1 eenheid trombine per ml plaatjesrijk plasma gebruikt. Door de werking van het trombine coaguleert het fibrinogeen en worden de plaatjes geactiveerd waardoor deze alfa-granules met daarin van plaatjes afgeleide groeifaktor en van plaatjes afgeleide angiogenese-faktor afgeven. Het gebruikte trombine was van het merk Thrombi nar van 30 Armour Pharmaceutical Co., Kankakee, Illinois. De bloedplaatjes en het trombine worden bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 5-10 minuten geincubeerd.

Het PRP wordt vervolgens onderworpen aan verwijdering van de plaatjes en fibrine door centrifugeren. De ontstane bovenstaande vloei-35 stof bevat na centrifugeren bij 4°C gedurende 5 minuten bij 950 x g zowel PDAF als PDGF. Het neerslag wordt verwijderd aangezien de PDAF en de PDGF in de bovenstaande vloeistof zijn geëxtraheerd. PDGF is geïsoleerd en gekarakteriseerd. Het is een eiwit met een molecuul gewicht van 30.000 dat zich splitst in twee delen met een molecuul gewicht van 40 15.000 en 14.000.

8620384 5

Om de aldus verkregen PDAF en PDGF in de bovenstaande vloeistof zonder plaatjes op een wond te kunnen aanbrengen is het gewenst een dragende stof te gebruiken die biologisch geschikt is en dienst doet als een tijdelijk "depot". Een macromoleculaire stof zoals microkris-5 tallijn collageen vormt een geschikte drager. Een bijzonder de voorkeur hebbende drager is mi crokri stal lijn collageen merk Avitend^van FMC Corp., Avicel Dept., Marcus Hook, PA 19061. De resulterende samenstelling is dikker en heeft de neiging op zijn plaats in contact met de wond te blijven. Als alternatieve drager kan worden gebruikt 10 Debrisar®wondbehandelingsmiddel dat Sepharos^S)parels bevat; de merknamen zijn van Pharmacia Fine Chemicals, Ine., Piscataway, New Jersey. Bij voorkeur wordt ongeveer 8-10 ml bovenstaande vloeistof per gram drager gebruikt voor de vorming van een pasta.

Toepassing van de wondbehandelingssamenstelling geschiedt door het 15 materiaal daadwerkelijk op en in de wond aan te brengen, zoals een geneesmiddel zalf wordt aangebracht. De behandeling dient dagelijks te worden herhaald zolang de wond open is. Een behandeling die de voorkeur heeft bestaat in het 's morgens aanbrengen van een ongeveer 1 mm dikke laag van het plaatjesfaktor/dragercomplex op de wond. Deze laag wordt 20 dan in een steriel droog verband ingepakt, 's Avonds wordt het verband afgenomen en wordt de stof verwijderd door wassen met een steriele zoutoplossing.

Hoewel de klinische beproeving van de wondbehandelende samenstellingen volgens de uitvinding gericht is op uitwendige wonden, kunnen de 25 samenstellingen ook worden gebruikt ter behandeling van inwendige wonden. Hechtingen kunnen met de wondbehandelende samenstellingen worden geïmpregneerd om inwendige genezing te versnellen. De wondbehandelende samenstellingen kunnen ook in samenhang met biologisch afbreekbare verbanden en als bekleding van in de chirurgie gebruikte implanteerbare 30 inrichtingen en biologisch afbreekbare inrichtingen worden toegepast.

In het algemeen kan elk in een patiënt in te brengen vreemd lichaam met de samenstelling worden bekleed om het genezingsproces te versnellen. In plaats daarvan kan de samenstelling rechtstreeks op het beschadigde weefsel worden aangebracht.

35 Eerste klinische proeven werden uitgevoerd op acht patiënten, steeds met wonden die in tijdsbestekken van een tot vijf jaar niet genazen. Alle patiënten hadden maximale standaardverzorging bij pogingen de wonden te genezen. Die behandeling had geen succes. In alle gevallen zette toediening van van bloedplaatjes afgeleide faktoren aan 40 tot een genezende respons zoals bleek uit vorming van granulatieweefsel 8520384 6 (granulatieweefsel bevat fibroblasten, endotheelcellen en collageen).

De wonden dichtten door contractie en epithee!vorming of door huid-enting. Stimulering van de genezing en uiteindelijk herstel traden in alle gevallen op.

5 Hoewel bereiding van geactiveerd PRP voor wondbehandelingsdoeleinden rechtstreeks uit het eigen bloed van het gewonde dier de voorkeur heeft, kunnen de voordelen van de uitvinding ook worden bereikt door bloed of plaatjes met een verstreken bewaartermijn van dieren van dezelfde soort te gebruiken. Toepassing van bloed van het te behandelen 10 gewonde individu heeft vooral de voorkeur omdat daardoor blootstelling aan eventuele hepatitis of andere contaminanten uit opgeslagen bloed wordt vermeden. Gebruik van het eigen bloed van een patiënt voorkomt ook alle mogelijke allergische reacties. Een constante bron van het materiaal kan worden verkregen uit gewassen, menselijke bloedplaatjes met 15 een verstreken bewaartermijn. De stoffen kunnen ook in veterinaire toepassingen worden gebruikt door plaatjes te gebruiken die afkomstig zijn van het dier zelf of van een ander dier binnen dezelfde soort.

Voorbeeld I

Een patiënt met een open wond aan de linker voet na excisie 20 van dood weefsel en transmetatarsale amputatie werd behandeld met PDGF en PDAF dat op de boven aangegeven wijze uit zijn eigen bloed was verkregen. Na de voorgeschreven behandeling was de wond gevuld met nieuw granulatieweefsel. Een volgend debridement toonde volledig bedekte me-tatarsale botten en contractie van de omvangrijke wond.

25 Voorbeeld II

Een patiënt onderging amputatie van zijn rechter grote teen en werd drie weken volgens een standaardtherapie behandeld zonder dat in de wond enig granulatieweefsel werd opgehoopt. Vervolgens werd op hem een therapie van plaatjesfaktoren volgens de uitvinding begonnen. Na 30 drie weken behandeling was de wond voor ongeveer 30 tot 40% gecontraheerd en genas deze snel.

Voorbeeld III

Een patiënt met twee grote wonden aan de midden- en zijkant van zijn transmetatarsale amputatiestomp was vier maanden volgens con-35 ventione!e therapie behandeld zonder genezing. Binnen twee weken van behandeling met PDAF en PDGF zoals boven beschreven was de wond vrij geworden van een kennelijke infectie en begon deze granulatieweefsel te vormen.

Achtendertig niet genezende zweren van 28 diabetespatiënten wer-40 den met de PRP pasta behandeld. De gemiddelde leeftijd van de zweren 8520384 7 voor de behandeling was 6 1/2 jaar. Een uit PRP in een concentratie van ongeveer 10^ plaatjes per ml bereide pasta werd gecombineerd met een collageen van het merk Avitene. De patiënten brachten de PDGF en PDAF bevattende pasta dagelijks gedurende 12 uur, gemiddeld ongeveer 8 weken 5 lang op. Elke dag werd dood weefsel uit de wond verwijderd. Alle wonden produceerden granulatieweefsel en gingen voor gemiddeld 83% dicht in vergelijking met het beginoppervlak van de wond. 95% van de zweren werden met succes behandeld hetgeen resulteerde hetzij in volledige epi-theelvorming op de wond hetzij in geslaagde huidenting. Slechts twee 10 van deze niet-genezende wonden genazen niet. De genezen zweren bleven dicht zonder verschijnselen van hypertrofe littekenvorming of neopla-sie.

Bij het beschouwen van de uitvinding moet worden bedacht dat de openbaring slechts illustratief is en dat omvang van de uitvinding 15 wordt bepaald door de bijgevoegde conclusies.

852 0 18 4

Claims (19)

1. Bij een werkwijze voor de bereiding van fysiologisch actieve wondhelende stoffen, de trappen, die omvatten: a) het mengen van bloed met een citraat-fosfaat-dextrose-oplos- 5 sing; b) het isoleren van plasma dat rijk is aan bloedplaatjes uit het bloed; c) het activeren van de bloedplaatjes en d) het combineren van het geactiveerde plaatjesrijke plasma met 10 een microkristallijne collageendrager.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de bloedplaatjes worden geactiveerd met trombine.

3. Werkwijze voor de bereiding van van bloedplaatjes afgeleide groei- en angiogenesefaktoren die omvat: 15 a) het verkrijgen van een oplossing van plaatjesrijk plasma uit bloed en b) het activeren van de plaatjes ter bereiding van van bloedplaatjes afgeleide groei- en angiogenesefaktoren.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, waarbij de plaatjes worden geac-20 tiveerd met trombine.

5. Werkwijze voor de bereiding van wondhelende stoffen, die omvat: a) het verkrijgen van een bloedmonster van een dier; b) het isoleren van een plaatjesrijk plasma uit het bloedmonster; 25 c) het activeren van de plaatjes met ongeveer 1-10 eenheden trombine per ml plaatjesrijk plasma.

6. Werkwijze voor de bereiding van van bloedplaatjes afgeleide an-giogenese- en groeifaktoren in vitro, die omvat: a) het verkrijgen van een bloedmonster; 30 b) het isoleren van een plasmafractie die verrijkt is met plaatjes uit het bloed; c) het activeren van de plaatjes met trombine en d) het isoleren van de resulterende angiogenese- en groeifaktoren uit de geactiveerde fractie.

7. Samenstelling voor de behandeling van wonden, die van plaatjes afgeleide angiogenese- en groeifaktoren en een drager omvat.

8. Samenstelling volgens conclusie 7, waarbij de drager een micro-kristallijn collageen is.

9. Werkwijze voor het versnellen van het genezen van wonden, die 40 a) het bedekken van een wond met de samenstelling volgens conclusie 7 8520364 omvat.

10. Werkwijze voor de behandeling van wonden, die het dagelijks opbrengen van de samenstelling volgens conclusie 7 op de wond omvat.

11. Werkwijze voor het uit bloed extraheren van een van bloed-5 plaatjes afgeleide angiogenesefaktor en groeifaktor, die de volgende trappen omvat: a) het verschaffen van een volume bloed; b) het toevoegen van een anticoagulant aan het bloed die van het type is dat gebruikt kan worden voor het tegengaan van coagulatie in 10 het lichaam; c) het isoleren van een met plaatjes verrijkte plasmafractie uit het bloed waarbij de plaatjes in een concentratie van tenminste 1.000.000 per ml bloed aanwezig zijn en d) het toevoegen van ongeveer 1 tot ongeveer 10 eenheden trombine 15 per 10 ml van het met plaatjes verrijkte plasma.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, waarbij de plaatjes geconcentreerd worden tot een concentratie van ongeveer 1.000.000.000 per ml.

13. Werkwijze voor de bereiding van wondhelende stoffen, die omvat: 20 a) het verkrijgen van een monster bloedplaatjes; b) het isoleren van een plaatjesrijk plasma uit plaatjes waarvan de bewaartermijn verstreken is; c) het wassen van de plaatjes ter verwijdering van serum bevattend materiaal; 25 d) het activeren van de plaatjes met ongeveer 1 tot ongeveer 10 eenheden trombine per ml plaatjesrijk plasma.

14. Werkwijze volgens conclusie 13, waarbij per ml plaatjesrijk plasma ongeveer 1 eenheid trombine wordt gebruikt.

15. Werkwijze volgens conclusie 13, waarbij de plaatjes worden 30 verkregen uit een bloedbank, uit plaatjes waarvan de bewaartermijn is verstreken.

16. Samenstelling voor de behandeling van wonden, die omvat: a) van bloedplaatjes afgeleide angiogenese- en groeifaktoren in een plaatjesrijk plasma dat een concentratie van tenminste 35 1.000.000.000 plaatjes per ml heeft, en b) ongeveer 1 tot ongeveer 10 eenheden trombine per ml plaatjesrijk plasma.

17. Samenstelling volgens conclusie 16, die tevens een farmaceutisch aanvaardbare drager bevat.

18. Samenstelling volgens conclusie 17, waarbij de drager een mi- 8520384 crokristal lijn collageen is.

19. Samenstelling volgens conclusie 16, waarbij de plaatjesconcentratie ongeveer 1.000.000.000 per ml is. +++++++ 8520384