FI85219B - Foerfarande foer framstaellning av ett fraon blodplaettar loesgjort material. - Google Patents

Description

! 85219

Menetelmä verihiutaleista vapautetun materiaalin valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää verihiutaleista 5 vapautetun materiaalin valmistamiseksi.

Angiogeneesi, joka on hiussuonten endoteelin lisääntyminen ja ohjattu kasvu, yhdessä fibroplasian ja kol-lageenisynteesin kanssa ovat yhteisvaikutteiset osatekijät isännän vasteessa haavoittumiseen. Verihiutaleiden akti-10 voituminen ja hyytymien runsaus kuuluvat haavan aiheuttamiin ensimmäisiin reaktioihin.

Trorabiinin aktivoimat verihiutaleet vapauttavat mi-togeenia eli sidekudossolujen ja pehmeiden lihasten solujen kasvutekijää ja stimuloivat pehmeiden lihasten solujen 15 kollageenisynteesiä in vitro. Mitogeeni (verihiutaleperäi- nen kasvutekijä, josta seuraavassa käytetään lyhennettä PDGF) koostuu kahdesta polypeptidistä. PDGF:ää kuvaavan artikkelin ovat julkaisseet vuonna 1982 Groten-dorst, G.R., Chang, T., Seppä, H.E.J., Kleinman, H.K. ja Martin, 20 G.R. julkaisussa Journal of Cellular Physiology, otsikolla "Platelet-derived growth factor is a chemoattractant for vascular smooth muscle cells" vol 113, s. 261 - 266. Tämä artikkeli esitetään tässä viitteenä.

Trombiinin aktivoimat verihiutaleet tuottavat myös 25 ei-mitogeenistä ainetta, jota nimitetään angiogeeniseksi tekijäksi ja joka stimuloi hiussuonten kasvua. Tunnetaan erilaisia angiogeneesitekijöitä kuten mm. kasvain-, retina- ja haavanesteangiogeneesitekijät. Ei tiedetä, onko kaikilla angiogeneesitekijöillä sama toimintamekanismi 30 niiden vaikuttaessa hiussuonten endoteelisoluihin.

Angiogeneesitekijöitä eristivät Banda, M.S., Knighton, D.R., Hunt, T.K. ja Werb, Z., jotka ovat kuvanneet niitä julkaisussa Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A., joulukuu 1982, s. 7773 - 7777, artikkelissa, jonka otsikko on 35 "Isolation of a nonmitogenic angiogenesis factor from 2 85219 wound fluid", jonka sisältö esitetään tässä viitteenä. Tässä artikkelissa on kuvattu menestyksellinen potilaan paranemattoman haavan hoito, jossa annettiin yksi kymmenen yksikön verihiutaletransfuusio. Haava parani kolmessa vii-5 kossa.

Eräs hiljattain suoritettu tutkimus on osoittanut, että kun kehon normaalin paranemisprosessi toimii, sen tehokkuus on vain noin 50 %:n tasolla.

Ihmisen angiogeeninen tekijä on tuotettu ihmisen 10 esinahan sidekudossoluista, Tolber et ai., US-patentti 4 273 871. Julkisesti saatavissa olevaa esinahan sideku-dossolulinjaa käytetään angiogeenisen tekijän tuottamiseen.

Antoniadesin US-patentissa 4 479 896, jonka sisältö 15 esitetään tässä viitteenä, on esitetty verihiutaleperäis- ten kasvutekijöiden karakterisointi ja niiden talteenotto tutkimusta varten geelielektroforeesin avulla.

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä verihiutaleista vapautetun materiaalin valmistamiseksi, joka käsit-20 tää vaiheet, joissa (a) otetaan tietty määrä verta, (b) verestä eristetään verihiutaleiden suhteen rikastettu suspensio, (c) aktivoidaan verihiutaleiden suhteen rikastettu 25 suspensio, jotta verihiutaleet saadaan vapauttamaan sisäl tämänsä materiaalin, ja (d) otetaan talteen verihiutaleiden vapauttama materiaali, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että se käsittää vaiheet, joissa 30 (e) aktivoidusta liuoksesta poistetaan oleellisesti kaikki veri- tai plasmakontaminantit ennen verihiutaleiden suhteen rikastetun liuoksen aktivointia, ja (f) poistetaan verihiutalehahmot tai muu verihiutaleista löydettävä mutta ei vapautuva materiaali.

35 Trombiinin aktivoimilla verihiutaleilla on kyky 3 85219 stimuloida angiogeneesiä, tehostunutta kollageenisynteesiä ja solujen jakautumista ja kasvua. On keksitty, että koko-verinäytteitä voidaan käyttää valmistettaessa verihiutaleiden suhteen rikastettua plasmaa, joka trombiinilla ak-5 tivoituna sisältää angiogeenisiä tekijöitä ja kasvutekijöitä, joita voidaan käyttää haavojen paranemisprosessin nopeuttamiseen.

Veri stabiloidaan ja sentrifugoidaan verihiutaleiden suhteen rikastetun plasman saamiseksi. Veri stabiloi-10 daan sekoittamalla se sitraatti-fosfaatti-dekstroosiin suhteessa 1:5 (20-prosenttinen liuos). Verihiutaleiden suhteen rikastettua plasmaa (josta seuraavassa käytetään lyhennettä PRP) sentrifugoidaan edullisesti uudelleen, kunnes aikaansaadaan verihiutaleiden suuri pitoisuus. Sen 15 jälkeen verihiutaleet viedään verihiutalepuskuriin. Veri hiutaleiden pitoisuuden tulisi olla ainakin 1 000 000 verihiutaletta millilitrassa. Edullisesti pitoisuuden tulisi olla suuruusluokkaa 1 000 000 000 verihiutaletta millilitrassa.

20 Trombiinia lisätään PRPrhen verihiutaleiden akti voimiseksi. Edullisesti käytetään noin 1- noin 10 yksikköä trombiinia PRP-millilitraa kohti. Trombiinin aktivoimat verihiutaleet vapauttavat verihiutaleperäisiä kasvutekijöitä (joista seuraavassa käytetään lyhennettä PDGF) ja 25 verihiutaleista peräisin olevia angiogeneesitekijöitä (joista seuraavassa käytetään lyhennettä PDAF). Veri hiutaleiden ja trombiinin annetaan inkuboitua huoneen lämpötilassa 5-10 minuuttia.

Aktivoitu PRP, joka sisältää PDGF:ää ja PDAF:ää, 30 lisätään edullisesti biologisesti sopivaan makromolekyyli- seen aineeseen, joka toimii kantajana. Ensin verihiutaleet sentrifugoidaan voimalla noin 950 x g ja verihiutaleita sisältämätön emäliemi sekoitetaan kantajaan. Biologisesti sopivana kantajana käytetään edullisesti mik-35 rokiteistä kollageenia kuten esimerkiksi Avitene® -merk- 4 85219 kistä kollageenia, jota myy FMC Corp., Avicel Dept., Marcus Hook, PA 19061. Mikrokiteiset kollageenit ovat biologisesti sopivia kehoon. Kantajaa lisätään niin paljon, että kaikki verestä saatu Verihiutaleiden suhteen 5 rikastettu plasma imeytyy siihen. Esimerkiksi 40 ml: n verinäyte vaatisi rikastamisen jälkeen tyypillisesti noin 25 ml kantajaa. Näin muodostunut tahna säilytetään edullisesti jäissä tai jääkaapissa.

Farmaseuttiset valmisteet, jotka on tarkoitettu 10 haavojen hoitoon ja joita myy Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, New Jersey tavaramerkillä Debrisan, ovat sopivia kantajia.

Kantajassa oleva aktivoitu PRP voidaan sitten levittää haavaan. Siinä olevat voimakkaasti rikastuneet ja 15 aktiiviset PDGF ja PDAF auttavat paranemista lisäämällä ja ohjaamalla hiussuoniendoteelin kasvua, kaksinkertaistamalla kollageenisynteesin nopeuden ja aikaansaaden leukosyyt-tikemotaksiksen. Mitogeeniaktiivisuus johtaa solujen jakautumiseen ja kasvuun menetetyn kudoksen korvaamiseksi. 20 Aktivoidun PRP:n päivittäinen käyttö haavoihin sti muloi ja ylläpitää paranemisprosessia. PRP-määrä, joka saadaan 40 ml:sta verta riittää seitsemän vuorokauden aikana käytettäviin annoksiin. Aine levitetään koko haavan päälle paksuudeltaan suhteellisen tasaiseksi suunnilleen 25 kahden millimetrin paksuiseksi kerrokseksi. Jyväiskudoksen muodostuminen, kokoonvetäytyminen ja epiteelin muodostuminen voidaan panna alkuun käyttämällä aktivoitua PRP:tä, silloin kun kehon omat korjaussignaalit ovat riittämättömät hyvän paranemisen stimulointiin.

30 Aina kun ilmaisua trombiini käytetään tässä esityk sessä, sillä tarkoitetaan trombiinia biologisesti laukaisevana aineena verihiutaleiden toiminnan käynnistämiseksi. Muita alalla tunnettuja biologisia laukaisuaineita, joihin kuuluu mm. kollageeni, ADP ja serotoniini, voidaan käyttää 35 trombiinin sijasta tai sen lisäksi verihiutaleiden akti- 5 85219 vointiin, vaikkakin trombiini on suositeltava.

Veri, joka on saatu keksinnön mukaisesti valmistetuilla haavanhoitotekijöillä hoidettavasta yksilöstä, stabiloidaan silikonisoiduissa putkissa, jotka sisältävät ha-5 panta sitraattidekstroosia (0,15 M sitraatti, 2 % glukoosia, pH 4,2) (seuraavassa CPD) ja sentrifugoidaan verihiutaleiden suhteen rikastuneen plasman erottamiseksi siitä. 40 - 60 millilitraa verta yhdistettynä 4-6 ml:aan CPD:tä sentrifugoidaan sitten noin 135 x g:n voimalla 20 minuut-10 tia noin 4 °C:ssa verihiutaleiden suhteen rikastetun plasman saamiseksi. Verihiutaleiden suhteen rikastettu plasma poistetaan ja siirretään toiseen steriiliin 50 ml:n putkeen. Lasketaan verihiutaleiden määrä. CDP:tä käytetään hyytymisprosessin aktivoitumisen estämiseen veren joutues-15 sa kosketukseen muovin kanssa ruiskussa. CPD on ruiskussa, kun verta otetaan potilaasta. Verta sekoitetaan jatkuvasti yhdessä CPD:n kanssa koaguloitumisen estämiseksi. Putkessa olevaa verihiutaleiden suhteen rikastettua plasmaa sentrifugoidaan sitten 750 x g:n voimalla 10 minuuttia 4 °C:ssa. 20 Verihiutaleita sisältämätön plasma poistetaan put kesta ja heitetään pois. Verihiutalepelletti suspendoidaan uudelleen verihiutalepuskurierään, jolla tilavuudeksi saadaan lopuksi millilitra. Pienempi pitoisuus, noin 1 000 000 verihiutaletta millilitrassa, on käyttökelpoinen, mut-25 ta ei yhtä edullinen. Käytetty verihiutalepuskuri sisältää 0,05 M HEPESiä (N-2-hydroksietyylipiperatsiini-n-2-etaani-sulfonihappoa), 0,03 M glykoosia, 0,004 M KC1, 0,1 M NaCl ja noin 0,35 % ihmisen seerumialbumiinia säädettynä pH-arvoon noin 6,5. Yksi näyte jäädytetään noin -20 °C:ssa 30 myöhempää mitogeeniaktiivisuuden määrittämistä varten. Toinen näyte sivellään veriagarille steriilisyyskokeena.

Verihiutaleiden suhteen rikastettu plasma on ainoa verifraktio, jota käytetään keksinnön mukaisessa menetelmässä, PRP aktivoidaan sitten puhdistetulla trombiinilla, 35 jota käytetään noin 1 - noin 10 yksikköä PRP-millilitraa 6 85219 kohti. Edullisesti käytetään noin 1 yksikkö trombiinia verihiutaleiden suhteen rikastetun plasman yhtä millilit-raa kohti. Trombiinin aktiivisuus koaguloi fibrinogeenin ja aktivoi verihiutaleet saaden ne vapauttamaan a-jyvä-5 siä, jotka sisältävät verihiutaleperäistä kasvutekijää ja verihiutaleperäistä angiogeneesitekijää. Käytetty trombiini oli merkkiä Thrombinar (tavaramerkki), toim. Armour Pharmaceutical Co., Kankanee, Illinois. Verihiutaleiden ja trombiinin annetaan inkuboitua huoneenlämmössä noin 5 -10 10 minuuttia.

Sen jälkeen PRP:lle suoritetaan verihiutaleiden ja fibriinin poisto sentrifugoimalla. Saatu emäliemi sisältää sekä PDAF:n että PDGF:n sen jälkeen, kun on sentrifugoitu noin 5 minuuttia 4 °C:ssa. Pelletti heitetään pois, sillä 15 PDAF ja PDGF ovat menneet emäliemeen. PDGF on eristetty ja karakterisoitu. Se on proteiini, jonka molekyylipaino on 30 000 ja joka katkeaa kahdeksi molekyyliksi, joiden molekyylipainot ovat 15 000 ja 14 000.

Näin saadussa verihiutaleita sisältämättömässä emä-20 liemessä olevien PDAF:n ja PDGF:n viemiseksi haavaan on toivottavaa käyttää kantoainetta, joka on biologisesti sopiva ja toimii väliaikaisena "depot"-aineena. Makromolekyyli nen aine kuten esimerkiksi mikrokiteinen kollageeni muodostaa sopivan kantajan. Erityisen edullinen kanta ja 25 on Avitene -merkkinen mikrokiteinen kollageeni, jota toimittaa FMC Corp., Avicel Dept., Marcus Hook, PA 19061. Muodostunut koostumus on sakeampaa ja pysyy helpommin paikallaan kosketuksessa haavaan. Haavanhoitoainetta Debrisan (tavaramerkki), joka sisältää helmiä nimeltä Sepharose 30 (tavaramerkki), kumpikin firman Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, New Jersey, tavaramerkkejä, voidaan käyttää vaihtoehtoisena kantajana. Edullisesti käytetään noin 8 - 10 ml emälientä kantajan yhtä grammaa kohti tahnan valmistamiseksi.

35 Haavanhoitokoostumuksen käyttötapa on, että materi- 7 85219 aalia levitetään fysikaalisesti haavan päälle ja haavaan samoin kuin käytettäessä lääkesalvaa. Käsittelyt tulisi toistaa päivittäin niin kauän kuin haava pysyy avoimena. Edullinen hoito on, että levitetään suunnilleen millimet-5 rin paksuinen kerros verihiutaletekijä/kantajakompleksia haavaan aamulla. Se peitetään sitten steriilillä kuivalla siteellä. Illalla side otetaan pois ja hoitoaine poistetaan pesemällä steriilillä suolavedellä.

Vaikka kliiniset kokeet, joissa keksinnön mukaises-10 ti valmistettua materiaalia sisältäviä haavanhoitokoostu- muksia on käytetty, ovat kohdistuneet kehossa oleviin ulkoisiin haavoihin, koostumukset voivat hoitaa myös sisäisiä haavoja. Kirurgiassa käytettävät langat voidaan impregnoida haavanhoitokoostumuksilla sisäisen paranemisen 15 nopeuttamiseksi. Haavanhoitokoostumuksia voidaan käyttää myös yhdessä biologisesti hajoavien sidosten kanssa kuten päällysteenä implantoitaville laitteille ja biologisesti hajoaville laitteille, joita käytetään kirurgisissa menetelmissä. Yleisesti sanoen mikä tahansa vieras esine, joka 20 on vietävä potilaaseen, voidaan päällystää koostumuksella paranemisprosessin nopeuttamiseksi. Vaihtoehtoisesti koostumus voidaan suoraan viedä vaurioituneelle kudokselle.

Kliinisiä alkukokeita on suoritettu kahdeksalla potilaalla, joilla kaikilla on paranemattomia haavoja, joi-25 den iät vaihtelivat vuodesta viiteen vuoteen. Kaikkien po tilaiden hoito standardimenetelmin oli maksimoitu haavojen parantamiseksi. Tämä terapia ei ollut johtanut tulokseen. Kaikissa tapauksissa verihiutaleista johdettujen tekijöiden käyttö hoidossa sai aikaan paranemisvasteen, mistä oli 30 osoituksena jyväiskudoksen muodostuminen (jyväiskudos sisältää sidekudossoluja, endoteelisoluja ja kollageenia). Haavat sulkeutuivat vetäytymällä kokoon ja epiteelinmuo-dostuksella tai ihonsiirroilla. Paranemisen stimuloitumi-nen ja mahdollinen vaurion korjaantuminen ilmeni kaikissa 35 hoitotapauksissa.

β 85219

Vaikka onkin edullista valmistaa haavanhoitoon tarkoitettu aktivoitu PRP suoraan haavoittuneen eläimen omasta verestä, keksinnön edut voidaan saavuttaa käyttämällä verta tai vanhentuneita verihiutaleita saman lajin muista 5 eläimistä. Haavoittuneen hoidettavan yksilön veren käyttö on erityisen edullista, koska tällöin vältetään altistuminen mahdolliselle hepatiitille tai muille veripankeista saatavan veren kontaminaatioille. Potilaan oman verenkäyttö eliminoisi myös mahdolliset allergiset reaktiot. Jatku-10 va lähde tälle materiaalille voidaan saada pestyistä, vanhentuneista ihmisen verihiutaleista. Näitä aineita voidaan käyttää myös eläinlääketieteellisiin sovellutuksiin käyttäen joko eläimestä itsestään tai saman lajin muusta eläimestä peräisin olevia verihiutaleita.

15 Esimerkki I

Potilaalle, jolla oli avoin haava vasemmassa jalassa kuolleen kudoksen levittämisen ja transmetatarsaalin amputaation seurauksena, aloitettiin hoito PDGFillä ja PDAF:llä, jotka oli saatu edellä kuvatulla tavalla hänen 20 omasta verestään. Hoitosuunnitelman mukaisesti käsittelyn jälkeen haava täyttyi jyväiskudoksella. Seuraava avaus osoitti metatarsaaliluiden peittyneen täydellisesti ja isohkon haavan kokoonvetäytyrnisen.

Esimerkki II

25 Potilaalle suoritettiin hänen oikean isovarpaansa amputointi ja häntä hoidettiin vakioterapialla kolme viikkoa ilman, että jyväiskudosta olisi kerääntynyt haavaan. Sen jälkeen aloitettiin keksinnön mukainen verihiu-taletekijäterapia. Kolmen viikon hoidon jälkeen haava oli 30 vetäytynyt kokoon suunnilleen 30-40 % ja paraneminen jatkui nopeasti.

Esimerkki III

Potilasta, jolla oli kaksi isoa haavaa hänen trans-metatarsaaliamputointitynkänsä mediaali- ja lateraaliase-35 missä, oli hoidettu neljä kuukautta konventionaalisella 9 85219 hoidolla ilman paranemista. Hoidettaessa kaksi viikkoa PDAF:llä ja PDGF:llä kuten edellä on kuvattu, haava oli puhdistunut ilmeisestä infektiosta ja alkoi muodostaa jy-väiskudosta.

5 Kahdenkymmenenkahdeksan diabetespotilaan 28 parane- matonta haavaumaa hoidettiin PRP-tahnalla. Haavaumien keskimääräinen ikä ennen hoitoa oli 6 1/2 vuotta. Tahna, joka oli valmistettu PRP:stä pitoisuuteen noin 109 verihiutalet-ta/ml, yhdistettiin Avitene -merkkiseen kollageeniin. Po-10 tilaita hoidettiin PDGF:ää ja PDAF:ää sisältävällä tahnalla päivittäin 12 tunnin periodein keskimäärin kahdeksan viikon ajan. Joka päivä haavat puhdistettiin kuolleesta kudoksesta. Kaikki haavat muodostivat jyväiskudosta ja sulkeutuivat keskimäärin 83 % alkuperäiseen haavan pinta-15 alaan verrattuna. 95 % haavoista hoidettiin menestyksellisesti, niin että tuloksena oli joko täydellinen epiteelin-muodostuminen haavan yli tai onnistunut ihonsiirto. Parantuneet haavaumat pysyivat sulkeutuneina ilman merkkejä hypertrofisesta arpeutumisesta tai kasvainmuodostuksesta.

Claims (8)

10 8521 9

1. Menetelmä verihiutaleista vapautetun materiaalin valmistamiseksi, joka käsittää vaiheet, joissa 5 (a) otetaan tietty määrä verta, (b) verestä eristetään verihiutaleiden suhteen rikastettu suspensio, (c) aktivoidaan verihiutaleiden suhteen rikastettu suspensio, jotta verihiutaleet saadaan vapauttamaan sisäl- 10 tämänsä materiaalin, ja (d) otetaan talteen verihiutaleiden vapauttama materiaali, joka menetelmä on tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa (e) aktivoidusta liuoksesta poistetaan oleellisesti 15 kaikki veri- tai plasmakontaminantit ennen verihiutaleiden suhteen rikastetun liuoksen aktivointia, ja (f) poistetaan verihiutalehahmot tai muu verihiutaleista löydettävä mutta ei vapautuva materiaali.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että aktivaattori aktivoi verihiu taleet aiheuttamalla sen, että ne vapauttavat verihiutale-peräistä kasvutekijää (PDGF) ja verihiutaleperäistä angio-geneesitekijää (PDAF) sisältävää materiaalia.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että aktivaattorina käytetään trombiinia.

4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että trombiinia käytetään määrässä noin 1-10 yksikköä trombiinia ml:a kohti verihiutaleiden 30 suhteen rikastettua liuosta.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että verihiutaleet ovat nisäkkään verihiutaleita.

6. Patenttivaatimusken 5 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että nisäkkään verihiutaleet ovat ihmisen verihiutaleita. n 85219

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaihe, jossa aktivoidusta liuoksesta poistetaan oleellisesti kaikki veri- tai plasmakontaminantit ennen verihiutaleiden suhteen rikaste- 5 tun liuoksen aktivointia suoritetaan sentrifugoimalla.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaihe, jossa poistetaan verihiutalehahmot tai muu verihiutaleista löydettävä mutta ei vapautuva materiaali suoritetaan sentrifugoimal- 10 la. i2 8521 9