JPH04504569A - 血小板抽出物の塗布による毛の成長促進法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血小板抽出物の塗布による毛の成長促進法本出願は現在放棄された米国特許出願 第６７６．４７１号（１９８４年１１月２９日出願）の一部継続出願である、現 在放棄された米国特許出願第７８６．　２０６号（１９８５年１０月１０日出願 ）の出願の継続出願である、米国特許出願第３９，７７６号の一部継続出願であ る。

発明の分野 本発明は創傷修復剤、特に血管形成及び成長因子、血液からのそれらの生産及び 創傷の修復及び毛の成長の促進のための使用に関する。

発明の背景 線維増殖及びコラーゲンの合成に伴う、毛細血管の内皮の増殖及び制御された成 長である血管形成は、創傷に対する宿主の応答の細胞膜内の構成要素である。

血小板の活性化及び凝固のカスケードは外傷に対する最初の反応のうちの一つで ある。

トロンビンにより活性化された血小板は、繊維芽細胞及び平滑筋細胞の分裂促、 進因子、あるいは成長因子を放出し、そしてｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて平滑筋細 胞により高められたコラーゲンの合成を刺激する。分裂促進因子（血小板由来の 成長因子、以後ＰＤＧＦとする）は２つのポリペプチドからなる。ＰＤＧＦを記 述している論文は「血小板由来の成長因子は血管の平滑筋細胞の化学的誘引剤で ある」という題名でジャーナル　オブ　セルラー　フィジオロジー（Ｊｏｕｒｎ ａｌ　ｏｆ　Ｃｅ］Ｉｕｌａｒ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ、１１３．ｐ ｐ、２６１−２６６においてグロテンドルスト（Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ）、Ｇ 。

Ｒ１，チャン（Ｃｈａｎｇ）　、Ｔ、−セパ（Ｓｅｐｐａ）　、Ｈ，Ｅ、Ｊ、、 　クラインマン（Ｋｌｅｊｎｍａｎ）、Ｈ，に、およびマーチン（Ｍａｒｔ　ｉ ｎ）　、Ｇ。

Ｒ１により１９８２年に公表された。この論文は参照により本明細書の一部をな す。

血管形成因子と呼ばれる非分裂促進物質もまたトロンビンで活性化された血小板 により生産され、そして毛細血管の成長を刺激する。さまざまな血管形成因子は 癌、網膜及び創傷の血管形成の液体の因子を含むことが知られている。すべての 血管形成因子が毛細血管の内皮細胞上への共通の作用機構をもつかどうかはわか っていない。

血管形成因子は単離され、そして「創傷の液体からの非分裂促進的な血管形成り 、その開示は参照により本明細書の一部をなす。

血管形成因子及び血小板由来の成長因子は「修復の連鎖における血小板及びフィ ブリンの役割ＪＡｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｓｕｒｇｅｙ　１９６：　３７９−３８８ （１９８２）においてナイトン（Ｋｎ　ｉ　ｇｈ　＋　ｏｎ）　、Ｄ、　Ｒ，、 ハ：／ト（Ｈｕｎｔ）　、Ｔ、　Ｋ、　、サクラル（Ｔｈａｋｒａ　１）　、Ｋ 、に、およびグッドソン（Ｇｏｏｄｓｏｎ）ＩＩＩＳＷ、Ｈ，により記述され、 その開示は参照により本発明の一部をなす。この論文において、１０ユニツトの 血小板の一回の輸血により、創傷が修復していない患者への治療が成功したこと を記述している。創傷は３週間で修復した。

体内の通常の修復機構が働くとき、それは約５０％の効果のレベルでしかないこ とが最近の研究により示唆されてきた。

トルバー）（Ｔｏｌｂｅｒｔ）らの米国特許第４．２７３，８７１号において、 ヒトの血管形成因子はヒトの包皮の繊維芽細胞から生産される。公げに入手でき る包皮の繊維芽細胞のセルラインが血管形成因子の生産に利用される。

参照によりその開示が本発明の一部をなすアンドニエーデス（Ａｎｔｏｎｉａｄ ｅｓ）の米国特許第４，４７９，８９６号において、血小板由来の成長因子が特 徴づけられ、そしてゲル電気泳動法により研究のために抽出された。

発明の簡単な概要 トロンビンで活性化された血小板は、血管形成、高められたコラーゲンの合成及 び細胞の分裂及び成長を刺激する能力をもつ。トロンビンで活性化されたときに 、創傷の修復機構を早めるために使用されつる血管形成因子及び成長因子を含む 、血小板富化血漿を調製するために、全血の試料を使用できることが見いだされ てきた。

血液を安定化しそして血小板が富化された血漿を得るために、血液を安定化しそ して遠心分離する。１：５の比率でクエン酸−リン酸デキストロースと混合する ことにより（２０％溶液）、血液は安定化される。血小板が豊富な血漿（以後Ｐ ＲＰとする）は、好ましくは高濃度の血小板が得られるまで再び遠心分離される 。そして血小板を血小板緩衝液中におく。血小板の濃度をミリリットルあたり少 なくとも１：　ｏｏｏ、ｏｏｏの血小板になるようにする。好ましくは、ミリリ ットルあたり１，０００，０００，０００の血小板のオーダーの濃度にすること が望ましい。

血小板を活性化するために、ＰＲＰにトロンビンを加える。好ましくは約１から １０ユニツトのトロンビンをＰＲＰ１ミリリットルに対して使用する。トロンビ ンで活性化された血小板は、血小板由来の成長因子（以後ＰＤＧＦとする）およ び血小板由来の血管形成因子（以後ＰＤＡＦとする）を放出する。血小板及びト ロンビンを室温において約５から１０分インキュベートさせる。

ＰＤＧＦおよびＰＤＡＦを含む活性化されたＰＲＰを、好ましくは、キャリアー として働く、生物学的に適合できる巨大分子物質に加える。最初に、血小板を約 ９５０Ｘｇで遠心分離し、そして血小板を除いた上清をキャリアーと混合する。

好ましくは、微晶性のコラーゲン、例えばＦＭＣＣａｒｐ、、ＡｖｉｃｅｌＤｅ ｐｔ、、Ｍａｒｕｓ　Ｈｏｏｋ、ＰＡ　１９０６１により販売されているＡｖｉ ｔｅｎｅｇブランドのコラーゲンを生物学的に適応できるキャリアーとして利用 する。微晶性のコラーゲンは体内において生物学的に適応できる。十分なキャリ アーを、血液から得られた、血小板が豊富な血漿すべてを吸収するように加える 。例えば、４０ｍ１の血液試料は典型的には濃縮後にキャリアー約２５ｍ１を必 要とするであろう。そうして得られたペーストを好ましくは氷上あるいは冷凍庫 中に保存する。

デブリザン（Ｄｅｂｒｉｓａｎ）という商標でＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮｅｗＪ ｅｒｓｅｙのＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ。

により販売されている創傷の外用剤としての使用のための薬学的な調製物は有用 なキャリアーである。

キャリアー内の活性化されたＰＲＰを創傷にぬる。キャリアー内に高度に濃縮さ れそして活性化されたＰＤＧＦおよびＰＤＡＦは毛細血管の内皮を増殖および制 御し、コラーゲンの合成速度を２倍にし、そして白血球の化学定性を起こすこと により修復を助ける。分裂促進活性が、失われた組織に代わるために細胞の分裂 および成長をもたらす。

活性化されたＰＲＰの創傷に対する毎日の塗布が、修復の連鎖を刺激および増進 する。４０ｍ１の血液から得られたＰＲＰの量は７日分の塗布に充分である。

約２ミリメートルの厚さの、比較的均一な厚さで創傷を覆うように物質をぬる。

体自身の修復シグナルが良好な修復を刺激するのには不充分である場合、活性化 されたＰＲＰの使用により顆粒形成、収縮および上皮形成が開始する。

従来、成長しないか又は限られた成長のみが観察されていた毛嚢を含む組織部分 に対する組成物の局所的な塗布が、毛の成長を促進することも見いだされた。

発明の詳細な説明 本発明の創傷の修復因子により処理されるべき個人から得られた血液を酸−クエ ン酸デキストロース（０，１５Ｍ　クエン酸、２％　グルコース、ｐＨ４，２） （以後ＣＰＤとする）を含むシリコナイズされたチューブ中で安定化し、そして そこから血小板が豊富な血漿を分離するために遠心分離する。そして血小板が豊 富な血漿を得るために、４−６ｍ１のＣＰＤと混合した４０４０−６Ｏの血液を 約４℃において２０分間１３５Ｘｇで遠心分離する。血小板が豊富な血漿を取っ て別の滅菌された５０ｍ１チユーブに移す。そして血小板の数を数える。ＣＰＤ は、シリンジ中で血液がプラスティックと接触することにより、凝固の連鎖反応 が活性化することを阻止するのに使用される。血液を患者から採血する間、ＣＰ Ｄはシリンジ中に存在する。凝固を阻害するために絶え間なく血液をＣＰＤと混 合する。そしてチューブの中の血小板が豊富な血漿を４℃において１０分間７５ ０Ｘｇで遠心分離する。

血小板を含まない血漿を除去して捨てる。血小板を最終体積を与える量で血小板 緩衝液に再懸濁する。１ｍｌあたり約百万の低めの血小板の濃度も有用であるが 、好ましくはない。使用される血小板緩衝液はＱ、Ｑ５　Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（Ｎ −２−ヒドロキシエチルピペラジン−ｎ−２−エタンスルホン酸）、０．０３Ｍ 　グルコース、０．００４Ｍ　塩化カリウム、０．１　Ｍ　塩化ナトリウムおよ び約０．３５％のヒト血清アルブミンで、ｐＨ約６．５に調整される。後の分裂 促進活性の試験のために試料の一部を約−２０℃において凍結させる。他の一部 の試料は無菌試験のために血液寒天上にぬられる。

血小板が豊富な血漿は、本発明の方法および組成物に利用される唯一の血液画分 である。そしてＰＲＰｌｍｌあたり約１から１０ユニツトのトロンビンの率で、 ＰＲＰを精製されたトロンビンで活性化する。好ましくは血小板が豊富な血Ｗｔ １ｍｌあたり約１ユニツトのトロンビンが利用される。このトロンビンの活性は フィブリノーゲンを凝固させ、そして血小板を活性化して、血小板由来の成長因 子および血小板由来の血管形成因子を含むアルファ顆粒を放出させる。使用され たトロンビンはＫａｎｋａｋｅｅ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓのＡｒｍｏｕｒ　Ｐｈａｒ ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ、のトロンビナ−（Ｔｈ　ｒ　ｏｍｂ　ｉ　ｎ　ａ 　ｒ”）ブランドである。血小板およびトロンビンを室温において約５−１０分 間インキュベートさせる。

次に、遠心分離によりＰＲＰの血小板およびフィブリンを除去する。４℃におけ る約５分間の９５０Ｘｇの遠心分離後、得られた上清はＰＤＡＦおよびＰＤＧＦ の両方を含む。ＰＤＡＦおよびＰＤＧＦは上清中に抽出されたから沈殿物は捨て る。ＰＤＧＦは既に単離されそして特徴が判明している。それは１５，０００お よび１４，０００の分子量をもつ２つの分子種に分解される３０，０００の分子 量の蛋白質である。

このようにして得られた血小板を含まない上清中のＰＤＡＦおよびＰＤＧＦを創 傷に適用するためには、生物学的に適応され、そして暫定的な”デボ−剤”とし て作用するキャリアー物質を利用するのが望ましい。微晶性コラーゲンのような 巨大分子物質は有用なキャリアーを提供する。特に好ましいキャリアーはＦＭＣ Ｃｏｒｐ、、Ａｖｉｃｅｌ　Ｄｅｐｔ、、Ｍａｒｕｓ　Ｈｏｏｋ、　ＰＡ１９０ ６１のアビテン（Ａｖｉｔｅｎｅ■）ブランドの微晶性のコラーゲンである。こ の結果得られる組成物は濃厚であり、創傷に接触してその位置に残存しやすい。

Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ　ＪｅｒｓｅｙのＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ 　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ、の商標であるセファ０−ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓ ｅＴ′）ブランドのビーズを含むデブリザン（Ｄｅ　ｂ　ｒ　ｉ　ｓ　ａｎＴＭ ）ブランドの創傷の外用剤はも別のキャリアーとして利用されつる。好ましくは 、キャリアー１グラムあたり約８−８−１Ｏの上清がペーストの生産に使用され る。

創傷治療用組成物の塗布は、薬用軟膏の塗布におけるようにして創傷の上および 中に物質を物理的に塗布することによる。治療は創傷が開いた状態であるかぎり 毎日繰り返すべきである。好ましい治療は創傷に対して血小板／キャリアー複合 体の約１ｍｍ厚の外用剤を朝にぬる。そして滅菌され、乾燥した外用剤を重ねる 。夜に、薬剤を除去し、そして滅菌食塩水で洗浄することにより物質を除去する 。

本発明の創傷治療用の組成物を含む臨床試験は体の外部の創傷に対して行われた が、この組成物は体内の創傷も治療するであろう。体内の修復をはかどらせるた めに縫合糸に創傷治療用の組成物を衾浸させる。別法として、組成物は損傷を受 けた組織上に直接適用してもよい。

最初の臨床の試みは、すべて１年から５年間修復されない創傷をもつ、８人の患 者について行われた。すべての患者は創傷を修復するために、統一化された最大 限の看護を受けた。治療は失敗した。すべての場合において、血小板由来の因子 の投与が顆粒組織の形成により証明される修復の応答を開始した（顆粒組織は線 維芽細胞、内皮細胞およびコラーゲンを含む）。創傷は収縮および上皮形成ある いは皮膚の移植により閉じた。修復刺激および最終的修復はすべての適用におい て起こった。

創傷の治療の目的のため、負傷した動物自身の血液から直接活性化されたＰＲＰ を調製することが好ましいが、本発明の長所は同じ種類の動物からの血液あるい は古い血小板を使用して達成される。治療される、負傷した個体からの血液の利 用は、貯蔵された血液からの肝炎あるいは他の汚染物との接触が避けられるので 特に好ましい。患者自身の血液の使用はどのようなアレルギー反応をも除外する であろう。一定した材料源は洗浄された古いヒト血小板から得られる。物質はま た同じ動物あるいは同じ種内の他の動物由来の血小板を利用することにより獣医 学の使用に利用される。

実施例１ 死んだ組織の壊死組織除去および中足の切断後の左足上の開いた創傷をもつ患者 に、彼自身の血液から上述のようにして得られたＰＤＡＦおよびＰＤＧＦを最初 に投与した。プロトコルの処理後、創傷は新しい顆粒組織で満たされた。引き続 いて壊死組織除去を行ったところ、完全に覆われた中足の骨およびがなり大きい 創傷の収縮を示した。

実施例２ 右の大きな足指の切断を行った患者に３週間通常の治療を行ったが、創傷内にど のような顆粒組織も蓄積しなかった。この患者に、続いて本発明の血小板因子の 治療を始めた。治療を始めてから３週間後、創傷が約３０−４０％縮み、素早く 修復されつつあった。

実施例３ 中足の切断跡の内側および外側の面上の２倍の大きさの創傷をもつ患者に、慣用 的な治療法を使用したが４週間修復しなかった。上述のようにＰＤＡＦおよびＰ ＤＧＦで処理してから２週間以内に、創傷からはっきりとした感染の跡が消え、 顆粒組織の生産が始まった。

２８人の糖尿病患者からの３８の非修復潰瘍をＰＰＰペーストで処理した。治療 前の潰瘍の持続期間の平均は６−１／２年であった。約１０９の血小板／ｍｌの 濃度でＰＲＰから調製されたペーストをアビテン（Ａｖｉｔｅｎｅ）ブランドの コラーゲンと混合した。ＰＤＡＦおよびＰＤＧＦを含むペーストを、毎日１２時 間づつ平均８週間ぬった。毎日死んだ組織を創傷から除去した。すべての創傷が 顆粒組織を生産し、最初の創傷部分と比較して平均８３％が閉じた。９５％の潰 瘍の治療が成功し、創傷全体の上皮形成および皮膚の移植の成功のどちらかがも たらされた。これらの非修復創傷のうちの２つのみが修復しながった。修復した 潰瘍は過形成性搬痕の形成あるいは腫瘍の形成の形跡なしに閉じたままである。

実施例４ 腎臓移植をうけてさらに、膝下切断（”ＢＫＡ”）された糖尿病患者に、上述の ようにして調製された組成物を用いて治療した。毛嚢を含む組織の部分を含む患 者の断端に、組成物を約３１／２力月間ぬった。治療後、以前には毛の見られな かった場所で組成物を処理した部分に顕著な毛の成長が観察された。

実施例５ 使用された血小板緩衝液にヒト血清アルブミンを含まない事態外には上述のよう に調製された組成物を用いて４人の患者に対して治療した。

１人目の患者はＢＫＡを受けた糖尿病であった。断端に対して約２カ月間、組成 物を用いて治療した。

２人目の患者は末梢血管の疾患（”ＰＶＤ”）で、ｉｎ　５ｉｔｕの副面行路を 施され、そして大きな足指をひとつ切断されていた。切断部分に対して約８１／ ２カ月間組成物を用いて治療した。

３人目の患者は糖尿病で、ｉｎ　５ｉｔｕ副血行路を施され、そして約３カ月間 下足部の潰瘍に対して組成物を用いて治療した。

４人目の患者はＰＶＤを持ち、腎臓移植を施され、ｉｎ　５ｉｔｕ副血行路を施 され、そして修復していない創傷に対して約４−４　１／２力月間組成物を用い て治療した。

４入金部の患者において、治療後、以前には毛の見られなかつた場所で組成物を 処理した部分に顕著な毛の成長が観察された。

本発明の解釈において、開示は説明のためのものであり、本発明の目的は添付さ れた請求の範囲の記載により決定されるべきことを忘れてはならない。

国際調査報告

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．毛嚢を含む組織に局所的に組成物をぬり、上記組成物は血小板由来の成長因 子からなり、上記組成物をぬることは上記組織から毛の成長を引き起こすのに十 分な量で行われる、毛の成長を促進する方法。
2. ２．上記血小板由来の成長因子が血小板から放出されたものである、請求項１に 記載の方法。
3. ３．上記組成物がさらに血小板由来の血管形成因子を含む、請求項１に記載の方 法。
4. ４．上記血小板由来の成長因子が哺乳動物の血小板由来の成長因子である、請求 項１に記載の方法。
5. ５．上記血小板由来の成長因子がヒトの血小板由来の成長因子である、請求項４ に記載の方法。
6. ６．毛嚢を含む組織に局所的に組成物をぬり、上記組成物は血小板由来の血管形 成因子からなり、上記組成物をぬることは上記組織から毛の成長を引き起こすの に十分な量で行われる、毛の成長を促進する方法。
7. ７．上記血小板由来の成長因子が血小板から放出されたものである、請求項６に 記載の方法。
8. ８．上記血小板由来の血管形成因子が哺乳動物の血小板由来の血管形成因子であ る、請求項３または６に記載の方法。
9. ９．上記血小板由来の血管形成因子がヒトの血小板由来の血管形成因子である、 請求項８に記載の方法。
10. １０．血小板から物質を放出させ；そして毛嚢を含む組織に局所的に組成物をぬ り、上記組成物は血小板から放出された上記物質からなり、上記組成物をぬるこ とは上記組織から毛の成長を引き起こすのに十分な量で行われる、毛の成長を促 進する方法。
11. １１．上記組織がヒトの組織である、請求項１，３，６または１０に記載の方法 。
12. １２．上記血小板が上記物質の放出前に血液から単離される、請求項２，７また は１０に記載の方法。
13. １３．上記組成物が実質的に（１）血液あるいは血漿中の汚染物および（２）血 小板中に見いだされ、しかし上記血小板により放出されない血小板の細胞形骸あ るいは他の物質を含まない、請求項１２に記載の方法。
14. １４．上記血小板が哺乳動物の血小板である、請求項２，７または１０に記載の 方法。
15. １５．上記血小板がヒトの血小板である、請求項１４に記載の方法。
16. １６．上記物資の放出前に治療を受ける人から上記血小板を採取する、請求項１ ５に記載の方法。
17. １７．上記物質の放出前に治療を受ける人以外の人あるいは人達から上記血小板 を採取する、請求項１５に記載の方法。
18. １８．トロンビン、アデノシン２リン酸およびコラーゲンからなるグループから 選択されたアクティベーターの使用により上記物質が上記血小板から放出される 、請求項２，７または１０に記載の方法。
19. １９．上記アクティベーターがトロンビンである、請求項１８に記載の方法。
20. ２０．上記組成物中の上記物質が上記組成物１ミリリットルあたり約１０６から 約１０９の血小板から放出された物質の量と等しい濃度の範囲内にある、請求項 １０に記載の方法。