JPS62501628A - 創傷治癒剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 創傷治癒剤 本出願は１９８４年１１月２９日付の係属中の特許出願第６７６４７１号の一部 継続出願である。

発明の分野 本発明は創傷治癒剤（特に血管形成因子および成長因子）、血液からのそれらの 調製法、および創傷の治癒を促進するためのそれらの使用に関する。

発明の背景 線維増殖およびコラーゲン合成をともなう毛細血管内皮細胞の増殖および制御さ れた成長である血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｌｅ）は、創傷に対して宿主が 応答する欠くことのできない要素である。血小板の活性化および血液凝固カスフ ードは損傷に対する第一の反応に含まれる。

トロンビンによって活性化された血小板は、線維芽細胞や平滑筋細胞のだめのマ イトジェン（すなわち成長因子）を放出し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　において平滑筋 細胞によるコラーゲン合成を刺激する。マイトジェン（血小板由来成長因子、以 後ＰＤＧＦ’と略す）は２つのポリベゾテドから成る。ＰＤＧＦに関する論文は グローチンドルスト（Ｇ、Ｒ，Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ）、チ：ｘ、ン（Ｔ、Ｃ ｈａｎｇ）、セパ（ＨｌＥ、Ｊ、５ｅｐｐａ）、クライーｒ　ｙ　（Ｈｌに、Ｋ ｌｅｉｎｍａｎ）　およびマーチン（Ｇ、Ｒ，Ｍａｒｔｉｎ）の［血小板由来成 長因子は血管平滑筋血管形成因子と呼ばれる非マイトジェン物質もまたトロンビ ン活性化血小板により産生され、毛細血管の成長を刺激する。

腫瘍、網膜および損傷液（ｗｏｕｎｄ　ｆｌｕｉｄ）の血管形成因子を含めて、 種々の血管形成因子が知られている。全ての血管形成因子が毛細血管内皮細胞に 対して共通の作用機序を有するかどうかについては知られていない。

血管形成因子は単離され、バング（Ｍ、Ｓ、Ｂａｎｄａ）　、ナイトン（Ｄ、Ｒ ｏＫｎｉｇｈｔｏｎ）、／％７ト（Ｔ、に、Ｈｕｎｔ）およびワープ（Ｚ、Ｗｅ ｒｂ）の「損傷液からの非マイトジェン血管形成因子の単離」と題する論文（Ｐ ｒｏａ、Ｎａｔ’ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　、　７７７３−７７７７　ｔ １９８２年１２月〕り発表された。この論文の内容は参照によりここに引用され る。

血管形成因子および血小板由来成長因子はナイトン（Ｄ、Ｒ。

Ｋｎｉｇｈｔｏｎ）、ハントσ、に、Ｈｕｎｔ）、タクラル（Ｋ、に、Ｔｈａｋ ｒａｌ）およびグツドンン（Ｗ、Ｈ，Ｇｏｏｄｓｏｎ　ＩＩＩ　）　の「治癒過 程における血小板とフイズリンの役割」と題する論文（Ａｎｎａｌｓ　Ｏｆ　Ｓ ｕｒｇｅｒｙ。

１９６：３７９−３８８（１９８２））に記載されており、この内容は参照によ シここに引用される。この論文には、単一の１０単位血小板を輸血した際に患者 の非治癒性創傷が上首尾で治療された旨記載されている。その創傷は３週間で治 癒した。

最近の研究は、人体の正常な治癒過程が働く場合に、それは約５０チの有効レベ ルに達するにすぎないことを示している。

トルバート（Ｔｏｌｂｅｒｔ）らの米国特許第４２７３８７１号では、ヒト血管 形成因子をヒト包皮線維芽細胞から生産している。一般に入手しうる包皮線維芽 細胞株を利用して、血管形成因子を生産することができる。

アントニアデス（ＡｎｔＯｎｉａｄｅｅ）の米国特許第４４７９８９６号（この 内容は参照によりここに引用される）では、血小板由来成長因子が同定され、研 究のためにゲル電気泳動法によシ抽出された。

発明の要約 トロンビン活性化血小板は血管形成、増強されたコラーゲン合成および細胞分裂 ／成長を刺激する能力を有する。全血液試料を利用して血小板に富む血漿を調製 し、これをトロンビンで活性化すると、創傷の治癒過程を促進するのに使用し得 る血管形成因子と成長因子を含む血小板濃厚化血漿が得られることが発見された 。

血液を安定化し、遠心して血小板に富む血漿を得る。血液はシトレート−ホス７ エートーテキストロースと１＝５の比（２０チ溶液）で混合することによ多安定 化される。血小板に富む血漿（以後ＰＲＰと略す）は高濃度の血小板が得られる までさらに遠心することが好ましい。次に、その血小板を血小板用緩衝液に加え る。血小板の濃度は１ミリリツトル当たシ少なくともＬＯＯＱＯＯＯ個の血小板 であシ、好ましくは約ＬＯＯＱＯＯＱＯＯＯｆｉの血小板であるだろう。

ＰＲＰにトロンビンを加えて血小板を活性化する。好ましくは、１ミリリツトル のＰＲＰ　当たり約１〜約１０単位のトロンビンを使用する。トロンビン活性化 血小板は血小板由来成長因子（以後ＰＤＧＦと略す）および血小板由来血管形成 因子（以後ＰＤＡＦと略す）を放出する。血小板とトロンビンは室温で約５〜１ ０分間インキュベートさせる。

ＰＤＧＦ’　、ｌ！：　ＰＤＡＦ’を含む活性化ＰＲＰは、好ましくはキャリア ーとして作用する生物学的に適合性の高分子物質に加えられる。最初に、血小板 を約９５０Ｘ９で遠心し、血小板不含上清をキャリアーと混合する。生物学的に 適合性のキャリアーとしては、例えばペンシルバニア州（１９０６１）マーカス フツクのＦＭＣ社、アビセル部門から市販されているアビテン（Ａｖｉｔｅｎｅ ）という商標名のコラーゲンのような微結晶質コラーゲンである。

微結晶質コラーゲンは人体に適合性である。血液から得られる血小板に富む血漿 のすべてを吸収するのに十分なキャリアーが添加される。例えば％４０ゴの血液 試料は濃厚化後に一般に約２５１１Ｌｅのキャリアーを必要とするだろう。こう して得られたペーストは好ましくは氷上または冷蔵庫内に保存される。

ニューシャーシー州ビス力タウエーのファーマシア・ファイン・ケミカルズ社か らデブリサン（Ｄｅｂｒｉｓａｎ）という商標名で市販される創傷用包帯として 使用するだめの医療製剤も適当なキャリアーである。

キャリアー中に吸収された活性化ＰＲＰはその後創傷部位に適用される。その中 に高度に濃厚化された活性ＰＤＧＦおよびＰＤＡＦは毛細血管内皮細胞を増殖お よび成長させ、コラーゲン合成の速度を倍加し、白血球の走化性をうながすこと により治癒を促進させる。マイトジェン活性は細胞分裂／成長を誘起させて、欠 損組織を再生させる。

活性ＰＲＰを創傷部位へ毎日適用すると、治癒過程が刺激されかつ促進される。

４０ｍＡ！の血液から調製されるＰＲＰＯ量は７日間の適用にとって十分な量で ある。この物質は創傷部位全体に比較的均一な厚さく約２ｒｒａｎの厚さ）で適 用される。人体自身の修復シグナルが良好な治癒を刺激するのに不十分である場 合、活性化ＰＲＰの使用により肉芽形成、収縮および上皮形成が開始される。

本明細書中で使用するとき、トロンビンとは血小板放出のだめの生物学的放出剤 としてのトロンビンを意味する。コラーゲン％ＡＤＰおよびセロトニンを含めて 、当分野で知られた他の生物学的放出剤もトロンビンの代わりに又はトロンビン に加えて、血小板を活性化するために使用しうるが、トロンビンが好適である。

本発明の創傷治癒因子で治療しようとする。患者から採取した血ｉは、　酸−シ トレードーテキストロース（０，１５Ｍシトレート、２％グルコース、ｐＨ４， ２）（以後ＣＰＤ　と略記する）を含むシリコーン処理試験管中で安定化し、そ の血液から血小板に富む血漿を分離するために遠心する。４０〜６０ｍ１の血液 を４〜６　ｍｇ（７）　ＣＰＤと混合し０、約１３５Ｘ９、約４℃で２０分間遠 心して血小板に富む血漿を得る。その血漿を取や出して別の無菌の５０ｒｕｌ試 験管に加える。その後血小板を数える。ＣＰＤを利用して血液とプラスチック製 注射器との接触による一連の凝血活性化を抑える。血液が患者から採取される間 、注射器の中にＣＰＤを入れておく。血液とＣＰＤを連続混合して血液凝固を予 防する。その後、試験管中の血小板に富む血漿は７５０ｘ９．４℃で１０分間遠 心する。

血小板不含血漿は取り出して捨てる。血小板沈殿物を適量の血小板用緩衝液中に 再懸濁して最終ＩＩｔ７？とする。１ｍｌ当たシ約１００万個の血小板より低い 濃度も使用し得るが、あまシ好ましくない。使用する血小板用緩衝液は０．０５ 　Ｍ　ＨＥＰＥＳ（Ｎ　−２−ヒドロキシエチルピペラジン−ｎ−２−エタンス ルホン酸）００３Ｍグルコース、０．００４Ｍ　ＫＣｌ、０．１Ｍ　ＮａＣ，（ および約ｐＨ６，５に調整された約０．３５％ヒト血清アルブミンを含む。試料 はその後のマイトジェン活性試験のために約−２０℃で凍結する。別の試料は無 菌試験として血液外人上で画線培養する。

血小板に富む血漿は本発明の方法および組成物において利用される唯一の血液画 分である。ＰＲＰはその後精製トロンビンによｌ）、　ＰＲＰ　１ｔｔｔｌ当シ トロフシトロンビン約１〜約１０単で活性化される。好ましくは、　ＰＲＰ　１ ｍｇ当たりトロンビン約１単位が使用される。トロンビンの働きはフィブリノー ゲンを凝固させ、且つ血小板を活性化して血小板由来成長因子と血小板由来血管 形成因子を含むアルファ顆粒を放出させる。使用されるトロンビンはイリノイ州 カンカキ−のアーモー・ファーマシューチカル社から市販されているトロンビナ −（Ｔｈｒｏｍｂｉｎａｒ）という商品である。血小板とトロンビンは室温で約 ５〜１０分間インキュベートさせる。

次いで、ＰＲＰは遠心により血小板とフィブリンの除去に付される。９５０Ｘ９ ．４℃で約５分間遠心した後に得られる上清はＰＤＡＦとＰＤＧＦ’の両方を含 有する。Ｉ’ＤＡＦ’とＰＤＧＩ’は上溝中に抽出されるので、沈殿物を捨てる 。ＰＤＧＦは単離して性状決定を行った。それは分子量３０，０００のタンパク 質であり、分子量が１５，０００と１４，０００の２つの物質に分解される。

こうして得られた血小板不含上清中のＰＤＡＦ’およびＰＤＧＦ’を創傷部位に 適用するために、生物学的に適合性であって一時的穐デポー備として作用するキ ャリアー物質を使用することが望ましい。微結晶質コラーゲンのような高分子物 質がキャリアーである。特に好適なキャリアーははンシルバニア州（１９０６１ ）マーカスフツクのＦＭＣ社、アビセル部門からアビテンという商標名で市販さ れている微結晶質コラーゲンである。得られた組成物は粘稠でちシ、創傷部位に 接触した状態で保持されるであろう。セファロースビーズを含むダブリサン創傷 用包帯にュージャージー州ビス力タウエーの７アーマシア・ファイン・ケミカル ズ社の商標名）も別のキャリアーとして利用し得る。

好ましくは、ペーストを調製するためにキャリアー１ｇ当たシ上清約８〜１０ｒ ｎｌが使用される。

創傷治療用組成物の適用は、薬用軟膏を塗るときのようにその物質を創傷部位に 物理的に塗布することによシ行われる。治療はその創傷が開口している限シ毎日 繰り返されるべきである。

好適な治療は朝のうちに血小板／キャリアー複合体から成る約１＋ｏ＋の厚さの 包帯を患部に適用することである。その後無菌の乾燥包帯を当てる。夜になって から、包帯を取り除いて、滅菌塩水で洗うことによシその物質を除去する。

本発明の創傷治療用組成物を使用する臨床試験が身体外部の損傷に対して行われ たが、本組成物は身体内部の損傷も同様に治療し得る。縫合糸にこの創傷治療用 組成物を含浸させることにより、内部治療が倍加されるかも知れない。また、創 傷治療用組成物は外科手術において使用される移植可能物品や生分解性物品上の コーティングとして、生分解性包帯と共に使用することができる。一般に、患者 の中に挿入されるべき外来物体はどれも本組成物で被覆されることにょシ、その 治癒過程を倍加し得る。これとは別に１本組成物は患部組織に直接塗布すること ができる。

最初の臨床試験は、１〜５年の間の非治癒性創傷を有する８人のＭ者に対して行 われた。全ての患者はその傷をなおそうとして最大限度の標準的治療を受けたが 、その治療は失敗であった。すべての場合において、血小板由来因子の投与は肉 芽組織形成（肉芽組織は線維芽細胞、内皮細胞およびコラーゲンを含む）によっ て示されるように、治癒応答を開始させた。創傷は収縮および上皮形成によシ、 あるいは皮膚移植により閉鎖された。すべての適用において、治癒の促進および その結果としての修復が生じた。

創傷治療用の活性化ＰＲＰは損傷を受けた動物自身の血液から直接調製すること が好ましいが本発明の利点は同じ種の動物から採取した血液または古い（ｏｕｔ ｄａｔｅｄ）血小板を使用することによシ達戊し得る。治療されるべき患者から の血液を利用することは、血液銀行に預けられていた血液から肝炎にかかる可能 性やその他の汚染物質にさらされる危険性が避けられるので特に好適である。患 者自身の血液の使用はまた起こシうるアレルギー反応を排除するだろう。この物 質のばらつきのない供給源は洗浄された古いヒト血小板から得られる。この物質 はまた動物自身または同じ種に含まれる他の動物から誘導される血小板を利用す ることにより、獣医学的にも適用しうる。

壊死組織切除および中足骨切断後の左足に開放側を有する患者は、彼自身の血液 から上記のようにして得られたＰＤＧＦ’およびＰＤＡＦ’を用いて治療を開始 した。治療計画通シに進行させた後、その傷は新しい肉芽細胞によって埋められ た。その後の壊死組織切除は完全におおわれた中足骨とかなり大きい傷の縮小患 者は右足の親指の切断を行い、３週間標準的な治療法で治療したが創傷内には肉 芽組織が集まらなかった。その後、彼は本発明の血小板因子による治療を開始し た。治療の３週間後、島は約３０〜４０％に収縮し、速やかに治癒しつつあった 。

中足骨切断後の肢端の内側と外側に２つの大きな傷を有する患者は通常の治療法 を使用して４ケ月間治療したが、治癒しなかった。上記のようなＰＤＡＦ’およ びＰＤＧＦ’による治療の２週間以内に、傷は明らかな感染が除かれ、肉芽組織 を産生じ始めた。

２８人の糖尿病患者からの３８の非治癒性潰瘍をＰＲＰ−？−ストで治療した。

治療前の平均潰瘍存続期間は６−捧年であった約１０９血小板／　ｔｎｌｌの濃 度のＰＲＰから調製したイーストはアビテン（Ａｖｉｔａｎｅ）　コラーゲンと 組み合わされた。患者にはＰＤＧＦ／ＰＤＡＦ含有は−ストを１２時間おきに毎 日、平均８週間塗布した。毎日、壊死組織を切除した。すべての患部は肉芽組織 を産生し、開始時の創傷面積と比較して平均８３チが閉鎖された。潰瘍の９５チ は上首尾で治療され、全創島の上皮形成または上首尾の皮膚移植をもたらした。

これらの非治癒性潰瘍のうち２つのみが治癒しなかった。治癒した潰瘍は過形成 性帝痕や新生物が形成される形跡もなく閉鎖されたままである。

本発明を考慮する場合、開示された実施態様は本発明を例証するだめのものであ って１本発明の範囲は次の請求の範囲によシ定められると理解されるべきである 。

国際調査報告

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. （１）生理学的に活性な創傷治癒物質を調製する方法であつて、ａ）血液とシト レートーホスフエート−デキストロース溶液とを混合し； ｂ）該血液から血小板に富む血漿を分離し；ｃ）血小板を活性化し；そして ｄ）活性化血小板に富む血漿を微結晶質コラーゲンキヤリアーと混合する； 各工程から成る上記方法。
2. （２）血小板をトロンビンで活性化する請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）ａ）血液から血小板に富む血漿溶液を分離し；ｂ）該血小板を活性化して 血小板由来の成長因子と血管形成因子を生産させる； ことから成る血小板由来の成長因子および血管形成因子の生産方法。
4. （４）血小板をトロンビンで活性化する請求の範囲第３項記載の方法。
5. （５）ａ）動物から血液試料を採取し；ｂ）該血液試料から血小板に富む血漿を 分離し；ｃ）血小板に富む血漿１ｍｌ当たり約１〜１０単位のトロンビンを用い て該血小板を活性化する； ことから成る創傷治癒物質の生産方法。
6. （６）ａ）血液試料を採取し； ｂ）該血液から血小板に富む血漿面分を分離し；ｃ）該血小板をトロンビンで活 性化し；そしてｄ）得られる血管形成因子と成長因子を上記の活性化画分から分 離する； ことから成る血小板由来の血管形成因子と成長因子のｉｎｖｉｔｒｏ生産方法。
7. （７）血小板由来の血管形成因子および成長因子、ならびにキヤリアーを含有す る創傷治療用組成物。
8. （８）前記キヤリアーは微結晶質コラーゲンである請求の範囲第７項記載の組成 物。
9. （９）請求の範囲第７項記載の組成物を創傷部位に塗布することから成る創傷修 復の促進方法。
10. （１０）請求の範囲第７項記載の組成物を創傷部位に毎日投与することから成る 創傷の治療方法。
11. （１１）ａ）ある容量の血液を用意し；ｂ）該血液に、体内で凝血を予防するた めに使用し得る型の抗凝固剤を添加し； ｃ）該血液から血小板に富む血漿面分（血液１ｍｌ当たり少なくとも１，０００ ，０００個の血小板を含む）を分離し；そして ｄ）血小板に富む血漿１０ｍｌ当たり約１〜約１０単位のトロンビンを加える； 各工程から成る血液から血小板由来の血管形成因子と成長因子を抽出する方法。
12. （１２）１ｍｌ当たり約１，０００，０００，０００個の血小板濃度へ濃縮する 請求の範囲第１１項記載の方法。
13. （１３）ａ）血小板の試料を得； ｂ）古い血小板から血小板に富む血漿を分離し；ｃ）該血小板を洗浄して血清含 有物質を除き；ｄ）血小板に富む血漿１ｍｌ当たり約１〜約１０単位のトロンビ ンを用いて該血小板を活性化する；ことから成る創傷治癒物質の生産方法。
14. （１４）血小板に富む血漿１ｍｌ当たり約１単位のトロンビンを使用する請求の 範囲第１３項記載の方法。
15. （１５）血液銀行に預けられた血小板から上記血小板を得る請求の範囲第１３項 記載の方法。
16. （１６）ａ）１ｍｌ当たり少なくとも約１，０００，０００，０００個の血小板 濃度を有する血小板に富む血漿中の血小板由来の血管形成因子と成長因子；およ び ｂ）血小板に富む血漿１ｍｌ当たり約１〜約１０単位のトロンビン； を含有する創傷治療用組成物。
17. （１７）薬学的に受容されるキヤリアーをさらに含む請求の範囲第１６項記載の 組成物。
18. （１８）前記キヤリアーは微結晶質コラーゲンである請求の範囲第１７項記載の 組成物。
19. （１９）１ｍｌ当たり約１，０００，０００，０００個の血小板濃度である請求 の範囲第１６項記載の組成物。