DE3586355T2

DE3586355T2 - Heilmittel fuer wunden.

Info

Publication number: DE3586355T2
Application number: DE8585905980T
Authority: DE
Inventors: R Knighton
Original assignee: University of Minnesota Twin Cities
Current assignee: University of Minnesota Twin Cities
Priority date: 1984-11-29
Filing date: 1985-11-08
Publication date: 1993-01-14
Anticipated expiration: 2005-11-09
Also published as: WO1986003122A1; EP0202298A4; DK357386A; IE852810L; SE8603228D0; EP0383363A2; NO170194B; AU5094985A; NO862964D0; NO862964L; ATE78167T1; FI863087A0; DE3586355D1; FI85219B; EP0383363A3; DK165169C; AU596954B2; DK357386D0; CA1261259A; HUT42329A

Description

Fachgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von durch Blutplättchen freigesetzten Substanzen zur Herstellung eines Medikamentes für die lokale Anwendung auf tierischem, einschließlich menschlichem Gewebe zum Zweck der Wundheilung.

Der der Erfindung zugrundeliegende Stand der Technik

Die Angiogenese, als solche bezeichnet man die Vermehrung und das gerichtete Wachstum des Kapillar-Endothels, zusammen mit der Fibroplasie und der Kollagensynthese sind wesentliche Bestandteile der Reaktion eines Wirts auf eine Verwundung. Die Aktivierung von Blutplättchen und der Gerinnungskaskade gehört zu den ersten Reaktionen auf eine Verletzung.
Durch Thrombin aktivierte Blutplättchen setzen ein Mitogen oder einen Wachstumsfaktor für Fibroblasten und glatte Muskelzellen frei und regen so eine verstärkte in vitro-Kollagensynthese durch glatte Muskelzellen an. Das Mitogen (ein aus Blutplättchen gewonnener Wachstumsfaktor, im folgenden als PDGF bezeichnet) besteht aus zwei Polypeptiden. Ein Artikel, welcher PDGF beschreibt, wurde 1982 von G.R. Grotendorst, T. Chang, H.E.J. Seppa, H.K. Kleinman und G.R. Martin im Journal of Cellular Physiology, Vol. 113, S. 261-266 unter dem Titel "Platelet-Derived Growth Factor is a Chemoattractant for Vascular Smooth Muscle Cells" veröffentlicht.
Eine nicht-mitogenetische, angiogenetischer Faktor genannte Substanz, wird ebenfalls durch thrombinaktivierte Blutplättchen hergestellt und regt das Kapillarwachstum an. Es sind mehrere Angiogenese-Faktoren bekannt, darunter Tumor-, Retinal- und Wundflüssigkeit-Angiogenese-Faktoren. Es ist nicht bekannt, ob alle diese Angiogenese-Faktoren nach einem gemeinsamen Mechanismus auf Kapillarendothel-Zellen wirken.
Angiogenese-Faktoren wurden von M.S. Banda, D.R. Knighton, T.K. Hunt und Z. Werb isoliert und in einem Artikel in Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (7773 - 7777, Dec. 1982) mit dem Titel "Isolation of a nonmitogenic angiogenesis factor from wound fluid" beschrieben.
Angiogenese-Faktoren und aus Blutplättchen erhaltene Wachstumsfaktoren werden von D.R. Knighton, T.K. Hunt, K.K. Thakral und W.H. Goodson III, in "Role of Platelets and Fibrin in the Healing Sequence" in Annals of Surgery 196: 379-388 (1982) beschrieben. In diesem Artikel wird die erfolgreiche Behandlung einer nicht heilenden Wunde bei einem Patienten beschrieben, dem eine einzige Transfusion mit zehn Einheiten Blutplättchen verabreicht wurde, da er eine sehr geringe Zahl an weißen Blutplättchen hatte. Die Wunde verheilte in drei Wochen.
Eine jüngere Studie gibt Hinweise darauf, daß der intakte normale Heilungsprozess des Körpers lediglich eine Effektivität von 50% aufweist.
Gemäß Tolbert et al. in der US-PS 4 273 871 wird ein menschlicher angiogenetischer Faktor durch Fibroblasten der menschlichen Vorhaut hergestellt. Zur Herstellung des angiogenetischen Faktors wurde eine öffentlich zugängliche Vorhautfibroblastenzellinie verwendet.
Gemäß US-PS 4 479 896 (Antoniades) werden aus Blutplättchen gewonnene Wachstumsfaktoren charakterisiert und für eine Untersuchung durch Gel-Elektrophorese charakterisiert.
Keine der zum Stand der Technik gehörenden Veröffentlichungen offenbart die lokale Behandlung von Wunden mit den durch Blutplättchen freigesetzten Substanzen.
Durch Thrombin aktivierte Blutplättchen besitzen die Fähigkeit die Angiogenese, eine erhöhte Kollagensynthese, die Zellteilung und das Zellwachstum anzuregen. Es wurde gefunden, daß Proben von Vollblut zur Herstellung eines mit Blutplättchen angereicherten Plasmas benutzt werden können, welches im Falle einer Aktivierung durch Thrombin angiogenetische und Wachstumsfaktoren enthält, die zur Beschleunigung des Heilungsprozesses von Wunden verwendet werden können.
Um an Blutplättchen reiches Plasma zu erhalten wird das Blut stabilisiert und zentrifugiert. Die Stabilisierung erfolgt durch Mischen mit Citrat-Phosphat-Dextrose in einem Verhältnis von 1 : 5 (20%-ige Lösung). Das an Blutplättchen reiche Plasma (im folgenden PRP) wird vorzugsweise nochmals zentrifugiert, bis eine hohe Konzentration an Blutplättchen erhalten wird. Danach werden die Blutplättchen in einem Blutplättchenpuffer gegeben. Die Konzentration der Blutplättchen sollte zumindest 10&sup6; pro ml betragen. Vorzugsweise sollte die Konzentration in der Größenordnung von 10&sup9; pro ml liegen.
Zur Aktivierung der Blutplättchen wird dem PRP Thrombin zugegeben, vorzugsweise werden dabei ein bis zehn Einheiten an Thrombin pro ml PRP verwendet. Die Thrombin-aktivierten Blutplättchen setzen Wachstumsfaktoren (im folgenden PDGF) und Angiogenese-Faktoren (im folgenden PDAF), welche aus den Blutplättchen stammen, frei. Man läßt die Blutplättchen und das Thrombin bei Raumtemperatur während etwa 5 bis 10 Minuten inkubieren.
Das aktivierte PRP, welches PDGF und PDAF enthält, wird vorzugsweise einer biologisch kompatiblen makromolekularen Substanz, welche als Träger fungiert, zugegeben. Zunächst werden die Blutplättchen bei 950 g zentrifugiert und der an Blutplättchen freie Überbestand mit dem Träger gemischt. Vorzugsweise wird ein mikrokristallines Kollagen, wie das Kollagen mit dem Markenzeichen Avitene der FMC Corp., Avicel Dept., Marcus Hook, PA 19061 als biologisch kompatibler Träger verwendet. Mikrokristalline Kollagene sind im Körper biologisch verträglich. Es wird ausreichend Träger zugegeben, um die Gesamtmenge des aus dem Blut erhaltenen Blutplättchen reichen Plasmas, aufzusaugen. Zum Beispiel benötigt man für eine 40 ml Blutprobe typischerweise ungefähr 25 ml Träger nach der Anreicherung. Die so erhaltene Paste wird vorzugsweise auf Eis oder im Kühlschrank aufbewahrt.
Ein geeigneter Träger sind die pharmazeutischen Präparate für Wundverbände, welche durch Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, New Jersey unter dem Handelsnahmen Debrisan verkauft werden.
Das aktivierte PRP in dem Trägers kann dann auf die Wunde aufgetragen werden. Das darin enthaltene hochgradig angereicherte und aktive PDGF und PDAF unterstützen den Heilungsprozess durch Vermehrung und Steuerung des Wachstums des Kapillarendothels, durch Verdoppelung der Kollagensynthese- Geschwindigkeit und durch die Verursachung von Leukozyten- Chemotaxis. Die mitogenetische Aktivität führt zu Zellteilung und Wachstum, wodurch das verlorene Gewebe ersetzt wird.
Tägliches Aufbringen des aktivierten PRP auf Wunden stimuliert und unterstützt den Heilungsablauf. Die aus 40 ml Blut erhaltene Menge an PRP genügt zur Herstellung der Anwendungen für sieben Tage. Das Material wird über die gesamte Wunde in einer relativ einheitlichen Dicke von ungefähr 2 mm verteilt. Die Granulation, Kontraktion und Epithelisierung kann durch die Verwendung von aktiviertem PRP dort eingeleitet werden, wo die körpereigenen
Reparatursignale nicht ausreichen, um eine gute Heilung anzuregen.
Immer wenn erfindungsgemäß Thrombin eingesetzt wird, wird auf Thrombin als biologischer Wirkstoff zur Stimulierung der Freisetzung durch Blutplättchen Bezug genommen. Obwohl der Einsatz von Thrombin bevorzugt ist können andere auf diesem Gebiet bekannte biologische "Freisetzungs"-Wirkstoffe, einschließlich Kollagen, ADP und Serotonin, an Stelle von oder zusätzlich zu Thrombin zur Aktivierung der Blutplättchen eingesetzt werden.
Das von den zu behandelnden Individuen erhaltene Blut mit den erfindungsgemäßen Wundheilungsfaktoren wird in silikonisierten Röhrchen, welche Säure-Citrat-Dextrose (0,15 M Citrat, 2% Glucose, pH 4,2) (im folgenden CPD) enthalten, stabilisiert und zur Abtrennung des an Blutplättchen reichen Plasmas zentrifugiert. 40 bis 60 ml Blut werden zusammen mit 4 bis 6 ml CPD bei 135 g bei ungefähr 4ºC 20 Minuten lang zentrifugiert, um das blutplättchenreiche Plasma zu erhalten. Dieses wird entfernt und in ein anderes, steriles 50 ml Röhrchen gegeben und eine Zählung der Blutplättchen vorgenommen. Das verwendete CDP verhindert die Aktivierung der Gerinnungs-Sequenz infolge des Kontakts des Blutes mit dem Kunststoff der Spritze. Das CPD befindet sich in der Spritze während der Blutentnahme vom Patienten, wobei das Blut zur Vermeidung der Gerinnung kontinuierlich mit dem CPD vermischt wird. Das an Blutplättchen reiche Plasma im Röhrchen wird anschließend bei 750 g bei 4ºC 10 Minuten lang zentrifugiert.
Das blutplättchenfreie Plasma wird entfernt und verworfen. Der aus Blutplättchen bestehende Feststoff wird in einer bestimmten Menge eines Blutplättchen-Puffers erneut suspendiert und so in einer bestimmten Endkonzentration erhalten. Eine niedrigere Konzentration von ungefähr 10&sup6;
Blutplättchen pro ml ist noch geeignet, aber weniger bevorzugt. Der verwendete Blutplättchen-Puffer enthält 0,05 M HEPES (N-2- Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure),0,03 M Glucose, 0,004 M KCl, 0,1 M NaCl und ungefähr 0,35% Human-Serumalbumin, welches auf einen pH von ungefähr 6,5 eingestellt ist. Eine Probe wird bei ca. -20ºC eingefroren um später die mitogenetische Aktivität zu bestimmen. Eine weitere Probe wird zum Testen der Keimfreiheit auf Blutagar aufgestrichen.
Das blutplättchenreiche Plasma ist die Fraktion des Blutes, welche in den Verfahren und den gemäß der Erfindung hergestellten Zusammensetzungen benutzt wird. Das PRP wird anschließend durch gereinigtes Thrombin in einem Anteil von ungefähr 1 bis 10 Thrombin-Einheiten pro ml PRP aktiviert. Vorzugsweise wird ungefähr eine Thrombin-Einheit pro ml des an Blutplättchen reichen Plasmas verwendet. Das Thrombin führt zur Gerinnung des Fibrinogens und aktiviert die Blutplättchen, was zu einer Freisetzung von α-Granula die Blutplättchenderivierten Wachstumsfaktor und Angiogenesefaktor enthalten, führt. Das benutzte Thrombin war ein Thrombin der Marke Thrombinar der Armour Pharmaceutical Co., Kankakee, Illinois. Man läßt die Blutplättchen und das Thrombin ungefähr 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Das PRP wird anschließend zur Entfernung der Blutplättchen und des Fibrins zentrifugiert. Der nach ca. 5 minütiger Zentrifugation bei 950 g bei einer Temperatur von 4ºC resultierende Überstand enthält sowohl PDAF als auch PDGF. Da sich PDAF und PDGF im Überstand befinden wird der Feststoff verworfen. Die Isolation und Charakterisierung des PDGF ergab, daß es sich um ein Protein mit einem Molekulargewicht von 30 000 handelt, welches in zwei Spezies mit einem Molekulargewicht von 15 000 und 14 000 zerfällt.
Zur Anwendung des im blutplättchenfreien Überstand demgemäß erhaltenen PDAF und PDGF auf eine Wunde ist es wünschenswert eine biologisch kompatible Trägersubstanz, die als ein temporäres "Depot" wirkt, zu verwenden. Eine makromolekulare Substanz wie mikrokristallines Kollagen stellt einen geeigneten Träger dar. Ein besonders bevorzugter Träger ist das mikrokristalline Kollagen der Marke Avitene , FMC Corp., Avicel Dept., Marcus Hook, PA 19061. Die resultierende Zusammensetzung ist verdickt und verbleibt eher an der Stelle in Kontakt mit der Wunde. Der Wundverband der Marke Debrisan , welcher Sepharose - Kügelchen (Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Phiscataway, New Jersey) enthält, kann alternativ als Träger verwendet werden. Vorzugsweise werden 8-10 ml des Überstandes pro Gramm des Trägers zur Herstellung der Paste verwendet.
Die Anwendung der Wundbehandlungs-Zusammensetzung geschieht durch Auftragen des Materials als medizinische Salbe auf die Wunde. Die Behandlung sollte täglich wiederholt werden solange die Wunde offenbleibt. Eine bevorzugte Behandlung ist das Auftragen eines ungefähr 1 mm Belages bestehend aus dem Blutplättchenfaktor-Träger-Komplex auf die Wunde am Morgen. Diese wird dann mit einem keimfreien, trockenen Verband verbunden. Am Abend wird der Verband entfernt und die Substanz durch Waschen mit steriler Kochsalzlösung entfernt.
Obwohl die klinischen Tests mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zur Behandlung von Wunden auf äußerliche Anwendungen gerichtet waren, können mit den Zusammensetzungen ebenfalls innere Wunden behandelt werden. Nähte können zur Beschleunigung der inneren Heilung mit den Zusammensetzungen imprägniert werden. Die Zusammensetzungen zur Wundbehandlung können ebenso in Verbindung mit biologisch abbaubaren Verbänden verwendet und als Überzug für Implantate und biologisch abbaubare in operativen
Eingriffen verwendete Geräte eingesetzt werden. Im allgemeinen kann jeder Fremdkörper, welcher einem Patienten eingesetzt wird, mit der Zusammensetzung überzogen werden, um den Heilungsprozesses zu beschleunigen. Als Alternative dazu kann die Zusammensetzung direkt auf das geschädigte Gewebe aufgebracht werden.
Erste klinische Versuche wurden an acht Patienten, welche nichtheilende Wunden über einen Zeitraum von einem bis fünf Jahren aufwiesen, durchgeführt. Bei allen Patienten war mit den bestmöglichen üblichen Behandlungsmethoden versucht worden die Wunden zu heilen, jedoch ohne Erfolg. In allen Fällen leitete die Anwendung der aus Blutplättchen erhaltenen Faktoren eine Heilreaktion ein, wie aus der Bildung von Granulationsgewebe (Granulationsgewebe enthält Fibroblasten, Endothelzellen und Kollagen) ersichtlich ist. Die Wunden schlossen sich durch Kontraktion und Epithelisierung oder durch Hauttransplantation. Stimulation des Heilungsprozesses und schließliche Wiederherstellung trat bei allen Anwendungen ein.
Während es bevorzugt ist, das aktivierte PRP zur Behandlung von Wunden direkt aus dem eigenen Blut des verletzen Tieres herzustellen, können die Vorteile der Erfindung auch bei der Verwendung von Blut oder hinterlegten, überalterten Blutplättchen von Tieren der gleichen Art erreicht werden. Die Verwendung des Blutes des verletzten und zu behandelnden Individuums ist besonders bevorzugt, da so die Ansteckung mit möglicherweise Hepatitis oder anderen Infektionsherden aus in der Blutbank hinterlegtem Blut verhindert werden kann. Weiterhin wird durch die Verwendung des patienten-eigenen Blutes jede mögliche allergische Reaktion ausgeschlossen. Eine ständig zugängliche Quelle für das Material kann in gewaschenen, überalterten menschlichen Blutplättchen bestehen. Die Substanzen können ebenfalls im tiermedizinischen Bereich bei der Verwendung von aus dem Tier selbst erhaltenen Blutplättchen oder aus einem anderen Tier derselben Art erhaltenen Blutplättchen angewendet werden.

Beispiel 1

Ein Patient mit einer offenen Wunde am linken Fuß als Folge der Entfernung abgestorbenen Gewebes und transmetatarsaler Amputation wurde mit in angegebener Weise aus seinem eigenen Blut erhaltenen PDGF und PDAF behandelt. Gemäß dem Behandlungsprotokoll füllte sich die Wunde mit neuem Granulationsgewebe. Anschließende Wundreinigung zeigte vollständig bedeckte Mittelfußknochen und eine Kontraktion der beträchtlichen Wunde.

Beispiel 2

Ein Patient wurde nach der Amputation seines rechten großen Zehs mit gewöhnlichen Behandlungsmethoden drei Wochen lang behandelt, ohne daß sich Granulationsgewebe in der Wunde bildete. Dann wurde mit der erfindungsgemäßen Blutplättchen- Faktor-Behandlungsmethode begonnen. Nach dreiwöchiger Behandlung kontrahierte die Wunde zu ungefähr 30 bis 40% und heilte schnell.

Beispiel 3

Ein Patient mit zwei großen Wunden auf der inneren und seitlichen Oberfläche seines Stumpfes infolge von transmatatarsaler Amputation wurde vier Monate lang mit gewöhnlichen Behandlungsmethoden ohne Heilung behandelt. Innerhalb einer zweiwöchigen, wie oben beschriebenen, Behandlung mit PDAF und PDGF war die Wunde frei von einer deutlich sichtbaren Infektion und begann mit der Produktion von Granulationsgewebe.
38 nicht-heilende Geschwüre von 28 Diabetes-Patienten wurde mit der PRP-Paste behandelt. Die Geschwüre waren im Durchschnitt vor der Behandlung seit 6,5 Jahren vorhanden. Eine aus PRP in einer Konzentration von ungefähr 10 Blutplättchen pro ml hergestellte Paste wurde mit einem Kollagen der Marke Avitene kombiniert. Die Patienten wendeten die PDGF und PDAF enthaltende Paste täglich für 12 Stunden auf eine mittlere Dauer von acht Wochen an. Jeden Tag wurden die Wunden von abgestorbenem Gewebe gereinigt. Alle Wunden produzierten Granulationsgewebe und waren im Vergleich zur Wundfläche beim Beginn der Behandlung im Mittelwert zu 83% geschlossen. 95% der Geschwüre wurden erfolgreich behandelt, was entweder zu einer vollständigen Wundepithialisation oder zu einer erfolgreichen Hauttransplantation führte. Nur zwei dieser Wunden heilten nicht. Die geheilten Geschwüre blieben geschlossen, ohne Hinweis auf hypertrophische Narben- oder Neoplastenbildung.

Claims

Verwendung der von Blutplättchen freigesetzten Substanzen zur Herstellung eines Medikaments für die lokale Anwendung auf tierisches Gewebe, einschließlich menschliches Gewebe zum Zweck der Wundheilung.