FR2652088A1 - Procede de preparation d'un produit a base de substance liberee par les plaquettes, et produit obtenu par ce procede. - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un procédé de préparation d'un produit à base de substance libérée par les plaquettes. Ledit procédé consiste à soumettre à une analyse un échantillon de substance libérée par les plaquettes pour déterminer la quantité d'un constituant de la substance libérée par les plaquettes et à former un produit à base de substance libérée par les plaquettes par comparaison des résultats de l'analyse à un intervalle prédéterminé de quantités du constituant devant être présent dans le produit. Application: utilisation dudit produit à base de substance libérée par les plaquettes pour le traitement de tissus.
Description
La présente invention a pour objet le choix de quantités de substance
libérée par les plaquettes pour un
traitement efficace d'un tissu.
La réparation des tissus ou "cicatrisation" fait intervenir de nombreuses réactions cellulaires et biochimiques qui transforment le tissu conjonctif quiescent et les cellules épidermiques en cellules à division rapide et à grande mobilité. Cette transformation fait intervenir le chimiotactisme (mouvement des cellules), la mitogénèse
(division des cellules) et une synthèse protéique accrue.
Les cellules épidermiques, les fibroblastes et les cellules endothéliales des capillaires sont impliqués dans la formation du tissu neuf. Les cellules épidermiques migrent et se divisent pour former de la peau neuve (épithélium) au niveau du site de réparation des tissus; les fibroblastes migrent et se divisent pour produire la matrice qui comble le site de réparation (site de granulation); des cellules endothéliales des capillaires migrent et se divisent pour produire des capillaires nouveaux qui revascularisent la
matrice de fibroblastes et de collagène.
Le processus de la migration cellulaire et de la mitose est sous le contrôle de plusieurs agents biochimiques. Ces agents à action locale agissent sur les différentes cellules pour diriger leur mouvement et leur
division.
Chacun de ces agents biochimiques (1) est chimiotactique (ce qui signifie qu'il s'agit d'un agent chimioattractif) et provoque une migration (chimiotactisme) d'un certain type de cellule; (2) engendre la mitose (ce qui signifie qu'il s'agit d'une substance mitogène) et provoque la division (mitogénèse) d'un certain type de cellules; et/ou (3) est angiogénique (ce qui signifie qu'il s'agit d'un facteur angiogénique) et provoque la formation de capillaires nouveaux (migration et division de cellules endothéliales des capillaires). Le caractère chimiotactique, mitogène ou angiogénique d'un agent biochimique est généralement déterminé en testant l'agent dans différentes analyses connues pour déterminer le chimiotactisme, la mitogénèse et l'angiogénèse. Certaines de ces analyses sont décrites ci-dessous. Il est escompté qu'il soit élaboré dans le futur d'autres analyses qui seront destinées aux mêmes caractéristiques, mais peut-être définiront ou détermineront plus nettement la présence de
ces caractéristiques.
Le Facteur de Croissance Dérivé des Plaquettes (PDGF) est une glycoprotéine dimère de 30 000 daltons, bien
caractérisée, présentant une activité mitogène et chimio-
attractive pour les fibroblastes, les cellules des muscles lisses et les cellules gliales. En présence de PDGF, les fibroblastes migrent dans la zone du tissu nécessitant une réparation et sont stimulés pour provoquer leur division dans l'espace proprement dit de la lésion. Les cellules mises en contact avec de plus faibles concentrations de PDGF (approximativement 0,5-1 ng/ml) sont stimulées pour provoquer leur migration et, lorsqu'elles migrent vers des milieux renfermant de plus fortes concentrations de PDGF (approximativement 1-2 ng/ml), sont stimulées pour
provoquer leur division.
Le processus de néovascularisation ou d'angio-
génèse (formation de capillaires nouveaux) est stimulé par des facteurs angiogéniques. Le facteur angiogénique pouvant
être extrait des plaquettes (PDAF) est un agent chimio-
attractif pur dépourvu d'activité mitogène pour les cellules endothéliales des capillaires, qui stimule ces cellules pour provoquer leur migration à travers un gradient vers la source du facteur angiogénique. Dès que les cellules des capillaires commencent à se déplacer hors
des capillaires d'origine, elles commencent à se diviser.
Cette division est probablement sous le contrôle de facteurs de croissance autocrine produits par les cellules endothéliales, qui se sont révélé être du type du facteur
basique de croissance des fibroblastes (FGF).
L'association de la migration et de la mitose des fibroblastes et de la migration et de la mitose des cellules endothéliales produit un tissu de granulation. Le tissu de granulation est également riche en polynucléaires neutrophiles et en monocytes qui ont été amenés au site de réparation par la présence de C5A provenant de l'activation du complément et de facteur de croissance transformant bêta (TGF-B) issu des plaquettes. La présence de ces cellules phagocytaires réduit la contamination et évite une surinfection. Le TGF-B est un polypeptide de 25 000 daltons (112 aminoacides) qui possède une fonction dans la synthèse de la fibrine et du collagène. Le TGF-B inhibe la division des fibroblastes et accroît leur production de matrice. La stimulation ou l'inhibition de la division par le TGF-B est fonction de la gamme complète de facteurs de croissance agissant dans le tissu. En présence de PDGF, le TGF-B stimule habituellement la division, tandis qu'il inhibe habituellement la division en présence des facteurs de
croissance épidermique (décrits ci-dessous).
Apres formation du tissu de granulation, les cellules épidermiques migrent depuis le bord de l'incision cutanée au-dessus du tissu de granulation pour former une couche cutanée neuve, qui subit ensuite une maturation pour donner de la peau normale. Cette activité cellulaire est au moins partiellement sous le contrôle du facteur de croissance épidermique dérivé des plaquettes (PDEGF) qui
est un agent chimioattractif pour les cellules épidermi-
ques. En résumé, le processus de réparation des tissus ou de "cicatrisation" est sous le contrôle d'au moins quatre facteurs de croissance: TGF-B, PDGF, PDAF et PDEGF. La présence de ces facteurs de croissance dans le tissu à réparer provoque un migration et une mitose des fibroblastes, une migration et une mitose ultérieure des cellules endothéliales et une migration et une mitose des cellules épidermiques. Le résultat final est le comblement de l'espace de la lésion par un tissu de granulation, puis
une re-épithélisation et une maturation de la peau.
Deux sources principales de ces facteurs provoquant la cicatrisation naturelle des tissus sont les plaquettes et les macrophages. Lorsqu'un tissu est lésé dans le corps, des plaquettes sont libérées par la présence de thrombine engendrée par activation du processus de coagulation. Ces plaquettes libèrent ensuite le PDGF, le PDAF, le PDEGF, le TGF-B et le facteur plaquettaire 4 (le PF-4 est un agent chimioattractif pour les polynucléaires neutrophiles et les monocytes) et stimulent la libération du complément C5A. Le PDGF, le PDAF, le PDEGF et le PF-4 contribuent eux-mêmes directement à la cicatrisation de la lésion, de la manière décrite ci-dessus, tandis que le TGF-B et le C5A attirent les macrophages vers le site de la lésion. Les macrophages libèrent eux- mêmes des agents mitogènes, des agents chimioattractifs et des facteurs angiogéniques identiques ou similaires, une fois qu'ils ont été amenés à la zone de réparation tissulaire. Cependant, on ne sait pas actuellement si les macrophages présentent une activité analogue à celle des facteurs de croissance
épidermique (EGF).
Les causes habituelles de la non-amélioration des lésions ne présentant pas de cicatrisation sont: une infection, une mauvaise cellularité, une insuffisance de fibroblastes, l'absence de capillaires neufs et le faible nombre de cellules inflammatoires. A l'opposé, les lésions présentant une cicatrisation sont caractérisées par la presence d'infiltrats de cellules mononucléaires et de macrophages, de fibroblastes en division et de nombreux
capillaires.
Knighton et collaborateurs, dans Ann. Sur.
1986, 204:322-330, incorporé dans son intégralité au présent mémoire à titre de référence, ont traité 49 patients souffrant d'ulcères cutanés chroniques ne présentant pas de cicatrisation au moyen d'une formulation de cicatrisation dérivée de plaquettes autologues (PDWHF) dans un baume à base de collagène microcristallin. Les lésions ont été traitées pendant un temps moyen de 198 semaines en suivant un traitement classique. Le temps moyen de cicatrisation pour parvenir à une épithélisation de 100 % était égal à 10,6 semaines; la corrélation directe avec une cicatrisation de 100 % était liée aux dimensions
initiales de la lésion et au déclenchement d'une thérapeu-
tique au moyen de PDWHF. Aucune formation de tissu anormal, aucune chéloide, ni aucune cicatrice hypertrophique n'a été mentionnée. Dans une étude en double aveugle, Knighton et collaborateurs, dans Tissue Repair Symposium at Tarpon Springs, Floride, mai 1987, qui est incorporée dans son intégralité au présent mémoire à titre de référence, ont comparé la cicatrisation au moyen de PDWHF dans un excipient à base de collagène à celle obtenue avec un placebo. Les 24 patients ont tous reçu des soins des lésions suivant un protocole de référence. Les 13 patients dans le groupe traité avec le PDWHF ont présenté une cicatrisation avec une épithélisation de 100 % dans 17 de 21 lésions au bout de 8 semaines de thérapeutique; parmi les 11 patients du groupe ayant reçu un placebo, 2 lésions
sur 13 présentaient seulement une épithélisation de 100 %.
Les sujets ayant présenté un échec par traitement avec un placebo ont été ensuite traités avec du PDWHF et leurs lésions ont présenté une cicatrisation en un temps moyen de 7,1 semaines. Les patients traités avec le PDWHF et n'ayant pas présenté de cicatrisation ont été maintenus sous traitement avec le PDWHF et ont présenté une épithélisation de 100 % en un temps moyen de 5,8 semaines supplémentaires
de traitement.
Les comptes-rendus des résutats de prétraite-
ment d'un groupe de patients examinés à la University of Minnesota Wound Care Clinic ont été présentés à un groupe de trois experts en amputation, en soins des pieds de patients diabétiques et en chirurgie vasculaire, reconnus au niveau national. Les 136 lésions des 73 patients ont été classées sur une échelle de gravité de 1 à 6 (gangrène dans une partie de l'épaisseur à gangrène dans la totalité de l'épaisseur). La thérapeutique avec le PDWHF a été instaurée dans chaque cas. Plus de 75 % présentaient des lésions de catégorie 3 ou supérieure. Soixante dix pour cent (70 %) des membres étudiés ont été considérés comme
présentant un risque important ou défini d'amputation.
Parmi les 26 membres classés dans la catégorie ne présen-
tant pas de risque d'amputation, aucun n'a nécessité une amputation. Plus de 90 % des 53 membres considérés comme
présentant un risque important d'amputation ont été sauvés.
Les membres classés dans la catégorie nécessitant une amputation immédiate (n=9) ont pu être sauvés dans 86 % des cas. L'application de PDWHF à des lésions de manière journalière a activé la formation du tissu de granulation
et la stimulation de la croissance des cellules épidermi-
ques. Les lésions présentant une non-cicatrisation chronique ont été guéries par formation de peau totalement fonctionnelle. Dans les études précitées de traitement de lésions, la formulation de PDWHF était basée sur la libération de 109 plaquettes dans le milieu, à un volume final de 1 ml. Aucune tentative n'a été effectuée pour ajuster la quantité de substance libérée par les plaquettes pour compenser une variation d'un donneur à l'autre, ou d'un moment à un autre pour un donneur particulier, des activités des facteurs de cicatrisation présents dans cette substance libérée par les plaquettes. Un objectif de la présente invention consiste en le choix des quantités de substance libérée par les plaquettes pour un traitement efficace des tissus, en portant une grande attention aux variations des activités des facteurs de cicatrisation
présents dans la substance libérée.
Conformément à la présente invention, un tissu peut être traité par application topique d'un produit à base de substance libérée par les plaquettes, contenant une
quantité choisie de substance libérée par les plaquettes.
Le produit à base de substance libérée par les plaquettes est de préférence appliqué à un tissu à traiter en une quantité suffisante pour provoquer, si cela est désiré, une migration et/ou une division des fibroblastes, des cellules
endothéliales des capillaires et/ou des cellules épidermi-
ques de sorte que la division ou la migration des cellules contribue à la formation d'un tissu de granulation, de
capillaires et/ou d'épithélium dans la zone du traitement.
La présente invention propose un procédé de préparation d'un produit à base de substance libérée par les plaquettes, utile dans le traitement des tissus. Une analyse est effectuée sur un échantillon de substance libérée par les plaquettes, l'analyse indiquant la quantité d'un constituant présent dans l'échantillon de substance libérée par les plaquettes. Le "constituant" est de préférence un facteur de cicatrisation, sa quantité pouvant être corrélée à la quantité de facteurs de cicatrisation désirés présents dans la substance libérée par les plaquettes. L'analyse peut être un immunoessai destiné à détecter la quantité ou la présence de ces constituants ou peut être n'importe quelle autre méthode de détermination de la présence ou de la quantité du constituant, cette méthode étant par exemple une chromatographie en phase liquide à hautes performances (CLHP). Sur la base des résultats de l'analyse, il est formé un produit à base de substance libérée par les plaquettes qui contient une
quantité choisie de substance libérée par les plaquettes.
La quantité est choisie en comparant la quantité du constituant dans l'échantillon de substance libérée par les plaquettes à une gamme prédéterminée de quantités du constituant identique devant être présent dans un produit à base de substance libérée par les plaquettes. La présente invention propose en outre un procédé de traitement d'un tissu par application topique à ce tissu du produit précité
à base de substance libérée par les plaquettes.
Un autre procédé de préparation d'un produit à
base de substance libérée par les plaquettes, et l'applica-
tion topique de ce produit à un tissu, font intervenir l'analyse d'un échantillon de substance libérée par les plaquettes, cette analyse indiquant le degré d'activité de
l'échantillon de substance libérée par les plaquettes.
La substance libérée par les plaquettes présente dans le produit à base de substance libérée par les plaquettes et dans l'échantillon de substance libérée par les plaquettes est de préférence obtenue à partir du même prélèvement de plaquettes. En variante, la substance libérée par les plaquettes présente dans le produit à base
de substance libérée par les plaquettes et dans l'échantil-
lon de substance libérée par les plaquettes peut être obtenue à partir de prélèvements différents de plaquettes provenant du même animal ou du même patient. Une autre possibilité consiste à obtenir la substance libérée par les plaquettes présente dans le produit à base de substance libérée par les plaquettes et dans l'échantillon de substance libérée par les plaquettes à partir d'un
échantillon de plaquettes obtenu par réunion de prélève-
ments uniques ou multiples de plaquettes obtenus à partir d'un seul animal ou d'un seul patient ou bien à partir d'un
groupe d'animaux ou de patients servant de donneurs.
La plage des quantités du constituant devant être présent dans un produit à base de substance libérée par les plaquettes peut être déterminée préalablement de sorte que la quantité choisie de substance libérée par les plaquettes présente dans ledit produit à base de substance libérée par les plaquettes soit suffisante pour parvenir à une grande efficacité de traitement d'un tissu dans un pourcentage choisi de traitements. Par exemple, cette efficacité de traitement peut être choisie de manière à obtenir au moins un résultat d'évaluation fonctionnelle de stade 2, tel qu'il est défini ci-après, dans plus de 50 % des lésions traitées. En variante, une plage de degrés d'activité d'un produit à base de substance libérée par les plaquettes peut être établie de manière similaire d'après
l'efficacité désirée de traitement d'un tissu.
Les constituants, pour lesquels une plage de quantités est déterminée préalablement pour parvenir à une telle efficacité, peuvent être la bêtathromboglobuline ("B-TG"), le PDGF, le PDAF, le PF-4, le FGF basique, le FGF
acide, le TGF-a, TGF-B, le PDEGF et la fibronectine.
L'activité peut être l'activité mitogène des fibroblastes
("AMF"), l'activité chimiotactique des cellules endothé-
liales ("ACCE"), l'activité dans l'effet sur la cornée de
lapin ("AECL") ou l'activité chimiotactique des kératino-
cytes ("ACK").
Finalement, la substance libérée par les plaquettes peut être mélangée à un véhicule ou diluant pharmaceutiquement acceptable, pour former un produit à base de substance libérée par les plaquettes. En outre, le produit peut être pratiquement dépourvu d'impuretés
provenant du sang ou du plasma et être dépourvu d'enve-
loppes des plaquettes ou d'autres matières présentes dans
les plaquettes mais non libérées par les plaquettes.
Le "traitement" comprend une cicatrisation, une application en chirurgie esthétique ou n'importe quel autre procédé dans lequel il est souhaitable d'accroître l'activité angiogénique, mitogène ou chimiotactique dans la zone du tissu à traiter. Les applications possibles du traitement d'un tissu comprennent, sans limitation, n'importe quelles applications parmi celles énumérées sur le Tableau 1. Ces traitements sont des traitements topiques en ce sens qu'ils consistent à appliquer une composition à la surface d'une zone ou du corps d'un tissu mais ne sont
pas mis en oeuvre par voie générale.
Tableau 1
Applications potentielles pour le traitement d'un tissu I. Traitement de lésions cutanées présentant une non-cicatrisation chronique A. Lésions ischémiques 1. Lésions diabétiques 2. Lésions ischémiques dues à une athérosclérose 3. Lésions dues à une vascularite artériolaire B. Lésions dues à une stase veineuse 1. Syndrome post-phlébitique 2. Stase veineuse post-traumatique C. Escarres de décubitus 1. Décubitus sacré 2. Décubitus ischiatique 3. Décubitus du talon et de la malléole 4. Autres zones de pression D. Lésions dues à un traumatisme cutané persistant II. Traitement topique de lésions aiguës A. Lésions par réduction d'épaisseur 1. Zones donneuses de greffes de peau 2. Abrasions, telles que celles provenant d'un accident de moto B. Perte de peau dans la totalité de son épaisseur 1. Lésion de dépouillement en doigt de gant 2. Perte de peau d'origine traumatique
3. Nécrose cutanée d'origine traumati-
que III. Brûlures A. Réparation d'une zone donneuse de greffes de peau ayant subi un amincissement B. Accélération de la formation du tissu de granulation et parage précoce d'une plaie et greffe de peau C. Accélération de la re-épithélisation de brûlures au deuxième degré D. Amélioration du résultat esthétique d'une greffe de peau par prévention d'une contraction chronique IV. Revascularisation de la peau intacte A. Nécrose lipoidique des diabétiques B. Ischémie cutanée induite par des radiations C. Pemphigus vulgaire V. Applications esthétiques A. Croissance des cheveux B. Préparation de renouvellement de la peau C. Traitement des rides VI. Traitement de lésions chirurgicales aiguës A. Lorsqu'elles sont associées à un agent biodégradable d'administration à libération lente, les compositions
peuvent accroître la vitesse de répara-
tion normale des lésions par raccourcis-
sement de la phase exponentielle de croissance. L'agent d'administration peut permettre l'application des compositions par voie topique à n'importe quelle lésion chirurgicale, que ce soit au niveau de la peau, de crevasses ou d'organes internes. -VII. Applications chirurgicales internes A. Les compositions peuvent être utilisées pour accélérer la réparation de lésions chirurgicales ou traumatiques internes, comprenant, à titre non limitatif, des
dilacérations hépatiques des dilacéra-
tions rénales, des dilacérations spléniques et des anastomoses, par exemple, de l'intestin, du côlon ou de
l'arbre biliaire.
B. Administration topique à des lésions
internes telles que des lésions traumati-
ques du foie et de la rate.
C. Les compositions peuvent être appliquées à des abcès intra-abdominaux pour accélérer leur réparation. Par exemple, lorsqu'un abcès intraabdominal est drainé par voie percutanée et le drain est laissé en place, les compositions pourraient être injectées à travers le
drain de manière à permettre l'applica-
tion topique de la composition aux surfaces de la cavité pour accélérer la
réparation de cet espace potentiel.
VIII. Applications vétérinaires
A. Accélération d'une réparation chirurgi-
cale B. Accélération d'une réparation de lésions présentant une noncicatrisation chronique, telles que celles des chevaux C. Accélération de la réparation de fractures des os longs des chevaux D. Un système pourrait être conçu pour délivrer des compositions pour le traitement de lésions chez les bovins pour empêcher le processus de contraction de se produire et couper le conduit mammaire. IX. Applications ophtalmologiques A. Accélération de la cicatrisation des ulcères de cornée B. Accélération de la cicatrisation des greffes de cornée C. Accélération de la cicatrisation d'autres
types de lésions chirurgicales ophtalmo-
logiques X. Applications orthopédiques A. Accélération de la cicatrisation normale des fractures - B. Stimulation de la réparation de l'absence d'ossification des cals C. Facilitation de la cicatrisation des greffes osseuses D. Stimulation de la réparation après parage d'une plaie d'ostéomyélite E. Des compositions pourraient être associées à une matière prosthétique (telle qu'une matière de remplacement articulaire) pour accélérer la croissance des tissus F. Accélération de la réparation de lésions des tendons et des ligaments G. Stimulation de l'incorporation de tendons artificiels XI. Applications en oto-rhino-laryngologie A. Accélération de la réparation de lésions de mastoidectomie (ce qui pourrait être effectué par une administration topique similaire à celle effectuée actuellement
pour des lésions présentant une non-
cicatrisation chronique) B. Association à des prothèses artificielles (telles que des membranes tympaniques, des tubes de membranes tympaniques ou des trompes d'Eustache artificielles) XII. Applications en chirurgie plastique
A. Remodelage d'un tissu correctif (comble-
ment de défauts tissulaires avec du tissu neuf) B. Stimulation de l'incarnation en prothèse (à savoir des implants du sein) C. Stimulation de la réparation accélérée dans des lambeaux D. Puisque la cicatrice qui résulte de l'administration topique de compositions est beaucoup plus satisfaisante au point de vue esthétique qu'une cicatrice non stimulée, la matière pourrait être utilisée par voie topique dans la révision des cicatrices E. Accélération de la réparation de lésions des tendons, telles que celles se produisant au niveau de la main XIII. Applications dentaires
A. Accélération de la guérison des alvéo-
lites sèches B. Accélération de la réparation des alvéoles normaux C. Accélération de l'incarnation dans les implants dentaires D. Stimulation de la croissance du tissu des gencives au niveau du liséré osseux dentaire XIV. Applications gastro-intestinales A. Lorsqu'elles sont associées à un médicament tel que le sucralfate, les compositions peuvent accélérer la réparation des ulcères de l'estomac et du duodénum B. Les compositions peuvent accélérer la réparation de la colite ulcéreuse du colon lorsqu'elles sont administrées sous forme de lavements C. Les compositions peuvent accélérer la réparation de la colite granulomateuse lorsqu'elles sont administrées par voie orale en association avec une substance à libération lente XV. Chirurgie vasculaire A. Les compositions (et notamment le facteur angiogénique), lorsqu'elles sont associées à une greffe artérielle, peuvent stimuler la formation de vasa
vasora nouveaux qui provoquerait une ré-
endothélisation de la greffe à partir de l'incarnation capillaire XVI. Organe endocrine artificiel A. Le facteur angiogénique peut être utilisé
pour stimuler l'incarnation des capil-
laires dans les tubes d'un organe endocrine artificiel qui pourrait être implanté dans le corps. La croissance des capillaires serait stimulée à travers les tubes et les cellules ou les îlots pourraient croître à l'extérieur des tubes pour permettre l'utilisation d'un système endocrine formant une xénogreffe totale XVII. Formation de rétrécissements A. Des compositions peuvent être associées à des dispositifs de rétention chirurgicale qui sont actuellement utilisés dans l'oesophage, l'arbre biliaire, l'urèthre
et les uretères pour stimuler l'angio-
génèse et la cicatrisation d'une structure tubulaire munie d'un dispositif de rétention chirurgicale qui diminue ensuite la vitesse de formation d'un rétrécissement. Les compositions peuvent être délivrées sur le dispositif de rétention chirurgicale sous une forme à libération lente de sorte que les compositions soient appliquées par voie topique aux surfaces du tissu entourant
le dispositif de rétention chirurgicale.
Les utilisations des compositions de la présente invention comprennent, à titre non limitatif, n'importe quelles utilisations parmi celles énumérées sur
le tableau 1A.
Tableau 1A
Applications potentielles supplémentaires de compositions de la présente invention I. Revascularisation d'infarctus du myocarde A. Des compositions peuvent être injectées au centre d'un infarctus du myocarde par cathétérisme cardiaque ou être guidées par voie percutanée en utilisant l'imagerie de résonance magnétique dans un système à libération lente, et peuvent accélérer la réparation de l'infarctus B. Des compositions peuvent être dirigées vers une cible avec des liposomes revêtus d'anticorps anti-collagène dénaturé et administrées par voie intraveineuse pour leur migration jusqu'au site d'une lésion
ou d'un infarctus du myocarde.
II. Revascularisation de lésions des nerfs A. Des compositions peuvent être injectées dans un infarctus cérébral ou une lésion
de la moelle épinière dans une formula-
tion à libération lente pour accélérer la réparation B. Comme dans le paragraphe I ci-dessus, des liposomes dirigés vers une cible, véhiculant les compositions, peuvent être utilisés par voie intraveineuse avec des anticorps anti-nerfs dénaturés pour leur migration vers le site d'une lésion
neurologique.
Un composé chimique possède une "activité chimiotactique", une "activité mitogène" ou une "activité angiogénique", de la manière dont ces expressions sont
utilisées tout au long de la présente description et des
revendications annexées, lorsque ce composé présente une
réponse positive dans les analyses correspondantes d'angiogénèse, de mitogénèse et de chimiotactisme décrites dans la présente invention ou dans des analyses similaires disponibles dans la pratique, ou telles qu'elles seront
élaborées ultérieurement. D'autres caractéristiques et avantages de la
présente invention ressortiront de la description détaillée
qui va suivre, faite en regard des dessins annexés, sur lesquels: - la figure 1 représente un graphique de l'évaluation fonctionnelle (EF) en fonction de la quantité, en ng/ml, de p-thromboglobuline (B-TG) dans l'extrait de substance libérée par les plaquettes lors d'une étude menée en Floride; - la figure 2 représente un graphique de l'évaluation fonctionnelle en fonction de la quantité, en ng/ml, de B-TG dans un extrait de substance libérée par les plaquettes lors d'une étude menée à Kansas City; - la figure 3 représente un graphique de l'évaluation fonctionnelle en fonction de la quantité, en ng/ml, de B-TG dans un extrait de substance libérée par les plaquettes lors d'une étude menée dans le Minnesota; - la figure 4 représente un graphique de la quantité de B-TG en fonction de la quantité de PF-4 dans un extrait de substance libérée par les plaquettes; - la figure 5 représente un graphique de la quantité de B-TG en fonction de la quantité de PDGF dans un extrait de substance libérée par les plaquettes; et - la figure 6 représente un graphique de la quantité de B-TG en fonction de l'activité de FMA dans un
extrait de substance libérée par les plaquettes.
L'efficacité du traitement des tissus a été
définie pour des lésions cutanées présentant une non-
cicatrisation chronique. Les stades 1 à 4 d'évaluation fonctionnelle mesurent la maturité de cicatrisation, sur la base des taux suivants: (1) moins de 100% d'épithélisation; présente
un drainage, nécessite un pansement.
(2) 100% d'épithélisation; présente un drainage, nécessite un pansement pour
limiter le drainage.
(3) 100% d'épithélisation; en voie de maturation, avec un léger drainage; nécessite seulement un pansement
protecteur.
(4) 100%. d'épithélisation; peau fonction-
nelle mature à 100%; ne nécessite pas de pansement. Le mode opératoire préféré pour le traitement des lésions cutanées présentant une noncicatrisation chronique consiste à appliquer le produit à base de substance libérée par les plaquettes une fois par jour, au même moment chaque jour. Le produit doit rester sur la lésion pendant au moins 8 heures avant son élimination par rinçage. Au cours de la période restante de 12 heures, lorsque le produit n'est pas présent sur la lésion, un pansement humidifié avec du sérum physiologique ou un
pansement sec doit être appliqué à la région.
Bien qu'il soit préféré de préparer un produit à base de substance libérée par les plaquettes à des fins de traitement de lésions directement à partir du propre sang d'un patient, les avantages de la présente invention peuvent être acquis en utilisant du sang ou des plaquettes périmées provenant d'autres sources. L'utilisation du propre sang d'un patient est mentionnée puisqu'elle évite l'exposition du patient à une hépatite, un sida ou d'autres impuretés éventuelles provenant d'un échantillon de sang d'une banque. L'utilisation du propre sang d'un patient supprime également la plupart des réactions allergiques à un sang étranger. Cependant, une autre source du produit peut être obtenue à partir de sang d'origine définie (c'est-à-dire de personnes chez lesquelles une hépatite, un sida, etc., ont été dépistés) ou à partir de plaquettes humaines périmées, et à partir d'une seule source ou bien d'un échantillon provenant de la réunion de plusieurs sources. Le sang d'autres espèces peut également être utilisé pour une application chez l'homme. Enfin, le produit à base de plaquettes peut également être utilisé dans des applications vétérinaires, au moyen de plaquettes issues de l'animal proprement dit, d'un autre animal de la
même espèce ou d'une autre espèce.
EXEMPLE 1
ml de sang entier ont été obtenus aseptique-
ment à partir d'une source d'approvisionnement dans 6 ml d'un anticoagulant acide-citrate-dextrose (désigné ci- après sous le nom de ACD), soit 1 ml de ACD pour 10 ml de sang entier. Le sang a été mélangé convenablement au ACD en
renversant et en faisant rouler la seringue. Les échantil-
lons de sang additionnés d'un anti-coagulant ont été maintenus sur de la glace jusqu'à utilisation dans un
traitement ultérieur.
Le sang additionné d'un anti-coagulant a été transféré dans deux tubes à centrifugation de 50 ml à fond conique stériles, silicones, en introduisant la moitié de l'échantillon dans chaque tube. Puis les tubes ont été centrifugés à 135g pendant 20 minutes à une température d'environ 4 C. Une fois le cycle de centrifugation terminé, on a laissé le rotor s'arrêter de lui-même. Aucun freinage n'a été effectué. La couche supérieure de l'échantillon centrifugé, le plasma riche en plaquettes (désigné ci-après sous le nom de PRP), a été transféré soigneusement au moyen d'une pipette stérile dans un autre tube à centrifuger siliconé stérile. Le prélèvement d'une quantité seulement égale à 4-5 ml à la fois a réduit au minimum les pertes dues à une contamination du PRP par les hématies. Un comptage de plaquettes du PRP a été ensuite effectué en
utilisant des procédés bien connus dans la pratique.
Le PRP a été centrifugé à 750g pendant 10 minutes à une température d'environ 4 C. Le surnageant a été rejeté, en prenant soin de ne pas déloger le culot plaquettaire. Au moyen d'une pipette stérile, le culot a été remis en suspension par aspiration et expulsion de
tampon contenant du HEPES 0,05 M (acide N-2-hydroxyéthyl-
pipérazine-n-2-éthanesulfonique), du dextrose 0,03 M, du
KCl 0,004 M, du NaCl 0,1 M, le pH étant ajusté à approxima-
tivement 6,5 à 28 C (désigné sous le nom de tampon pour plaquettes) à une concentration approximative de 109
plaquettes par ml de suspension.
La suspension de plaquettes résultante a été ensuite activée avec de la thrombine purifiée. De préféren- ce, environ 1 unité de thrombine par ml de suspension de plaquettes a été ajoutée à la suspension de plaquettes et mélangée. On a laissé les plaquettes et la thrombine en incubation à température ambiante pendant environ 10 minutes. Après incubation, l'agrégat plaquettaire résultant a été rompu par aspiration et expulsion de la suspension au
moyen d'un pipette stérile.
En variante, la suspension de plaquettes peut être activée avec d'autres activateurs qui provoquent la libération du contenu de plaquettes. D'autres activateurs comprennent le collagène, de préférence en une quantité de 6 à 100 gg de monomère de collagène par ml de tampon contenant 10% de plaquettes, 1'ADP, de préférence en une concentration de 2 à 10 gmolaire dans ledit tampon, l'épinéphrine, de préférence en une concentration de 25 à 450 gmolaire dans ledit tampon, et l'acide arachidonique, de préférence en une concentration de 35 à 50 gmolaire
dans ledit tampon.
Comme autre forme de réalisation possible, le PRP peut être activé avec la thrombine ou d'une autre manière avant centrifugation. Le PRP activé peut également être incorporé à des préparations liquides ou pâteuses, de
la manière décrite ci-dessus.
Dans la forme de réalisation préférée, le surnageant résultant a été centrifugé à 950g pendant environ 5 minutes à une température d'environ 4 C, ce qui a permis d'éliminer les enveloppes plaquettaires libérées et toute quantité de fibrine présente dans la suspension. Le culot formé par cette centrifugation a été rejeté après
extraction du surnageant.
Après élimination des enveloppes des plaquettes et de la fibrine, le surnageant restant constitue la substance libérée par les plaquettes dans du tampon pour plaquettes, ce qui est désigné dans la présente invention sous le nom d'extrait de substance libérée par les plaquettes. L'extrait est congelé par portions aliquotes de 4 ml pour son entreposage ou bien est utilisé immédiatement pour une analyse ou pour préparer un produit liquide ou
pâteux, de la manière décrite ci-dessous.
EXEMPLE 2
L'extrait de substance liquide dans les plaquettes peut être préparé à partir de plaquettes
obtenues auprès d'une banque de sang ou d'une autre source.
Un concentré de plaquettes obtenu par phérèse peut être
acquis auprès d'une banque de sang et être traité im-
médiatement. Une unité de plaquettes donne approximative-
ment 200 ml de PRP.
Le concentré peut être traité pour produire la suspension de plaquettes activées de la manière indiquée ci-dessus pour le traitement de l'échantillon de sang du patient, additionné d'un anti-coagulant, sauf que le PRP est centrifugé 4 fois à 750g pendant 10 minutes à une température d'environ 4 C, en remettant en suspension le culot plaquettaire dans du tampon pour plaquettes après
chaque centrifugation. Au bout de la quatrième centrifuga-
tion, le culot plaquettaire est remis en suspension dans du tampon pour plaquettes, à une concentration approximative
de 109 plaquettes/ml.
La suspension de plaquettes est activée de la manière décrite ci-dessus et centrifugée à 950g pendant 10 minutes à une température d'environ 4 C. Le surnageant est extrait et centrifugé à 10 000g pendant 15 minutes à une température d'environ 4 C pour éliminer les plaquettes résiduelles et toute quantité de fibrine. Le culot est rejeté après extraction du surnageant. Le surnageant qui est constitué par l'extrait de substance libérée par les plaquettes est congelé par portions aliquotes de 4 ml pour son entreposage ou bien est utilisé immédiatement pour sa mise sous forme de préparations liquides ou pâteuses, de la manière décrite ci- dessous. Comme autre variante de production à partir de plaquettes provenant d'une banque de sang, il est possible d'activer directement le PRP produit à partir de plaquettes
provenant d'une banque, avant centrifugation.
EXEMPLE 3
Le produit à base de substance libérée par les plaquettes est de préférence administré au patient sous forme liquide. L'extrait de substance libérée par les plaquettes, c'est-à-dire la substance libérée par les plaquettes, congelée dans du tampon pour plaquettes, peut être décongelée à température ambiante. Un volume mesuré d'extrait à température ambiante peut être introduit dans un tube à centrifugation de manière à obtenir, après introduction de tampon pour plaquettes dans le tube à centrifugation, une dilution appréciée. 0,5 ml de lidocaïne
peut être ajouté avant addition du tampon pour plaquettes.
Dans ce cas, le tampon joue le rôle de véhicule. De même, l'extrait peut dans certains cas être utilisé sans autre dilution.
EXEMPLE 4
Comme autre forme de réalisation, le produit à base de substance libérée par les plaquettes peut être appliqué sous forme de pâte, comprenant l'extrait dans une substance servant de véhicule qui est biologiquement compatible avec, et joue le rôle de "dépôt" temporaire pour, les constituants actifs du surnageant. Une substance macromoléculaire telle que du collagène microcristallin, par exemple le collagène microcristallin de marque Avitene R disponible dans le commerce auprès de Alcon Laboratories, Inc., Forth Worth, TX, constitue un véhicule convenable. Pour préparer le produit à base de substance libérée par les plaquettes sous forme de pâte, l'extrait a été décongelé et dilué de la manière indiquée ci-dessus pour la forme liquide. Des quantités appropriées d'extrait peuvent être introduites à la pipette dans une fiole renfermant du collagène microcristallin Avitene et mélangées au moyen d'une pipette stérile pour parvenir à une consistance uniforme. En variante, l'extrait peut être
mélangé au collagène microcristallin.
Les fioles contenant le produit résultant à base de substance libérée par les plaquettes, sous forme de pâte, doivent être bouchées et mises dans des sachets en matière plastique avec de la glace ou bien être congelées pour le transport et l'entreposage jusqu'à l'application au patient.
EXEMPLE 5
Dans une étude de traitement de lésions conduite en Floride, Etats-Unis d'Amérique, portant sur 102 lésions cutanées ne présentant pas de cicatrisation, un produit à base de substance libérée par des plaquettes autologues a été utilisé pour traiter les lésions suivant les procédés de traitements précités. Le produit à base de substance libérée par les plaquettes a été préparé de la manière suivante: l'extrait de substance libérée par les plaquettes, produit suivant les modes opératoires de l'exemple 1, a été dilué en outre à 1:100 pour former un
produit à base de substance libérée par les plaquettes.
Avant application topique de chacun des produits à base de substance libérée par les plaquettes, un immuno-essai de la bêta-thromboglobuline, disponible dans le commerce auprès de Diagnostica Stago, Asnières-surSeine, France, sous le nom de ASSERACHROM B-TG, a été conduit sur le produit correspondant à l'extrait de substance libérée par les plaquettes pour déterminer la quantité de B-TG présente dans l'extrait proprement dit. Les lésions ont été classées pour une évaluation fonctionnelle une fois le traitement terminé. La quantité de B-TG présente dans l'échantillon de substance libérée par les plaquettes, qui était dans ce cas l'extrait, présentait une corrélation avec le succès du traitement par le produit à base de substance libérée par les plaquettes, de la manière mesurée par l'évaluation fonctionnelle: Variables: B-TG en fonction de Nombre d'échantillon: 102 Valeur de R de Spearman: 0,2427 Valeur de T: 2,5023
P, 2 queues de distribu-
tion 0,014 La figure 1 présente un graphique représentatif
des résultats.
EXEMPLE 6
L'exemple précédent a été répété dans une étude
de traitement de lésions effectuée à Kansas City, Etats-
Unis d'Amérique, conduite sur 86 lésions traitées avec du produit à base de substance libérée par des plaquettes autologues. La quantité de B-TG présente dans l'échantillon de substance libérée par les plaquettes présentait une corrélation avec l'évaluation fonctionnelle: Variables: BTG en fonction de EF Nombre d'échantillon: 86 Valeur de R de Spearman: 0, 3508 Valeur de T: 3,4328
P, 2 queues de distribu-
tion 0,0009 La figure 2 présente un graphique représentatif
des résultats obtenus.
EXEMPLE 7
L'exemple 5 a été répété de nouveau dans une étude de traitement de lésions effectuée à Minnesota, Etats-Unis d'Amérique, conduite sur 32 lésions traitées avec le produit à base de substance libérée par des plaquettes autologues. La quantité de B-TG présente dans l'échantillon de substance libérée par les plaquettes présentait une corrélation avec l'évaluation fonction- nelle: Variables: B-TG en fonction de EF Nombre d'échantillon: 32 Valeur de R de Spearman: 0,3629 Valeur de T: 2,1329
P, 2 queues de distribu-
tion 0,0412 La figure 3 présente un graphique représentatif
des résultats obtenus.
Sur la base des exemples précédents de traitement de lésions, le succès du traitement des lésions présentait une corrélation avec la quantité de B-TG
présente dans l'extrait utilisé pour préparer le produit.
En conséquence, le produit à base de substance libérée par les plaquettes doit de préférence être préparé de manière à
contenir une quantité de B-TG dans un intervalle prédéter-
miné. Puisque le produit est constitué de dilutions d'extrait de substance libérée par les plaquettes, la quantité de substance libérée par les plaquettes sous forme d'extrait ou utilisée d'une autre manière pour constituer le produit doit être ajustée pour tenir compte de la quantité de B-TG présente dans l'extrait de substance libérée. Ce procédé de production permet au produit de renfermer une quantité désirée de B-TG, bien que la quantité de B-TG dans la substance libérée varie d'un donneur à l'autre et d'un moment à un autre pour un donneur particulier. Comme le montrent les figures 1 à 3, si un stade moyen de EF égal ou supérieur à 2 est désiré, la quantité de B-TG doit être au moins égale à environ 25 ng par ml de produit. Bien entendu, des quantités de B-TG supérieures à 66 ng par ml de produit provoquent une cicatrisation optimale dans la plage de quantités de B-TG
ayant fait l'objet des études.
En variante, d'autres constituants de la substance libérée par les plaquettes peuvent être utilisés pour préparer un produit à base de substance libérée par les plaquettes contenant une quantité minimale ou optimale de substance libérée par les plaquettes. Ces constituants comprennent, à titre non limitatif, le PDGF, le PDAF, le PF-4, le PGF basique, le PGF acide, le TFG-2, le TGF-B, le PDEGF et la fibronectine. Les exemples 8 et 9 montrent la
corrélation entre le B-TG, le PF-4 et le PDGF.
EXEMPLE 8
41 échantillons de substance libérée par des plaquettes autologues ont été analysés pour déterminer la quantité de B-TG par l'immuno-essai de B- TG précité et pour déterminer la quantité de PF-4 par un immuno-essai de PF-4 disponible dans le commerce auprès de Diagnostica Stago sous le nom d'ASSERACHROM PF-4. La quantité de B-TG dans l'échantillon de substance libérée par les plaquettes présentait une corrélation avec la quantité de PF-4, de la manière suivante: Variables: B-TG en fonction de PF-4 Nombre d'échantillons: 41 Valeur de R de Spearman: 0,9148 Valeur de T: 14,1449
P, 2 queues de distribu-
tion < 0,0001 La figure 4 présente un graphique représentatif
des résultats.
EXEMPLE 9
41 échantillons de substance libérée par des plaquettes autologues ont été également analysés pour déterminer la quantité de B-TG suivant l'analyse de B-TG
précitée et pour déterminer la quantité de PDGF conformé-
ment au protocole analytique suivant: PROTOCOLE D'IMMUNO-ESSAI ENZYMATIQUE (EIA) du PDGF
JOUR 1:
1. Plaques de réaction de blocage (R) (Dynatech Imm-l, à fond rond) a) Introduire 150 gl de PT-20 (sérum physiologique tamponné avec un phosphate (STP), TWEEN-20
0,05%) dans chaque puits.
b) Mettre à incuber les plaques R pendant plus de minutes à 37 C, après avoir placé un couvercle.
* c) Aspirer le contenu des plaques R et sécher.
Passer à l'étape 3.
2. Plaques de quantification de revêtement (O) (Dynatech Imm-2, à fond plat) a) Introduire 150 gl/puits de PDGFcsis (40ng/ml
dans du tampon de revêtement).
b) Mettre à incuber pendant une nuit à 4 C les plaques Q munies d'un couvercle dans un sachet Ziplock. 3. Après blocage a) Effectuer des dilutions de l'échantillon dans du PBA-T/20 (STP+1% de SAB+0,05% de T-20) en utilisant des tubes en polypropylène. Mélanger convenablement. 4. Mise en contact des échantillons avec les plaques R a) Introduire 60 pl par puits d'anti-PDGF de
chèvre (dilution dans du PBA-T/20) à 2 gmg/ml.
b) Introduire 60 4l/puits d'échantillon dilué ou
d'échantillon de référence.
c) Mettre en incubation pendant une nuit à 4 C les plaques R munies d'un couvercle, dans un sachet.
JOUR 2:
1. Aspiration du contenu des plaques O a) Aspirer le contenu des plaques Q. b) Bloquer le contenu des plaques Q avec
4l/puits de PT-20 (1 à 2 heures, à 37 C).
c) Aspirer, lavers trois fois, sécher à l'air.
2. Transfert du contenu des plaques R a) Transférer le contenu des plaques R sur des
plaques Q (100 pl).
b) Mettre à incuber les plaques Q à température
ambiante pendant 30 minutes.
c) Aspirer et laver.
3. Réaction colorée a) Introduire 100 4l/puits d'anti-peroxydase de
chèvre obtenue chez le rat (1 gg/ml).
b) Mettre en incubation pendant 1 heure à
température ambiante.
c) Aspirer et laver.
d) Introduire 100 pl de substrat dans chaque puits (tétraméthylbenzidine).
e) Lecture des plaques.
La quantité de B-TG présente dans l'échantillon de substance libérée par les plaquettes présentait une corrélation avec la quantité de PGDF, de la manière suivante: Variables: B-TG en fonciton de PDGF Nombre d'échantillons: 41 Valeur de R de Spearman: 0,8103 Valeur de T: 8,6359 P, 2 queues de distribu- tion < 0,001 La figure 5 présente un graphique représentatif
des résultats.
Comme autre variante, les activités de la substance libérée par les plaquettes peuvent être utilisées comme bases pour la préparation d'un produit à base de substance libérée par les plaquettes contenant une quantité
minimale ou optimale de substance libérée par les plaquet-
tes. Ces activités comprennent, à titre non limitatif, l'activité mitogène des fibroblastes ("AMF"), l'activité chimiotactique des cellules endothéliales ("ACCE"), l'activité dans l'essai sur la cornée de lapin ("AECL") et
l'activité chimiotactique des kératinocytes ("ACK").
L'exemple 9 présente la corrélation entre la B-TG et la AMF, tandis que les exemples 10 à 12 décrivent des analyses
définissant les activités additionnelles.
EXEMPLE 9
41 échantillons de substance libérée par des plaquettes autologues ont été analysés pour déterminer la quantité de B-TG par l'immuno-essai de B- TG ci-dessus et pour déterminer la AMF par le protocole d'analyse de AMF suivant.
MODE OPERATOIRE
1. Déterminer le nombre de plaques de microtitration nécessaires pour les échantillons de AMF à tester (une plaque reçoit 24 échantillons en quatre exemplaires ou 32 échantillons en triple exemplaire, "y compris" les témoins
nécessaires.
2. Préparer approximativement 20 ml par plaque de Milieu de Eagle Modifié selon Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum de
veau inactivé par la chaleur (10% HI-CS).
Préparer un volume supplémentaire de ml de DMEM/10% HI-CS (utilisé pour la préparation des cellules). 3. Décongeler le nombre approprié de tubes de fibroblastes 3T3 (A31), qui sont entreposés à l'état congelé dans de l'azote liquide, dans un bain d'eau à 37 C (la quantité par tube varie suivant l'échantillon congelé). Approximativement 2 000 000 de cellules viables sont
requises par plaque de microtitration.
4. Transférer aseptiquement les cellules dans des tubes de culture stériles de ml (des volumes de 12 ml et 15 ml peuvent également être utilisés à cette fin), contenant 20 ml (5-10 ml) de DMEM/10% HI-CS. "Remettre en suspension le contenu du puits" et centrifuger à g (1400 tr/min dans un appareil Mistral 3000i muni de rotors à godets oscillants protégés) pendant 10 minutes à température ambiante. Décanter le surnageant, remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de DMEM/10% HI-CS, le transférer dans un tube de culture stérile de 12 ml. Répéter la centrifugation.
5. Remettre en suspension le culot cel-
lulaire dans approximativement 2-5 ml de DMEM/10% HI-CS. Effectuer un comptage des cellules.
6. Diluer les cellules dans du DMEM/10% HI-
CS pour obtenir une concentration de 000 cellules par ml. (Pour chaque
plaque, 10-11 ml sont nécessaires).
7. Introduire 100 gl par puits d'une boîte de microtitration à 96 puits au moyen d'un appareil de pipetage à 8 ou 12 canaux et d'un réservoir à nacelle stérile. Etre sûr d'aspirer la suspension dans l'appareil de pipetage et d'expulser la suspension de cet appareil au moins une fois par rangée pour maintenir une
suspension cellulaire adéquate.
8. Introduire 100 Ml de DMEM/10% HI-CS dans chaque puits (pour un volume total de
gl de liquide par puits).
9. Marquer les plaques avec la lignée cellulaire et dater la préparation des plaques. Mettre les plaques à incuber à 37 C, avec 5% de C02, pendant 3 jours ou jusqu'à obtention de fibroblastes confluents.
CHANGEMENT DE MILIEU AU TROISIEME JOUR
Trois jours après le début de la mise en service des plaques de microtitration, le milieu doit être
remplacé par du DMEM/0,8% HI-CS pour poursuivre l'opéra-
tion. 1. Examiner les plaques au microscope pour
déterminer si la croissance des fibro-
blastes a permis d'atteindre une confluence. (Il ne doit y avoir aucun intervalle entre les cellules). Si les cellules sont confluentes, poursuivre l'opération. Si les cellules ne sont pas confluentes, ces cellules peuvent être cultivées pendant un jour de plus ou bien
être rejetées.
2. Préparer 16 ml/plaque de DMEM/0,8% HI-CS.
3. Ouvrir et placer une feuille stérile de protection sous la hotte. En une seule fois, prendre les plaques pour faire couler et chasser soigneusement la
totalité du liquide hors de la plaque.
Replacer le couvercle immédiatement.
4. Revenir rapidement à la hotte stérile et tamponner doucement la plaque ouverte sur la feuille stérile de protection pour
éliminer le liquide en excès.
5. Introduire immédiatement et doucement pl de DMEM/0,8% HI-CS dans chaque puits en utilisant un appareil de pipetage à 8 ou 12 canaux. Il faut prendre soin d'éviter de perturber les cellules confluentes dans la mesure du possible. Répéter les étapes 3 à 5 avec
la ou les plaques suivantes.
6. Mettre les plaques à incuber à 37 C, avec % de C02, pendant 6 heures. 7. Conserver la solution à 0,8% de HI-CS en
excès pour effectuer des dilutions.
STIMULATION DES CELLULES 6 HEURES APRES LE CHANGEMENT
DE MILIEU
Six heures après le changement de milieu, la solution de HI-CS à 10% ayant été remplacée par une solution de HI-CS à 0,8%, les cellules sont prêtes pour une
stimulation.
1. Remplir le modèle pour chaque plaque de microtitration indiquant l'emplacement de chaque témoin et de chaque échantillon à tester. 2. En commençant dans le coin supérieur gauche, les trois ou quatre premiers puits reçoivent 50 pi de DMEM/0,8% HI-CS seulement. (Cela sert de témoin de base
des plaques).
3. Les 3 ou 4 puits suivants (en procédant horizontalement) reçoivent 20, 1 de HI-CS non dilué et 30 M1 de solution de HI-CS à 0,8% par puits. (La dilution finale est
donc: HI-CS à 10%).
4. Les 3 ou 4 puits suivants reçoivent 50 pi
de témoin à base de tampon pour plaquet-
tes (10 ml de tampon pour plaquettes +
ml de thrombine).
5. Ajouter 50 g1 des échantillons d'es-
sai/témoin.
6. Mettre les plaques à incuber à 37 C, avec % de C02, pendant 18 heures. (L'unifor-
mité de chronométrage est importante).
MAROUAGE RADIO-ACTIF
Dix-heures après stimulation avec les échantil-
lons d'essai et les échantillons témoins, les plaques de microtitration de AMF sont marquées avec de la thymidine
radioactive pour démontrer l'activité mitogène.
1. Recouvrir la surface de travail avec du papier de revêtement jetable pour
contenir toutes les projections acciden-
telles lors du travail avec les radio-
nucléides. Des gants protecteurs doivent
être portés.
2. Préparer une solution de [3H]-thymidine à gCi/ml de DMEM, de la manière suivante: Transférer dans des conditions stériles 0,5 cm3 de [3H]thymidine (catalogue NEN N NET-027, 6,7 CImmole, lmC '/ml) dans 49,5 ml de DMEM (une
dilution au 1/100).
3. Introduire 50 i1 de solution de [3H]-
thymidine/DMEM dans chaque puits.
Entreposer la solution radioactive restante au réfrigérateur jusqu'à
l'utilisation suivante.
4. Rejeter de la manière adéquate les embouts de pipettes, les gants, le récipient distributeur renfermant la portion aliquote de milieu marqué et le papier de revêtement dans le réservoirdestiné aux déchets radioactifs.
5. Marquer les plaques présentant une radioactivité et les mettre à incuber dans un bac pour contenir toutes les projections à 37 C, avec 5% de CO2,
pendant 6 heures.
PRELEVEMENT
1. Eliminer par une aspiration soigneuse le milieu radioactif de culture en utilisant un lavage "immuno wash NUNC". S'assurer de l'utilisation des "broches de levage" fournies pour éviter le contact des
embouts d'aspiration avec les cellules.
2. Laver les cellules par addition de 200 Ml de STP au moyen d'un appareil de pipetage multicanaux. Aspirer en effectuant un
lavage "immuno wash NUNC".
3. Introduire 200 gl de 0,25% trypsis/solu-
tion de sels équilibrée de Hanks (HBSS)
(dépourvu de Ca, Mg) dans chaque puits.
Mettre à incuber à 37 C, avec 5% de C02,
pendant 30 minutes.
4. Recueillir la plaque sur du papier-filtre en verre en utilisant l'appareil de récolte de cellules Skatron Combi Cell Harvestor. 5. Transférer immédiatement les disques de papier-filtre humide dans des flacons d'analyse par scintillation (Packard Pico Pro Vials) en utilisant l'appareil de
transfert de filtre Skatron.
6. Laisser sécher les disques de papier-
filtre pendant une nuit, ou bien dans une
étuve de séchage pendant 1 à 2 heures.
PREPARATION DU MILIEU DE SCINTILLATION
1. Introduire 4 ml de cocktail de scintilla-
tion (Beckman Ready-Safe) dans chaque puits. 2. Les flacons son bouchés hermétiquement et agités énergiquement par un mouvement de va-et-vient pendant quelque temps pour mettre totalement en contact le filtre avec le cocktail et chasser les bulles
d'air pouvant être présentes.
COMPTAGE
1. Placer les flacons dans les supports verts Beckman LS1701, dans l'ordre de
gauche à droite.
2. Placer en premier dans le compteur le "support de programme", consistant en un support vert vide avec un flacon en 18ème position, en commandant à l'appareil
d'utiliser le programme N 1.
3. Le programme N 1 est programmé de la manière suivante: - Répétitions: 3 - Temps de comptage: 2 minutes
- H: N
- Répétitions d'échantillonnage: 1 - Calcul des résultats: CPM - SCR: Oui - RCM: Oui - Volume des flacons: minimal - Essai de comptage à blanc: Aucun 4. Placer les supports restants dans le compteur en opérant "d'arrière en avant" tout d'abord du côté droit, puis "d'avant en arrière" du côté gauche. Finir
toujours avec le support d'arrêt RED.
5. Pousser en même temps les deux boutons de
"RESET".
6. Une fois terminée l'opération RESET et contrôlée la présence d'une quantité suffisante de papier dans l'imprimante, presser le bouton START et replacer le couvercle. 7. Contrôler le tirage initial pour confirmer la précision du programme utilisé. Les unités de 1/ED-50 représentent la dilution de l'échantillon de substance libérée par les plaquettes qui a pour résultat une stimulation de 50% de l'activité mitogène dans les fibroblastes 3T3. Par exemple, si une dilution de 0,25 ou 1:4 de l'échantillon a engendré une stimulation de 50%, la valeur de 1/ED-50 serait égale à 4 unités. De manière similaire, une dilution à 1:8 donnerait
une valeur de 1/ED-50 de 8 unités.
La quantité de B-TG dans l'échantillon de substance libérée par les plaquettes présentait une corrélation avec l'activité AMF, de la manière suivante: Variables: B-TG en fonction de AMF Nombre d'échantillons: 41 Valeur de R de Spearman: 0,7674 Valeur de T: 6,1927
P, 2 queues de distribu-
tion: < 0,0001
La figure 6 présente un graphique représenta-
tif des résultats:
EXEMPLE 11
L'activité ACCE peut être définie par le
protocole suivant.
PREPARATION DES CELLULES
1. Cultiver des cellules endothéliales de capillaires de lésions de lapin (RECU)
jusqu'à une "confluence" de 60-85% sur 3-
4 flacons Primaria (Falcon N 3824) de cm2. 2. Approximativement 20 à 24 heures avant chimiotactisme, éliminer le milieu et rincer les flacons à deux reprises (2X) avec du HBSS * (dépourvu de Ca/Mg,
6 ml/flacon).
3. Eliminer l'échantillon final de HBSS de lavage et introduire 12 à 15 ml (suivant les cas) de lactalbumine à 0,2% dans du Milieu 199* dans chaque flacon. (Cela fournit des substances nutritives minimales et réduit la stimulation induite par le sérum, de sorte que les cellules peuvent répondre aisément aux substances attractives). Noter le temps
de changement de milieu sur le flacon.
4. Le jour suivant, préparer ce qui suit: a) 50 à 100 ml de lactalbumine à 0,2% dans du M199 (LA-M199) b) 20 à 30 ml (5 ml/flacon de 75 cm2)
de cocktail enzymatique N 2 (EC2-
iX) par dilution de 1 ml de EC2(10X)
dans 9 ml de HBSS.
5. Eliminer la LA-M199 à 0,2% et rincer le flacon avec 6 à 10 ml de HBSS*. Ajouter immédiatement 5 ml de EC2(lX)* et mettre en incubation pendant exactement 14
minutes à température ambiante.
6. Rassembler les échantillons de EC2 des flacons dans un ou plusieurs tubes en polypropylène de 50 ml contenant au moins 2 ml/flacon de LA-M199 à 0,2%, pour
faciliter la désactivation des enzymes.
Introduire immédiatement 5 ml de LA-M199
à 0,2% dans chaque flacon.
7. Prélever doucement par raclage les cellules au fond au moyen d'un racloir
stérile pour cellules (American Scien-
tific Products, N du catalogue T4206-1).
8. Introduire les cellules et le milieu dans l'échantillon total de EC2. Pour un
rinçage final, introduire 10 ml de LA-
M199 à 0,2% dans un flacon. Transférer le liquide de rinçage d'un flacon à l'autre,
puis réunir ce liquide aux cellules.
9. Si le volume final excède 40 ml, diviser les cellules en deux tubes pour la centrifugation. Centrifuger les cellules à 1400 tr/min (approximativement 450g sur une centrifugeuse Mistral 3000) pendant 10 minutes à température ambiante. 10. Rejeter le surnageant en le versant rapidement. Remettre en suspension le ou les culots dans un volume total de 8 ml de LA-M199 à 0,2% (rassembler les échantillons en cas de division) et les transférer dans un tube à centrifugation de 15 ml. Laver les tubes avec un volume supplémentaire de 2 ml de milieu et ajouter ce volume aux cellules remises en suspension. Centrifuger à 1400 tr/min pendant 10 minutes à température
ambiante.
11. Remettre en suspension les cellules dans 2 à 5 ml de LA-M199 à 0,2% (ajuster le volume aux dimensions du culot et au rendement cellulaire estimé: pour éviter
une recentrifugation) pour le comptage.
12. Comptage des cellules: a) Ajouter 30 g1 de suspension
cellulaire à 30 g1 de bleu Trypan.
b) Charger les deux faces d'un
hémocytomètre.
c) Sous un grossissement 1OX, compter
les cellules dans 8 carrés de 1 mm.
Noter le nombre de cellules viables (bleues). Ne pas compter les cellules de dimensions ou de formes anormales. d) Multiplier le nombre de cellules viables par 2,5 x 103 pour obtenir
le nombre de cellules par ml.
13. Ajuster la concentration cellulaire à
0,75 x 106 cellules/ml de LA-M199 (c'est-
à-dire 33 750 cellules par/puits dans ,l). Un volume d'approximativement
2,25 ml/chambre est requis.
a) Exemple: Il existe 3 ml de 1,5 x 10 cellules par ml. Le volume ajusté final doit être (3 ml (1,5x106 cellules/ml) = 5,95 ml (0,75x106 cellules/ml) En conséquence, ajouter 2,95 ml de LA-M199 à 0,2% aux cellules pour obtenir une concentration finale de 0,75x106. En résumé, préparer puits renfermant des cellules par chambre à une concentration de 33 750 cellules/45 Ml de LA-M199 à 0,2%/puits. *Volumes proposés Surface du Milieu d'alimenta- HBSS de EC2(lX) flacon (cm2) tion à 0,2% de LA-M199 lavage (ml) (ml) (ml)
5 5 3
15 6-10 5
30 10-15 10
PREPARATION DES FILTRES
1. Préparer 20 ml de solution renfermant 1 Mg de fibronectine ( S igma N F4759)/1 ml de HBSS (FN/HBSS) à partir
d'une solution de réserve congelée.
Utiliser seulement des embouts et des
tubes en polypropylène pour sa prépara-
tion. (Exemple: solution de réserve congelée = 1 ng/ml de dH2O-HBSS. En conséquence, diluer 200 pi de solution de
réserve dans 19,8 ml de HBSS).
*Entreposer sur de la glace jusqu'à utilisation. 2. Utiliser des filtres en polypropylène Nuclepore (pores de 8,0 gm, PVPF, de Neuro Probe Inc., 3012-229-8598), à
raison d'un filtre par chambre.
3. Couper le coin supérieur gauche du côté brillant du filtre pour permettre l'orientation du filtre. Utiliser des pinces Brucelles pour manipuler le filtre (jamais avec les doigts) et seulement aux extrémités. 4. Placer 3 à 4 ml de FN/HBSS au centre d'une boîte de Petri stérile. Disposer le filtre à la surface du FN/HBSS, le côté brillant vers le bas, en laissant l'étalement s'effectuer au-dessous du filtre; ne pas laisser une quelconque quantité de FN/HBSS à la face supérieure
du filtre.
5. Couvrir la boîte de Petri et laisser au repos à température ambiante pendant
30 minutes.
6. Eliminer soigneusement par écoulement le FN/HBSS (en inclinant lentement la plus grande partie d'un côté, en laissant le filtre coller à la plaque, puis en éliminant totalement par écoulement), soulever le filtre, placer 3 à 4 ml de FN/HBSS frais au centre et répéter le mode opératoire de l'autre côté du filtre
(la face terne vers le bas).
7. Le revêtement est alors terminé et les
filtres peuvent être utilisés.
*Note: a) Pour des raisons d'uniformité,
utiliser le filtre immédiate-
ment, en chronométrant le remplissage de la chambre inférieure de manière à ce
qu'il coïncide avec l'achève-
ment du revêtement de la
seconde face du filtre.
b) Lors de la préparation de deux filtres, il est recommandé de décaler leurs temps de revêtement de 15 minutes pour permettre le remplissage d'une chambre avant le remplissage de la seconde, pour éviter de
devoir remplir avec précipita-
tion les deux chambres en même
temps.
PREPARATION DES CHAMBRES
1. Enlever les chambres de chimiotactisme à 48 puits du bain d'eau distillée (dH20) d'entreposage. Rincer soigneusement avec dH2O propre. Sécher la partie supérieure et le joint avec un morceau de tissu et
sécher la partie inférieure par insuf-
flation d'azote gazeux pur.
2. Préparer des échantillons d'essai pour le remplissage de la partie inférieure de la
chambre. Chaque puits renferme approxima-
tivement 26,0 à 26,5 gl de solution.
3. Introduire approximativement 26,1 à 26,5 gl d'échantillons dans les puits
présents dans la chambre inférieure.
*Note: a) Pour produire un "ménisque positif" désiré, un léger "étêtement" avec un fluide peut être nécessaire. Cela aide à contrecarrer le séchage qui se produit lors du remplissage du reste de la chambre. Eviter de produire
des bulles.
b) Utiliser une pipette à déplacement positif pour une meilleure uniformité. Puisque la première et la dernière colonne (A,L) de quatre puits à chaque extrémité de la chambre ne sont pas utilisées pour le chimiotactisme, les
remplir de HBSS. En consé-
quence, ces mêmes rangées dans la chambre supérieure sont également remplies de HBSS et
non de cellules.
4. Lorsque les filtres sont prêts, éliminer le FN/HBSS par écoulement (de la manière
décrite précédemment. Soulever soigneuse-
ment le filtre hors de la boîte de Petri; ne pas laisser l'une ou l'autre face racler le bord de la boîte. En soulevant lentement le filtre, la quantité résiduelle de FN/HBSS sur le filtre est réduite au minimum. Ne pas laisser tomber ou effleurer le filtre à
ce moment.
5. Tout en maintenant les deux extrémités du filtre avec des pinces, abaisser le centre du filtre sur le centre de la chambre, puis recouvrir uniformément les puits inférieurs. Le filtre doit avoir la
face brillante tournée vers le haut.
*Note: Orienter toujours de la même façon
la chambre et le filtre; c'est-à-
dire maintenir toujours la marque commerciale et le coin coupé sur le filtre dans le coin supérieur gauche. 6. Seulement si nécessaire, ajuster léqèrement le filtre pour un alignement convenable. 7. Placer le joint juste au-dessus du
filtre, mais non en contact.
8. Placer la moitié supérieure de la chambre sur la face supérieure du joint et appuyer pour les mettre en contact. Les maintenir énergiquement tout en fixant
les vis de blocage.
9. Une fois la fixation effectuée, saisir la chambre et regarder à travers les puits pour déterminer la présence de toutes
bulles qui peuvent s'être formées au-
dessous du filtre; noter leur présence, ces bulles pouvant interférer avec le chimiotactisme. 10. Introduire 45 gl de HBSS dans les quatre
puits aux deux extrémités (A,L).
* 11. Introduire ensuite 45 g1 de suspen-
sion de cellules (c'est-à-dire 0,75 x 106
cellules par ml) dans les puits restants.
*Note: Ajouter les cellules avec un embout de pipette à un angle pour éviter le
piégeage d'air à la partie in-
férieure. Si une bulle se forme, prélever soigneusement du liquide et
remplir à nouveau. Après remplis-
sage, tous les puits doivent présenter un aspect uniforme. Sinon, il est probable que de l'air a été
piégé et il faut recommencer.
12. Placer la chambre dans un bac en verre ou en polypropylène, ajouter un carré de gaze imbibé d'eau (pour accroître l'humidité et éviter l'évaporation), et recouvrir sans tasser avec une feuille d'aluminium. 13. Mettre à incuber pendant 4 heures à 37 C,
avec 5 % de CO2.
ENLEVEMENT ET ESSUYAGE DU FILTRE
1. Graver la date et le numéro de la chambre à une extrémité d'une lame de verre. Nettoyer soigneusement avec de
l'alcool et sécher.
2. Enlever les écrous de blocage tout en
maintenant baissée la plaque supérieure.
3. Orienter la chambre avec la marque commerciale dans le coin supérieur
gauche, sur un chiffon à papier.
4. Retourner la totalité de la chambre (le long de l'axe horizontal) sur le chiffon
en papier.
5. Appuyer sur les quatre angles de la plaque supérieure de sorte que cette plaque reste parallèle à la plaque inférieure lors de son mouvement descendant. Le filtre doit être collé au joint.
6. Enlever la plaque inférieure et l'im-
merger immédiatement dans une solution de Tergazyme (1/4 de cuillère à thé de
Tergazyme/1000 ml de dH20).
7. Les "cellules ayant migré" sont à présent tournées vers le haut. Ne pas perturber
cette face du filtre.
8. Attraper le bord droit du filtre avec des pinces, soulever le bord pour le décoller, puis tirer légèrement le filtre vers la droite de sorte que l'extrémité
soit juste suspendue au bord.
9. Fixer cette extrémité avec la pince en matière plastique et soulever le filtre pour le séparer du joint. Appliquer rapidement la seconde pince en matière plastique à l'autre extrémité. Placer la
partie supérieure de la chambre immé-
diatement dans du Tergazyme.
10. Maintenir le côté portant les cellules vers le haut (toujours), mouiller le côté n'ayant pas de migration en le plaçant dans du STP. Ne pas laisser le STP mouiller le côté portant les "cellules
ayant migré".
11. Tenir le filtre tendu, tirer le côté ne présentant pas de migration contre la lame d'essuyage (d'une extrémité à la
suivante dans une direction seulement).
12. Répéter 4 ou 5 fois ce mode opératoire.
Réduire au minimum le temps entre le mouillage et l'essuyage pour éviter le séchage et le collage des cellules n'ayant pas migré et pour éviter une élimination incomplète. Sécher toujours la lame d'essuyage avant chaque essuyage
successif.
13. Placer le filtre sur une lame gravée de la manière appropriée, avec le coin coupé à la même extrémité que les inscriptions gravées, mais du côté opposé. Laisser
sécher pendant une nuit.
14. Rincer les éléments de chambre se trouvant dans du Tergazyme avec dH20 et entreposer dans dH20 frais. Recouvrir, jusqu'à ce qu'il soit nécessaire de
nettoyer les chambres.
COLORATION DU FILTRE
Placer le densitomètre (LKB) de sorte que le filtre puisse être soumis immédiatement à une lecture
après coloration.
1. Placer une petite pince noire sur l'extrémité du filtre et de la lame
séchés, avec l'angle coupé.
2. Colorer dans du LeukoStat (marque Fisher) par immersion dans chacune de trois solutions, dans l'ordre, à 5 reprises pendant 5 secondes à chaque fois. Eliminer le colorant en excès par tamponnement sur un chiffon à papier ou sur un morceau de gaze, entre les
passages dans les solutions.
3. Laisser le filtre séjourner dans le troisième colorant pendant 30 secondes de
plus après les 5 immersions.
4. Rincer le filtre dans dH2O (utiliser deux bains différents de dH20). Eliminer la
dH2O en excès par tamponnement.
5. Placer une autre lame de verre propre (non marquée) directement sur le filtre et les presser l'un contre l'autre soigneusement et cependant fermement, en
chassant la plupart des bulles d'air.
6. Effectuer la lecture sur le densitomètre.
LECTURE DE DENSITOMETRIE DU FILTRE COLORE
1. Laisser le densitomètre (LKB) se
réchauffer pendant 10 à 20 minutes.
2. Placer la lame humide colorée sur la table de lecture et l'orienter pour l'amener aux coordonnées convenables, de la manière suivante: Colonne Position X "Piste"
B 113,6 1
C 119,6 2
D 127,0 3
E 132,6 4
F 138,6 5
G 146,6 6
H 152,6 7
I 158,0 8
J 166,0 9
K 171,6 10
Autres réglages du densitomètre: a) Filtrage: 3 b) Largeur x: 4 c) Déclenchement y: 19 d) Arrêt y: 43 3. Centrer la lame. Contrôler les positions
des colonnes.
4. Fixer au moyen d'une pince la lame vers
le bas, sans la déplacer.
5. Contrôler les coordonnées "Y" sur
différentes rangées.
6. Envoyer le guide "en position de repos".
"Ecst".
7. Fermer le couvercle.
8. Appuyer sur "Enter" (sur l'ordinateur), puis sur "6" (ou sur "Run") sur le densitomètre. 9. Calculer la surface des pics obtenue avec le densitomètre en utilisant le programme
"GSXL" de LKB.
NETTOYAGE DES CHAMBRES
Le mode opératoire suivant est utilisé pour éliminer les protéines résiduelles, etc., des chambres et des joints de chimiotactisme (source: Terri Superdock,
118:61, 2/21/89).
1. Rincer soigneusement les joints et les
chambres sales avec de l'eau désionisée.
Placer les chambres avec les joints correspondants dans un bécher en matière plastique de 1 litre (2 séries par bêcher). 2. Chauffer une solution à 0,75 % de Tergazyme (7,5 g de Tergazyme/l litre de dH2O; 500750 ml/2 chambres) à 50 C. Ne
pas dépasser la température de 500C.
3. Recouvrir les chambres et les joints avec du Tergazyme à 50 C. 4. Placer le ou les béchers dans un bain d'eau à 50 C. Couvrir le bain et mettre à
incuber pendant 2 heures.
*Pour le nettoyage des joints, voir les étapes 10 et 11.
5. Enlever seulement les chambres et rincer soigneusement avec dH20. Placer les chambres dans un bécher en matière
plastique de 1 litre (1000 ml); 2-
3 chambres/bécher.
6. Couvrir les chambres avec NaOH 1M à
température ambiante (600-700 ml/bécher).
Couvrir le bécher avec une feuille de
papier métallisé.
7. Mettre à incuber le ou les béchers dans un bain d'eau couvert à 50 C pendant 30 minutes. 8. Rincer très soigneusement les chambres avec dH20. Placer les chambres et un volumineux barreau d'agitation dans un
bac profond en matière plastique.
Orienter de manière déterminée les chambres (parties supérieures et parties inférieures) de manière à ne pas interférer avec le barreau d'agitation tournant. Placer le bac sur un agitateur
magnétique à proximité d'un évier.
9. Remplir le bas de dH2O, en maintenant un
écoulement continu pendant 2 heures.
S'assurer que l'eau circule de manière adéquate, et qu'il est placé dans le bac un dispositif de siphonnage conduisant à
l'évier, pour éviter un débordement.
10. Placer les joints dans un bécher avec une solution à 0,75 % de Tergazyme et effectuer un traitement par ultrasons
pendant 30 minutes.
11. Rincer soigneusement avec dH2O et placer
les joints dans 1 litre de dH2O.
Effectuer un traitement par ultrasons pendant 2 heures, en changeant l'eau
toutes les 30 minutes.
12. Assembler les chambres et les joints (serrés légèrement avec des vis) et les placer dans un récipient plat (en
polypropylene) rempli de dH2O fraîche.
Recouvrir avec une feuille d'aluminium et
changer l'eau une fois par semaine.
13. Rincer les chambres et les joints soigneusement avec dH20 fraîche avant utilisation.
EXEMPLE 12
L'activité ACK peut être définie par le
protocole suivant.
PREPARATION DES CELLULES
1. Utiliser un dispositif EpiPack contenant des cellules en prolifération dans un flacon T-25 de kératinocytes épidermiques humains normaux (NHEK), des flacons de 500 ml de KGM (milieu de croissance de kératinocytes dépourvus d'agents de supplementation et de sérum), un flacon de 500 ml de KBM (milieu basai pour
kératinocytes) et des réactifs de sous-
culture consistant en une solution de sérum- physiologique tamponné avec du HEPES, une solution de trypsine [(0,025 % en poids/volume)/EDTA (0,01 % en
poids/volume)], une solution de neutrali-
sation de trypsine de Clonetics Corpora-
tion, San Diego, Californie.
2. Lors de la réception, déballer et mettre à incuber la fiole T-25 close à 37 C, avec 5 % de C02, pour équilibrer la température. 3. Chauffer 5 ml de KGM dans un récipient stérile. 4. Essuyer soigneusement la fiole T-25 avec de l'alcool isopropylique à 70 % sous un
champ stérile (Biohood).
5. Eliminer le milieu; le rejeter dans un récipient contenant une petite quantité de décolorant et le remplacer par 5 ml de KGM chauffé. Laisser le bouchon vissé,
mais sans un bouchage hermétique.
6. Replacer dans un incubateur à 37 C, humidifié avec 5 % de CO2, pendant un
temps de 24 à 48 heures pour la sous-
culture. Ne pas laisser la culture de
cellules devenir confluente.
ENLEVEMENT DES CELLULES DE LA FIOLE T-25
1. Sous une hotte Biohood, éliminer le milieu de culture (le rejeter dans un récipient avec une petite quantité de décolorant) et laver les cellules avec
2 ml de solution tamponnée avec du HEPES.
2. Eliminer le HEPES, ajouter 2 ml de solution de trypsine/EDTA, laisser en
place pendant 2 minutes.
3. Enlever la solution de trypsine/EDTA et placer dans un tube à centrifugation stérile contenant 2 ml de solution de neutralisation de trypsine. Serrer le bouchon sur la fiole et regarder sous un
instrument optique.
4. Observer les cellules se détachant et
rassemblées. Après un temps supplémen-
taire de 3 minutes, frapper la fiole contre la paume de la main une fois d'un
côté et une fois de l'autre côté.
Observer au microscope pour déterminer le flottement des cellules. Ne pas dépasser un temps total de 4 minutes à partir de
l'addition de trypsine.
5. Sous une hotte Biohood, ajouter immé-
diatement 2 ml de solution de neutralisa-
tion de trypsine et effectuer un lavage.
Transférer les cellules dans un tube à
centrifugation stérile (voir le paragra-
phe 3), rincer la fiole avec un autre
volume de 2 ml de solution de neutralisa-
tion de trypsine et introduire dans un
tube à centrifugation.
6. Contrôler la fiole au microscope; serrer le bouchon pour voir s'il reste de
quelconques cellules.
7. S'il reste un certain nombre de cellules, répéter la totalité du mode opératoire à partir de l'étape 1 et introduire dans un tube à centrifugation. Si aucune cellule n'est présente ou bien s'il en existe une très petite quantité, poursuivre
l'opération avec le tube à centrifuga-
tion. 8. Centrifuger les cellules à 220g à une température de 25 C pendant 10 minutes,
rejeter le surnageant.
9. Remettre en suspension le culot de cellules avec 5 ml de KGM chaud et
effectuer un comptage avec l'hémocyto-
mètre.
10. Ensemencer une nouvelle fiole à la
densité désirée.
ENLEVEMENT DES CELLULES DE LA FIOLE T-75
(CONFLUENCE DE 70 à 80 t): 1. Suivre le même mode opératoire que pour la fiole T-25, sauf en ce qui concerne l'utilisation des quantités suivantes: a. 5 ml de solution tamponnée avec de l'HEPES b. 7 ml de solution trypsine/EDTA c. Enlever les cellules par lavage de la fiole avec 7 ml de solution de neutralisation de trypsine,
transférer dans un tube "blue max".
d. Laver de nouveau la fiole avec 3 ml de solution de neutralisation de trypsine et introduire dans un tube
"blue max".
2. Centrifuger à 220g à une température de 25 C pendant 10 minutes. Rejeter le surnageant. 3. Remettre en suspension le culot de cellules avec 5 ml de KBM et introduire
dans un tube à centrifugation.
4. Centrifuger, rejeter le surnageant, remettre en suspension avec 2 ml de KBM
et effectuer un comptage avec l'hémocyto-
mètre. - 5. Effectuer l'analyse de chimiotactisme et
établir de nouvelles densités.
NOTE: 1. En ce qui concerne le chimio-
tactisme, remettre en suspen-
sion le culot avec du KBM.
2. Pour le passage des cellules pour établir seulement une nouvelle densité cellulaire,
utiliser du KGM.
3. Alimenter les cellules avec du
KGM M, W, F frais.
Dans la fiole T-75 = 15 ml de KGM Fiole T-25 = 5 ml de KGM
PREPARATION DES CELLULES POUR LE CHIMIOTACTISME
1. Traiter par la trypsine et centrifuger les cellules suivant le mode opératoire indiqué pour enlever les cellules de la
fiole T-75.
2. Remettre en suspension les cellules dans du KBM et effectuer un comptage avec un hémocytomètre. Nombre total de cellules = (dénombrement moyen) x (ml de KBM) x
(dilution du bleu trypan) x (1 x 104).
3. Opérer pour parvenir à une dilution finale de cellules de 5,56 x 105
cellules/ml (soit 25 000 cellules/45 Il).
Maintenir les cellules sur de la glace
jusqu'au moment requis.
PREPARATION DU FILTRE
1. Préparer 20 ml de solution à 5 gg/ml de fibronectine (Sigma N F4759) à partir
d'une solution de réserve congelée.
Utiliser des embouts et des tubes stériles en polypropylène pour la préparation de cette solution (exemple: solution de réserve congelée = 0, 1 mg/ml de dH2 - HBSS. En conséquence, diluer 1000 gl de solution de réserve dans 19,0 ml de HBSS). Entreposer sur de la
glace jusqu'à utilisation.
2. Utiliser des filtres en polypropylène Nucleopore (pores de 8,0 pm, PVPF, de Neuro Probe Inc., 301-229-8598), à raison
d'un par chambre.
3. Couper le coin supérieur gauche de la face brillante du filtre pour permettre l'orientation du filtre. Utiliser des pinces Brucelles pour manipuler le filtre (jamais avec les doigts) et seulement aux extrémités. 4. Placer 3 à 4 ml de FN/HBSS au centre d'une boîte de Petri stérile. Etendre le filtre sur la face supérieure du FN/HBSS, le côté brillant vers le bas, en laissant l'étalement s'effectuer au-dessous du filtre; ne laisser aucune quantité de
FN/HBSS à la face supérieure du filtre. 5. Couvrir la boître de Petri et laisser au repos à température ambiante
pendant
minutes.
6. Eliminer soigneusement le FN/HBSS par écoulement (en inclinant lentement la plus grande partie d'un côté, en laissant le filtre coller à la plaque, puis en éliminant totalement par écoulement), soulever le filtre, placer 3 à 4 ml de FN/HBSS frais au centre et répéter le mode opératoire sur l'autre face du
filtre (la face terne vers le bas).
7. Le revêtement est alors total et les
filtres peuvent être utilisés.
*NOTE: a) Pour des raisons d'uniformité,
utiliser le filtre immédiate-
ment, en chronométrant le remplissage de la chambre inférieure de manière qu'il coïncide avec l'achèvement du revêtement de la seconde face
du filtre.
b) Lors de la préparation de deux filtres, il est recommandé de décaler leurs temps de revêtement de 15 minutes pour permettre le remplissage d'une chambre avant d'avoir à remplir la seconde, pour éviter de devoir remplir brusquement les deux chambres
en même temps.
PREPARATION DES CHAMBRES
1. Enlever les chambres de chimiotactisme à 48 puits Neuro Probe du bain d'eau distillée (dH20) d'entreposage. Rincer
soigneusement avec de la dH2O pure.
Sécher la partie supérieure et le joint avec un morceau de tissu et sécher la partie inférieure par insufflation
d'azote gazeux pur.
2. Préparer des échantillons d'essai pour
l'introduction au fond de la chambre.
Chaque puits renferme approximativement
26,0 à 26,5 gl de solution.
3. Introduire approximativement 26,1 à 26,5 il d'échantillons dans les puits de
la chambre inférieure.
*NOTE: a) Pour produire un "ménisque positif" désiré, un léger "étêtement" avec un liquide peut être nécessaire. Cela permet de s'opposer au séchage qui se produit lors du remplissage du reste de la chambre. Eviter de créer des bulles. b) Utiliser une pipette à déplacement positif pour une
plus grande uniformité.
Puisque les première et dernière colonnes (A,L) des quatre puits de chaque extrémité de la chambre ne sont pas utilisées pour le chimiotactisme, les remplir avec du HBSS. En conséquence, ces mêmes rangées dans la chambre supérieure sont également remplies de HBSS et
non de cellules.
4. Lorsque les filtres sont prêts, éliminer le FN/HBSS par écoulement (de la manière décrite précédemment). Enlever le filtre de la boite de Pétri en le soulevant avec précaution; ne pas laisser l'une ou
l'autre face racler le bord de la boîte.
En soulevant le filtre lentement, la quantité résiduelle de FN/HBSS restant sur le filtre est réduite au minimum. Ne pas laisser tomber ou effleurer le filtre
à ce moment.
5. Tout en maintenant les deux extrémités du filtre avec des pinces, abaisser le centre du filtre sur le centre de la chambre, puis couvrir uniformément les puits inférieurs. Le filtre doit avoir sa
face brillante tournée vers le haut.
*NOTE: Toujours orienter de la même manière, la chambre et le filtre; c'est-à-dire toujours maintenir la marque commerciale de la chambre et le coin coupé sur le filtre dans le
coin supérieur gauche.
6. Seulement si nécessaire, ajuster le filtre légèrement pour un alignement convenable. 7. Placer le joint juste au-dessus du
filtre, mais non en contact.
8. Placer la moitié supérieure de la chambre sur le sommet du joint et appuyer pour les mettre en contact. Les maintenir fermement appuyés tout en fixant les vis
de blocage.
9. Une fois la fixation effectuée, prendre la chambre et regarder à travers les puits pour déterminer la présence de toutes bulles qui peuvent s'être formées au-dessous du filtre; noter leur présence, ces bulles pouvant interférer
avec le chimiotactisme.
* 10. Introduire 45 1l de HBSS dans les quatre
puits aux deux extrémités (A,L).
11. Puis introduire 45 gl de suspension de
cellules dans les puits restants.
*NOTE: Ajouter les cellules avec un embout de pipette à un angle pour éviter de piéger l'air dans la partie inférieure. Si une bulle se forme, prélever soigneusement du liquide et
remplir à nouveau. Après remplis-
sage, tous les puits doivent présenter un aspect uniforme. Sinon, suspecter la présence d'air piégé et
recommencer l'opération.
12. Placer la chambre dans un bac en verre ou en polypropylène, ajouter un carré de gaze imbibé d'eau (pour accroître l'humidité et éviter l'évaporation), et recouvrir sans tasser avec une feuille d'aluminium. 13. Mettre à incuber pendant 18 heures à 37 C
avec 5 % de CO2.
ENLEVEMENT ET ESSUYAGE DU FILTRE
1. Graver la date et le numéro de la chambre
à une extrémité d'une lame de verre.
Nettoyer soigneusement avec de l'alcool
et sécher.
2. Enlever les écrous de blocage tout en
maintenant la plaque supérieure.
3. Orienter la chambre avec la marque commerciale dans le coin supérieur
gauche, sur un chiffon en papier.
4. Retourner la totalité de la chambre (le long de l'axe horizontal) sur le chiffon
en papier.
5. Pousser vers le bas les quatre angles de la plaque supérieure de sorte que cette plaque reste parallèle à la plaque inférieure lors de son mouvement vers le
bas. Le filtre doit être collé au joint.
6. Enlever la plaque inférieure et immerger immédiatement dans une solution de Tergazyme (1/4 de cuillère à thé de
Tergazyme/1000 ml de dH2O).
7. Les "cellules ayant migré" sont alors tournées vers le haut. Ne pas perturber
cette face du filtre.
8. Saisir le bord droit du filtre avec des pinces, soulever le bord pour le décoller, puis tirer légèrement le filtre vers la droite de sorte que l'extrémité
recouvre juste le bord.
9. Fixer cette extrémité avec la pince en matière plastique et soulever le filtre pour le séparer du joint. Appliquer rapidement la seconde pince en matière plastique à l'autre extrémité. Placer la
partie supérieure de la chambre immédia-
tement dans du Tergazyme.
10. Maintenir le côté portant les cellules vers le haut (toujours), mouiller le côté ne présentant pas de migration avec du STP. Ne pas laisser le STP mouiller le
côté portant les "cellules ayant migré".
11. Maintenir le filtre tendu, tirer le côté ne présentant pas de migration contre la lame d'essuyage (d'une extrémité à la
suivante dans une direction seulement).
12. Répéter ce mode opératoire 4 ou 5 fois.
Réduire au minimum le temps entre le mouillage et l'essuyage pour éviter le séchage et le collage des cellules n'ayant pas migré et une élimination incomplète. Toujours sécher la lame d'essuyage avant chaque essuyage successif. 13. Placer le filtre sur une lame portant les indications gravées appropriées, avec l'angle coupé à la même extrémité que les indications gravées, mais sur la face
opposée. Laisser sécher pendant une nuit.
14. Rincer les parties de la chambre se trouvant dans le Tergazyme avec dH2O et entreposer dans dH20 frais, couvrir, jusqu'à ce qu'il soit nécessaire de
nettoyer les chambres.
COLORATION DU FILTRE
Installer le densitomètre (LKB) de sorte que le filtre puisse être soumis à une lecture immédiatement après coloration. 1. Placer la petite pince noire sur l'extrémité du filtre et de la lame
séchés avec l'angle coupé.
2. Colorer dans du LeukoStat (marque Fisher) par immersion dans chacune de trois solutions, dans l'ordre, à reprises pendant 5 secondes à chaque fois. Eliminer le colorant en excès par tamponnement sur un chiffon en papier ou un morceau de gaze entre les passages
dans les solutions.
3. Laisser le filtre dans le troisième colorant pendant 30 secondes de plus
après les 5 immersions.
4. Rincer le filtre dans dH2O (utiliser deux bains différents de dH2O). Eliminer le
dH20 en excès par tamponnement.
5. Placer une autre lame de verre propre (non marquée) directement sur le filtre et les presser l'un contre l'autre soigneusement, mais cependant fermement,
en chassant la plupart des bulles d'air.
6. Effectuer la lecture sur le densitomètre.
LECTURE PAR DENSITOMETRIE DU FILTRE COLORE
1. Laisser le densitomètre (LKB) se
réchauffer pendant 10 à 20 minutes.
2. Placer la lame humide colorée sur la table de lecture et effectuer une orientation pour l'amener aux coordonnées convenables, de la manière suivante: Colonne Position X "Piste"
B 113,6 1
C 119,6 2
D 127,0 3
E 132,6 4
F 138,6 5
G 146,6 6
H 152,6 7
I 158,0 8
J 166,0 9
K 171,6 10
Réglages supplémentaires du densitomètre: a) Filtrage: 3 b) Largeur X: 4 c) Déclenchement y: 19 d) Arrêt y: 43 3. Centrer la lame. Contrôler les positions
des colonnes.
4. Fixer par une pince la lame en position
basse sans la déplacer.
5. Contrôler les coordonnées "Y" sur
différentes rangées.
6. Ramener le guide "en position de repos".
"Ecs".
7. Fermer le couvercle.
8. Appuyer sur la touche "Enter" (sur l'ordinateur), puis sur "6" (ou sur
"'Run") sur le densitomètre.
9. Calculer la surface des pics obtenus avec le densitomètre en utilisant le programme
"GSXL" de LKB.
NETTOYAGE DES CHAMBRES
Le mode opératoire suivant est utilisé pour éliminer les protéines résiduelles, etc., des chambres et des joints de chimiotactisme. (Source: Terri Superdock,
118:61, 2/21/89).
1. Rincer soigneusement les joints et les
chambres sales avec de l'eau désionisée.
Placer les chambres avec les joints correspondants dans un bécher en matière
plastique de 1 litre (2 jeux/bécher).
2. Chauffer une solution à 0,75 % de Tergazyme (7,5 g de Tergazyme/1 litre de dH20; 500-750 ml/2 chambres) à 50 C. Ne
pas dépasser 50 C.
3. Couvrir les chambres et les joints avec
la solution de Tergazyme à 50 C.
4. Placer le ou les béchers dans un bain d'eau à 50 C. Couvrir le bain et mettre à incuber pendant 2 heures. *Pour le nettoyage des joints, voir les
étapes 10 et 11.
5. Enlever seulement les chambres et les rincer soigneusement avec dH2O. Placer les chambres dans un bécher en matière plastique de 1 litre (1000 ml); 2-3 chambres/bécher. 6. Couvrir les chambres avec NaOH 1M à
température ambiante (600-700 ml/bécher).
Couvrir le bécher avec une feuille de
papier métallisé.
7. Mettre à incuber le ou les béchers dans un bain d'eau couvert, à 50 C, pendant 30 minutes. 8. Rincer très soigneusement les chambres avec dH2O. Placer les chambres et un volumineux barreau d'agitation dans un
bac profond en matière plastique.
Orienter de manière adéquate les chambres
(parties supérieures et parties infé-
rieures) de manière à ne pas interférer
avec le barreau d'agitation en rotation.
Placer le bac sur un agitateur magnétique
à proximité d'un évier.
9. Remplir le bac de dH2O, en laissant le dH2O s'écouler continuellement pendant 2 heures. S'assurer que l'eau circule de la manière adéquate, et placer un dispositif de siphonage dans le bac pour
éviter un débordement de l'évier.
10. Placer les joints dans un bécher avec une solution de 0,75 % de Tergazyme et effectuer un traitement par ultrasons
pendant 30 minutes.
11. Rincer soigneusement avec dH20 et placer
les joints dans 1 litre de dH2O.
Effectuer un traitement par ultrasons pendant 2 heures, en changeant l'eau
toutes les 30 minutes.
12. Assembler les chambres et les joints (serrer légèrement avec des vis) et les placer dans un bac plat (en polypropy- lène) rempli de dH20 fraîche. Couvrir avec une feuille d'aluminium et changer
l'eau une fois par semaine.
13. Rincer les chambres et les joints soigneusement avec dH2O fraîche avant utilisation.
EXEMPLE 13
L'activité AECL peut être définie par le protocole suivant: 2 à 4 pastilles de polymère sont préparées pour chaque échantillon à tester pour déterminer l'activité angiogénique. Une solution à 10 % en volume/volume de polymère, disponible sous le nom de polymère Hydron, de
type NCC, de qualité et pour cultures de cellules (dis-
ponible dans le commerce auprès de HydroMed Sciences, New
Brunswick, NJ 08901), 1 % en volume/volume de polyéthylène-
glycol dans 70 % en volume/volume d'éthanol doit être préparée (cette solution étant désignée ci-après sous le nom de solution de polymère). La solution de polymère est mélangée dans le rapport 1:1 en volume/volume avec l'échantillon d'essai. Un morceau de sachet en matière plastique pour autoclave est appliqué sur une surface plate, en s'assurant qu'il est tendu. Puis on essuie la surface avec de l'alcool et on la laisse sécher. On laisse tomber goutte à goutte 20 gl du mélange dans le rapport 1:1 sur le morceau de matière plastique. Puis les pastilles de polymère sont séchées sous vide pendant approximativement
2 heures ou bien jusqu'à ce qu'elles soient sèches.
L'essai d'implant cornéen est effectuée sur un lapin New Zealand White de 1,8 à 2,7 kg. L'anesthésique
est préparé en mélangeant dans le rapport 1:1 en volume/vo-
lume 100 mg/ml de chlorhydrate de kétamine, disponible dans le commerce sous le nom de Ketaset auprès de Veterinary Products, Bristol Laboratories, Syracuse, NY 13201, et 10 mg/ml de maléate d'acépromazine, disponible dans le commerce sous le nom de Promace@ auprès de Aveco Co., Inc., Fort Dodge, IA 50501, dans la même seringue. Un
volume de 4 à 5 cm3 est utilisé pour chaque lapin.
L'anesthésique est injecté dans le gluteus maximum ou le gastrocnemius en utilisant une aiguille de calibre 23, en frottant doucement la zone après injection. Le lapin est convenablement anesthésié lorsqu'il ne peut résister à un renversement sur le dos, habituellement en un temps de 10 à
minutes.
Le lapin est placé sur un morceau d'étoffe stérile. 3 à 5 gouttes de chlorhydrate de proparacine à
0,5 %, disponible dans le commerce sous le nom de Oph-
theticR auprès de Allergan Pharmaceuticals, Inc., Irvine, CA 92713, sont placées dans chaque oeil pour engourdir le champ. La solution d'anesthésique est utilisée de la manière requise tout au long de l'opération chaque fois que
l'oeil devient sec.
L'oeil est sorti de l'orbite en utilisant des pinces à pointes fines pour tissus. Les pinces sont amenées lentement vers l'angle interne de l'oeil et un morceau de tissu est bloqué pour garantir que l'oeil reste dans cette position lors de l'opération, en prenant soin de
ne pas pincer le nerf optique.
Un scalpel, à lame pour chirurgie de l'oeil Beaver N 5210, disponible dans le commerce auprès de Beaver Surgical Products, Waltham, MA 02154, est tiré doucement à travers l'apex de la cornée, en pratiquant une incision d'approximativement 3,0 mm de longueur. Il est possible que cela provoque une perforation de la cornée, ce
qui amène l'humeur aqueuse à suinter à travers la perfora-
tion. Si cela doit se produire, l'animal doit être
sacrifié.
Au moyen d'une spatule Elschnig pour cyclodia-
lyse, de 1 mm de largeur et 10 mm de longueur, disponible dans le commerce auprès de U. Mueller, Chicago, IL 60648, produit N OP-2040, un canal est pratiqué avec ménagement à travers la cornée vers le lit capillaire. Une "poche" destinée à la pastille de polymère est formée en déplaçant la pointe d'une sonde d'un côté à l'autre, en prenant soin de ne pas déplacer la sonde vers l'avant lorsque la pastille ne doit pas être située à moins de 1 mm du lit capillaire. Une pastille de polymère est détachée du morceau de matière plastique en utilisant des pinces et est placée sur l'oeil au point d'incision. Au moyen d'une spatule, la pastille est poussée à travers le canal et dans la poche. Plusieurs gouttes de solution d'anesthésique sont utilisées pour lubrifier le champ et rendre plus aisée l'insertion de la pastille. La pastille doit être logée dans la poche. L'air piégé est chassé de la poche en tirant
une spatule le long du canal à l'extérieur de la cornée.
Puis les pinces sont enlevées. Les paupières sont soulevées et abaissées doucement manuellement et l'oeil reprend sa position normale. Trois gouttes de solution anti-bactérienne, disponible dans le commerce sous le nom de solution ophtalmique NeosporinE auprès de Burroughs Wellcome Co., Research Triangle Park, NC 27709, sont placées dans chaque oeil pour réduire au minimum la
possibilité d'infection.
Un lapin est utilisé pour chaque échantillon à tester (soit 2 pastilles du même échantillon par lapin,
l'une dans chaque oeil).
Les yeux sont contrôlés aux jours 3, 5 et 7 pour déterminer toute croissance directe de capillaires vers la pastille et sont classés suivant le procédé de
Gimbrone et collaborateurs, J. Natl. Cancer Inst. 52:413-
427(1974), et de Banda et collaborateurs, brevet des Etats-
Unis d'Amérique N 4 503 038, l'un et l'autre de ces documents étant cités dans leur intégralité à titre de référence. Des clichés des yeux sont effectués au 7ème jour
pour noter la croissance des capillaires.
En conséquence, la présente invention peut être mise en application sous d'autres formes spécifiques sans s'écarter de son esprit ou de ses caractéristiques essentielles. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées
sans sortir de son cadre.
Claims (20)
1. Procédé de préparation d'un produit à base de substance libérée par les plaquettes, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre à une analyse un échantillon de substance libérée par les plaquettes, ladite analyse indiquant la quantité d'un constituant présent dans l'échantillon de substance libérée par les plaquettes; et à former un produit à base de substance libérée par les plaquettes, contenant une quantité choisie de substance libérée par les plaquettes, ladite quantité étant choisie en comparant la quantité du constituant dans l'échantillon de substance libérée par les plaquettes à un intervalle prédéterminé de quantités du constituant identique devant être présent dans un produit à base de substance libérée
par les plaquettes, ledit constituant présent dans l'échan-
tillon de substance libérée par les plaquettes étant choisi dans le groupe comprenant la bêta-thromboglobuline, le facteur de croissance dérivé des plaquettes, le facteur angiogénique dérivé des plaquettes, le facteur plaquettaire 4, le facteur basique de croissance des fibroblastes, le facteur acide de croissance des fibroblastes, le facteur de croissance transformant alpha, le facteur de croissance transformant bêta, le facteur de croissance épidermique
dérivé des plaquettes et la fibronectine.
2. Procédé suivant la revendication 1,
caractérisé en ce que le constituant présent dans l'échan-
tillon de substance libérée par les plaquettes est la bêta-
thromboglobuline, de préférence en une concentration supérieure à environ 25 nanogrammes par millilitre de
produit à base de substance libérée par les plaquettes.
3. Procédé suivant la revendication 1,
caractérisé en ce que le constituant présent dans l'échan-
tillon de substance libérée par les plaquettes est le facteur de croissance dérivé des plaquettes, de préférence en une concentration supérieure à environ 0,2 nanogramme saanbeid saI led avlqFI aouesqns ap aseq Ve Tnpod ap aIIIFi ed sTun 0S-aG/I ' UOlFAua Ve anaTadns S saXseIqoq! sap auo!m %AToe un ouaa9d p uKee sa%anbeId saI aed aaqTi aouesqns ap assq ae Tnpoad aI1 a 'saseIqoqF.; sap uo!m;IzAIoe.I uamasnaBeuRAe ue; sa$anbeId saI aed aglqTI aouezsqns ap uoii!ueqo.I p 9l!AIOe %!peI 'sKoou!$elaX sap anb!lvoZo!mIq 9!A! OE -oeI Xs u!deI P pUaoo eI ans!ess.I suep a,%!A!$O,I saIeIIaqopua sInIIa>O sap nbIoeo!m!qo PZ!A!oeI sa$seIqoaq! sap auo!m!aIFJFoeI $ueuaadmoo adnolS aI suep aIs!Oqo ue saanbeId saI led a{q!I aouezsqns p uoII!Uegop,. a p %!A!oe a!PeI 's$nbeld sI aed 5z PavlaqI aoueasqns ap ssq e!npoad np anb!uap! 9!A!oe.P spaap ap u!mlaagpaNd aIIeaaau! un ev saapnbeId saI aed saPaq!I aouezsqns ap uoII!Ueqoa,I ap $A!JaFoe a$!PeI 3p alSp oI $ueaedmoo uo a!s!oqo ueXa9 9!uenb o!PeI saanbeId sI aed aPlq!I ouesqns ap!s!oqo 9!uen5 0z un $ueuszuoo 'ssa;anbeid sI aed avl!I oueXsqns p seq se Inpoad un lamo e za 'sanbeId sI aed alq!I aouesqns ap uoII!ueqo.I ap P%!A!%oeP 9aiP al %uenbpu! sKIeUe a;!PeI 'sa;nbeId saI aed 9aPlq!I aouezsqns ap uoii!juegoa un asKIeUe aun w a$amnos e $s!suoo I!.nb 51 ao ua s!Iaoeaeo 'saanbeId saI aed oaNalq!I aouesqns p aseq V!npoad unp uo!%onpoad ap ppooaH '9 - saanbeId sap AFIaP anb!ugo!2ue anacJo I $sa sa$anbeId saI aed ail!I aouesqns ap uoII! - I uo!4eo!puaAa eI ueA!ns,Sppooa ' S saanbeId saI aed gaalqII aouesqns ap aseq e Inpoad aP al^I!lIIm aed sammeaoueu 01 uoaI^aU çe an!aldns aI $sa sa;;nbeId saI aed a{laq! aoueXsqns aP uoII!$ -ueqop. I suep uaspad %uen!%suoo aI anb ao ua as!Iagoeaeo I UO!Xeo!puAo eI:UeA!nS pap9ood ' -'sa$$anEbed saI ed alqII aouesqns ap aseq se %!npoad p al; I!II!m ad S9 ssOgs9g 7. Procédé suivant la revendication 1 ou 6, caractérisé en ce que la substance libérée par les plaquettes présente dans le produit à base de substance libérée par les plaquettes et l'échantillon de substance libérée par les plaquettes sont obtenus à partir du même
prélèvement de plaquettes.
8. Procédé suivant la revendication 1 ou 6, caractérisé en ce que la substance libérée par les plaquettes présente dans le produit à base de substance libérée par les plaquettes et l'échantillon de substance libérée par les plaquettes sont obtenus à partir de prélèvements différents de plaquettes chez le même animal
ou la même personne.
9 Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que la substance libérée par les plaquettes présente dans le produit à base de substance libérée par les plaquettes et l'échantillon de substance libérée par les plaquettes sont obtenus par réunion d'un ensemble d'échantillons de plaquettes prélevés chez un
groupe de donneurs animaux ou humains.
_ Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que les plaquettes sont des plaquettes de
mammifères ou des plaquettes humaines.
11. Procédé suivant la revendication 8 ou 9,
caractérisé en ce que l'animal est un mammifère.
12. Produit à base de substance libérée par les plaquettes, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité choisie de substance libérée par les plaquettes, ladite quantité étant choisie par comparaison de la quantité d'un constituant présent dans un échantillon de substance libérée par les plaquettes à un intervalle prédéterminé de quantités du constituant identique devant être présent dans le produit à base de substance libérée par les plaquettes, et un véhicule ou diluant, pharmaceutiquement acceptable, pour ladite substance libérée par les plaquettes, ledit constituant présent dans l'échantillon de substance libérée par les plaquettes étant choisi dans le groupe comprenant la bêtathromboglobuline, le facteur de croissance dérivé des plaquettes, le facteur angiogénique dérivé des plaquettes, le facteur plaquettaire 4, le facteur basique de croissance des fibroblastes, le facteur acide de croissance des fibroblastes, le facteur de croissance transformant alpha, le facteur de croissance transformant bêta, le facteur de croissance épidermique
dérivé des plaquettes et la fibronectine.
13_ Produit à base de substance libérée par les plaquettes, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité choisie de substance libérée par les plaquettes, ladite quantité étant choisie par comparaison du degré d'activité d'un échantillon de substance libérée par les plaquettes à un intervalle prédéterminé de degrés d'activité identique de produit à base de substance libérée par les plaquettes, et un véhicule ou diluant, pharmaceutiquement acceptable, pour ladite substance libérée par les plaquettes, ladite activité de l'échantillon de substance libérée par les plaquettes étant choisie dans le groupe comprenant
l'activité mitogène des fibroblastes, l'activité chimiotac-
tique des cellules endothéliales, l'activité dans l'essai sur la cornée de- lapin et l'activité chimiotactique des kératinocytes, ladite activité de l'échantillon de substance libérée par les plaquettes étant avantageusement l'activité mitogène des fibroblastes, et le produit à base de substance libérée par les plaquettes ayant de préférence une activité mitogène des fibroblastes supérieure à environ 2,5 1/ED-50 unités par millilitre de produit à base de
substance libérée par les plaquettes.
14. Produit suivant la revendication 12 ou 13,
caractérisé en ce qu'il est pratiquement dépourvu d'im-
puretés provenant du sang ou du plasma, ainsi que d'en-
veloppes des plaquettes ou d'autres substances présentes dans les plaquettes mais non libérées par lesdites
plaquettes-
15. Utilisation d'un produit à base de substance libérée par les plaquettes caractérisée en ce que ce produit, qui contient une quantité choisie de substance libérée par les plaquettes, ladite quantité étant choisie en comparant la quantité d'un constituant d'un échantillon de substance libérée par les plaquettes à un intervalle prédéterminé de quantités du constituant identique devant être présent dans un produit à base de substance libérée par les plaquettes, est utilisé pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'un tissu par application
topique sur ce dernier.
16. Utilisation suivant la revendication 15 caractérisée en ce que le constituant présent dans l'échantillon de substance libérée par les plaquettes est choisi dans le groupe comprenant la bêta-thromboglobuline, le facteur de croissance dérivé des plaquettes, le facteur
angiogiénique dérivé des plaquettes, le facteur plaquet-
taire 4, le facteur basique de croissance des fibroplastes, le facteur de croissance transformant alpha, le facteur de croissance transformant bêta, le facteur de croissance
épidermique dérivé des plaquettes et la fibronectine.
17. Utilisation suivant la revendication 15 caractérisée en ce que le constituant présent dans l'échantillon de substance libérée par les plaquettes est
la bêta-thromboglobuline, de préférence en une concentra-
tion supérieure à environ 25 nanogrammes par millilitre de
produit à base de substance libérée par les plaquetttes.
18. Utilisation selon la revendication 15 caractérisée en ce que le constituant présent dans l'échantillon de substance libérée par les plaquettes est le facteur de croissance dérivé des plaquettes, de préférence en une concentration supérieure à environ 0,2 nanogramme par millilitre de produit à base de substance
libérée par les plaquettes.
19. Utilisation selon la revendication 15 caractérisée en ce que le constituant présent dans l'échantillon de substance libérée par les plaquettes est
le facteur plaquettaire 4, de préférence en une concentra-
tion supérieure à environ 10 nanogrammes par millilitre de
produit à base de substance libérée par les plaquette.
20. Utilisation selon la revendication 15 caractérisée en ce que le constituant présent dans l'échantillon de substance libérée par les plaquettes est
le facteur angiogénique dérivé des plaquettes.
21. Utilisation d'un produit à base de substance libérée par les plaquettes caractérisée en ce que le produit qui contient une quantité choisie de subtance libérée par les plaquettes, ladite quantité étant choisie en comparant le degré d'une activité d'un échantillon de substance libérée par les plaquettes à un intervalle prédéterminé de degrés d'activité identique du produit à base de substance libérée par les plaquettes, est utilisé pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement
d'un tissu par application topique sur ce dernier.
22. Utilisation suivant la revendication 15 ou 21 caractérisée en ce que la substance libérée par les plaquettes présente dans le produit à base de substance libérée par les plaquettes et l'échantillon de substance libérée par les plaquettes sont obtenus à partir du même
prélèvement de plaquettes.
23. Utilisation suivant la revendication 15 ou 21 caractérisée en ce que la substance libérée par les plaquettes présente dans le produit à base de substance libérée par les plaquettes et l'échantillon de substance libérée par les plaquettes sont obtenus à partir de prélèvements différents chez le même animal ou la même personne. 24. Utilisation suivant la revendication 15 ou 21 caractérisée en ce que la substance libérée par les plaquettes présentes dans le produit à base de substance libérée par les plaquettes et l'échantillon de substance libérée par les plaquettes sont obtenus par réunion d'un ensemble d'échantillon de plaquettes prélevées chez un
groupe de donneurs animaux ou humains.
25. Utilisation selon la revendication 15 ou 21 caractérisée en ce que la quantité choisie de substance libérée par les plaquettes est suffisante pour parvenir à une grande efficacité du traitement d'un tissu et est de préférence choisie de manière à obtenir au moins un
résultat d'évaluation fonctionnelle de stade 2.
26. Utilisation selon la revendication 21 caractérisée en ce que l'activité de l'échantillon de substance libérée par les plaquettes est choisie dans le groupe comprenant l'activité mitogène des fibroblastes, l'activité chimiotactique des cellules endothéliales,
l'activité dans l'essai sur la cornée du lapin et l'ac-
tivité chimiotactique des kératinocytes, ladite activité de l'échantillon de substance libérée par les plaquettes étant avantageusement l'activité mitogène des fibroblastes, et le produit à base de substance libérée par les plaquettes ayant de préférence une activité mitogène des fibroblastes supérieure à environ 2,5 l/ED-50 unités par millilitre de
produit à base de substance libérée par les plaquettes.
27. Utilisation selon la revendication 15 ou 21 caractérisée en ce que le tissu est un tissu de mammifère
et en particulier un tissu humain.
28. Utilisation selon la revendication 22 caractérisée en ce que les plaquettes sont des plaquettes
de mammifères et en particulier des plaquettes humaines.
29_ Utilisation selon la revendication 23 ou 24
caractérisée en ce que l'animal est un mammifère.
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