CN110734894B - 普适性癌症类器官体外培养培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种培养基。该培养基由DMEM/F‑12K基础培养基以及添加因子组成，所述添加因子由HEPES，L‑Glutamine，EGF，Noggin，FGF‑10，A83‑01，Y27632组成。根据本发明实施例的培养基不仅大大提高了类器官的传代培养的成功率，而且还可以实现对胃癌，直肠癌以及肺癌等癌种样本的普适性培养，这大大降低了培养成本，可实现类器官长期培养并建立生物样本库。
Description
技术领域
本发明涉及细胞工程领域，具体地，本发明涉及一种普适性癌症类器官体外培养培养基。
背景技术
在体外利用组织存在的干细胞在适宜条件下培养获得的三维器官结构，此结构被称为类器官(organoid)。类器官由组织分化而来，与组织细胞含有相同的遗传信息特征。由于其三维结构特质，在体外环境下最大限度保留了体内的生理特性。
而现有的类器官体外培养技术，培养基都是针对某一类肿瘤样本，无法实现多种肿瘤样本使用同一种培养基，导致培养过程中频繁的配制不同的培养基，增加了培养成本。
因此，开发一种具有普适性类器官体外培养培养基，对类器官的体外培养技术的发展具有重要意义。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种培养基。根据本发明的实施例，所述培养基由DMEM/F-12K基础培养基以及添加因子组成，所述添加因子由HEPES，L-Glutamine，EGF，Noggin，FGF-10，A83-01，Y27632组成。发明人发现，基于现有技术的类器官体外培养培养基，其中Wnt-3A，R-spondin1，SB202190以及Nicotinamide组分对类器官的生长没有促进作用，因此，本申请的发明人首次将Wnt-3A，R-spondin1，SB202190以及Nicotinamide组分从现有培养基中剔除，同时，发明人意外地发现，剔除上述组分后的根据本发明实施例的培养基不仅大大提高了类器官的传代培养的成功率，而且还可以实现对胃癌，直肠癌以及肺癌等癌种样本的普适性培养，这大大降低了培养成本，可实现类器官长期培养并建立生物样本库。
根据本发明的实施例，上述培养基还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述添加因子在所述培养基中的浓度分别为：HEPES 8～12mM，L-Glutamine 1～4mM，EGF 48～52ng/mL，Noggin 95～105ng/mL，FGF-10 8～12ng/mL，A83-010.3～0.7μM，Y27632 8～12μM。
根据本发明的实施例，所述添加因子在所述培养基中的浓度分别为：HEPES 10mM，L-Glutamine 2mM，EGF 50ng/mL，Noggin 100ng/mL，FGF-10 10ng/mL，A83-01 0.5μM，Y27632 10μM。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种癌类器官的体外培养方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将癌细胞进行体外培养，所述体外培养是在前面所述的培养基中进行的。根据本发明实施例的培养方法，实验了对多种癌种样本的普适性培养，大大降低了培养成本，同时也大大提高了类器官的传代培养的成功率，实现类器官长期培养并建立生物样本库。
根据本发明的实施例，所述癌细胞包括选自肠腺癌、胃癌、直肠癌以及肺癌细胞的至少之一。
根据本发明的实施例，所述癌细胞是通过如下方式获得的：将癌组织样本进行剪切和消化处理，所述剪切处理后癌组织的大小为1～2mm3，所述消化处理是在组合消化酶的作用下进行的，所述组合消化酶包括胶原酶type I和Dispase酶。
根据本发明的实施例，体外培养前，进一步包括将消化处理后获得的癌细胞利用预冷基质胶进行重悬处理，所述癌细胞在所述基质胶中的浓度为500～1500/10μL；将癌细胞悬液进行点板处理，并将点板处理后的癌细胞进行所述体外培养，以便获得癌类器官。
发明人在实验过程中发现，控制剪切处理后癌组织的大小为1～2mm3，可使癌组织彻底消化；消化过程中采用组合消化酶(胶原酶type I和Dispase酶)进行消化，可进一步提高酶解获得的肿瘤细胞的个数，同时保持细胞的高活力；同时控制癌细胞在基质胶中的浓度为500～1500/10μL，一方面类器官不至于相互接触影响彼此生长，另一方面癌细胞还能通过自分泌维持类器官良好的生长。
根据本发明实施例的上述获得癌细胞的方法，提高了癌组织的酶解效率和类器官的传代培养的成功率，能实现类器官长期培养并建立生物样本库。
根据本发明的实施例，所述组合消化酶是以酶溶液的形式提供的，所述胶原酶type I在所述酶溶液中的浓度为75u/mL，所述Dispase酶在所述酶溶液中的浓度为0.6u/mL。
根据本发明的实施例，所述癌组织与所述酶溶液的体积比为(1～2mL)：(5～6mL)。进而进一步提高酶解效率，提高酶的利用率。
根据本发明的实施例，所述消化处理是通过如下方式进行的：(1)将剪切处理后癌组织与组合消化酶在37℃的条件下进行第一消化处理，所述第一消化处理的时间为13～17分钟；(2)更换组合消化酶，将经过第一消化处理的癌组织与新鲜组合消化酶进行第二消化处理，所述第二消化处理是在37℃的条件下进行13～17分钟；(3)重复步骤(2)2～4次，以便获得癌细胞。通过上述消化处理方式，可将大部分癌组织消化为单细胞，并且不会造成过度消化，有效维持了癌细胞的细胞活力。
根据本发明的实施例，所述消化处理后，重悬处理前，进一步包括将所述癌细胞进行清洗处理。进而可将消化下的除细胞之外的其他成分清洗掉，进一步提高后续酶解效率。
根据本发明的实施例，所述清洗处理是在HBSS缓冲液中进行的。
根据本发明的实施例，利用HBSS缓冲液对所述癌细胞进行3～4遍清洗处理。
根据本发明的实施例，进行点板处理前，进一步包括将点板处理用的枪头进行预冷处。需要说明的是，所述“点板处理”是指用带有枪头的移液枪将细胞接种到细胞培养板中。将枪头进行预冷处理，可使细胞保持在约4℃的低温环境中，保持癌细胞活力。
根据本发明的实施例，所述点板处理是通过如下方式进行的：利用预冷枪头将所述癌细胞悬液点接在24孔板中，每孔点接4滴，每滴10μL；将点接有癌细胞悬液的24孔板置于37℃的培养箱中静置30min。进而可使癌细胞在适当的密度下充分贴壁和生长。
根据本发明的实施例，进一步包括将24孔板中的基质胶更换为细胞培养基，所述细胞培养基预先进行37℃遇热处理。进而可使细胞培养过程中，一直处于37℃的环境下，不会造成细胞预冷收缩，保持细胞状态。
根据本发明的实施例，将点板处理后的癌细胞进行培养6～7天后，进一步将所获得的癌类组织进行传代、冻存或复苏处理。进而建立相应的生物样本库。
根据本发明的实施例，所述癌组织样本预先经过清洗处理。
根据本发明的实施例，所述清洗处理是通过如下方式进行的：将新鲜肿瘤样本在清洗缓冲液中进行第一清洗处理；将第一清洗处理后的样本进行剔除处理，以便去除脂肪、血液、坏死以及间质含量大于20％的组织；以及将剔除处理后组织进行第二清洗处理。根据本发明实施例的上述清洗处理方式有效降低了肿瘤样本培养后的微生物污染的概率，提高了肿瘤样本的培养成功率，且方法中选择剔除脂肪、血液、坏死以及间质含量大于20％的组织，对剔除标准进行了严格限定，一方面可以去除部分污染，另一方面使得第二清洗更加彻底有效，也大大提高了获得肿瘤细胞含量较多的组织部位，提高了后续酶解效率以及增加了后续肿瘤细胞培养成功的克隆数。
根据本发明的实施例，所述第一清洗处理是在清洗缓冲液2～4中进行的，所述清洗缓冲液2为包含体积分数为75％的无水乙醇的HBSS缓冲液，所述清洗缓冲液3为包含体积分数为3％的乙酸HBSS缓冲液，所述清洗缓冲液4为包含浓度为1000单位/mL的青霉素、浓度为1000μg/mL的链霉素以及浓度为2.5μg/mL的两性霉素B的HBSS缓冲液。
根据本发明的实施例，所述第一清洗处理是通过如下方式进行的：将所述新鲜肿瘤样本在清洗缓冲液4中清洗2或3遍，每遍4～6分钟；将经过清洗缓冲液4清洗的肿瘤样本在清洗缓冲液2中清洗2～4分钟；将经过清洗缓冲液2清洗的肿瘤样本在清洗缓冲液3中清洗2～4分钟。
发明人发现，使用清洗缓冲液4清洗新鲜肿瘤样本，可以有效去除和抑制肿瘤样本表面携带的各种细菌和真菌，现有技术中使用的添加了100单位/mL的青霉素和100μg/mL链霉素的双抗的细胞清洗液，用在类器官的培养中，真菌污染导致失败的概率很高，而本申请的方法采用的清洗缓冲液4，增加了两性霉素B来进行抗真菌的处理，同时使用10倍浓度的青霉素以及链霉素，对存在的细菌真菌污染进行冲击法处理，在保证组织细胞活性的前提下，最大限度地降低了类器官的污染概率。
本申请的方法中，发明人创造性的采用了含有乙醇体积分数为75％的HBSS缓冲液2进行组织样本的清洗，有效杀灭了样本携带的细菌真菌，本领域技术人员常规所了解的是，75％乙醇会对细胞的产生伤害作用，因此75％乙醇不会用来处理原代组织，而本申请的发明人发现，采用清洗缓冲液2短时间(2～4分钟)处理肿瘤样本，不仅可以有效的杀灭样本表面的细菌和真菌，同时仍可以保留细胞活性，实现后续的培养。
含有乙酸体积分数为3％的HBSS缓冲溶液3现有技术中主要用于尖锐湿疣、尖锐湿疣亚临床表现或HPV潜伏感染的试验方法。而本申请的发明人发现，使用清洗缓冲液3处理原代肿瘤样本，可以一定程度地抑制真菌的生长，降低样本后续培养发生真菌污染的概率。
根据本发明的实施例，所述第二清洗处理是在清洗缓冲液1～5中进行的，所述清洗缓冲液1包含浓度为100单位/mL的青霉素，浓度为100μg/mL的链霉素以及浓度为0.25μg/mL两性霉素B的HBSS缓冲液，所述清洗缓冲液5为包含体积分数为1％的FBS的HBSS缓冲液。
根据本发明的实施例，所述第二清洗处理是通过如下方式进行的：将剔除处理后组织在清洗缓冲液1中清洗5或6遍，每遍4～6分钟；将经过清洗缓冲液1清洗的组织在清洗缓冲液2中清洗2～4分钟；将经过清洗缓冲液2清洗的组织在清洗缓冲液3中清洗2～4分钟；将经过清洗缓冲液3清洗的组织在清洗缓冲液4中、在4℃的条件下浸泡28～32分钟；以及将经过清洗缓冲液4浸泡的组织在清洗缓冲液5中清洗5或6遍，每遍4～6分钟。发明人发现，将剔除处理后组织首先在含有青霉素浓度为100单位/mL，链霉素浓度为100μg/mL以及0.25μg/mL两性霉素B的HBSS缓冲液1中进行清洗，可以进一步清洗并抑制样本携带的细菌和真菌，进而陆续在清洗缓冲液2、3、4进行清洗，最后在含有1％FBS的HBSS缓冲液5中进行清洗，可通过多次清洗，降低污染概率，维持细胞活性。
根据本发明的实施例，所述新鲜肿瘤样本预先保存在转移缓冲液中，所述转移缓冲液为Advanced DMEM/F-12K培养基，所述转移缓冲液含有包含15mM HEPEs、100μM甘氨酸、100μM L-丙氨酸，100μM L-天冬酰胺、100μM L-天冬氨酸、100μM L-谷氨基酸、100μM L-脯氨酸以及100μM L-丝氨酸。根据本发明实施例的转移缓冲液采用了高浓度HEPEs，在保证细胞活性的前提下，有效提高了转移缓冲液的缓冲能力。
根据本发明的实施例，所述新鲜肿瘤样本预先保存在4～8℃的条件下。
发明人发现，采用上述清洗处理方式，可大大降低样本培养过程中的污染概率，可长久保持组织样本的活力。
根据本发明的实施例，所述癌组织样本为结肠腺癌组织样本。根据本发明实施例的癌类器官的体外培养方法，提高了结肠腺癌组织的酶解效率和类器官的传代培养的成功率，能实现结肠腺癌类器官长期培养并建立生物样本库。
附图说明
图1是根据本发明实施例的检测不同培养基条件下对类器官生长的影响的结果图；
图2是根据本发明实施例的胃癌类器官培养结果；
图3是根据本发明实施例的直肠癌类器官培养结果；
图4是根据本发明实施例的肺癌类器官培养结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
根据本发明的实施例，利用本发明所提出的培养基进行类器官的体外培养，可进行如下操作：
1、获得肿瘤样本之后，使用剪刀进行初步的剔除，然后使用5种不同的washBuffer进行清洗预处理，该过程有效的去除样本所携带的微生物，降低样本培养过程中的污染概率。
其中，Wash Buffer 1为包含浓度为100单位/mL的青霉素，浓度为100μg/mL的链霉素以及浓度为0.25μg/mL两性霉素B的HBSS缓冲溶液；Wash Buffer 2为包含体积分数为75％的无水乙醇的HBSS缓冲溶液；Wash Buffer 3为包含体积分数为3％的乙酸的HBSS缓冲溶液；Wash Buffer 4为包含浓度为1000单位/mL的青霉素、浓度为1000μg/mL的链霉素以及浓度为2.5μg/mL的两性霉素B的HBSS缓冲溶液；Wash Buffer 5为包含体积分数为1％的FBS的HBSS缓冲溶液。
2、随后，将清洗后的样本剪成1-2mm3大小的组织块，使用75u/mL胶原酶type I和0.6u/mL Dispase酶解液在37℃条件下消化上述组织块，同时每个15分钟在镜下观察酶解状态，及时收集并更换新的酶解液，防止过度消化，维持收集后的细胞活力。
3、基质胶和枪头4℃预冷，培养基37℃预热。将收集的细胞使用合适体积的基质胶混悬均匀，使用枪头点板，放置在37℃培养箱中，30分钟后，加入相应的培养基300μL。该培养基是在DMEM/F-12K基础培养基的基础上添加了HEPES 8～12mM，L-Glutamine 1～4mM，EGF 48～52ng/mL，Noggin 95～105ng/mL，A83-01 0.3～0.7μM，Y276328～12μM的普适性培养基，可实现肺癌，胃癌以及直肠癌等类器官的快速生长。
下面将详细描述本发明的具体实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1培养基成分的优化实验
本次方案中，采用结肠腺癌类器官样本，分别考察了现有技术培养基常见组分对类器官生长的影响。
具体方案如下：将类器官计数，按照每10μL/50个类器官的浓度，使用Matrigel重悬类器官，种96孔板内，10μL/well，种板后分别使用减去不同单一组分的培养基进行培养，培养5天后，记录生长图片以及定量检测不同培养基条件下对类器官生长的影响。
结果如图1所示，CM代表完全培养基(包括10mM HEPES，2mM L-Glutamine，50ng/mLEGF，100ng/mLNoggin，500ng/mLR-Spondin 1，100ng/mLWNT-3A，10ng/mL FGF-10，0.5μMA83-01，5uM SB202190，4mM Nicotinamide以及10μM Y27632的DMEM/F-12K培养基)；X(—)代表去除培养基单一组分。结果发现，Noggin，A83-01，EGF以及Y27632组分对类器官生长具有促进作用，缺失后明显影响类器官增殖，Wnt-3A，R-spondin 1以及Nicotinamide的缺失基本上没有影响类器官的增殖，SB202190组分的缺失反而促进了类器官的增殖。根据筛选结果，申请人去除了Wnt-3A，R-spondin 1，Nicotinamide以及SB202190组分，使用优化后的培养基进行以下实施例所述的类器官培养。
实施例2
在本次方案中，采用胃癌骨转移病人的样本，使用实施例1所优化获得的培养基进行培养。
将肿瘤样本(该肿瘤样本可来自病人手术或者穿刺之后取下的肿瘤样本，属于医疗废弃物)十分钟内转移至含有转移缓冲液(transfer Buffer)的离心管中，放入含有冰盒的生物样本转运箱中(保持温度4～8℃)，同时样本转运箱中的冰盒可长时间维持在4～8℃，在此条件下可以维持样本的生物活性长达4天。
其中，transfer Buffer为包含15mM HEPEs、100μM甘氨酸、100μM L-丙氨酸，100μML-天冬酰胺、100μM L-天冬氨酸、100μM L-谷氨基酸、100μM L-脯氨酸以及100μM L-丝氨酸的Advanced DMEM/F-12K培养基。
样本预处理：本次样本为胃癌骨转移手术样本，样本大小约为2cm3。使用上述方法以及清洗液进行样本预处理。
即样本进行以下5步清洗处理，(1)Wash Buffer 4，清洗2遍，每遍5分钟(2)WashBuffer 2清洗3分钟。(3)Wash Buffer 3清洗3分钟。(4)眼科剪剔除脂肪，血液，坏死以及间质含量大于20％的部位(5)Wash Buffer1～5分别清洗。
其中，Wash Buffer 1为包含浓度为100单位/mL的青霉素，浓度为100μg/mL的链霉素以及浓度为0.25μg/mL两性霉素B的HBSS缓冲溶液；Wash Buffer 2为包含体积分数为75％的无水乙醇的HBSS缓冲溶液；Wash Buffer 3为包含体积分数为3％的乙酸的HBSS缓冲溶液；Wash Buffer 4为包含浓度为1000单位/mL的青霉素、浓度为1000μg/mL的链霉素以及浓度为2.5μg/mL的两性霉素B的HBSS缓冲溶液；Wash Buffer 5为包含体积分数为1％的FBS的HBSS缓冲溶液。
酶解：然后用剪刀剪成1-2mm3的组织块，加入5mL75u/mL胶原酶type I和0.6u/mLDispase组合酶的酶解液，处理15分钟后，镜下观察酶解情况，然后收集酶解液并更换新的酶解液，继续酶解过程，重复操作4次，全部组织消化完成，然后将收集到的细胞液离心，HBSS缓冲液清洗3遍，在显微镜下取3个10μl液滴计数，按照计数结果加入200μL基质胶进行重悬，维持细胞浓度在500～1500细胞/10μl；
培养：将上述悬液通过预冷的枪头点在24孔细胞培养板中，4滴/孔，10μL/孔。点板之后，将培养板放入37℃培养箱中，30分钟后加入相应培养基(包括HEPES 10mM，L-Glutamine 2mM，EGF 50ng/mL，10ng/mL FGF-10，Noggin 100ng/mL,A83-01 0.5μM，Y2763210μM的DMEM/F-12K培养基)，300μL/孔。培养过程中，每3天更换培养基，观察类器官生长状态并拍照记录。分别在培养第3天，第5天以及第6天后观察类器官生长状态并拍照记录，结果如图2所示。
实施例3
在本次方案中，采用直肠癌病人的样本，使用上述培养方法进行培养。
具体过程参考实施例2。分别在培养第1天，第4天以及第6天时拍照记录类器官生长状态，结果如图3所示。
实施例4
在本次方案中，采用肺癌病人的样本，使用上述培养方法进行培养。
具体过程参考实施例2。分别在培养第0天，第9天以及第16天时拍照记录类器官生长状态，结果如图4所示。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (5)
1.一种培养基，其特征在于，由DMEM/F-12K基础培养基以及添加因子组成，所述添加因子由HEPES、L-Glutamine、EGF、Noggin、FGF-10、A83-01和Y27632组成。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述添加因子在所述培养基中的浓度分别为：HEPES 8～12mM、L-Glutamine 1～4mM、EGF 48～52ng/mL、Noggin 95～105ng/mL、FGF-10 8～12ng/mL、A83-01 0.3～0.7μM和Y27632 8～12μM。
3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述添加因子在所述培养基中的浓度分别为：HEPES 10mM、L-Glutamine 2mM、EGF 50ng/mL、Noggin 100ng/mL、FGF-1010ng/mL、A83-01 0.5μM和Y27632 10μM。
4.一种癌类器官的体外培养方法，其特征在于，将癌细胞进行体外培养，所述体外培养是在权利要求1～3任一项所述的培养基中进行的。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述癌细胞为肠腺癌、胃癌、直肠癌或肺癌细胞。
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| CN110734894A (zh) | 2020-01-31 |
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