CN113812400A - 一种构建脐带间充质干细胞库用冻存保护液及细胞库的构建方法 - Google Patents

一种构建脐带间充质干细胞库用冻存保护液及细胞库的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种构建脐带间充质干细胞库用冻存保存液，包括培养基和添加在培养基中以下成分：腺苷、卡瓦胡椒内酯、镰叶芹二醇、丙酸钾、羟乙基淀粉注射液、硫辛酸、维生素E、L‑谷氨酰胺。本发明提供的冻存保存液中不添加DMSO和动物血清，成分安全，各成分协同作用，减少在降温以及冻存过程中对细胞造成的损害，保证细胞库中的细胞在应用时具有较好的活性。本发明还提供了一种脐带间充质干细胞库的建立方法，采用本发明的冻存保护液，使细胞库中的细胞在经冻存后仍具有较好的增殖活性，保证在科研或者临床应用的效果。

Description

一种构建脐带间充质干细胞库用冻存保护液及细胞库的构建 方法
技术领域
本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种脐带间充质干细胞库用冻存保护液及细胞库的构建方法。
背景技术
脐带间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。脐带间充质干细胞（MSCs）具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。有报道从人脐带中分离出MSCs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。
脐带间充质干细胞具有较强的免疫调节作用，可用于治疗红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病，降低细胞或器官移植后的免疫排斥反应，提高细胞或器官移植的成功率。能促进造血恢复功能，与单一造血干细胞移植比较，间充质干细胞和造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等疾病的治疗效果。能修复损伤或病变的组织器官，用于治疗骨和肌肉衰退性疾病、心脑血管疾病、肝病、脑及脊髓神经损伤和老年痴呆等。
为了保证脐带间充质干细胞的应用，需要建立细胞库保存一定数量的细胞。细胞库的构建过程中，培养得到的细胞需要经过降温过程保存在超低温的液氮中，在使用时进行复苏，但是该过程由于经历降温至超低温过程和复温过程，会对细胞活性造成损伤，导致细胞活率下降，增殖及分化能力变差，影响后续细胞库中细胞的应用，因此如何保证细胞库中的细胞在经过超低温保存后仍具有较好的质量显得尤为重要。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种构建脐带间充质干细胞库用冻存保护液，提高细胞库中细胞的复苏率，保证经超低温保存后的脐带间充质干细胞的活率以及增殖活性。
本发明的目的之二在于提供一种脐带间充质干细胞库的构建方法。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种构建脐带间充质干细胞库用冻存保存液，包括培养基和添加在培养基中以下成分：腺苷、卡瓦胡椒内酯、镰叶芹二醇、丙酸钾、羟乙基淀粉注射液、硫辛酸、维生素E、 L-谷氨酰胺。
进一步地，所述培养基为DMEM低糖培养基。
进一步地，各成分在培养基中的终浓度为：腺苷1-5μg/mL、卡瓦胡椒内酯9-12.5ng/mL、镰叶芹二醇10-15 ng/mL、丙酸钾5-10μg/mL、羟乙基淀粉注射液10-15μg/mL、硫辛酸0.5-0.8 μg/mL、维生素E 3.5-5μg/mL、L-谷氨酰胺6.5-8.5μg/mL。
进一步地，各成分在培养基中的终浓度为：腺苷3μg/mL、卡瓦胡椒内酯10.5ng/mL、镰叶芹二醇12ng/mL、丙酸钾8μg/mL、羟乙基淀粉注射液12.5μg/mL、硫辛酸0.7 μg/mL、维生素E 4μg/mL、L-谷氨酰胺7μg/mL。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种脐带间充质干细胞库的构建方法，采用上述的冻存保护液。
进一步地，所述脐带间充质干细胞库的构建方法，包括以下步骤：取传代培养得到的脐带间充质干细胞，经检测合格后离心去除培养基，加入上述冻存保护液重悬，分装于冻存管中，然后进行程序降温，转移至液氮中冷冻保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建得到脐带间充质干细胞库。
进一步地，程序降温的过程为：先以1-2℃/min降温至-20℃，然后再以5℃/min降温至-80℃，最后转移至液氮中保存。
进一步地，所述脐带间充质干细胞为传代培养得到的P3-P5代脐带间充质干细胞。
进一步地，每个冻存管中分装2-3mL冻存保护液，所述冻存保护液中细胞的密度为2-7×107个/mL。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种构建脐带间充质干细胞库用冻存保存液，该保存液中不添加DMSO和动物血清，成分安全。保存液中的卡瓦胡椒内酯和镰叶芹二醇可以在降温过程中稳定细胞，避免因外部环境的改变细胞凋亡，提高细胞在低温冻存环境下的生存能力，降低低温冻存过程对细胞活性损伤。丙酸钾和羟乙基淀粉注射液一起维护细胞膜外的渗透压，防止细胞膜表面的蛋白变性，避免细胞因细胞外渗透压的改变导致内部结构紊乱引起细胞凋亡。本发明的保护液中还添加硫辛酸和维生素E清除过量的自由基，有助于细胞保持活性。
本发明还提供了一种脐带间充质干细胞库的建立方法，采用本发明的冻存保护液，使细胞库中的细胞在经冻存后仍具有较好的增殖活性，保证在科研或者临床应用的效果。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
本发明实施例1至3中构建细胞库所用细胞通过以下方法制备得到：
（1）收集健康婴儿的脐带登记个人信息，用PBS清洗脐带组织3次后，剔除血管，剥离出华氏胶组织，用手术剪剪成1-2mm3大小，加入含有10%FBS的DMEM/F12培养基，在37℃，5%CO2的培养箱中培养，待组织块周边细胞融合度达到80%后，加入0.25%的胰蛋白酶进行消化，离心后收集细胞记为P0代；
（2）将步骤（1）收集的P0代细胞以2×105个/mL接种在T75培养瓶中进行传代培养，传代比例为1:3，收集P3-P5细胞，经检测合格后作为建库细胞。
实施例1
一种构建脐带间充质干细胞库用冻存保存液，由DMEM低糖培养基和添加在培养基中以下成分组成：腺苷3μg/mL、卡瓦胡椒内酯10.5ng/mL、镰叶芹二醇12ng/mL、丙酸钾8μg/mL、羟乙基淀粉注射液12.5μg/mL、硫辛酸0.7 μg/mL、维生素E 4μg/mL、L-谷氨酰胺7μg/mL。
一种脐带间充质干细胞库的构建方法，取检测合格的传代培养得到的P3代脐带间充质干细胞，离心去除培养基，加入上述冻存保护液重悬，冻存保护液中细胞的密度为5×107个/mL，分装于冻存管中，每个冻存管中分装2-3mL冻存保护液，然后进行程序降温，程序降温的过程为：先以1℃/min降温至-20℃，然后再以5℃/min降温至-80℃，最后转移至液氮中保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建得到脐带间充质干细胞库。
实施例2
一种构建脐带间充质干细胞库用冻存保存液，由DMEM低糖培养基和添加在培养基中以下成分组成：腺苷1μg/mL、卡瓦胡椒内酯9ng/mL、镰叶芹二醇10 ng/mL、丙酸钾5μg/mL、羟乙基淀粉注射液10μg/mL、硫辛酸0.5 μg/mL、维生素E 3.5μg/mL、L-谷氨酰胺6.5μg/mL。
一种脐带间充质干细胞库的构建方法，取检测合格的传代培养得到的P4代脐带间充质干细胞，离心去除培养基，加入上述冻存保护液重悬，冻存保护液中细胞的密度为2×107个/mL，分装于冻存管中，每个冻存管中分装2-3mL冻存保护液，然后进行程序降温，程序降温的过程为：先以2℃/min降温至-20℃，然后再以5℃/min降温至-80℃，最后转移至液氮中保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建得到脐带间充质干细胞库。
实施例3
一种构建脐带间充质干细胞库用冻存保存液，由DMEM低糖培养基和添加在培养基中以下成分组成：腺苷5μg/mL、卡瓦胡椒内酯12.5ng/mL、镰叶芹二醇15 ng/mL、丙酸钾10μg/mL、羟乙基淀粉注射液15μg/mL、硫辛酸0.8 μg/mL、维生素E 5μg/mL、L-谷氨酰胺8.5μg/mL。
一种脐带间充质干细胞库的构建方法，取检测合格的传代培养得到的P5代脐带间充质干细胞，离心去除培养基，加入上述冻存保护液重悬，冻存保护液中细胞的密度为7×107个/mL，分装于冻存管中，每个冻存管中分装2-3mL冻存保护液，然后进行程序降温，程序降温的过程为：先以1℃/min降温至-20℃，然后再以5℃/min降温至-80℃，最后转移至液氮中保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建得到脐带间充质干细胞库。
对比例1
对比例1提供一种构建脐带间充质干细胞库用冻存保存液，和实施例1的区别为：省去卡瓦胡椒内酯，其余均和实施例1相同。
对比例2
对比例2提供一种构建脐带间充质干细胞库用冻存保存液，和实施例1的区别为：省去镰叶芹二醇，其余均和实施例1相同。
对比例3
对比例3提供一种构建脐带间充质干细胞库用冻存保存液，和实施例1的区别为：省去卡瓦胡椒内酯，将镰叶芹二醇的用量调整为22.5 ng/mL，其余均和实施例1相同。
对比例4
对比例4提供一种构建脐带间充质干细胞库用冻存保存液，和实施例1的区别为：省去镰叶芹二醇，将卡瓦胡椒内酯的用量调整为22.5 ng/mL，其余均和实施例1相同。
对比例5
对比例5提供一种构建脐带间充质干细胞库用冻存保存液，和实施例1的区别为：省去丙酸钾，将羟乙基淀粉注射液的用量调整为20.5 μg/mL，其余均和实施例1相同。
对比例6
对比例6提供一种构建脐带间充质干细胞库用冻存保存液，和实施例1的区别为：省去羟乙基淀粉注射液，将丙酸钾的用量调整为20.5 μg/mL，其余均和实施例1相同。
用台盼兰染色法统计实施例1至3、对比例1至6中的脐带间充质干细胞在液氮中分别冻存1个月、3个月和6个月后的细胞活率，每次取三个冻存管复苏，结果取平均值。结果如表1所示。
表1
样品 冻存前细胞活率（%） 冻存1个月活率（%） 冻存3个月活率（%） 冻存6个月活率（%）
实施例1 99.08 95.27 93.44 90.59
实施例2 98.87 94.51 92.32 89.90
实施例3 98.91 94.46 92.09 89.71
对比例1 98.92 70.58 66.72 61.83
对比例2 99.04 72.39 68.54 63.37
对比例3 98.76 74.33 71.94 65.29
对比例4 99.11 78.94 74.25 69.73
对比例5 98.85 83.29 79.22 75.94
对比例6 99.01 85.61 82.39 78.67
由表1可以看出实施例1至3中细胞库中的脐带间充质干细胞经复苏后细胞活率较高，实施例1至6中分别调整了冻存保护液的成分，经冻存后的细胞活率均有不同程度的下降。
对比例1至4中分别省去卡瓦胡椒内酯和镰叶芹二醇中的一种，无论是否调整剩余成分的用量，将保护液用于细胞库的构建时，细胞的活率均有显著的下降，这是因为本发明的冻存保护液中通过添加卡瓦胡椒内酯和镰叶芹二醇可以在降温过程中稳定细胞，避免因外部环境的改变细胞凋亡，提高细胞在低温冻存环境下的生存能力，降低低温冻存过程对细胞活性损伤，提高细胞的活率。
对比例5至6中分别省去丙酸钾和羟乙基淀粉注射液中一种，并调整剩余成分的用量后，细胞的活率均有不同程度的下降，这是因为丙酸钾和羟乙基淀粉注射液一起维护细胞膜外的渗透压，防止细胞膜表面的蛋白变性，避免细胞因细胞外渗透压的改变导致内部结构紊乱引起细胞凋亡，提高细胞复苏的活率。
分别取实施例1，对比例1至6中在液氮中保存3个月后的细胞，经复苏后离心去除保护液，加入完全培养基（含10%FBS的DMEM/F12）中重悬，细胞密度为1×104个/mL，对比例7为未经冻存的P3代脐带间充质干细胞，接种在12孔板中，每组3孔，培养7d时用台盼兰染色进行细胞计数，取3孔的平均值，结果取表2所示。
表2
组别 脐带间充质干细胞数量（×10<sup>4</sup>个）
实施例1 34.22
对比例1 22.68
对比例2 24.18
对比例3 27.41
对比例4 29.99
对比例5 31.05
对比例6 32.54
对比例7 35.83
由表2可以看出：和对比例1至6相比，实施例1中的脐带间充质干细胞的增殖活性最好。实施例1和对比例7中未经冻存的脐带间充质干细胞增殖活性相差不大。对比例1至6中扩增得到的细胞数量低于实施例1，这是因为对比例1至6中调整了保护液的组成，经冻存的脐带间充质干细胞增殖活性均有不同程度的下降。说明本发明的保护液中各成分协同作用，减少在降温以及冻存过程中对细胞造成的损害，保证细胞库中的细胞在应用时具有较好的活性。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (9)

1. 一种构建脐带间充质干细胞库用冻存保存液，其特征在于，包括培养基和添加在培养基中以下成分：腺苷、卡瓦胡椒内酯、镰叶芹二醇、丙酸钾、羟乙基淀粉注射液、硫辛酸、维生素E、 L-谷氨酰胺。
2.根据权利要求1所述构建脐带间充质干细胞库用冻存保存液，其特征在于，所述培养基为DMEM低糖培养基。
3. 根据权利要求1所述构建脐带间充质干细胞库用冻存保存液，其特征在于，各成分在培养基中的终浓度为：腺苷1-5μg/mL、卡瓦胡椒内酯9-12.5ng/mL、镰叶芹二醇10-15 ng/mL、丙酸钾5-10μg/mL、羟乙基淀粉注射液10-15μg/mL、硫辛酸0.5-0.8 μg/mL、维生素E3.5-5μg/mL、L-谷氨酰胺6.5-8.5μg/mL。
4.根据权利要求1所述构建脐带间充质干细胞库用冻存保存液，其特征在于，各成分在培养基中的终浓度为：腺苷3μg/mL、卡瓦胡椒内酯10.5ng/mL、镰叶芹二醇12ng/mL、丙酸钾8μg/mL、羟乙基淀粉注射液12.5μg/mL、硫辛酸0.7 μg/mL、维生素E 4μg/mL、L-谷氨酰胺7μg/mL。
5.一种脐带间充质干细胞库的构建方法，其特征在于，采用权利要求1至4任一项所述的冻存保护液。
6.根据权利要求5所述脐带间充质干细胞库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：取传代培养得到的脐带间充质干细胞，经检测合格后离心去除培养基，加入权利要求1至5任一项所述冻存保护液重悬，分装于冻存管中，然后进行程序降温，转移至液氮中冷冻保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建得到脐带间充质干细胞库。
7.根据权利要求5所述脐带间充质干细胞库的构建方法，其特征在于，程序降温的过程为：先以1-2℃/min降温至-20℃，然后再以5℃/min降温至-80℃，最后转移至液氮中保存。
8.根据权利要求5所述脐带间充质干细胞库的构建方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞为传代培养得到的P3-P5代脐带间充质干细胞。
9.根据权利要求5所述脐带间充质干细胞库的构建方法，其特征在于，每个冻存管中分装2-3mL冻存保护液，所述冻存保护液中细胞的密度为2-7×107个/mL。
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