CN109609443A - 一种小鼠肝脏原代细胞培养基、培养方法及培养箱 - Google Patents

一种小鼠肝脏原代细胞培养基、培养方法及培养箱 Download PDF

Info

Publication number
CN109609443A
CN109609443A CN201910032156.0A CN201910032156A CN109609443A CN 109609443 A CN109609443 A CN 109609443A CN 201910032156 A CN201910032156 A CN 201910032156A CN 109609443 A CN109609443 A CN 109609443A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
mouse liver
cell culture
culture
liver
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910032156.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109609443B (zh
Inventor
江泉
李欣伦
祝加和
金治全
许冉
潘珍珍
孟婉冰
李超
李秋圆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yinhai Shanghai Saint Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Yinhai Shanghai Saint Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yinhai Shanghai Saint Biotechnology Co Ltd filed Critical Yinhai Shanghai Saint Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201910032156.0A priority Critical patent/CN109609443B/zh
Publication of CN109609443A publication Critical patent/CN109609443A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109609443B publication Critical patent/CN109609443B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/10—Petri dish
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/48—Holding appliances; Racks; Supports
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种小鼠肝脏原代细胞培养基及培养方法，培养基配方为：William’s E培养基，牛血清白蛋白，胰岛素，和地塞米松，L‑谷氨酰胺，青霉素，链霉素。培养方法为：使用所述小鼠肝脏原代细胞培养基进行小鼠肝脏原代细胞的培养。本发明的培养基完全可以满足原代肝脏细胞的生长需求，细胞生长状态良好，且培养基配制简单，成本低，具有快速、经济、高效的优点。本发明的培养方法在所有阶段均未使用胎牛血清，避免了血清的复杂成分对小鼠原代肝脏细胞造成的影响。本发明还提供了一种改进的细胞培养箱。

Description

一种小鼠肝脏原代细胞培养基、培养方法及培养箱
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种小鼠肝脏原代细胞培养基、培养方法及培养方法中使用到的培养箱。
背景技术
来源于肝脏经特殊分离方法制备而来的原初培养的肝脏细胞称之为原代肝细胞。将小鼠的肝脏从机体中取出，经胰酶、螯合剂(常用EDTA)处理，分散成单细胞，用肝脏组织制备的细胞以肝细胞为主，但是还有胆管上皮细胞，星形细胞，肝血窦内皮细胞，血细胞等需要清除，通过一定大小的网筛筛选，合适的转速离心，同时置于合适的培养基中培养筛选，最终才能获得高纯度的肝细胞。
高纯度的肝脏原代细胞在研究肝脏的生物学实验中使用非常广泛，是肝脏分子生物学研究中的重要工具细胞，因此研发一个性价比高，使用效果好的原代肝脏细胞培养基具有重要的意义。
现有的肝脏原代细胞的培养基主要是购买国外品牌赛默飞世尔科技旗下的HepatoZYME-SFM无血清培养基，此外添加胎牛血清等维持原代肝脏细胞的生长和性能。例如《热带医学杂志》2008年第10期论文“改良原代大鼠肝细胞的体外分离培养和功能研究”使用含有胎牛血清的HepatoZYME-SFM培养原代大鼠肝细胞；《世界华人消化杂志》2011年第19期论文“成人原代肝细胞的分离、培养及冻存”使用含胎牛血清和DMSO的HepatoZYME-SFM培养成人原代肝细胞。
现存在的问题：HepatoZYME-SFM无血清培养基货品价格昂贵且用量很大，在肝脏原代细胞的培养中造成了很多的不便。而且胎牛血清成分复杂，对原代细胞的生长具有许多不确定的影响因素，尤其是胎牛血清中高含量的内毒素、多胺氧化酶和血清中所含的抗体、补体以及可能含有的支原体、病毒等对原代肝脏细胞的生长具有毒害作用。此外胎牛血清中含有的成份、含量及其作用机制仍不清楚，尤其是其中的一些多肽类生长因子、激素和脂类的对细胞的影响尚未充分认识，此外其中含有的众多激素可诱导小鼠原代肝脏细胞的异形性分化，导致小鼠原代肝脏细胞的性状改变，从而使获得高标准的肝脏原代细胞受到限制。
《癌变·畸变·突变》2016年第28期论文“原代小鼠肝细胞培养方法的比较”比较了3种不同培养条件下原代小鼠肝细胞的形态以及肝细胞功能，寻找适合于原代小鼠肝细胞体外培养的培养基配方。具体的小鼠原代肝细胞培养方法为：小鼠原代肝细胞以1.0×105/cm2的细胞密度接种于包被有鼠尾胶原的培养板内，使用贴壁培养基(William’s E培养基、体积分数为10％的胎牛血清、1μmol/L地塞米松、4μg/mL牛胰岛素、2mmol/L L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素、100μg/mL链霉素，15mmol/L HEPES)在37摄氏度，体积分数为5％的CO2培养箱内培养4小时后，将培养基吸出，铺上层胶原，形成三明治结构，2小时后分为3组分别加入不同的无血清培养基来维持肝细胞生长。3组的培养基分别为基础培养基、基础培养基加DMSO(DMSO组)、基础培养基加DMSO和EGF(DMSO+EGF组)，其中基础培养基为：William’s E培养基、0.1μmol/L地塞米松、4μg/mL牛胰岛素、2mmol/L L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素、100μg/mL链霉素，15mmol/L HEPES，结果表明小鼠原代肝细胞培养基中加入DMSO对于维持肝细胞的形态和功能有促进作用。
专利CN102643778A，2012.08.22，公开了一种畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法，将螯合法与原位两步灌流法进行整合，预先脱去畜禽肝脏组织内Ca2+与Mg2+，使之尽量多地释放出原代肝细胞，通过调整培养液的添加物配方，完善其无血清培养体系，并就所获原代肝细胞进行糖原鉴定。其中畜禽原代肝细胞的具体培养方法为：细胞计数后，用贴壁培养液将细胞悬液稀释为2～5×105/ml，在直径为60ml的培养瓶中接种15ml，接种密度为1×105/cm2，在37摄氏度、5％CO2和饱和湿度的条件下培养，4小时细胞贴壁后，用生长培养液全量换液，该生长培养液中含体积百分比为10％的新生牛血清及双抗的基础培养液继续培养20小时。此后，用无血清培养液、10μg/ml维生素C、0.15％BSA和双抗的Williams’mediumE基础培养液)全量换液，该无血清培养液中含5×10-7M地塞米松、1×SITE(这是(insulin,transferrin,selenium,ethanolamine)的缩写，Sigma-Aldrich-Aldrich公司，含10μg/ml牛胰岛素、5.5μg/ml人转铁蛋白、2.9×10-8M亚硒酸钠、2μg/ml乙醇胺)，以后每24小时更换培养液，倒置显微镜下观察肝细胞形态及生长情况。
但目前还未见不使用胎牛血清对小鼠肝脏原代细胞进行培养，且能够保证细胞生长状态良好的培养基和培养方法。
同时，在进行细胞培养时，培养箱的方便使用也有利于细胞培养的顺利进行，当前现有的生物细胞培养箱只能放置固定高度的培养皿或培养瓶，适用范围有限，比如专利CN203462058U，2014.03.05，公开了一种生物细胞培养装置，该生物细胞培养装置可以利用立柱上的可拆卸的卡合箍，使用者可以随意调节卡合箍之间的间距，可以放置任何制尺寸的培养瓶或培养皿，但在实际使用过程中，由于该装置不便于实验操作人员对培养基或培养皿放置和取出，容易发生碰撞，导致培养皿受损或受污染等情况，需要对该装置进行改进，因此本发明也提出一种改进的细胞培养箱用于解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种小鼠肝脏原代细胞培养基及培养方法。
所述小鼠肝脏原代细胞培养基，配方为：William’s E培养基，0.9％-1.1％牛血清白蛋白，0.9-1.1nmol/L胰岛素，和98-102nmol/L地塞米松，1.9-2.1mmol/L L-谷氨酰胺，95-105U/ml青霉素，95-105ug/ml链霉素。
优选配方为：William’s E培养基，1％牛血清白蛋白，1nmol/L胰岛素，和100nmol/L地塞米松，2mmol/L L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素。
所述小鼠肝脏原代细胞培养方法，使用如上任一所述的小鼠肝脏原代细胞培养基进行培养。
优选包括以下步骤：
1)将经原位灌注后获取的肝脏放于预冷的灌注液II中；
2)分离肝脏原代细胞，重悬于如上任一所述的小鼠肝脏原代细胞培养基中；
3)将肝脏原代细胞悬液接种于胶原处理过的培养装置，在37摄氏度，体积分数为5％的CO2培养箱内培养，每隔5-7小时使用如上任一所述的小鼠肝脏原代细胞培养基常规换液。
优选所述灌注液II配方为：不含钙离子的Kreb-Ringer’s磷酸盐缓冲液，0.1％葡萄糖，0.5mg/ml I型胶原酶，0.1％葡萄糖，5mmol/L氯化钙，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素。
优选初始培养密度为1.2*106/ml。
优选每隔6小时常规换液。
优选所述胶原处理过的培养装置其处理方法为：胶原蛋白用0.02mol/l醋酸稀释到50ug/ml后，在细胞操作橱中，向培养装置中加入胶原溶液；在室温下放置1-2小时后，将胶原溶液吸出，用PBS洗三遍；在细胞操作橱中通风过夜吹干。
本发明的培养基及培养方法，其有益效果在于：
1、本发明的培养基成分均明确，在小鼠肝脏原代细胞培养中完全可以满足原代肝脏细胞的生长需求，细胞生长状态良好；该培养基配制简单，成本低，无需因国外品牌的货期长而延迟实验进程，具有快速、经济、高效的特点。
2、本发明提供了一种新的小鼠肝脏原代细胞培养方法，该方法在细胞的分离以及维持培养阶段均未使用胎牛血清，避免了血清的复杂成分对小鼠原代肝脏细胞造成的影响，因而该方法更加有利于肝细胞生理功能调节、代谢性疾病等领域的研究。
3、同时本技术采用高纯度的牛血清白蛋白(BSA)，具有低脂肪酸，低内毒素，低IgG，无蛋白酶等优点，完全可以满足原代肝脏细胞的良好生长需求。
本发明同时还提供了一种改进的细胞培养箱，包括固定块，固定块上开设有固定腔，固定腔的一侧内壁上开设有圆孔，圆孔的顶部内壁上开设有固定槽，固定槽的一侧内壁上开设有连接槽，固定槽的另一侧内壁上开设有滑孔，连接槽的顶部内壁和底部内壁上固定安装有同一个固定杆，固定杆上滑动安装有连接杆，连接杆的一端延伸至固定槽内并固定安装有升降板，所述圆孔的底部内壁上开设有方槽，升降板的底部延伸至方槽内，升降板的另一侧固定安装有连接座，连接座的一侧延伸至圆孔的外侧且连接座的顶部开设有凹槽，凹槽内滑动安装有滑柱，滑柱的一侧固定安装有卡杆，所述固定块的另一侧固定安装有推杆电机，所述固定块的一侧开设有连接孔，推杆电机的输出轴贯穿连接孔延伸至固定腔内并固定安装有推杆，推杆的一端固定安装有放置板。
在连接杆的顶部可以开设有固定孔，连接杆通过固定孔与固定杆滑动连接。
固定块的一侧可以开设有卡槽，卡杆与卡槽相适配。
放置板的底部可以固定安装有连接块，连接块的底部转动安装有滚轮。
固定块的一侧可以固定安装有连接板。
连接杆的顶部可以固定安装有弹簧的一端，弹簧的另一端则固定安装在连接槽的顶部内壁上。
改进后的细胞培养箱与现有的细胞培养箱相比，其效果是积极的：
通过固定块、固定腔、连接孔、推杆电机、推杆、放置板、圆孔、方槽、连接板、固定槽、滑孔、连接槽、固定杆、固定孔、弹簧、连接杆、升降板、凹槽、滑柱、连接座、卡杆、卡槽的相配合，能够便于实验操作人员对培养皿的拿取，当操作人员需要对培养皿进行拿取时，拉动连接座，连接座便会带动升降板升降，升降板升降便会带动连接杆在固定杆上滑动，连接杆滑动便会压缩弹簧，使得弹簧处于压缩状态，当升降板升降到合适的位置时，推动滑柱，滑柱便会带动卡杆卡入卡槽内，此时便完成了对升降板的固定，此时再启动推杆电机，推杆电机的输出轴带动推杆移动，推杆移动便会带动放置板移到固定腔的外侧，从而能够便于操作人员对培养皿的放置和拿取。
附图说明
图1是各实验组原代肝脏细胞的活力检测结果。*表示有统计学差异，p<0.05。
图2为本发明改进的细胞培养箱的结构示意图；
图3为本发明改进的细胞培养箱中A部分的结构示意图。
图2至图3中：1为固定块、2为固定腔、3为转孔、4为推杆电机、5为推杆、6为放置板、7为圆孔、8为转槽、9为连接板、10为固定槽、11为滑孔、12为连接槽、13为固定杆、14为固定孔、15为弹簧、16为连接杆、17为升降板、18为凹槽、19为滑柱、20为连接座、21为卡杆、22为卡槽、23为连接块、24为滚轮。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
实施例1
制备小鼠肝脏原代细胞培养基，配方为：William’s E培养基，1％牛血清白蛋白(BSA)，1nmol/L胰岛素，和100nmol/L地塞米松，2mmol/L L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素。其中，William’s E培养基和L-谷氨酰胺购买于赛默飞世尔科技公司，William’s E培养基为Invitrogen品牌，货号A1217601、牛血清白蛋白(BSA)购于NEWZERUMLtd.，货号BSA-P100G，胰岛素和地塞米松，青霉素和链霉素购买于Sigma-Aldrich公司。
实施例2
制备小鼠肝脏原代细胞培养基，配方为：William’s E培养基，0.9％牛血清白蛋白(BSA)，0.9nmol/L胰岛素，和102nmol/L地塞米松，1.9mmol/L L-谷氨酰胺，105U/ml青霉素，95ug/ml链霉素。其中，William’s E培养基和L-谷氨酰胺购买于赛默飞世尔科技公司，William’s E培养基为Invitrogen品牌，货号A1217601，牛血清白蛋白(BSA)购于NEWZERUMLtd.，货号BSA-P100G，胰岛素和地塞米松，青霉素和链霉素购买于Sigma-Aldrich公司。
实施例3
制备小鼠肝脏原代细胞培养基，配方为：William’s E培养基，0.9％牛血清白蛋白(BSA)，0.9nmol/L胰岛素，和98nmol/L地塞米松，2.1mmol/L L-谷氨酰胺，95U/ml青霉素，105ug/ml链霉素。其中，William’s E培养基和L-谷氨酰胺购买于赛默飞世尔科技公司，William’s E培养基为Invitrogen品牌，货号A1217601，牛血清白蛋白(BSA)购于NEWZERUMLtd.，货号BSA-P100G，胰岛素和地塞米松，青霉素和链霉素购买于Sigma-Aldrich公司。
实施例4
制备小鼠肝脏原代细胞培养基，配方为：William’s E培养基，1.1％牛血清白蛋白(BSA)，1.1nmol/L胰岛素，和102nmol/L地塞米松，2.1mmol/L L-谷氨酰胺，95U/ml青霉素，95ug/ml链霉素。其中，William’s E培养基和L-谷氨酰胺购买于赛默飞世尔科技公司，William’s E培养基为Invitrogen品牌，货号A1217601，牛血清白蛋白(BSA)购于NEWZERUMLtd.，货号BSA-P100G，胰岛素和地塞米松，青霉素和链霉素购买于Sigma-Aldrich公司。
实施例5
制备小鼠肝脏原代细胞培养基，配方为：William’s E培养基，1％牛血清白蛋白(BSA)，1nmol/L胰岛素，和100nmol/L地塞米松，2mmol/L L-谷氨酰胺，95U/ml青霉素，105ug/ml链霉素。其中，William’s E培养基和L-谷氨酰胺购买于赛默飞世尔科技公司，William’s E培养基为Invitrogen品牌，货号A1217601，牛血清白蛋白(BSA)购于NEWZERUMLtd.，货号BSA-P100G，胰岛素和地塞米松，青霉素和链霉素购买于Sigma-Aldrich公司。
实施例6
制备小鼠肝脏原代细胞培养基，配方为：William’s E培养基，1％牛血清白蛋白(BSA)，1nmol/L胰岛素，和100nmol/L地塞米松，2mmol/L L-谷氨酰胺，95U/ml青霉素，105ug/ml链霉素。其中，William’s E培养基和L-谷氨酰胺购买于赛默飞世尔科技公司，William’s E培养基为Invitrogen品牌，货号A1217601，牛血清白蛋白(BSA)购于NEWZERUMLtd.，货号BSA-P100G，胰岛素和地塞米松，青霉素和链霉素购买于Sigma-Aldrich公司。
实施例7
1肝脏原代细胞的分离方法
1.1胶原处理细胞培养皿
胶原蛋白(Collagen Type I)(Sigma-Aldrich公司)用0.02mol/l醋酸稀释到50ug/ml后，在细胞操作橱中，每个六孔板的单孔加入1ml胶原溶液。在室温下放置1-2小时后，将溶液吸出，用1ml PBS洗三遍。在细胞操作橱中通风过夜吹干后，待用。
1.2肝脏的原位灌注
一型胶原酶(collagenase I)(Sigma-Aldrich公司)以33mg/ml的浓度将胶原酶配在PBS中，将灌注液I，灌注液II放入37摄氏度水浴(灌注液I，灌注液II成分见表1)，同时，将配好的肝脏原代细胞预处理清洗缓冲液(成分见表1)，表2中所示的肝脏原代培养基在冰上预冷。将C57BL/6小鼠(购买于南京模式动物研究所)用戊巴比妥钠(Sigma-Aldrich公司)麻醉后，放置于手术台上，打开腹腔，找到下腔静脉，小心插入针头，开动蠕动泵，流速2ml/min，迅速用剪刀剪破肝门静脉，将流速调至7ml/min，当灌注液I消耗50ml左右的时候，换灌注液II，当灌注液II即将耗尽时，迅速用弯头镊将整个肝脏摘除，放置于事先盛有预冷的20ml灌注液II的细胞培养皿中，将培养皿架于冰上，转于细胞操作橱中。
1.3肝脏原代细胞的分离
用灭菌过的钝头眼科剪迅速剪破各叶肝脏后，用1ml移液器反复吹打直至肝细胞均匀分散在液体里。取一个新的50ml离心管架于冰上，开盖后，套上70um细胞滤网迅速将吹打后的肝细胞分数次转移到细胞滤网上，筛去大于70um的杂质。离心，50g，2分钟，4摄氏度。弃上清，加入预冷的30ml肝脏原代细胞预处理清洗缓冲液，混匀后，离心，50g，2分钟，4摄氏度。重复洗三次后，重悬于15ml表2中肝脏原代培养基中，取100ul细胞悬液，与100ul 0.4％台盼蓝染液(Sigma-Aldrich公司)，800ul PBS混合后，于细胞计数器中计数。最后，用相应的原代培养基稀释细胞悬液，分别以1.2*106/ml细胞铺6孔板。
表1原代细胞用溶液配方
注释：Kreb-Ringer’s磷酸盐缓冲液购买于赛默飞世尔科技公司，乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)和I型胶原酶购买于Sigma-Aldrich公司，Hank's平衡盐溶液(不含钙离子)为我公司自行配制。Hank's平衡盐溶液(不含钙离子)配方：氯化钠(NaCl)8g，氯化钾(KCl)0.4g，十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)0.152g，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.06g，碳酸氢钠(NaHCO3)0.35g。配制方法为：1.依次将上述试剂800毫升双蒸水中，调整pH至7.2；2.定容至1000毫升；3.高压灭菌后即可使用。
2肝脏原代细胞的培养方法
细胞计数后，使用相应的培养基按照一定比例稀释，1.2*106/ml接种于胶原处理过的六孔板中，每孔2ml细胞悬液，每种培养基分别接种4个6孔板，在37摄氏度，体积分数为5％的CO2培养箱内培养，6小时后用相应的培养基进行细胞常规换液，然后利用MTT法检测细胞活性。
表2培养基配方
注释：HepatoZYME-SFM无血清培养基、William’s E培养基和L-谷氨酰胺购买于赛默飞世尔科技公司，牛血清白蛋白(BSA)购于NEWZERUM Ltd.，货号BSA-P100G，胎牛血清购于NEWZERUM Ltd.，货号FBS-E500，胰岛素和地塞米松，青霉素和链霉素，HEPES购买于Sigma-Aldrich公司。
通过MTT法检测原代肝脏细胞的活力，进而对比各培养基的培养效果。具体方法：原代细胞培养24小时后，六孔板中选取三个孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配，购买于Sigma-Aldrich公司)100ul。继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加1mlDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，此后每隔12小时取三个孔测细胞活性，一直监测至96小时。
结果发现，使用本发明的专门用于肝脏原代细胞培养的具有明确成分的细胞培养基，完全可以满足原代肝脏细胞的生长需求，细胞生长状态良好，细胞活力于48小时左右达到高峰，随后逐渐降低，而且本发明培养基组的细胞活性显著高于常规培养基组和期刊文献中培养基组(如图1所示)，更重要的是本发明公布的培养基成分简单明确，成本较低，具有快速，经济，高效的特点。
进一步按照上述方法，但换用期刊文献中的培养基：William’s E培养基、体积分数为10％的胎牛血清、0.1μmol/L地塞米松、4μg/mL胰岛素、2mmol/L L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素、100μg/mL链霉素，15mmol/L HEPES，进行悬浮、稀释和培养，检测培养24小时至96小时的细胞活力。结果表明细胞活力于48小时左右达到高峰，此时的细胞活力值为3.68，与本发明培养基组的细胞活力相比，差异具有统计学意义(p<0.05)。
实施例7
为了使本发明的细胞培养过程更加顺利，本发明还改进了现有的细胞培养箱，参照图1-2，细胞培养箱，包括固定块1，固定块1上开设有固定腔2，固定腔2的一侧内壁上开设有圆孔7，圆孔7的顶部内壁上开设有固定槽10，固定槽10的一侧内壁上开设有连接槽12，固定槽10的另一侧内壁上开设有滑孔11，连接槽12的顶部内壁和底部内壁上固定安装有同一个固定杆13，固定杆13上滑动安装有连接杆16，连接杆16的一端延伸至固定槽10内并固定安装有升降板17，圆孔7的底部内壁上开设有方槽8，升降板17的底部延伸至方槽8内，升降板17的另一侧固定安装有连接座20，连接座20的一侧延伸至圆孔7的外侧且连接座20的顶部开设有凹槽18，凹槽18内滑动安装有滑柱19，滑柱19的一侧固定安装有卡杆21，固定块1的另一侧固定安装有推杆电机4，固定块1的一侧开设有连接孔3，推杆电机4的输出轴贯穿连接孔3延伸至固定腔2内并固定安装有推杆5，推杆5的一端固定安装有放置板6，通过固定块1、固定腔2、连接孔3、推杆电机4、推杆5、放置板6、圆孔7、方槽8、连接板9、固定槽10、滑孔11、连接槽12、固定杆13、固定孔14、弹簧15、连接杆16、升降板17、凹槽18、滑柱19、连接座20、卡杆21、卡槽22的相配合，能够便于实验操作人员对培养皿的拿取，当实验操作人员需要对培养皿进行拿取时，拉动连接座20，连接座20便会带动升降板17升降，升降板17升降便会带动连接杆16在固定杆13上滑动，连接杆16滑动便会压缩弹簧15，使得弹簧15处于压缩状态，当升降板17升降到合适的位置时，推动滑柱19，滑柱19便会带动卡杆21卡入卡槽22内，此时便完成了对升降板17的固定，此时再启动推杆电机4，推杆电机4的输出轴带动推杆5移动，推杆5移动便会带动放置板6移到固定腔2的外侧，从而能够便于实验操作人员对培养皿的放置和拿取。
本发明中，连接杆16的顶部开设有固定孔14，连接杆16通过固定孔14与固定杆13滑动连接，固定块1的一侧开设有卡槽22，卡杆21与卡槽22相适配，放置板6的底部固定安装有连接块23，连接块23的底部转动安装有滚轮24，固定块1的一侧固定安装有连接板9，连接杆16的顶部固定安装有弹簧15的一端，弹簧15的另一端固定安装在连接槽12的顶部内壁上，通过固定块1、固定腔2、连接孔3、推杆电机4、推杆5、放置板6、圆孔7、方槽8、连接板9、固定槽10、滑孔11、连接槽12、固定杆13、固定孔14、弹簧15、连接杆16、升降板17、凹槽18、滑柱19、连接座20、卡杆21、卡槽22的相配合，能够便于实验操作人员对培养皿的拿取，当实验操作人员需要对培养皿进行拿取时，拉动连接座20，连接座20便会带动升降板17升降，升降板17升降便会带动连接杆16在固定杆13上滑动，连接杆16滑动便会压缩弹簧15，使得弹簧15处于压缩状态，当升降板17升降到合适的位置时，推动滑柱19，滑柱19便会带动卡杆21卡入卡槽22内，此时便完成了对升降板17的固定，此时再启动推杆电机4，推杆电机4的输出轴带动推杆5移动，推杆5移动便会带动放置板6移到固定腔2的外侧，从而能够便于实验操作人员对培养皿的放置和拿取。
工作原理：当实验操作人员需要对培养皿进行拿取存放时，拉动连接座20，连接座20便会带动升降板17升降，升降板17升降便会带动连接杆16在固定杆13上滑动，连接杆16滑动便会压缩弹簧15，使得弹簧15处于压缩状态，当升降板17升降到合适的位置时，推动滑柱19，滑柱19便会带动卡杆21卡入卡槽22内，此时便完成了对升降板17的固定，此时再启动推杆电机4，推杆电机4的输出轴带动推杆5移动，推杆5移动便会带动放置板6移到固定腔2的外侧，从而能够便于实验操作人员对培养皿的放置和拿取。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种小鼠肝脏原代细胞培养基，其特征在于，配方为：William’s E培养基，0.9％-1.1％牛血清白蛋白，0.9-1.1nmol/L胰岛素，和98-102nmol/L地塞米松，1.9-2.1mmol/L L-谷氨酰胺，95-105U/ml青霉素，95-105ug/ml链霉素。
2.根据权利要求1所述的小鼠肝脏原代细胞培养基，其特征在于，配方为：William’s E培养基，1％牛血清白蛋白，1nmol/L胰岛素，和100nmol/L地塞米松，2mmol/L L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素。
3.一种小鼠肝脏原代细胞培养方法，其特征在于，使用如权利要求1或2任一所述的小鼠肝脏原代细胞培养基进行培养。
4.根据权利要求3所述的小鼠肝脏原代细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将经原位灌注后获取的肝脏放于预冷的灌注液II中；
2)分离肝脏原代细胞，重悬于如权利要求1或2任一所述的小鼠肝脏原代细胞培养基中；
3)将肝脏原代细胞悬液接种于胶原处理过的培养装置，在37摄氏度，体积分数为5％的CO2培养箱内培养，每隔5-7小时使用权利要求1或2任一所述的小鼠肝脏原代细胞培养基常规换液。
5.根据权利要求4所述的小鼠肝脏原代细胞培养方法，其特征在于，所述灌注液II配方为：不含钙离子的Kreb-Ringer’s磷酸盐缓冲液，0.1％葡萄糖，0.5mg/ml I型胶原酶，0.1％葡萄糖，5mmol/L氯化钙，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素。
6.根据权利要求4所述的小鼠肝脏原代细胞培养方法，其特征在于，初始培养密度为1.2*106/ml。
7.根据权利要求4所述的小鼠肝脏原代细胞培养方法，其特征在于，每隔6小时常规换液。
8.根据权利要求4所述的小鼠肝脏原代细胞培养方法，其特征在于，所述胶原处理过的培养装置其处理方法为：胶原蛋白用0.02mol/l醋酸稀释到50ug/ml后，在细胞操作橱中，向培养装置中加入胶原溶液；在室温下放置1-2小时后，将胶原溶液吸出，用PBS洗三遍；在细胞操作橱中通风过夜吹干。
9.根据权利要求4所述的小鼠肝脏原代细胞培养方法中的培养箱，其特征在于，包括固定块，所述固定块上开设有固定腔，固定腔的一侧内壁上开设有圆孔，圆孔的顶部内壁上开设有固定槽，固定槽的一侧内壁上开设有连接槽，固定槽的另一侧内壁上开设有滑孔，连接槽的顶部内壁和底部内壁上固定安装有同一个固定杆，固定杆上滑动安装有连接杆，连接杆的一端延伸至固定槽内并固定安装有升降板，所述圆孔的底部内壁上开设有方槽，升降板的底部延伸至方槽内，升降板的另一侧固定安装有连接座，连接座的一侧延伸至圆孔的外侧且连接座的顶部开设有凹槽，凹槽内滑动安装有滑柱，滑柱的一侧固定安装有卡杆，所述固定块的另一侧固定安装有推杆电机，所述固定块的一侧开设有连接孔，推杆电机的输出轴贯穿连接孔延伸至固定腔内并固定安装有推杆，推杆的一端固定安装有放置板。
10.根据权利要求9所述的培养箱，其特征在于，所述连接杆的顶部开设有固定孔，连接杆通过固定孔与固定杆滑动连接。
CN201910032156.0A 2019-01-14 2019-01-14 一种小鼠肝脏原代细胞培养基、培养方法及培养箱 Active CN109609443B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910032156.0A CN109609443B (zh) 2019-01-14 2019-01-14 一种小鼠肝脏原代细胞培养基、培养方法及培养箱

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910032156.0A CN109609443B (zh) 2019-01-14 2019-01-14 一种小鼠肝脏原代细胞培养基、培养方法及培养箱

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109609443A true CN109609443A (zh) 2019-04-12
CN109609443B CN109609443B (zh) 2022-07-05

Family

ID=66018736

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910032156.0A Active CN109609443B (zh) 2019-01-14 2019-01-14 一种小鼠肝脏原代细胞培养基、培养方法及培养箱

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109609443B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110463689A (zh) * 2019-07-31 2019-11-19 周明 一种原代肝细胞冻存液、肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法
CN111849867A (zh) * 2020-07-28 2020-10-30 吉林大学第一医院 一种用于改善大鼠dcd供肝的常温机械灌注液

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040229355A1 (en) * 2003-05-14 2004-11-18 Board Of Regents University Of Texas System Culture medium for long-term culture of hepatocytes
US20050265980A1 (en) * 2004-05-14 2005-12-01 Becton, Dickinson And Company Cell culture environments for the serum-free expansion of mesenchymal stem cells
WO2006045331A1 (en) * 2004-10-27 2006-05-04 Vrije Universiteit Brussel Differentiation of stem cells and stabilization of phenotypical properties of primary cells
CN101213289A (zh) * 2005-07-01 2008-07-02 株式会社尼康 培养器
US20100208960A1 (en) * 2007-09-03 2010-08-19 Nikon Corporation Culture apparatus, culture information management method, and computer readable medium storing program of same
CN103509751A (zh) * 2013-07-08 2014-01-15 康珞生物科技（武汉）有限公司 人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法
WO2015041510A1 (en) * 2013-09-20 2015-03-26 Simjanovska Liljana C02 incubator with device for direct controlled ionization of the air
CN107043738A (zh) * 2017-02-07 2017-08-15 韶关学院 一种猪肝细胞无血清培养基及其制备方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040229355A1 (en) * 2003-05-14 2004-11-18 Board Of Regents University Of Texas System Culture medium for long-term culture of hepatocytes
US20050265980A1 (en) * 2004-05-14 2005-12-01 Becton, Dickinson And Company Cell culture environments for the serum-free expansion of mesenchymal stem cells
WO2006045331A1 (en) * 2004-10-27 2006-05-04 Vrije Universiteit Brussel Differentiation of stem cells and stabilization of phenotypical properties of primary cells
CN101213289A (zh) * 2005-07-01 2008-07-02 株式会社尼康 培养器
US20100208960A1 (en) * 2007-09-03 2010-08-19 Nikon Corporation Culture apparatus, culture information management method, and computer readable medium storing program of same
CN103509751A (zh) * 2013-07-08 2014-01-15 康珞生物科技（武汉）有限公司 人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法
WO2015041510A1 (en) * 2013-09-20 2015-03-26 Simjanovska Liljana C02 incubator with device for direct controlled ionization of the air
CN107043738A (zh) * 2017-02-07 2017-08-15 韶关学院 一种猪肝细胞无血清培养基及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GODOY P 等: "Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME", 《ARCH TOXICOL》 *
王晓南 等: "动物细胞无血清培养基的优势、特点与实验研究", 《亚太传统医药》 *
王珊 等: "原代小鼠肝细胞培养方法的比较", 《癌变·畸变·突变》 *
胡聪 等: "原代培养大鼠肝细胞分离方法的比较研究", 《河北医科大学学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110463689A (zh) * 2019-07-31 2019-11-19 周明 一种原代肝细胞冻存液、肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法
CN110463689B (zh) * 2019-07-31 2022-12-30 周明 一种原代肝细胞冻存液、肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法
CN111849867A (zh) * 2020-07-28 2020-10-30 吉林大学第一医院 一种用于改善大鼠dcd供肝的常温机械灌注液
CN111849867B (zh) * 2020-07-28 2022-06-28 吉林大学第一医院 一种用于改善大鼠dcd供肝的常温机械灌注液

Also Published As

Publication number Publication date
CN109609443B (zh) 2022-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Smyth Studies on tapeworm physiology: XI. In vitro cultivation of Echinococcus granulosus from the protoscolex to the strobilate stage
CN100389193C (zh) 安全连续封闭式细胞培养、病毒生产和灭活的方法
CN109609443A (zh) 一种小鼠肝脏原代细胞培养基、培养方法及培养箱
CN107904215A (zh) 一种禽流感病毒的全悬浮培养方法
CN106591231B (zh) 促进cik细胞增殖分化的卡介菌多糖核酸、培养基、培养方法和应用
CN109706115A (zh) 一种小鼠骨髓间充质干细胞细胞系的构建方法
CN102807965A (zh) 一种组织工程角膜的制备方法及其装置
CN104726392A (zh) 一种制备无血清培养的悬浮哺乳动物细胞系的方法、及其制备的细胞系和应用
Hirumi et al. Cultivation of bloodstream Trypanosoma brucei
CN101382549A (zh) 一种结核分枝杆菌快速检测系统及方法
CN105265312B (zh) 一种利用诱导子提高反应器培养东北刺人参不定根中有效物质的方法
CN102886043B (zh) 猪乙型脑炎病毒与猪细小病毒二联灭活疫苗及其制备方法
CN105001296A (zh) 一种一氧化氮供体型地塞米松及制备方法与用途
CN107254446A (zh) 一种人原代肿瘤细胞的分离制备方法
CN109792972A (zh) 一种囊尾蚴体外培养方法
Seto et al. Cultivation of tissues and leukocytes from amphibians
Brooks et al. Culture and expansion of rodent and porcine Schwann Cells for preclinical animal studies
CN101580818A (zh) 诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化并稳定表达胰岛素的方法及其专用诱导液
Emancipator Animal Models of Ig A Nephropathy
EP0451217A1 (en) Production of horseshoe crab amebocytes in vitro
CN102604887B (zh) 一种哲罗鲑体细胞体外培养方法
CN108795879A (zh) 一种利用兔胎儿成纤维细胞制备玉米赤霉烯酮单克隆抗体的方法
CN108676776A (zh) 一种嗜中性粒细胞的富集分离方法
Newport et al. Miracidia infective for snails derived from eggs laid by adult Schistosoma mansoni in vitro
CN110241090B (zh) 一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant