CN111849867A

CN111849867A - 一种用于改善大鼠dcd供肝的常温机械灌注液

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Publication number: CN111849867A
Application number: CN202010738433.2A
Authority: CN
Inventors: 吕国悦; 矫春宝; 孙晓东; 李明谦; 李书轩
Original assignee: First Hospital Jinlin University
Current assignee: First Hospital Jinlin University
Priority date: 2020-07-28
Filing date: 2020-07-28
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-07-28
Also published as: CN111849867B

Abstract

本发明属于医疗领域，尤其涉及一种用于改善大鼠DCD供肝的常温机械灌注液。本发明提供的灌注液包括L‑抗坏血酸、葡萄糖、肝素、胰岛素、L‑谷氨酰胺、抗生素和William’s medium E培养基。借助常温机械灌注平台，使用本发明提供的灌注液对大鼠DCD供肝在体外进行干预治疗，并对干预治疗过程中的组织形态、灌注液中相关酶与代谢物、相关细胞因子分泌情况等进行分析评价，结果显示：本发明提供的灌注液对大鼠DCD供肝有显著改善作用。本发明验证了富含L‑抗坏血酸等成分的常温机械灌注液对DCD边缘供肝改善的可行性，为临床肝移植中DCD边缘供肝的常温机械灌注干预治疗提供了参考与理论依据。

Description

一种用于改善大鼠DCD供肝的常温机械灌注液

技术领域

本发明属于医疗领域，尤其涉及一种用于改善大鼠DCD供肝的常温机械灌注液。

背景技术

随着外科技术和免疫抑制剂的进步与发展，肝移植手术已成为终末期肝病的标准疗法。然而肝移植手术需求的增加使供肝短缺的问题逐渐凸显，供肝来源目前主要为脑死亡供体(donation after brain death，DBD)以及心脏死亡供体(donation after cardiacdeath，DCD)，DBD供肝其热缺血时间短，因而受缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusioninjury，IRI)小，移植后效果明显优于DCD供肝，因此国际上大多数中心主要采用DBD供肝，DCD供肝并没有得到充分的利用。而我国自2010年开始DCD器官捐献的试点工作并制定了相关指南，参考国际通用的Maastricht分类，中国标准分别为：中国一类(C-I)即国际DBD标准供体；中国二类(C-II)国际DCD标准供体，包含Maastricht I-V类；中国三类(C-III)脑-心双死亡供体(donation after brain death awaitingcardiac death，DBCD)，即在家属同意捐献的情况下，对符合脑死亡标准的供者，严格按照DCD供体的捐献程序实施。由于我国脑死亡立法尚未完善，C-III类符合我国国情，移植后效果良好,为现阶段器官捐献的主要方式。而如何充分利用C-II类即不可控制的DCD边缘供肝，充分缓解热缺血时间较长带来的IRI，以及随之而来的冷缺血时间加重IRI，是国内外扩大供肝池亟需解决的问题。

近年来，机械灌注在缩短冷缺血时间，以及体外干预治疗IRI上取得了良好的效果，其有效性及安全性得到广泛证明。Dutkowski等首次报告了携氧低温机械灌注后的DCD肝脏，其移植术后并发症以及移植物1年存活率(90％)要明显高于常规静态冷保存的DCD肝脏(69％)，并且与DBD肝脏的移植后结果相差无几。不仅如此，常温机械灌注可以为供肝提供氧气与营养物质，将肝脏在体外的保存时间最高延长至1周。这为体外干预治疗DCD供肝的热缺血时间所造成的IRI提供了充分的时间与平台。

目前，特异性针对DCD边缘供肝在体外常温机械灌注灌注液的研究尚无报道，因此研制一款针对性改善DCD边缘供肝的灌注液配方，对于DCD肝脏移植技术的发展和推广，具有十分重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于改善大鼠DCD供肝的常温机械灌注液，本发明提供的灌注液对大鼠DCD供肝有显著的改善作用。

本发明提供了一种用于改善大鼠DCD供肝的常温机械灌注液，包括L-抗坏血酸、葡萄糖、肝素、胰岛素、L-谷氨酰胺、抗生素和William’s mediumE培养基。

优选的，所述L-抗坏血酸在灌注液中的含量为1～10mmol/L。

优选的，所述L-抗坏血酸在灌注液中的含量为5mmol/L。

优选的，所述葡萄糖在灌注液中的含量为5～20mmol/L。

优选的，所述肝素在灌注液中的含量为1～10U/mL。

优选的，所述胰岛素在灌注液中的含量为0.2～2U/mL。

优选的，所述L-谷氨酰胺在灌注液中的含量为1～10mmol/L。

优选的，所述抗生素包括青霉素和链霉素。

优选的，所述青霉素在灌注液中的含量为10～100U/mL。

优选的，所述链霉素在灌注液中的含量为10～100μg/mL。

与现有技术相比，本发明提供了一种用于改善大鼠DCD供肝的常温机械灌注液。本发明提供的灌注液包括L-抗坏血酸、葡萄糖、肝素、胰岛素、L-谷氨酰胺、抗生素和William’s medium E培养基。借助常温机械灌注平台，使用本发明提供的灌注液对大鼠DCD供肝在体外进行干预治疗，并对干预治疗过程中的组织形态、灌注液中相关酶与代谢物、相关细胞因子分泌情况等进行分析评价，结果显示：本发明提供的灌注液对大鼠DCD供肝有显著改善作用。本发明验证了富含L-抗坏血酸等成分的常温机械灌注液对DCD边缘供肝改善的可行性，为临床肝移植中DCD边缘供肝的常温机械灌注干预治疗提供了参考与理论依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的肝脏HE染色图；

图2是本发明实施例提供的肝脏Suzuki’s病理评分图；

图3是本发明实施例提供的肝脏PAS染色图；

图4是本发明实施例提供的胆汁生成量柱形图；

图5是本发明实施例提供的各组肝脏SOD活力与MDA含量柱形图；

图6是本发明实施例提供的各组炎性细胞因子TNF-α、IL-1β与IL-6的含量柱形图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种用于改善大鼠DCD供肝的常温机械灌注液，包括L-抗坏血酸、葡萄糖、肝素、胰岛素、L-谷氨酰胺、抗生素和William’s medium E培养基。

本发明提供的灌注液包括L-抗坏血酸、葡萄糖、肝素、胰岛素、L-谷氨酰胺、抗生素和William’s medium E培养基。其中，所述L-抗坏血酸在灌注液中的含量优选为1～10mmol/L，更优选为5mmol/L，具体可为1mmol/L、1.5mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L、3mmol/L、3.5mmol/L、4mmol/L、4.5mmol/L、5mmol/L、5.5mmol/L、6mmol/L、6.5mmol/L、7mmol/L、7.5mmol/L、8mmol/L、8.5mmol/L、9mmol/L、9.5mmol/L或10mmol/L。

在本发明提供的灌注液中，所述葡萄糖在灌注液中的含量优选为5～20mmol/L，更优选为11.6mmol/L，具体可为5mmol/L、5.5mmol/L、6mmol/L、6.5mmol/L、7mmol/L、7.5mmol/L、8mmol/L、8.5mmol/L、9mmol/L、9.5mmol/L、10mmol/L、10.5mmol/L、11mmol/L、11.5mmol/L、11.6mmol/L、12mmol/L、12.5mmol/L、13mmol/L、13.5mmol/L、14mmol/L、14.5mmol/L、15mmol/L、15.5mmol/L、16mmol/L、16.5mmol/L、17mmol/L、17.5mmol/L、18mmol/L、18.5mmol/L、19mmol/L、19.5mmol/L或20mmol/L。

在本发明提供的灌注液中，所述肝素在灌注液中的含量优选为1～10U/mL，更优选为5U/mL，具体可为1U/mL、1.5U/mL、2U/mL、2.5U/mL、3U/mL、3.5U/mL、4U/mL、4.5U/mL、5U/mL、5.5U/mL、6U/mL、6.5U/mL、7U/mL、7.5U/mL、8U/mL、8.5U/mL、9U/mL、9.5U/mL或10U/mL。

在本发明提供的灌注液中，所述胰岛素在灌注液中的含量优选为0.2～2U/mL，更优选为1U/mL，具体可为0.2U/mL、0.3U/mL、0.4U/mL、0.5U/mL、0.6U/mL、0.7U/mL、0.8U/mL、0.9U/mL、1U/mL、1.1U/mL、1.2U/mL、1.3U/mL、1.4U/mL、1.5U/mL、1.6U/mL、1.7U/mL、1.8U/mL、1.9U/mL或2U/mL。

在本发明提供的灌注液中，所述L-谷氨酰胺在灌注液中的含量优选为1～10mmol/L，更优选为5mmol/L，具体可为1mmol/L、1.5mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L、3mmol/L、3.5mmol/L、4mmol/L、4.5mmol/L、5mmol/L、5.5mmol/L、6mmol/L、6.5mmol/L、7mmol/L、7.5mmol/L、8mmol/L、8.5mmol/L、9mmol/L、9.5mmol/L或10mmol/L。

在本发明提供的灌注液中，所述抗生素优选包括青霉素和链霉素；所述青霉素在灌注液中的含量优选为10～100U/mL，更优选为40U/mL，具体可为10U/mL、15U/mL、20U/mL、25U/mL、30U/mL、35U/mL、40U/mL、45U/mL、50U/mL、55U/mL、60U/mL、65U/mL、70U/mL、75U/mL、80U/mL、85U/mL、90U/mL、95U/mL或100U/mL；所述链霉素在灌注液中的含量优选为10～100μg/mL，更优选为40μg/mL，具体可为10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL、55μg/mL、60μg/mL、65μg/mL、70μg/mL、75μg/mL、80μg/mL、85μg/mL、90μg/mL、95μg/mL或100μg/mL。

本发明针对大鼠DCD供肝的特点，提供了一种富含L-抗坏血酸等成分的灌注液。借助常温机械灌注平台，使用本发明提供的灌注液对大鼠DCD供肝在体外进行干预治疗，并对干预治疗过程中的组织形态、灌注液中相关酶与代谢物、相关细胞因子分泌情况等进行分析评价，结果显示：本发明提供的灌注液对大鼠DCD供肝有显著改善作用，可以清除热缺血再灌注损伤后肝脏中的ROS。本发明验证了富含L-抗坏血酸等成分的常温机械灌注液对DCD边缘供肝改善的可行性，为临床肝移植中DCD边缘供肝的常温机械灌注干预治疗提供了参考与理论依据。

为更清楚起见，下面通过以下实施例进行详细说明。

实施例

1)灌注液配方：

将L-抗坏血酸(1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L、10mmol/L)溶于添加了11.6mmol/L葡萄糖、5U/mL肝素、1U/mL胰岛素、5mmol/L L-谷氨酰胺、40U/mL青霉素、40ug/mL链霉素的William’s medium E培养基(美国ThermoFisher Scientific公司，货号：W1878，[1x]g/L)中，即得DCD供肝灌注液。

2)样本准备：

无特殊病原菌(SPF)级健康雄性wistar大鼠共20只，体重250～300g。

2.1)NMP组(n＝4)：肝脏离体后，经门静脉及胆管插管，连接至大鼠常温机械灌注系统中，经门静脉灌注常温(37℃)灌注液4h，流量为0.5mL/g/min，灌注压力保持3mmHg以内。

2.2)L-抗坏血酸组(n＝16)：肝脏离体后，经门静脉及胆管插管，连接至大鼠IPRL系统中，经门静脉灌注加L-抗坏血酸的常温(37℃)灌注液4h，流量为0.5mL/g/min，灌注压力保持3mmHg以内。药物浓度梯度分组分别为1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L、10mmol/L，n＝4，根据酶学水平，筛选最佳L-抗坏血酸进行后续L-抗坏血酸组实验。

SPF级健康雄性wistar大鼠术前12小时禁食不禁水，经小动物麻醉机用异氟烷行持续气体麻醉。

麻醉生效后，将大鼠固定于手术台上，腹部去毛，75％酒精消毒，铺设无菌手术单，采用上腹部正中切口，切口上缘至剑突，下缘为耻骨联合。用血管钳将剑突翻转向上，拉钩将两侧腹壁牵拉固定，保持术野良好。用棉签将腹腔内胃肠轻推至左髂区，盐水纱布覆盖保湿，钝性分离肝周韧带及腹主动脉，经腹主动脉注射1mL肝素生理盐水(肝素100IU/mL)，进行全身肝素化处理。剪开膈肌诱导心脏停跳，血管钳夹闭胸主动脉阻滞血流，37℃热缺血30min后，经腹主动脉灌注40mL冷肝素生理盐水(肝素20IU/mL)，将肝脏缓慢冲至土黄色，随后充分游离并将肝脏分离。

3)标本采集：

3.1)灌注液：

灌注过程中，10min，20min，30min，40min，50min，60min，90min，120min，3h，4h，分别取灌注液1mL，经3000rpm，离心5min后，取上清液于-80℃保存，用全自动多功能分析仪检测肝功酶学指标。

3.2)肝组织：

肝脏分别经静态冷保存或机械灌注4h后，统一取各组大鼠中叶一小块，分别进行福尔马林固定以及-80℃保存，行后续实验。

3.3)胆汁收集：

灌注结束后收集胆汁称重，考虑胆汁密度约等于水，用重量法估算胆汁流量，并用ul/h/g肝脏表示。

4)检测指标：

全自动多功能分析仪检测灌注液肝功酶学指标。在常温机械灌注或静态冷保存4h后，留取肝组织标本行HE染色，观察DCD大鼠肝组织形态；PAS染色观察DCD大鼠肝组织糖原消耗及补充情况；分别用试剂盒检测DCD大鼠肝组织MDA与SOD含量；用ELISA法检测各组肝脏TNF-α，IL-1β，IL-6含量。

5)统计分析：

采用GraphPad Prism8.0进行统计分析及做图，计数资料以mean±SEM表示，两组样本间差异比较用T检验，多组间单因素比较采用单因素方差分析one-way ANOVA，Tukey法进行多重比较；多组间双因素分析比较，用双因素方差分析two-way ANOVA，Tukey法进行多重比较。当p<0.05认为差异具有统计学意义。

6)结果：

6.1)灌注液肝功酶学指标：

表1、2、3为灌注过程中酶学具体数值mean±SEM，可见，同一组肝脏在灌注前2h，酶学变化不显著，在3～4h时出现显著变化，以5mmol/L为最佳浓度，后续L-抗坏血酸组实验均以5mmol/L L-抗坏血酸浓度进行。

表1各组肝脏灌注液AST数值

注：表1中数据为每组数值的mean±SEM；各L-抗坏血酸浓度组(1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L、10mmol/L)的AST数据均与同时间点的NMP组(0mmol/L)相比较(a表示p<0.05；b表示p<0.01；c表示p<0.005；d表示p<0.0001，n＝4)；各浓度组在不同灌注时间内均与组内0min数值相比较(A表示p<0.05；B表示p<0.01；C表示p<0.005；D表示p<0.0001，n＝4)。

表2各组肝脏灌注液ALT数值

注：表2中数据为每组数值的mean±SEM；各L-抗坏血酸浓度组(1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L、10mmol/L)的ALT数据均与同时间点的NMP组(0mmol/L)相比较(a表示p<0.05；b表示p<0.01；c表示p<0.005；d表示p<0.0001，n＝4)；各浓度组在不同灌注时间内均与组内0min数值相比较(A表示p<0.05；B表示p<0.01；C表示p<0.005；D表示p<0.0001，n＝4)。

表3各组肝脏灌注液LDH数值

注：表3中数据为每组数值的mean±SEM；各L-抗坏血酸浓度组(1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L、10mmol/L)的LDH数据均与同时间点的NMP组(0mmol/L)相比较(a表示p<0.05；b表示p<0.01；c表示p<0.005；d表示p<0.0001，n＝4)；各浓度组在不同灌注时间内均与组内0min数值相比较(A表示p<0.05；B表示p<0.01；C表示p<0.005；D表示p<0.0001，n＝4)。

6.2)各组肝脏病理学检查：

各组肝脏保存4h后的HE染色如图1所示，图1是本发明实施例提供的肝脏HE染色图(100倍200μm、200倍100μm、400倍50μm)。通过图1可以看出，NMP组肝细胞排列规则，少量肝细胞空泡变性，胞质内可见少量大小不一的圆形空泡；L-抗坏血酸组(5mmol/L组)肝小叶结构完整，肝细胞排列更为规则，分界较为清晰，细胞形态亦正常，未见明显异常。

肝脏的病理切片Suzuki’s评分如图2所示，图2是本发明实施例提供的肝脏Suzuki’s病理评分图(***表示p<0.001，**表示p<0.01，*表示p<0.05；n＝4)。

6.3)各组肝脏糖原消耗比较：

各组肝脏保存4h后的PAS染色如图3所示，图3是本发明实施例提供的肝脏PAS染色图(100倍200μm、200倍100μm、400倍50μm，L-抗坏血酸组为5mmol/L组(n＝4))。通过图3可以看出，NMP组(n＝4)肝细胞糖原储存尚可，机械灌注过程中给予补充糖原；L-抗坏血酸组(5mmol/L)肝细胞糖原储存较好，L-抗坏血酸修复细胞，并于机械灌注过程中给予补充糖原。对比可知，L-抗坏血酸能有效减轻肝脏中的糖原降低。

6.4)各组肝脏胆汁生成比较：

两组肝脏分别为HMP组与L-抗坏血酸组(5mmol/L)，灌注4h结束后，计算胆汁量，以ul/h/g肝脏表示，结果如图4所示，图4是本发明实施例提供的胆汁生成量柱形图(ns：notsignificant，n＝4)。通过图4可以看出，HMP组与L-抗坏血酸组并没有明显差别(2.53±0.26)vs(2.66±0.66),(p＝0.8617，n＝4)。

6.5)各组肝脏SOD与MDA含量：

提取相同重量的肝组织制备均浆后，测得SOD活力(U/mg protein)与MDA含量(nmol/mg protein)，结果如图5所示，图5是本发明实施例提供的各组肝脏SOD活力与MDA含量柱形图(*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001；n＝4)。通过图5可以看出，L-抗坏血酸组(5mmol/L)SOD抑制率较高(NMP组1.24±0.01，L-抗坏血酸组0.84±0.06)，MDA含量与之相反(NMP组212.53±5.23，L-抗坏血酸组(5mmol/L)314.94±22.195)，各组间差异较为显著p<0.01，n＝4。

6.6)各组肝脏炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量比较：

经4h保存后，L-抗坏血酸组(5mmol/L)的炎症因子水平较低，具体结果如图6所示，图6是本发明实施例提供的各组炎性细胞因子TNF-α、IL-1β与IL-6的含量柱形图(*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001；n＝4)。通过图6可以看出，各组间差异显著：TNF-α(NMP组25817.33±500.87pg/mL，L-抗坏血酸组21053.66±1337.65pg/mL)，IL-1β(NMP组58757.66±235.79pg/mL，L-抗坏血酸组54294.33±376.03pg/mL)，IL-6(NMP组107.33±1.45pg/mL，L-抗坏血酸组79.00±0.57pg/mL)，p<0.05，n＝4。

7)结论：

L-抗坏血酸应用于常温机械灌注的灌注液中对大鼠DCD供肝有显著改善作用，且L-抗坏血酸应用于常温机械灌注的灌注液最适浓度为5mmol/L。

本发明中涉及的英文缩写所对应的中、英文全称详见下表：

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种用于改善大鼠DCD供肝的常温机械灌注液，包括L-抗坏血酸、葡萄糖、肝素、胰岛素、L-谷氨酰胺、抗生素和William’s medium E培养基。

2.根据权利要求1所述的常温机械灌注液，其特征在于，所述L-抗坏血酸在灌注液中的含量为1～10mmol/L。

3.根据权利要求2所述的常温机械灌注液，其特征在于，所述L-抗坏血酸在灌注液中的含量为5mmol/L。

4.根据权利要求1所述的常温机械灌注液，其特征在于，所述葡萄糖在灌注液中的含量为5～20mmol/L。

5.根据权利要求1所述的常温机械灌注液，其特征在于，所述肝素在灌注液中的含量为1～10U/mL。

6.根据权利要求1所述的常温机械灌注液，其特征在于，所述胰岛素在灌注液中的含量为0.2～2U/mL。

7.根据权利要求1所述的常温机械灌注液，其特征在于，所述L-谷氨酰胺在灌注液中的含量为1～10mmol/L。

8.根据权利要求1所述的常温机械灌注液，其特征在于，所述抗生素包括青霉素和链霉素。

9.根据权利要求8所述的常温机械灌注液，其特征在于，所述青霉素在灌注液中的含量为10～100U/mL。

10.根据权利要求8所述的常温机械灌注液，其特征在于，所述链霉素在灌注液中的含量为10～100μg/mL。