CN114557993B - 4-衣康酸辛酯在制备胰腺提取胰岛前的注射制剂中的应用 - Google Patents

4-衣康酸辛酯在制备胰腺提取胰岛前的注射制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了4‑衣康酸辛酯在制备胰腺提取胰岛前的注射制剂中的应用。该注射制剂为4‑衣康酸辛酯，注射剂量为10‑50mg/kg体重,注射时间为胰腺获取前3‑4小时。本发明在操作上简单、易行，降低了缺血损伤，最终减少了胰腺胰岛的损失，有效地提高了胰岛的得率并保护其活性，为制备移植胰岛提供可用资源，具有广阔的临床应用前景。

Description

4-衣康酸辛酯在制备胰腺提取胰岛前的注射制剂中的应用
技术领域
本发明属于胰岛提取的技术领域，具体是涉及4-衣康酸辛酯在制备胰腺提取胰岛前的注射制剂中的应用。
背景技术
糖尿病是严重威胁人类健康的常见病，国际糖尿病联盟(The InternationalDiabetes Federation,IDF)2019年公布的第九版《全球糖尿病概览》，全球已有的糖尿病患者为4.63亿，依照目前的涨幅，到2045年这个数字将突破7亿，在如此庞大的患者数中，我国位居第一，患者数占总数的四分之一，而我国每年因糖尿病死亡的人数约为83.4万。每年有约100万人因糖尿病截肢，400万人死亡。常规采用的各种强化血糖控制方案只能减少糖尿病高血糖的发生，但在对代谢及激素信号的反应以及对时间和剂量的精确调节方面，却不能模拟正常的胰岛，不能从根本上阻止低血糖和其他并发症的发生。胰岛移植是一种可治愈糖尿病的重要疗法，并能防止其并发症的发生。
2000年，加拿大Edmonton AIberta大学研究小组提出的胰岛移植方案取得了重大成功，连续7例I型糖尿病患者在接受胰岛移植后停用了胰岛素，(Shapiro A.M,Lakey J.R,Ryan E.A,et al.Islet transplantation in seven patients with type 1diabetesmellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen[J].N Engl JMed 2000,343:230-238.)成为胰岛移植史上的一个里程碑。胰岛移植是从供者胰腺中分离出包含β细胞的胰岛，通过门静脉到患者的肝脏后发挥功能。该治疗方法比胰腺移植对患者的创伤和负担更小，时间也短。因此可以反复进行多次。足够临床研究表明脑死亡(DBD)后器官捐献者分离的胰岛比循环死亡(DCD)以后的器官捐献者分离的胰岛有显著提高(vanLoo ES,Krikke C,Hofker HS,Berger SP,Leuvenink HG,Pol RA.Outcome of pancreastransplantation from donation after circulatory death compared to donationafter brain death.Pancreatology.2017Jan-Feb；17(1):13-18.)。这可能由于胰腺是一个极易发生缺血性损伤的器官。胰岛散在分布于胰腺的外分泌组织中，并与周围组织紧密连接，胰岛的分离过程实际上是将其从富含消化酶的腺泡中分离出来。获得胰腺时，由于血液循环阻断，以及胰腺与血管的剥离，存在着一段缺血时间(Rosenberg L,Wang R,Paraskevas S,Maysinger D.Structural and functional changes resulting fromislet isolation lead to islet cell death.Surgery.1999Aug；126(2):393-8.)。由于胰岛细胞发生缺血损伤，导致淋巴细胞与巨噬细胞活化，炎性因子增加，氧自由基产生，都是造成胰腺中胰岛细胞凋亡的重要因素(Emamaullee JA,Shapiro AM.Factorsinfluencing the loss of beta-cell mass in islet transplantation.CellTransplant.2007；16:1-8.)。因此，本发明的目的是提供一种对机体无伤害的注射制剂，使用后能够从胰腺分离胰岛提取中可靠的得到稳定高质量的胰岛细胞。该注射液的使用丰富了胰腺的提取技术，也更好地遵从了动物福利原则。
发明内容
本发明的目的是提供一种注射制剂的应用，使用后能够从小鼠胰腺可靠的得到稳定高产量的胰岛，该注射液丰富了小鼠胰腺的提取技术，也更好地遵从了动物福利原则。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的，
4-衣康酸辛酯(4-OI)在制备胰腺提取胰岛前的注射制剂中的应用。
4-衣康酸辛酯化学式：C13H22O4
Figure BDA0003558815750000021
进一步地，4-衣康酸辛酯注射剂量为10-50mg/kg体重。
进一步地，4-衣康酸辛酯注射时间为胰腺获取前3-4小时。
进一步地，4-衣康酸辛酯注射浓度为10mg-20mg/mL。
注射4-衣康酸辛酯后，取胰腺进一步提取胰岛。
进一步地，将装有胰腺的离心管放入38℃水浴锅中，静置；剧烈震荡后，迅速取出；用含有10％胎牛血清的HBSS充分混匀中止消化；离心，弃上清；用含有10％胎牛血清的HBSS重悬，筛网过滤；过滤后的细胞再次进行离心，弃上清，进行密度梯度离心。
更进一步地，将装有3-4只胰腺的离心管放入38℃水浴锅中，静置15分钟；剧烈震荡30秒后，迅速取出；用含有10％胎牛血清的40ml HBSS充分混匀中止消化；1200rpm离心3分钟，弃上清；用含有10％胎牛血清的HBSS重悬，经80目的筛网过滤；过滤后的细胞再次进行离心，弃上清，进行密度梯度离心2500rpm离心20分钟。
本发明所述的应用，处理对象为小鼠。
注射本发明的4-衣康酸辛酯注射液进行小鼠胰腺提取胰岛的方法，具体包括以下步骤：
1.小鼠腹腔注射4-OI注射液，4-OI溶解于含有玉米油或者PEG300的溶剂中(溶剂：5％DMSO+95％玉米油；或者5％DMSO+40％PEG 300+5％Tween80+50％水)，工作浓度范围(10mg-20mg/mL)。
2.3-4小时后进行胰腺提取。首先穿刺胆总管，并将胆总管与穿刺针用5-0缝合线扎紧，接着用止血钳夹紧十二指肠乳头处胰管开口。然后推注胶原酶LT。待胰腺充盈膨胀后，可以清晰看出胰腺与脂肪的区别。
3.待胰腺充盈膨胀后沿着肠道将充盈的胰腺分离剪下，放入50ml离心管中。
4.将装有3-4只胰腺的离心管放入38℃水浴锅中，静置15分钟。
5.剧烈震荡30秒后，迅速取出；用含有10％胎牛血清的40ml HBSS充分混匀中止消化；1200rpm离心3分钟，弃上清；用含有10％胎牛血清的HBSS重悬，经80目的筛网过滤；过滤后的细胞再次进行离心，弃上清，进行密度梯度离心2500rpm离心20分钟分离得到较高纯度的胰岛细胞。
6.DTZ计数胰岛细胞，发现使用了4-OI注射组胰岛的数量、胰岛团大小均高于对照组，AO/PI检测细胞死活发现使用了4-OI注射组胰岛活率较高。
7.将125-250mM的4-OI加入RPMI1640中，培养胰岛细胞过夜，第二天胰岛细胞进行流式细胞术，发现4-OI处理组胰岛细胞能够抑制早期凋亡，细胞活率高于对照组。
本发明的创新点如下：
1.胰腺被认为对缺血缺氧损伤极度敏感，因为在胰岛β细胞上包括过氧化氢酶(Cat)、谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx)和超氧化物歧化酶(Sod)等在内的抗氧化酶体系表达非常低，缺血缺氧导致的氧化应激极易造成胰岛细胞死亡。此外，胰岛素合成过程中会产生ROS，而β细胞作为一种专业的胰岛素分泌细胞，在血糖水平升高时发挥独特的作用，高血糖促进β细胞内胰岛素生物合成增加50倍。在这个过程中，每个胰岛素分子形成三个二硫键，每分钟释放数百万个ROS分子，这加剧胰岛细胞对氧化应激导致损伤的敏感性。在胰腺移植过程中，因为提取胰腺时的血管离断与植入体内时新生血管的不足，胰腺会处于一段缺血缺氧状态，加上移植过程中的机械与理化损伤，导致胰岛细胞不可避免的遭受氧化应激损伤，导致功能性胰岛的损失。2.在胰腺分离过程中，胰岛暴露于各种应激刺激，细胞遭受应激损伤，氧自由基产生增加，炎性因子分泌增加，这导致淋巴细胞与巨噬细胞活化浸润，加速免疫细胞的攻击，造成胰腺中胰岛细胞凋亡。此外，分离的胰腺在移植入体内时，胰岛易受即时血液介导的炎症反应(IBMIR)形成的的血栓影响，这也导致炎症细胞攻击，导致胰岛细胞的丧失，影响胰岛移植的效果。
本发明发现4-OI不仅可以直接抑制胰岛提取过程中的炎症反应，提高胰岛细胞活率，提高分离所获得的胰岛细胞质量，还能明显抑制胰岛细胞的凋亡。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1.采用本发明注射液注射后所分离提取的胰岛细胞培养一天后，胰岛细胞的细胞早期凋亡率明显低于现有技术得到的胰岛，说明胰岛细胞抵御应激损伤的能力较强，免疫细胞活化浸润较少，胰岛细胞存活率好。
2.采用本发明注射液注射后所得到的胰岛与现有技术得到的胰岛相比，形态更规整，胰岛细胞团的包膜相对更完整，凋亡胰岛细胞团的数目明显减少，胰岛碎片也更少，胰岛大小多在50-200μm之间，更适合移植。
3.采用本发明注射液注射后所得到的胰岛与现有技术得到的胰岛相比，数目明显增多，每只小鼠得到的胰岛细胞的数量明显提高，胰岛的凋亡率明显下降，胰岛细胞的回收率明显提高。
本发明的优势总结如下：
1.相同重量的胰腺得到的胰岛细胞的数量明显提高。
2.胰岛的凋亡率下降，胰岛细胞的存活率提高。
3.胰岛的包膜完整，细胞团破碎减少，大小均一，多在50-200μm之间。
4.抑制胰岛细胞氧化应激损伤，提高胰岛培养后活率。
采用本发明注射液注射后得到的胰岛在大小和数量，以及细胞活力与功能状态上相对现有技术来说更符合胰岛细胞移植临床要求，更适宜胰岛细胞移植手术。这些都为胰岛细胞移植治疗技术的推广打下了基础。
附图说明
图1显示了本发明与现有技术(即提取前不进行任何注射)以及专利CN201410544587.2中最优方案处理之后获得的小鼠胰岛细胞DTZ染色后计数得到的胰岛细胞数量；
图2显示了本发明与现有技术(即提取前不进行任何注射)以及专利CN201410544587.2中最优方案处理之后获得的小鼠胰岛细胞0天的经AO/PI染色后的效果对比图，放大倍数80×；
图3显示了本发明与现有技术(即提取前不进行任何注射)以及专利CN201410544587.2中最优方案处理之后获得的小鼠胰岛细胞培养一天后胰岛细胞流式细胞仪检测结果对比。本发明明显减少了早期凋亡细胞。
图4显示了本发明与现有技术(即提取前不进行任何注射)以及专利CN201410544587.2中最优方案处理之后获得的小鼠胰岛细胞培养一天后胰岛细胞存活率的效果对比图。
CN201410544587.2一种新生猪胰腺提取胰岛前的注射制剂，该注射制剂包括奥曲肽和低分子肝素钠；按照最优选效果奥曲肽的注射剂量为2μg/kg体重；低分子肝素钠的注射剂量为10IU/kg体重。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1，注射本发明的注射液进行小鼠胰腺提取胰岛的方法
1.取胰腺前3.5小时先给小鼠注射4-衣康酸辛酯，注射剂量为15mg/kg体重；
2.小鼠肌肉注射戊巴比妥钠使其麻醉；
3.将小鼠仰卧位固定在铺有中单的无菌托盘中，并于小鼠的手术区喷洒络合碘溶液；
4.将托盘置于无菌操作台中并铺上孔巾，暴露腹部手术区；
5.无菌手术操作，术者与助手先于上腹部剑突下正中线部位“+”字型切开腹部皮肤以及壁层腹膜以外的各层腹壁结构，随之打开腹腔；
6.使用棉签推开胃(注意动作轻柔不要夹破)，充分暴露出胰腺；
7.使用30G针头，在1/4处折成90°直角，穿刺胆总管，并将胆总管与穿刺针用5-0缝合线扎紧，接着用止血钳夹紧十二指肠乳头上下两端，避免酶从十二指肠通过。缓慢推注胶原酶LT，待胰腺充盈膨胀后，可以清晰看出胰腺与脂肪的区别。
8.待胰腺充盈膨胀完全后沿着肠道将充盈的胰腺分离剪下，放入50ml离心管中。
9.将装有3-4只胰腺的离心管放入38℃水浴锅中，静置15分钟。剧烈震荡30秒后，迅速取出。
10.用含有10％胎牛血清的40ml HBSS充分混匀中止消化。1200rpm离心3分钟，弃上清。
11.用含有10％胎牛血清的HBSS重悬，经80目的筛网过滤。过滤后的细胞再次进行离心，弃上清，进行密度梯度离心2500rpm离心20分钟。
12.取上层细胞纯度较高胰岛细胞。
在具体实验过程中，我们进行了多次探索，尝试注射各种注射制剂，但效果并不显著(图2-图4)，结果均没有本发明的效果明显。
实施例2，胰岛细胞团计数：
将上层收集到的高纯度胰岛细胞，1200rpm离心3min，弃上清，定容至一定体积的细胞悬液，每次于细胞悬液中取出50μl的样品，镜下计数胰岛细胞团并重复取样3次，按下列公式计数胰岛：islet＝(3次胰岛数值之和/3)×[样本总量(ml)/50μl]。胰岛得率结果见图1。
实施例3，AO/PI染色：
试剂配置(10ml工作液)
Figure BDA0003558815750000071
吖啶橙AO(acridine orange,AO)能够进入正常细胞膜的细胞中，与DNA结合显绿色/黄绿色荧光，与RNA结合显桔红色荧光，而碘化丙啶PI(Propidium Iodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红，从而通过荧光显微镜观察细胞的染色情况来判断胰岛细胞的存活,结果见图2。
实施例4，新生小鼠胰岛细胞的培养：
计数完成后的胰岛细胞1200rpm离心3min，弃上清，用含有125-250mM的4-OI及10％胎牛血清的RPMI1640重悬胰岛细胞，置于37℃、5％CO2及95％空气培养箱内进行培养，24h后进行细胞活率检测。
实施例5，流式细胞术分析：
收集实施例4培养的胰岛细胞，用冷的PBS冲洗两次，然后用1ⅹBinding Buffer以1ⅹ106个细胞/ml重悬细胞，吸取100μl溶液于流式管中，加入5μl FIFC Annexin V和5μlPI染色，在25℃下于避光处孵育15分钟，每管加入400μl Binding Buffer后上机检测。
Annexin V分子量35KDa左右，是一种钙离子依赖性的磷脂结合蛋白，当细胞发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸会从膜内外翻，Annexin V与外翻后的磷脂酰丝氨酸具有很高的亲和力，此时我们将FITC这种荧光蛋白标记在Annexin V上，便可以利用流式细胞仪进行检测。PI是核酸染料，不能穿过活细胞膜，当细胞膜出现破损时，PI可进入细胞并结合核酸。细胞消化重悬后，加入Annexin V和PI以及染色Buffer，正常细胞不会被Annexin V和PI标记上；早期凋亡的细胞，膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻，此时磷脂酰丝氨酸会和Annexin V结合；晚期凋亡的细胞，膜结构破损，此时PI会进入细胞，故晚期凋亡的细胞会被PI标记上，结果见图3。胰岛存活率统计见图4。

Claims (8)

1.4-衣康酸辛酯在制备胰腺提取胰岛前的注射制剂中的应用；其特征在于，4-衣康酸辛酯能抑制胰岛细胞早期凋亡。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，注射剂量为10-50mg/kg体重。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，4-衣康酸辛酯注射时间为胰腺获取前3-4小时。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，4-衣康酸辛酯注射浓度为10mg-20mg/mL。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，注射4-衣康酸辛酯后，取胰腺进一步提取胰岛。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将装有胰腺的离心管放入38℃水浴锅中，静置；剧烈震荡后，迅速取出；用含有10%胎牛血清的HBSS充分混匀中止消化；离心，弃上清；用含有10%胎牛血清的HBSS重悬，筛网过滤；过滤后的细胞再次进行离心，弃上清，进行密度梯度离心。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将装有3-4只胰腺的离心管放入38℃水浴锅中，静置15分钟；剧烈震荡30秒后，迅速取出；用含有10%胎牛血清的40ml HBSS充分混匀中止消化；1200rpm离心3分钟，弃上清；用含有10%胎牛血清的HBSS重悬，经80目的筛网过滤；过滤后的细胞再次进行离心，弃上清，进行密度梯度离心2500rpm离心20分钟。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，处理对象为小鼠。
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