CN105001296A - 一种一氧化氮供体型地塞米松及制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种一氧化氮供体型地塞米松及制备方法与用途。该化合物通过环己甲酸酯将亚硝酸酯与地塞米松相连，得到的一种一氧化氮供体型地塞米松，其体外抗炎活性优于地塞米松，并且体外可以抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)生长，抑制MRSA生物膜的形成，以及导致MRSA生物膜内细菌死亡。此外，该化合物可以显著提高MRSA脓毒症致死模型中小鼠的生存率，在亚致死模型中降低小鼠炎症病理损伤，降低细菌定值量，在预防和治疗MRSA脓毒症方面具有显著优势。

Description

一种一氧化氮供体型地塞米松及制备方法与用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，进一步地，本发明涉及一种一氧化氮供体型地塞米松及制备方法与用途

背景技术

炎症是指具有血管系统的活体组织，对各种致炎因子引起损伤所发生的以防御反应为主的病理过程，其病理变化为变质、渗出和增生。很多疾病，包括各种炎症性疾病(肺炎、肾炎、类风湿性关节炎等)、冠心病、阿尔茨海默病，甚至糖尿病等都与炎症反应密切相关。在炎症反应过程中，致炎因子引起机体以血管系统改变为主的一系列反应，有利于消灭致炎因子、稀释毒素和吞噬自身伤亡细胞等，促进组织损伤的修复。但是，过强的炎症反应会对机体造成损伤，甚至威胁生命。

地塞米松是一种临床常用的糖皮质激素类抗炎药物，是泼尼松的衍生物，其抗炎和免疫抑制作用能限制早期炎症细胞的普遍激活，阻断了炎症的“瀑布样”链锁反应，有效减少自身组织在机体扩大的应激反应中所受炎性介质“双刃剑”的损伤，使机体对应激耐受性大大增强，从而为炎症的控制提供宝贵时机。然而，长期应用可引起一系列严重不良反应，且严重程度与剂量及用药时间成正相关。其主要副作用是：医源性库欣综合征、向心性肥胖、满月脸、皮肤紫纹淤斑、类固醇性糖尿病(或已有糖尿病加重)、骨质疏松、自发性骨折甚或骨坏死(如股骨头无菌性坏死)、女性多毛、月经紊乱或闭经不孕、男性阳萎、出血等。

大量研究表明，将现有药物与一氧化氮(Nitric Oxide，NO)供体直接相连或通过中间链连接修饰形成的NO供体型药物是目前新药开发的一个新领域和新方向。这类新型NO供体型药物既保留原有药物的作用，又能释放NO，发挥NO的生理作用，赋予母体药物以新的性质，且两部分发挥着协同或增效的作用，使之较母体药物更安全有效。由于NO本身是机体内重要的信使分子、效应分子和免疫调节分子，其研究已经渗透到众多学科，成为生物医学领域研究的热点和前沿之一，美国国家卫生研究院(NIH)和国家肿瘤研究所(NCI)都联手开始进行NO供体型药物的开发。此外，NO在抗感染及抗炎方面有着独特的作用，从而使NO供体型药物具有良好的应用前景，并已有一些NO供体型抗炎药物进入临床研究阶段，如NCX4016(NO-阿司匹林)、NCX701(NO-扑热息痛)等。这些药物不仅保留了原药的抗炎作用，而且降低了胃肠道的副作用，也不产生肾脏和心血管毒性。近年来，NO供体型糖皮质激素(NO-GCs)的研究也在逐渐深入，已经合成得到NCX1015(NO-氢化泼尼松)、NCX1022(NO-氢化可的松)等化合物。与母体药物相比，NO-GCs的抗炎免疫活性显著提高，并具有明显的抗骨质疏松作用，也避免了原型药物所诱导的高血压反应，有效地减轻了不良反应。

虽然目前有少数人正在研究NO-地塞米松，其所得NO-地塞米松与地塞米松相比起，抗炎活性没有无明显的优势。

发明内容

本发明的目的是提供一种一氧化氮供体型地塞米松，该化合物的体外抗炎活性优于地塞米松，并且体外可以抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)生长，抑制MRSA生物膜的形成，以及导致MRSA生物膜内细菌死亡。此外，该化合物可以显著提高MRSA脓毒症致死模型中小鼠的生存率，在亚致死模型中降低小鼠炎症病理损伤，降低细菌定值量，在预防和治疗MRSA脓毒症方面具有显著优势。

一氧化氮供体型地塞米松的结构如式D3所示：

该一氧化氮供体型地塞米松的化学名称为地塞米松-21-(4-硝氧基环己甲酸)酯。

本发明还提供上述一氧化氮供体型地塞米松的制备方法，该方法以4-氧代环己基甲酸甲酯(1)为原料，经硼氢化钠还原得到4-羟基环己基甲酸甲酯(2)，化合物2与在氢溴酸的作用下发生溴代和水解得4-溴环己基甲酸(3)，再与二氯亚砜发生反应即得4-溴环己基甲酰氯(4)。地塞米松与化合物4发生酯化应得地塞米松-21-(4-溴环己甲酸)酯(5)，再与硝酸银发生反应即得目标产物地塞米松-21-(4-硝氧基环己甲酸)酯(D3)，即一氧化氮供体型地塞米松。

其制备方法具体如下：

1)4-羟基环己甲酸甲酯(2)的合成

取4-氧代环己甲酸甲酯(1)溶于甲醇中，搅拌下加入硼氢化钠，反应完全后，减压除去溶剂，剩余物加冰水，搅拌30分钟后二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，除去溶剂后剩余物油泵减压蒸馏得4-羟基环己甲酸甲酯；

2)4-溴环己甲酸(3)的合成

步骤1)所得4-羟基环己甲酸甲酯与浓氢溴酸的混合物加热至50℃搅拌反应24小时，反应液冷却后二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，剩余物溶于乙酸乙酯，搅拌下缓慢滴加石油醚，冰水混合浴冷却下搅拌5小时，过滤收集固体，得4-溴环己甲酸(3)白色晶体状粉末；

3)4-溴环己甲酰氯(4)的合成

步骤2)所得4-溴环己甲酸(3)和氯化亚砜在无水条件下油浴加热至70℃，回流反应4小时，常压蒸馏除去过量的氯化亚砜，剩余物减压蒸馏，收集高沸点馏分，得4-溴环己甲酰氯(4)；

4)地塞米松-21-(4-溴环己甲酸)酯(5)的合成

氮气保护下，地塞米松溶与4-溴环己甲酰氯(4)及缚酸剂发生反应，减压除去溶剂，乙酸乙酯/石油醚混合溶剂洗涤，过滤，柱层析分离纯化，得地塞米松-21-(4-溴环己甲酸)酯(5)；

5)地塞米松-21-(4-硝氧基环己甲酸)酯(D3)的合成

将地塞米松4-溴环己甲酸酯溶于乙腈中，氮气流保护下加入硝酸银，反过夜，硅胶柱分离纯化，得地塞米松-21-(4-硝氧基环己甲酸)酯(D3)。

步骤4)所用反应溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺、甲苯或乙腈；

步骤4)所述反应温度为-30～60℃；

步骤4)所述缚酸剂为三乙胺、吡啶、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、碳酸钾或氢氧化钾；

步骤4)所述的乙酸乙酯/石油醚混合溶剂的体积比为1∶10；

步骤5)所述地塞米松-21-(4-溴环己甲酸)酯(5)与硝酸银的摩尔比为1∶2；

步骤5)所述反应温度为30～120℃；

化合物D3可以制成口服剂、皮下、肌肉和静脉注射剂，用于制备具有抗炎作用的制剂，特别是用于MRSA脓毒症的预防和治疗，其剂量为127.4nmol/kg，每天一次用药。

化合物D3在L-半胱氨酸的条件下，能缓慢释放出NO，为NO供体型地塞米松。与原药地塞米松相比，D3对脂多糖(LPS)激活的小鼠腹腔巨噬细胞产生的前炎症因子TNF-α和IL-6具有更显著的抑制作用，表明其体外抗炎活性要明显优于地塞米松。在实验性MRSA脓毒症模型中，与对照组相比，D3可以显著提高小鼠的生存率，而地塞米松与对照组无显著差异。在MRSA感染的亚致死模型中，D3可以显著降低小鼠的炎症程度。D3在体外可以显著抑制MRSA生物膜的形成，减少生物膜的厚度，以及提高生物膜中细菌的死活比。

为了提高地塞米松的抗炎活性，降低其副作用，本发明通过连接基团将亚硝酸酯与地塞米松相连，得到了一种新型一氧化氮供体型地塞米松，该化合物还能够有效抑制生物膜形成，具有抗菌作用，实验证明，该一氧化氮供体型地塞米松在MRSA诱导的小鼠脓毒症模型中，有效地提高了小鼠的生存率，明显降低细菌定植量和炎症病理损伤。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1为D3体外NO的释放率；

图2为D3体外抗炎活性的评价；

图3为D3体外抑制MRSA生长活性的检测；

图4为D3体外抑制MRSA生长动力学的研究；

图5为D3抑制MRSA生物膜形成活性的检测；

图6为D3抑制MRSA生物膜形成表面结构图；

图7为D3抑制MRSA生物膜形成的三维结构图；

图8为D3治疗MRSA脓毒血症致死模型小鼠生存率曲线；

图9为D3治疗MRSA脓毒血症亚致死模型小鼠血液中前炎症因子的表达情况；

图10为D3治疗MRSA脓毒血症亚致死模型小鼠肾脏HE病理组织学观察结果。

具体上述方式

实施例中所用化学试剂均采用市售的分析纯试剂。

实施例1 4-羟基环己甲酸甲酯(2)的合成

将3.12g 4-氧代环己甲酸甲酯(1)(20mmol)溶于甲醇50mL中，搅拌下分次加入1.90g硼氢化钠(50mmol)，TLC显示反应完全后，减压除去溶剂，剩余物加冰水(50mL)，搅拌30分钟后二氯甲烷萃取(20mL×4)。无水硫酸钠干燥，过滤，除去溶剂后剩余物油泵减压蒸馏得无色液体产物2.88g，产率：91.1％。

实施例2 4-溴环己甲酸(3)的合成

4-溴环己甲酸甲酯(2.88g，1.82278mmol)与浓氢溴酸(25mL)的混合物加热至50℃搅拌反应24小时。反应液冷却后二氯甲烷(10mL×4)萃取四次，合并萃取液，无水硫酸钠干燥。过滤，旋干溶剂，剩余物溶于乙酸乙酯(10mL)，搅拌下缓慢滴加石油醚(约100mL)，冰水混合浴冷却下搅拌5h，过滤收集固体，得白色晶体状粉末1.92g，产率：50.9％。

实施例3 4-溴环己甲酰氯(4)的合成

250mL干燥三口瓶中加入1.92g化合物3(9.275mmol)和氯化亚砜10mL，装上带无水氯化钙干燥管的冷凝管，油浴加热至70℃，回流反应4小时。常压蒸馏除去过量的氯化亚砜，剩余物减压蒸馏，收集高沸点馏分(油泵减压)。得无色液体产物1.54g，产率：73.65％。

实施例4 地塞米松-21-(4-溴环己甲酸)酯(5)的合成

100mL干燥反应瓶中加入地塞米松(1.1172g，2.85mmol)，再加入干燥四氢呋喃(30mL)，搅拌溶解后，氮气流保护下用注射器滴加0.964g化合物4(4.275mmol)及0.866g三乙胺(8.55mmol)。混合物室温下搅拌反应过夜。减压除去溶剂，剩余物悬浮于乙酸乙酯/石油醚混合溶剂(50mL，1/10，v/v)，过滤，同样比例混合溶剂洗涤3次，固体再柱层析分离纯化，得产物1.36g，产率：82.0％。

实施例5 地塞米松-21-(4-硝氧基环己甲酸)酯(D3)的合成

将1.36g地塞米松4-溴环己甲酸酯(10)(2.3388mmol)溶于50mL干燥乙腈中，氮气流保护下加入硝酸银(0.795g，4.6776mmol)，反应液油浴加热至45℃反应过夜。反应液不处理直接硅胶柱分离纯化，得硝酸酯目标产物D3，其重量为1.06g，产率为76.3％。

化合物D3的结构经核磁共振氢谱确证：¹H NMR(CDCl₃，600MHz)δ(ppm)：7.176-7.193(d，1H，J＝10.2Hz)，6.312-6.328(d，1H，J＝10.2Hz)，6.095(s，1H)，5.663-5.709(m，1H)，4.841-4.930(m，2H)，4.349-4.364(d，1H，J＝8.0Hz)，3.071-3.106(m，1H)，2.670-2.714(m，1H)，2.570-2.625(td，1H，J₁＝6.0Hz，J₂＝13.8Hz)，2.290-2.416(m，6H)，2.032-2.192(m，4H)，1.796-1.848(m，2H)，1.618-1.774(m，7H)，1.502-1.574(m，2H)，1.525(s，3H).LS-MS(ES+)m/z：564

实施例6 D3体外释放NO能力的检测

将所合成化合物D3溶解于DMSO中，使其终浓度为2mM。以1∶1(v∶v)配制甲醇：PBS(pH 7.4)混合溶液2mL，加入L-半胱氨酸使其终浓度为5×10^-4mol/L，取药物和2mM NaNO₂标准品20ul加入以上含L-半胱氨酸的甲醇PBS溶液中，37℃反应1小时，从中取100ul测定其中NO的含量。硝普钠(SNP)做阳性对照，实验结果表明D3可以体外释放NO，释放率为16.7％，参见图1。

实施例7 D3体外抗炎活性的测定

分别称取2.82mg D3和2.0mg DEX溶于1ml DMSO中，再用DMSO分别稀释1000倍，2000倍和4000倍，使最终浓度浓度为5umol/ml，2.5umol/ml和1.25umol/ml。

取KM鼠2-4只，体质量为约20)g，眼球放血后颈椎脱臼处死，75％酒精消毒腹部皮肤，用外科剪剪一小口，撕开皮肤充分暴露腹壁，用5ml(9号针头)玻璃注射器向腹腔内注入5mL无菌DMEM培养液，用手指轻揉腹壁，然后回抽灌洗液，1000rpm离心5min收集细胞，用DMEM培养液配成1×10⁶cells/ml的细胞悬液，然后往96孔板中每孔加入上述细胞悬液200uL，边吹打边加入。细胞置培养箱中在饱和湿度、5％C02、37℃条件下培养2小时，让其充分贴壁。2小时后，观察到细胞有明显变形伸展现象，细胞贴壁密度在90％以上，说明细胞状态良好，可用于下一步实验。吸弃上清，并用DMEM培养液清洗掉未贴壁细胞。根据实验要求加入目标化合物或药物，继续培养适当的时间，然后收集上清用于炎症相关因子的测定。

LPS体外诱导的实验分组如下：空白组、LPS+DMSO组、地塞米松(DEX)(5uM)+LPS组、D3(5uM)+LPS组、D3(2.5uM)+LPS组、D3(1.25uM)+LPS组。以空白组为阴性对照，DEX为阳性对照，每组均设4复孔。24小时后取细胞培养上清用于TNF-α和IL-6的ELISA检测。实验结果表明，与原药地塞米松相比，D3对脂多糖(LPS)激活的小鼠腹腔巨噬细胞细胞产生的前炎症因子TNF-α和IL-6具有更显著的抑制作用，其体外抗炎活性要明显优于地塞米松，参见图2。

实施例8 D3对MRSA抗菌作用的评价

1.对MRSA体外抑菌效果的研究

10mL无菌MHB培养基中接种MRSA252，37℃过夜培养。紫外吸光仪检测菌液OD600吸光度，并用无菌MHB调节菌液吸光度约为1.0，此时细菌浓度约为2×10⁹CFU/mL。加入终浓度分别为500、250、100、50、25、10、5、1μM的DEX、D3、ISMN和乙醇对照液20μL和菌液180μL，加入水平摇床150rpm摇匀1min，放入恒温培养箱，37℃培养24h，用酶标仪在波长600nm处检测吸光度值。根据吸光度值，判定抑菌效果。实验结果显示，随着浓度的降低，细菌的OD值逐渐增加，而D3的吸光度数值则均低于其它组，说明随着浓度的增加，其抑菌作用增加，参见图3

2.对MRSA体外抑菌动力学的研究

10ml无菌MHB培养基中接种细菌，37℃过夜培养。紫外吸光仪检测菌液OD600吸光度，并用无菌MHB调节菌液吸光度为1，此时细菌浓度约为2×10⁹CFU/mL。继续用无菌MHB培养基稀释10,000倍(取100μL菌液加入到10ml的无菌MHB培养基中，摇匀，再取100μL稀释后的菌液加入到10mL无菌MHB培养基中)此时细菌的浓度约为2×10⁵CFU/mL。吸取菌液1.8mL和0.2mL浓度均为5mmol/mL的DEX和DEX-3，放入37℃氧培养箱，培养0、4、8、12、24h。孵育不同时间后，用MHB稀释0，10¹，10²，10³和10⁴倍，取5μL稀释溶液到MHA平板，放在37℃24h，用自动菌落计数仪计数。在相同溶媒及摩尔浓度条件下，D3存在下MRSA252在生长至平台期的菌浓度比DEX低约2个数量级，且在8h左右，既生长对数期中段内两者差别的增加最为明显，参见图4。说明D3具有抑制MRSA252生长的作用。

实施例9 D3对MRSA生物膜形成的影响研究

1.用结晶紫染色法观察对影响生物膜形成量的影响：

根据前期预实验，发现D3对MRSA在其均为50μM的浓度下，对其有良好的抑菌作用。因此，我们在生物膜形成的影响研究下，选择D3、DEX终浓度均为50μM。将MRSA252培养的菌液调节至OD＝1.0，再将菌液用MHB液体培养基稀释100倍后根据药物：菌液(1∶9)比例吸取1.8ml放入24孔细胞培养板，放入37℃条件下培养24h、48h取出。弃去上清液，用PBS清洗2～3次，室温干燥30min，每孔加入0.1％的结晶紫200μL，15min染色，用PBS同样方法清洗3次，室温干燥10min。在加入33％冰乙酸200μL/孔于96孔板中，微量震荡器上震荡30min，用酶标仪在波长为570nm处检测其OD数值，每孔重复3次，以不含菌悬液的孔作为基数对照。实验结果显示，D3组的生物膜在24小时和48小时形成量最少，且和DEX之间存在显著性差异，提示D3对MRSA生物膜的形成具有明显抑制作用，参见图5。

2.扫描电镜观察D3对影响生物膜形成表面结构的影响

在24孔细胞培养皿内放入环氧乙烷灭菌的1cm×1cm聚苯乙烯塑料片，将调节OD＝1.0的MRSA252菌液用TSB液体培养基稀释100倍后吸取1.8mL和0.2mL DEX或D3于24孔细胞培养板中。放入37℃条件下培养24h。将其塑料片小心取出，用2.5％戊二醛固定，依次用50％、70％、80％、90％酒精各脱水1次，然后用100％酒精脱水2次，醋酸异戊酯脱水2次，每次均为5min，CO2冷冻干燥5h，载体表面在真空条件下镀金粉，置于扫描电镜下观察，每个标本均分四个象限观察，每个象限随机观察3个视野。扫描电镜检测结果，，DEX组生物膜表面形态与对照组差异不大，而D3组生物膜则呈小团聚集，将其进一步放大后观察到D3有大量空壳状物存在，表明大量空壳可能是死细菌，参见图6。

3.用激光共聚焦观察对影响生物膜形成三维结构的影响

(1)生物膜样本的制备：在24孔细胞培养皿内放入环氧乙烷灭菌的1cm×1cm聚苯乙烯塑料片，|将调节OD＝1.0的252菌液用TSB液体培养基稀释100倍后吸取1.8mL和DEX或DEX-3 0.2mL于24孔细胞培养板中。放入37℃条件下培养24h。将其塑料片小心取出，用1mL PBS液轻洗去除黏附松散细菌，重复两次，置于载玻片上，然后取200μL上述荧光染液滴于聚苯乙烯塑料片上的生物膜，于室温、黑暗环境中孵育15min后，加入200μLPBS液缓冲液洗涤生物膜标本，去除生物膜表面其他附着物。

(2)荧光染液的配制：荧光染色剂为L-7012Live/Dead BacLight BacterialViability Kit，含有两种荧光染液SYTO9和PI，其中SYTO9可使活菌发出绿色荧光，PI可使死菌发出红色荧光，从而可以在镜下区分活菌和死菌。荧光染液的配制按SYTO9∶PI∶蒸馏水＝1.5μL∶1.5μL∶1mL的比例将3种试剂加入同一离心管，振荡混匀备用。

(3)封片：黑暗环境下，在生物膜上滴1滴p-苯二胺抗淬灭剂(90％甘油，10％PBS液，pH为8.5-9.0，其中p-苯二胺浓度为2.7mM)，再滴1滴PBS液缓冲液，盖上盖玻片，4℃避光存放并立即镜检。

(4)激光共聚焦扫描显微镜观察：将上述标本倒置于激光共聚焦扫描显微镜下观察。其中死菌为红色，活菌为绿色。每个生物膜标本由外(生物膜游离的一面)向内(生物膜和聚苯乙烯塑料片相贴的一面)逐层沿Z轴扫描，步距(Z轴)为1μm。得到断层扫描图像。每个标本均分四个象限观察，每个象限随机观察3个视野。观察条件：氩激光(514-488nm)，氦氖激光(543nm)，物镜×20，物镜×10，油镜×63，目镜×10。

(5)图像分析：通过专业软件处理得到生物膜的厚度，将各断层扫描图像应用软件进行组合，得到变链菌生物膜的三维图像。并应用Image图像分析软件分别计算死菌和活菌连续扫描图像最内层、中间层及最外层红光和绿光面积，其分别代表生物膜内层、中间层及外层的情况，对死菌和活菌进行计数，计算细菌密度、死活菌百分比。计算公式分别为：

每层细菌密度＝(每层红光+绿光面积的总和)变链菌/每层生物膜面积

每层活菌百分比＝[每层绿光面积/(每层红光+绿光面积的总和)]×100％

D3对抑制MRSA生物膜形成的三维结构，激光共聚焦检测结果如图所示，D3的活细胞数量较对照组以及DEX，ISMN组，死细胞比例均有显著增长，表明其对生物膜的影响可能主要是通过造成生物膜内细菌死亡引起的，参见图7。

实施例10 D3对MRSA脓毒血症致死小鼠模型体内药效学评价

将MRSA252三线法接种于MHA固体培养基上，37℃培养过夜。将培养过夜后细菌单菌落接种于10mL MHB液体培养基中，培养过夜后的细菌再按1∶10比例转种培养6h。将培养后细菌离心(5000g，5min)，弃去上清，将细菌用0.1M PBS(pH＝7.0)洗涤三次，再用PBS溶解，用紫外分光光度计测定其OD值，并用MHB液体培养基调节至其OD＝1.0。小鼠尾静脉注射200μL含PBS稀释的浓度为9×108CFU/小鼠的MRSA252菌液。

实验分组：实验分组及给药剂量见表1。

表1 脓毒血症致死小鼠的实验分组及给药剂量表

组别	给药剂量	每组动物数
			DEX组	0.05mg/kg	8
D3组	0.072mg/kg	8
			ISMN组	0.038mg/kg	8
溶剂对照组	200μL/mice	8
			空白PBS对照组	200μL/mice	8

动物处理：小鼠攻毒后，2h每组根据表1的给药剂量和药物进行腹腔注射给药，每天1次，连续3天。连续7天，每天观察小鼠的存活状态，记录其存活率，绘制其生存曲线。实验结果表明，攻读后各对照组以及地塞米松组小鼠的生存率均低于30％，而D3组的生存率高达75％，说明D3治疗能够显著提高MRSA引起的脓毒症的存活率，参见图8。

实施例11 D3对体内亚致死感染小鼠动物模型体内药效学评价

1.亚致死感染小鼠模型的建立

将MRSA252三线法接种于MHA固体培养基上，37℃培养过夜。将培养过夜后细菌单菌落接种于10mLMHB液体培养基中，培养过夜后的细菌再按1∶10比例转种培养6h。将培养后细菌离心(5000g，5min)，弃去上清，将细菌用0.1M PBS(pH＝7.0)洗涤三次，再用PBS溶解，用紫外分光光度计测定其OD值，并用MHB液体培养基调节至其OD＝1.0。小鼠尾静脉注射200μL含PBS稀释的浓度为3×10⁸CFU/小鼠的MRSA252菌液。

2.实验分组以及动物处理

实验分组：实验分组及给药剂量见表2。

表2 亚致死感染小鼠的实验分组及给药剂量表

组别	给药剂量	只数
			DEX	0.05mg/kg	21
D3	0.072mg/kg	21
			ISMN	0.038mg/kg	21
溶剂对照组	200μL/mice	21
			PBS对照组	200μL/mice	21

动物处理：小鼠攻毒后2h，每组根据表2的给药剂量和药物进行腹腔注给药，每天1次，连续3次。在感染后在6h，12h、24h各组分别处死6只小鼠，去其脾脏、肾脏、血清。

3.血清中细胞因子的检测

将C57小鼠眼球取血，将静置后全血置于冷冻离心机中，1500rpm，4℃离心15min。小心吸取上层血清，分别装入新的PCR管中，-80℃冻存，待测细胞因子。用IL-1β，TNF-α，IL-6试剂盒测定血清中的含量。小鼠血清中TNF-α，IL-6和IL-1β等前炎症细胞因子检测结果如图9所示。

4.肾脏病理组织的观察

攻毒后第三天，每组处死剩余3只小鼠(颈椎脱臼)，取肾脏组织于1mlPBS中漂洗2次，置于0.5ml多聚甲醛中，室温下固定一周，送出切片与HE染色。相同摩尔浓度，相同剂量下D3治疗后在感染第三天未见明显的病理改变，DEX治疗虽然有一定的抗炎作用，但D3的抗炎效果明显高于地塞米松，参见图10。

结论：本发明中所涉及的一氧化氮供体型地塞米松体外抗炎活性优于地塞米松，并且具备地塞米松所没有的活性，包括体外抑制MRSA生长，体外抑制MRSA生物膜的形成，以及导致MRSA生物膜内细菌死亡等作用。此外，该化合物可以显著提高MRSA脓毒症致死模型中小鼠的生存率，在亚致死模型中降低小鼠炎症病理损伤，在控制MRSA脓毒症方面具有显著优势。

Claims (10)

1.一种一氧化氮供体型地塞米松，其特征在于，其结构如式D3所示：

该一氧化氮供体型地塞米松的化学名称为地塞米松-21-(4-硝氧基环己甲酸)酯。

2.权利要求1所述的一氧化氮供体型地塞米松的制备方法，其特征在于，其制备方法有以下步骤：

1)4-羟基环己甲酸甲酯(2)的合成

4-氧代环己甲酸甲酯(1)溶于甲醇中，搅拌下加入硼氢化钠，反应完全后，减压除去溶剂，剩余物加冰水，搅拌30分钟后二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，除去溶剂后剩余物油泵减压蒸馏得4-羟基环己甲酸甲酯；

2)4-溴环己甲酸(3)的合成

步骤1)所得4-羟基环己甲酸甲酯与氢溴酸的混合物加热至50℃搅拌反应24小时，反应液冷却后二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，剩余物溶于乙酸乙酯，搅拌下缓慢滴加石油醚，冰水混合浴冷却下搅拌5h，过滤收集固体，得4-溴环己甲酸(3)白色晶体状粉末；

3)4-溴环己甲酰氯(4)的合成

步骤2)所得4-溴环己甲酸(3)和氯化亚砜在无水条件下油浴加热至70℃，回流反应4小时，常压蒸馏除去过量的氯化亚砜，剩余物减压蒸馏，收集高沸点馏分，得4-溴环己甲酰氯(4)；

4)地塞米松-21-(4-溴环己甲酸)酯(5)的合成

氮气保护下，地塞米松溶与4-溴环己甲酰氯(4)及缚酸剂发生反应，减压除去溶剂，乙酸乙酯/石油醚混合溶剂洗涤，过滤，柱层析分离纯化，得地塞米松-21-(4-溴环己甲酸)酯(5)；

5)地塞米松-21-(4-硝氧基环己甲酸)酯(D3)的合成

步骤4)所得地塞米松-21-(4-溴环己甲酸)酯(5)溶于乙腈中，氮气流保护下加入硝酸银，反应过夜，硅胶柱分离纯化，得地塞米松-21-(4-硝氧基环己甲酸)酯(D3)。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤4)所用反应溶剂为四氢呋喃、丙酮、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、三氯甲烷或甲苯。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤4)所述反应温度为-30～60℃。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤4)所述缚酸剂为三乙胺、吡啶、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、碳酸钾或氢氧化钾。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤4)所述的乙酸乙酯/石油醚混合溶剂的体积比为1_∶10。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤5)所述地塞米松-21-(4-溴环己甲酸)酯(5)与硝酸银的摩尔比为1_∶2。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤5)所述反应温度为30～120℃。

9.权利要求1所述的一氧化氮供体型地塞米松在制备治疗抗炎药物中的应用。

10.权利要求1所述的一氧化氮供体型地塞米松在制备预防和治疗由MRSA引起的脓毒症药物中在的应用。