CN110235863A - 捻转血矛线虫体外培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种捻转血矛线虫体外培养方法。所述方法包括：采集捻转血矛线虫虫卵，经无菌处理后，将虫卵置于捻转血矛线虫幼虫培养液中培养至感染性三期幼虫。其中，所述捻转血矛线虫幼虫培养液中含有NCTC‑109培养基、OP50大肠杆菌和水溶性两性霉素B。本发明提供的捻转血矛线虫体外培养方法，通过选择最适培养基并降低培养液中培养基的含量，并向培养液中加入大肠杆菌和水溶性两性霉素B，使得捻转血矛线虫可在无杂菌污染的环境下更好地发育到感染性三期幼虫。本发明为捻转血矛线虫的体外培养研究，捻转血矛线虫发育生物学，新兽药筛选与耐药性检测，功能基因和致病机制研究奠定了坚实的基础。
Description
技术领域
本发明涉及寄生虫的体外培养方法，具体地说，涉及捻转血矛线虫体外培养方法。
背景技术
捻转血矛线虫病(Haemonchosis)是由牛羊等反刍动物感染捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)而引起的一种传播性疾病。该病原为土源性寄生虫，无需中间宿主即可在反刍动物体内发育至成虫。捻转血矛线虫通过吸食宿主的血液获取营养，进而造成宿主贫血、消瘦、被毛粗糙、生产性能降低，严重时可致被寄生动物死亡，尤其是幼畜，死亡率可达30％。
常规培养捻转血矛线虫感染性三期幼虫的方法是收集新鲜粪便后，加入适量的锯末或蛭石直接培养，然后利用贝尔曼氏法收集幼虫并进行鉴定。研究显示，在羊粪中添加锯末要比添加蛭石时的捻转血矛线虫发育率高，可能是因为锯末不仅可以吸收和释放水份，调节培养物的湿度，同时使粪便疏松，通气性更好，从而保证了虫卵发育时所需的氧气和水分，进一步提高了虫卵孵化率和幼虫发育率。
在无氧条件下，虫卵室温下放置7天后再次培养，与新鲜虫卵的发育水平无明显差异。但捻转血矛线虫卵孵化过程需要氧气参与，液体培养基培养时要注意液层深度；虫卵孵化过程不需要营养，但受温度、湿度、渗透压、pH等物理条件的影响。孵化出的幼虫虽然可以摄取培养液中的营养物质，但仍需捕食细菌来补充某些营养成分，以保证生长发育。
现有的培养体系，对于现场羊只粪便中收集的虫卵，因杂菌数量相对较多，虫卵未经处理直接接入培养液后，仅通过在培养液中添加青链霉素和两性霉素不足以抑制杂菌生长。
发明内容
本发明的目的是提供一种捻转血矛线虫体外培养方法。
本发明的另一目的是提供一种捻转血矛线虫幼虫培养液。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种捻转血矛线虫幼虫培养液，所述培养液中含有NCTC-109培养基、OP50大肠杆菌和水溶性两性霉素B。
进一步地，所述培养液中还添加有适量水。
优选地，所述培养液按200μL计，包括如下组分：17.5％的NCTC-109培养基，OP50大肠杆菌菌液10μL，1.5±1μg/mL水溶性两性霉素B，余量为水。
其中，所述OP50大肠杆菌菌液的制备方法如下：取1mL OP50大肠杆菌种子液转入盛有100mL LB液体培养基的三角瓶内，37℃，150r/min培养3～5h至菌液OD600＝0.4～0.5，即得。
第二方面，本发明提供所述培养液在捻转血矛线虫体外培养中的应用。
第三方面，本发明提供一种捻转血矛线虫(幼虫)体外培养方法，采集捻转血矛线虫虫卵，经无菌处理后，将虫卵置于上述培养液中培养至幼虫(三期幼虫)。
前述的方法，培养液中接入的虫卵密度为400±100枚/mL。
前述的方法，培养条件为：27±0.5℃恒温培养。
其中，虫卵无菌处理的具体方法为：虫卵先用0.4％甲醛洗3次，然后用150±50U/mL青链霉素(以青霉素计)洗2～3次，最后用灭菌生理盐水或无菌水洗2～3次。所述青链霉素优选100U/mL青霉素，0.1mg/mL链霉素。
可选地，用48孔细胞培养板培养虫卵。
本发明所有操作均在超净工作台中完成。所用试剂耗材也均经过无菌处理。
新鲜的捻转血矛线虫虫卵形态，孵化后的捻转血矛线虫虫卵形态，捻转血矛线虫一期幼虫，二期幼虫及三期幼虫分别见图1～图5。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明提供的捻转血矛线虫(幼虫)体外培养方法，通过选择最适培养基并降低培养液中培养基的含量，并向培养液中加入大肠杆菌和水溶性两性霉素B，使得捻转血矛线虫可在无杂菌污染的环境下更好地发育到感染性三期幼虫。虫卵到幼虫的孵化率为90％以上，幼虫发育率达85％以上。
(二)该培养方法中使用的虫卵为无菌处理后的纯净捻转血矛线虫虫卵，所用培养液成分包括NCTC-109培养基、大肠杆菌和水溶性两性霉素B。该培养液在保证捻转血矛线虫幼虫发育所需的全部营养成分以外，确保了培养基无杂菌污染。
(三)本发明为捻转血矛线虫的体外培养研究，捻转血矛线虫发育生物学，新兽药筛选与耐药性检测，功能基因和致病机制研究奠定了坚实的基础。
附图说明
图1为本发明新鲜的捻转血矛线虫虫卵形态(100×)。
图2为本发明孵化后的捻转血矛线虫虫卵形态(250×)。
图3为本发明捻转血矛线虫一期幼虫(250×)。
图4为本发明捻转血矛线虫二期幼虫(250×)。
图5为本发明捻转血矛线虫三期幼虫(100×)。
图6为本发明实施例1中培养液对幼虫发育的影响。
图7为本发明实施例2中培养液中血清对幼虫发育的影响。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1捻转血矛线虫幼虫最适发育培养液的筛选
1、仪器及耗材
恒温培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；超净工作台，ESCO(上海)贸易有限公司；移液器，艾本德(上海)国际贸易有限公司；光学显微镜，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；倒置显微镜，重庆奥特生物仪器有限责任公司；低速离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；电子天平，赛多利斯(上海)贸易有限公司。细胞培养板、载玻片、平皿、烧杯、网筛(40目、200目、300目、500目)、研钵、硬塑料板、洗瓶、吸管等。
2、试剂及溶液配制
RPMI-1640、MEM、DMEM、W’S、M199、NCTC-109培养基，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；DMEM/F12(1:1)，购自上海生物工程有限公司；无菌无酶水，购自北京天根生化有限公司；水溶性两性霉素B，购自北京索莱宝科技有限公司。生理盐水，购自内蒙古驰誉药液有限公司；新生牛血清，购自草原绿野生物工程材料有限公司。NCTC-109培养基的详细配方见表1。
0.5mg/mL水溶性两性霉素B母液：25mg水溶性两性霉素B，加50mL无菌去离子水溶解，过滤除菌，-20℃避光保存。
3、试验动物与虫卵
试验动物来自内蒙古农牧业科学院人工感染捻转血矛线虫的用于传代的绵羊。
直肠采集绵羊新鲜粪便，放入50mL离心管中，加入蒸馏水至50mL，摇动几次，带回实验室收集虫卵。
(1)取无氧条件下保存的新鲜粪便约20g，放入研钵碾碎，加500mL饱和食盐水混匀；
(2)依次过40目、200目、300目网筛，滤液中加入100mL 20％蔗糖水，混匀；
(3)将滤液倒入大平皿中，补充饱和食盐水，使液面与平皿齐平，盖上一个硬塑料板；
(4)15min后，慢慢取下硬塑料板，用蒸馏水将粘在硬塑料板上的虫卵冲洗到烧杯中，再用500目网筛过滤；
(5)将筛网上的虫卵冲洗到小烧杯中，并进行虫卵计数。
(6)将收集的虫卵3000r/min离心，0.4％甲醛溶液清洗三次后用双抗(100U/mL青霉素，0.1mg/mL链霉素)清洗三次，最后无菌水漂洗三次并调节虫卵浓度为4000枚/mL。
4、最适幼虫发育培养液的筛选
以48孔细胞培养板培养虫卵，200μL培养液(以无菌水配制)中加入虫卵25μL，加入水溶性两性霉素B至终浓度1.5μg/mL，OP50大肠杆菌菌液10μL(菌液OD600＝0.4)。以生理盐水做空白对照，每种培养液三个平行对照。27℃恒温培养7d，分别计算各培养液(RPMI-1640、DMEM/F12(1:1)、MEM、DMEM、W’S、M199、NCTC-109、生理盐水)中含17.5％的培养基时捻转血矛线虫幼虫的发育率。对数据进行分析比较。同时以上述8种培养基全液为对照组。
所述OP50大肠杆菌菌液的制备方法如下：取1mL OP50大肠杆菌种子液转入盛有100mL LB液体培养基的三角瓶内，37℃，150r/min培养4h左右(菌液OD600＝0.4)。将培养好的菌液分装，于4℃保存备用。
结果显示，捻转血矛线虫幼虫在DMEM/F-12(1:1)、NCTC-109、MEM、RPMI-1640、W'S、DMEM、M199和生理盐水8种培养基全液中三期幼虫发育率分别为5.12％、65.34％、52.28％、47.65％、0.00％、0.00％、35.45％和33.33％；其中NCTC-109培养液中的发育率最高；W’S和DMEM中未发育；平均发育率为29.89％。在含17.5％培养基的培养液中，DMEM/F-12(1:1)、NCTC-109、MEM、RPMI-1640、W'S、DMEM、M199和生理盐水的三期幼虫发育率分别为68.69％、87.56％、73.93％、64.23％、49.47％、70.57％、51.90％和33.33％；其中NCTC-109培养液中的发育率最高；生理盐水最低，其次为W’S；平均发育率为62.46％。含17.5％培养基的培养液和全培养基作为培养液对比，含17.5％培养基的培养液中的发育率相对更高。
图6所示为培养液对幼虫发育的影响。
实施例2培养液中血清浓度的筛选
据资料介绍，离体培养细胞及进行寄生虫体外培养时，常添加10％～20％的血清。以NCTC-109全培养基作为培养液，实验分为4组，血清浓度分别为0、10％、20％、30％，每组3个重复，培养方法同上。分别计算三期幼虫发育率，并对数据进行分析比较。结果显示，在加入0％、10％、20％、30％新生牛血清的培养液中，捻转血矛线虫的幼虫平均发育率分别为63.05％、5.41％、10.91％、24.68％；在不添加血清的培养液中，捻转血矛线虫的发育率最高。在10％～30％血清范围内，捻转血矛线虫的幼虫发育率随着血清浓度的增加有所提升，但发育率最高也不足不加血清培养液的1/2。
图7所示为培养液中血清对幼虫发育的影响。
实施例3具体应用实例
在家畜捻转血矛线虫病防控实践中，由于疫苗缺失，因此，以基于化学驱虫药物的治疗或预防性驱虫为主。但随着化学驱虫药物的不规范使用，捻转血矛线虫对常用驱虫药物均产生了一定的耐药性。而现有的耐药性检测方法中，以粪便虫卵减少试验和幼虫发育抑制试验最为常用，而且后者可在实验室进行检测，进而通过药物半数致死率评估其耐药程度。
以幼虫发育抑制试验检测捻转血矛线虫对伊维菌素的耐药性程度为例。首先需采集待检捻转血矛线虫虫卵并按照实施例1的方法进行无菌处理。之后，以48孔细胞培养板为容器，利用该培养方法，每孔加入200μL培养液，每孔加入约100个虫卵，设置12个药物浓度梯度(浓度依次为0ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、3.9ng/mL、7.8ng/mL、15.6ng/mL、31.25ng/mL、62.5ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL)，于27℃恒温箱培养7d后，倒置显微镜下观察，记录L3(三期)幼虫数和未发育至L3幼虫数。以药物浓度的对数为自变量x值，以幼虫发育抑制率为因变量y值，建立线性回归方程(y＝ax+b)，求出半数致死量(LD50)，最终确定捻转血矛线虫对伊维菌素的耐药程度。
利用该方法，对于现场分离的捻转血矛线虫伊维菌素敏感分离株(SX-S)，线性回归方程为y＝0.4298x+0.3442(R2＝0.7742)，LD50为2.08ng/mL。对于现场分离的捻转血矛线虫耐伊维菌素分离株(WS-R)，线性回归方程为y＝0.2831x+0.1277(R2＝0.8346)，LD50为24.05ng/mL。
所述培养液的配方为：按200μL计，质量百分数为17.5％的NCTC-109培养基，OP50大肠杆菌菌液(OD600＝0.4)10μL和1.5μg/mL水溶性两性霉素B，余量为水。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
表1 NCTC-109培养基配方
Claims (10)
1.捻转血矛线虫幼虫培养液，其特征在于，所述培养液中含有NCTC-109培养基、OP50大肠杆菌菌液和水溶性两性霉素B。
2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述培养液中还添加有适量水。
3.根据权利要求2所述的培养液，其特征在于，所述培养液按200μL计，包括如下组分：17.5％的NCTC-109培养基，OP50大肠杆菌菌液10μL，1.5±1μg/mL水溶性两性霉素B，余量为水；
其中，所述OP50大肠杆菌菌液的制备方法如下：取1mL OP50大肠杆菌种子液转入盛有100mL LB液体培养基的三角瓶内，37℃，150r/min培养3～5h至菌液OD600＝0.4～0.5，即得。
4.权利要求1-3任一项所述培养液在捻转血矛线虫体外培养中的应用。
5.捻转血矛线虫体外培养方法，其特征在于，采集捻转血矛线虫虫卵，经无菌处理后，将虫卵置于权利要求1-3任一项所述的培养液中培养至感染性三期幼虫。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，培养液中接入的虫卵密度为400±100枚/mL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，用48孔细胞培养板培养虫卵。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，培养条件为：27±0.5℃恒温培养。
9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于，虫卵无菌处理的具体方法为：虫卵先用0.4％甲醛洗3次，然后用150±50U/mL青链霉素洗2～3次，最后用灭菌生理盐水或无菌水洗2～3次。
10.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于，所有操作均在超净工作台中完成。
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