JP2003533192A - 細胞保存のための凍結保護剤の微量注入 - Google Patents
細胞保存のための凍結保護剤の微量注入Info
- Publication number
- JP2003533192A JP2003533192A JP2001583540A JP2001583540A JP2003533192A JP 2003533192 A JP2003533192 A JP 2003533192A JP 2001583540 A JP2001583540 A JP 2001583540A JP 2001583540 A JP2001583540 A JP 2001583540A JP 2003533192 A JP2003533192 A JP 2003533192A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- extracellular
- cell
- medium
- carbohydrate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 title claims description 19
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 title description 44
- 238000004321 preservation Methods 0.000 title description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 159
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 84
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims abstract description 76
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims abstract description 75
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 59
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims abstract description 59
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims abstract description 59
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims abstract description 31
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims abstract description 28
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims abstract description 18
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 claims abstract description 16
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims abstract description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims abstract description 4
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 claims abstract description 4
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 claims description 100
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 38
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 30
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 29
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims description 19
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 18
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 claims description 15
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 7
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 claims description 6
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 6
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 claims 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims 1
- UQZIYBXSHAGNOE-USOSMYMVSA-N Stachyose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]2[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O2)O1 UQZIYBXSHAGNOE-USOSMYMVSA-N 0.000 claims 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 claims 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims 1
- UQZIYBXSHAGNOE-XNSRJBNMSA-N stachyose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)O2)O)O1 UQZIYBXSHAGNOE-XNSRJBNMSA-N 0.000 claims 1
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 claims 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 abstract description 7
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 5
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 abstract description 2
- 230000000513 bioprotective effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 54
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 32
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 27
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 16
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 15
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 15
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 12
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 12
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 12
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 12
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 12
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 12
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 12
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 6
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 6
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 4
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 4
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 3
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 3
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 3
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 2
- 206010020852 Hypertonia Diseases 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029803 blastocyst development Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 2
- HOVAGTYPODGVJG-UHFFFAOYSA-N methyl beta-galactoside Natural products COC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HOVAGTYPODGVJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- 238000010587 phase diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000000859 sublimation Methods 0.000 description 2
- 230000008022 sublimation Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- -1 10M carbohydrate Chemical class 0.000 description 1
- VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 2',7'-difluorofluorescein Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(F)C(=O)C=C2OC2=CC(O)=C(F)C=C21 VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000282979 Alces alces Species 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000282817 Bovidae Species 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241001331845 Equus asinus x caballus Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 1
- 208000007976 Ketosis Diseases 0.000 description 1
- 241000282842 Lama glama Species 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 229930182474 N-glycoside Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001502414 Ovis canadensis Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001323 aldoses Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- OCIBBXPLUVYKCH-QXVNYKTNSA-N alpha-maltohexaose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O[C@@H]3[C@H](O[C@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H](O[C@@H]5[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]5O)CO)[C@H](O)[C@H]4O)CO)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O OCIBBXPLUVYKCH-QXVNYKTNSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000009932 biopreservation Methods 0.000 description 1
- 210000004952 blastocoel Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- GTSMOYLSFUBTMV-UHFFFAOYSA-N ethidium homodimer Chemical compound [H+].[H+].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2C(C)=[N+]1CCCNCCNCCC[N+](C1=CC(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C=C11)=C1C1=CC=CC=C1 GTSMOYLSFUBTMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 229950006191 gluconic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 1
- 239000000819 hypertonic solution Substances 0.000 description 1
- 229940021223 hypertonic solution Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002584 ketoses Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 150000003893 lactate salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010872 live dead assay kit Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- DJMVHSOAUQHPSN-UHFFFAOYSA-N malto-hexaose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 DJMVHSOAUQHPSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- HOVAGTYPODGVJG-ZFYZTMLRSA-N methyl alpha-D-glucopyranoside Chemical compound CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HOVAGTYPODGVJG-ZFYZTMLRSA-N 0.000 description 1
- HOVAGTYPODGVJG-XUUWZHRGSA-N methyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HOVAGTYPODGVJG-XUUWZHRGSA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 150000002840 non-reducing disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 150000004728 pyruvic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002522 swelling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000626 ureter Anatomy 0.000 description 1
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 150000008135 α-glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 150000008136 β-glycosides Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
- Y10T436/108331—Preservative, buffer, anticoagulant or diluent
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Spectrometry And Color Measurement (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Nuclear Medicine (AREA)
Abstract
(57)【要約】
細胞膜を有する生物学的材料の保存法は、細胞に糖質を微量注入すること；貯蔵のために細胞を調製すること；生物学的材料を貯蔵すること；および、貯蔵された生物学的材料を貯蔵から回復することを含む。トレハロース、スクロース、フルクトース、デキストラン、およびラフィノースのような炭水化物系糖質を、生体-保護剤として使用することができる。
Description
【０００１】発明の分野
本発明は、凍結および／または乾燥により細胞を保存するために、糖質を含有
する細胞内保護剤の微量注入を用いた生物学的組織の保存に関する。
する細胞内保護剤の微量注入を用いた生物学的組織の保存に関する。
【０００２】発明の背景
近年、癌患者の化学療法および放射線療法の成功が増しつつあり、持続寛解が
達成されている。しかしこれらの療法の長期生存者の生殖系への慢性的な副作用
が、特に懸念される。女性に対するこれらの作用は、卵巣生殖細胞の枯渇および
不妊である。癌療法を受けた者には将来の受精喪失の可能性があるので、卵子バ
ンクの必要性が明らかにされつつある。卵母細胞の凍結は、体外受精と組合せた
場合、摘出療法、放射線療法または化学療法による生殖機能の喪失が予想される
将来妊娠を希望する女性にとって有益である。卵母細胞凍結は、ヒト胚凍結に代
わる可能性も提供しており、その結果胚凍結において遭遇する法律的・倫理的問
題点が避けられる。
達成されている。しかしこれらの療法の長期生存者の生殖系への慢性的な副作用
が、特に懸念される。女性に対するこれらの作用は、卵巣生殖細胞の枯渇および
不妊である。癌療法を受けた者には将来の受精喪失の可能性があるので、卵子バ
ンクの必要性が明らかにされつつある。卵母細胞の凍結は、体外受精と組合せた
場合、摘出療法、放射線療法または化学療法による生殖機能の喪失が予想される
将来妊娠を希望する女性にとって有益である。卵母細胞凍結は、ヒト胚凍結に代
わる可能性も提供しており、その結果胚凍結において遭遇する法律的・倫理的問
題点が避けられる。
【０００３】
1983年に最初にヒト胚極低温保存に成功し、現在では胚凍結は一般的手法とな
っている。これとは対照的に、ヒト卵母細胞の極低温保存については非常に限ら
れた成功例しか報告されていない。1500を超える極低温保存された卵母細胞によ
り、わずかに5例の妊娠が報告されている。従って現在の凍結法は、依然実験的
とみなされ、ヒト卵母細胞の極低温保存時に遭遇する難点を克服するために新規
手法が必要とされている。
っている。これとは対照的に、ヒト卵母細胞の極低温保存については非常に限ら
れた成功例しか報告されていない。1500を超える極低温保存された卵母細胞によ
り、わずかに5例の妊娠が報告されている。従って現在の凍結法は、依然実験的
とみなされ、ヒト卵母細胞の極低温保存時に遭遇する難点を克服するために新規
手法が必要とされている。
【０００４】
従来型の極低温保存技術は、例えばジメチルスルホキシド(DMSO)、グリセロー
ル、またはエチレングリコールなどの凍結保護剤の濃度1〜2Mでの浸透、それに
続く緩やかな凍結速度(0.3〜0.5℃/分)を含む。典型的には、卵母細胞は、過剰
な脱水および高い電解質濃度を含む有害な凍結条件への長期曝露のために損傷を
受ける。ガラス化保存(すなわち氷晶化を伴わない、ガラス質の物質の形成)と称
される代替法は、卵母細胞への凍結の致命的作用を避けるために、高濃度の凍結
保護剤混合物(6〜8M)を使用し、その後急冷される。
ル、またはエチレングリコールなどの凍結保護剤の濃度1〜2Mでの浸透、それに
続く緩やかな凍結速度(0.3〜0.5℃/分)を含む。典型的には、卵母細胞は、過剰
な脱水および高い電解質濃度を含む有害な凍結条件への長期曝露のために損傷を
受ける。ガラス化保存(すなわち氷晶化を伴わない、ガラス質の物質の形成)と称
される代替法は、卵母細胞への凍結の致命的作用を避けるために、高濃度の凍結
保護剤混合物(6〜8M)を使用し、その後急冷される。
【０００５】
ガラス化保存法は魅力的代替法ではあるが、これは、敏感な細胞に対する高い
凍結保護剤濃度の毒性作用および浸透圧作用が欠点である。これらふたつの手法
(緩徐な凍結-解凍および急速なガラス化保存)はいずれも、ヒト卵母細胞の極低
温保存に関して信頼できる成功を伴う結果をもたらしていない。従って、ヒト卵
母細胞貯蔵のための信頼できる技術が必要である。臨床医療における治療的道具
としての生細胞の適用に必要な哺乳類細胞の保存を提供するために、低レベルの
無毒の保存剤を使用しかつ様々な細胞に利用可能な簡単な手技を有する、生存し
ている有核細胞を保存するための新たなプロトコールが開発されなければならな
い。
凍結保護剤濃度の毒性作用および浸透圧作用が欠点である。これらふたつの手法
(緩徐な凍結-解凍および急速なガラス化保存)はいずれも、ヒト卵母細胞の極低
温保存に関して信頼できる成功を伴う結果をもたらしていない。従って、ヒト卵
母細胞貯蔵のための信頼できる技術が必要である。臨床医療における治療的道具
としての生細胞の適用に必要な哺乳類細胞の保存を提供するために、低レベルの
無毒の保存剤を使用しかつ様々な細胞に利用可能な簡単な手技を有する、生存し
ている有核細胞を保存するための新たなプロトコールが開発されなければならな
い。
【０００６】発明の概要
本発明の目的は、休眠状態での生細胞の貯蔵、およびその後の細胞の活動状態
への回復を可能にすることである。この方法は、哺乳類細胞膜に関して実質的に
不透過性であり、かつ一時的に休眠状態で貯蔵しその後活動状態に実質的に回復
することができるように細胞の生存力を維持するような保護剤を、細胞の細胞質
へ微量注入することを含む。この微量注入された細胞は、休眠状態へと入らせる
ような条件に晒され、この休眠状態にて貯蔵される。貯蔵された細胞は、その後
活動状態へと回復される。この方法には、存在したとしても最小限の有害な副作
用を細胞に引き起すような条件下で、あらゆる哺乳類細胞を必要時まで貯蔵する
ことができるという利点がある。
への回復を可能にすることである。この方法は、哺乳類細胞膜に関して実質的に
不透過性であり、かつ一時的に休眠状態で貯蔵しその後活動状態に実質的に回復
することができるように細胞の生存力を維持するような保護剤を、細胞の細胞質
へ微量注入することを含む。この微量注入された細胞は、休眠状態へと入らせる
ような条件に晒され、この休眠状態にて貯蔵される。貯蔵された細胞は、その後
活動状態へと回復される。この方法には、存在したとしても最小限の有害な副作
用を細胞に引き起すような条件下で、あらゆる哺乳類細胞を必要時まで貯蔵する
ことができるという利点がある。
【０００７】
従って本発明は、一部の態様において、細胞、好ましくは卵母細胞への、有効
な糖質を含有する保護剤の微量注入により始まるような、生細胞を保存する方法
を提供する。その他の保存されるのが好ましい細胞は、分化型細胞、例えば、上
皮細胞、神経細胞、表皮細胞、角化細胞、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、
B-細胞、T-細胞、赤血球、マクロファージ、単球、繊維芽細胞、または筋細胞；
ならびに、未分化型細胞、例えば、胚細胞、間葉細胞、または成体幹細胞を含む
。ある好ましい態様において、これらの分化型細胞は、これらが凍結または乾燥
状態から回復された後も分化し続け、未分化型細胞は、これらが回復された後も
未分化であり続ける。これらの細胞は、一倍体(DNA含量n；ここで「n」は、特定
の属または種の哺乳類の正常な一倍性染色体セットにおいて認められる染色体数
である)、二倍体(2n)、または四倍体(4n)であることができる。その他の細胞は
、膀胱、脳、食道、卵管、心臓、小腸、胆嚢、腎臓、肝、肺、卵巣、膵臓、前立
腺、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿管、尿道、または子宮由来
のものを含む。これらの細胞は、ヒトまたはヒト以外の哺乳類、例えばサル、類
人猿、雌牛、ヒツジ、オオツノヒツジ、ヤギ、バッファロー、レイヨウ、雄牛、
ウマ、ロバ、ラバ、シカ、ヘラジカ、カリブー、水牛、ラクダ、ラマ、アルパカ
、ウサギ、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、またはネコ
などに由来することができる。
な糖質を含有する保護剤の微量注入により始まるような、生細胞を保存する方法
を提供する。その他の保存されるのが好ましい細胞は、分化型細胞、例えば、上
皮細胞、神経細胞、表皮細胞、角化細胞、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、
B-細胞、T-細胞、赤血球、マクロファージ、単球、繊維芽細胞、または筋細胞；
ならびに、未分化型細胞、例えば、胚細胞、間葉細胞、または成体幹細胞を含む
。ある好ましい態様において、これらの分化型細胞は、これらが凍結または乾燥
状態から回復された後も分化し続け、未分化型細胞は、これらが回復された後も
未分化であり続ける。これらの細胞は、一倍体(DNA含量n；ここで「n」は、特定
の属または種の哺乳類の正常な一倍性染色体セットにおいて認められる染色体数
である)、二倍体(2n)、または四倍体(4n)であることができる。その他の細胞は
、膀胱、脳、食道、卵管、心臓、小腸、胆嚢、腎臓、肝、肺、卵巣、膵臓、前立
腺、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿管、尿道、または子宮由来
のものを含む。これらの細胞は、ヒトまたはヒト以外の哺乳類、例えばサル、類
人猿、雌牛、ヒツジ、オオツノヒツジ、ヤギ、バッファロー、レイヨウ、雄牛、
ウマ、ロバ、ラバ、シカ、ヘラジカ、カリブー、水牛、ラクダ、ラマ、アルパカ
、ウサギ、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、またはネコ
などに由来することができる。
【０００８】
本発明の方法は、低レベル、約6、5、4、3、2、もしくは1M未満もしくはこれ
と等しい、または約0.4M未満でさえあるような保存剤を有利に使用することがで
き、かつ保存剤として糖質単体を、または糖質を従来の凍結保護剤と組合わせて
、もしくは他の細胞内糖質もしくは細胞外糖質と組合わせて使用することができ
る。より好ましくは、糖質の細胞質濃度は、細胞の微量注入後および凍結または
乾燥前に、0.3、0.2、0.1、0.05、または0.01M未満である。糖質の細胞外濃度は
、好ましくは細胞を含む液体培地への希釈後に、0.3、0.2、0.1、0.05、または0
.01M未満である。細胞が、寒天プレートのような固形支持体上で増殖される場合
は、細胞と接触している保存剤中の糖質の濃度は、好ましくは0.3、0.2、0.1、0
.05、または0.01M未満である。別の好ましい態様において、細胞を含む培地中の
細胞外糖質の最終濃度は、細胞の微量注入後および凍結または乾燥前に、細胞内
糖質の細胞質濃度よりも少なくとも2、3、4、5、または10倍大きい。細胞内およ
び細胞外保存剤は、同じまたは異なる分子種であることができる。
と等しい、または約0.4M未満でさえあるような保存剤を有利に使用することがで
き、かつ保存剤として糖質単体を、または糖質を従来の凍結保護剤と組合わせて
、もしくは他の細胞内糖質もしくは細胞外糖質と組合わせて使用することができ
る。より好ましくは、糖質の細胞質濃度は、細胞の微量注入後および凍結または
乾燥前に、0.3、0.2、0.1、0.05、または0.01M未満である。糖質の細胞外濃度は
、好ましくは細胞を含む液体培地への希釈後に、0.3、0.2、0.1、0.05、または0
.01M未満である。細胞が、寒天プレートのような固形支持体上で増殖される場合
は、細胞と接触している保存剤中の糖質の濃度は、好ましくは0.3、0.2、0.1、0
.05、または0.01M未満である。別の好ましい態様において、細胞を含む培地中の
細胞外糖質の最終濃度は、細胞の微量注入後および凍結または乾燥前に、細胞内
糖質の細胞質濃度よりも少なくとも2、3、4、5、または10倍大きい。細胞内およ
び細胞外保存剤は、同じまたは異なる分子種であることができる。
【０００９】
好ましい保護剤は、単糖、二糖、およびその他のオリゴ糖のような糖質を含む
。好ましくは本保護剤は、実質的に不透過性であり、その結果保護剤の少なくと
も50、60、70、80、90、または95％は、能動または受動拡散により、形質膜を超
えて細胞の内外へと移動することはない。好ましい糖質は、低くとも-60、-50、
-40、-30、-20、-10、または0℃であるような最大凍結濃縮溶液のガラス転移温
度(Tg')を有する。このような糖質の例は図8に列記されたものである。その他の
糖質のTg'も、LevineおよびSladeの論文(J. Chem. Soc.、Faraday Trans. 1、84
:2619-2633(1988))に記載された方法のような常法を用い、型どおりに決定する
ことができる。Tg'が-50℃を下回る糖質または従来型凍結保護剤を、Tg'が-50℃
を上回る糖質と組合せることができ、その結果得られる混合物のTg'は、低くと
も-60、-50、-40、-30、-20、-10、または0℃であり、かつこの混合物は極低温
保存に使用される。
。好ましくは本保護剤は、実質的に不透過性であり、その結果保護剤の少なくと
も50、60、70、80、90、または95％は、能動または受動拡散により、形質膜を超
えて細胞の内外へと移動することはない。好ましい糖質は、低くとも-60、-50、
-40、-30、-20、-10、または0℃であるような最大凍結濃縮溶液のガラス転移温
度(Tg')を有する。このような糖質の例は図8に列記されたものである。その他の
糖質のTg'も、LevineおよびSladeの論文(J. Chem. Soc.、Faraday Trans. 1、84
:2619-2633(1988))に記載された方法のような常法を用い、型どおりに決定する
ことができる。Tg'が-50℃を下回る糖質または従来型凍結保護剤を、Tg'が-50℃
を上回る糖質と組合せることができ、その結果得られる混合物のTg'は、低くと
も-60、-50、-40、-30、-20、-10、または0℃であり、かつこの混合物は極低温
保存に使用される。
【００１０】
適当な単糖類には、アルデヒド基を有するもの(すなわちアルドース類)または
ケト基を有するもの(すなわちケトース類)が含まれる。単糖は、直鎖状または環
状であることができ、これらは様々な高次構造で存在することができる。その他
の糖質には、修飾されたものが含まれる(例えば、1個または複数のヒドロキシル
基がハロゲン、アルコキシ部分、脂肪族基と置換されているか、またはエーテル
、エステル、アミン、もしくはカルボン酸として官能基化されている)。修飾さ
れた糖質の例は、α-またはβ-グリコシド、例えばメチルα-D-グルコピラノシ
ドまたはメチルβ-D-グルコピラノシド；N-グリコシルアミン；N-グリコシド；D
-グルコン酸；D-グルコサミン；D-ガラクトサミン；および、N-アセチル-D-グル
コサミンを含む。その他の好ましい態様において、保存剤は、少なくとも10、25
、50、75、100、250、500、1000個またはそれ以上のモノマーを含むオリゴ糖で
ある。このオリゴ糖は、同一のモノマーまたは異なるモノマーの組合せからなる
ことができる。その他の適当なオリゴ糖は、ヒドロキシエチルデンプン、デキス
トラン、セルロース、セロビオース、およびグルコースを含む。他の適当な保存
剤は、糖残基を含みかつ加水分解により切断され糖質を生成するような化合物を
含む。更に別の適当な保存剤は、糖タンパク質および糖脂質を含み、これらは好
ましくはTg'が低くとも-60、-50、-40、-30、-20、-10、または0℃であり、分子
量が少なくとも120ダルトンであるような糖質に由来した1、2、3、4、5個または
それよりも多い糖残基の付加により修飾されている。「糖残基」とは、別の化合
物に結合することができる基を含む保護糖(protective sugar)を意味する。例え
ば、糖質内の反応基−例えばアルコール、第1級アミン、または第2級アミン−な
どは、化合物と反応し、この糖残基を含む化合物を生成することができる。
ケト基を有するもの(すなわちケトース類)が含まれる。単糖は、直鎖状または環
状であることができ、これらは様々な高次構造で存在することができる。その他
の糖質には、修飾されたものが含まれる(例えば、1個または複数のヒドロキシル
基がハロゲン、アルコキシ部分、脂肪族基と置換されているか、またはエーテル
、エステル、アミン、もしくはカルボン酸として官能基化されている)。修飾さ
れた糖質の例は、α-またはβ-グリコシド、例えばメチルα-D-グルコピラノシ
ドまたはメチルβ-D-グルコピラノシド；N-グリコシルアミン；N-グリコシド；D
-グルコン酸；D-グルコサミン；D-ガラクトサミン；および、N-アセチル-D-グル
コサミンを含む。その他の好ましい態様において、保存剤は、少なくとも10、25
、50、75、100、250、500、1000個またはそれ以上のモノマーを含むオリゴ糖で
ある。このオリゴ糖は、同一のモノマーまたは異なるモノマーの組合せからなる
ことができる。その他の適当なオリゴ糖は、ヒドロキシエチルデンプン、デキス
トラン、セルロース、セロビオース、およびグルコースを含む。他の適当な保存
剤は、糖残基を含みかつ加水分解により切断され糖質を生成するような化合物を
含む。更に別の適当な保存剤は、糖タンパク質および糖脂質を含み、これらは好
ましくはTg'が低くとも-60、-50、-40、-30、-20、-10、または0℃であり、分子
量が少なくとも120ダルトンであるような糖質に由来した1、2、3、4、5個または
それよりも多い糖残基の付加により修飾されている。「糖残基」とは、別の化合
物に結合することができる基を含む保護糖(protective sugar)を意味する。例え
ば、糖質内の反応基−例えばアルコール、第1級アミン、または第2級アミン−な
どは、化合物と反応し、この糖残基を含む化合物を生成することができる。
【００１１】
別の適当な細胞外保存剤は、レクチン、または細胞表面の糖タンパク質または
糖脂質の一部を形成する糖質に非共有結合または共有結合することができるよう
なタンパク質である。この結合は、細胞貯蔵時に細胞膜を安定化することができ
る。
糖脂質の一部を形成する糖質に非共有結合または共有結合することができるよう
なタンパク質である。この結合は、細胞貯蔵時に細胞膜を安定化することができ
る。
【００１２】
本発明において使用することができるその他の凍結保護剤の例は、分子量が少
なくとも120ダルトンである糖質、ポリオール、グリコシド、ポリマー、および
可溶性タンパク質を含む。図8および9に例示したように、より大きい分子量の化
合物は、比較的小さい化合物によって促進される温度よりも高い温度で、ガラス
形成を促進する傾向があり、このことは細胞のより高い温度での貯蔵を可能にす
る。
なくとも120ダルトンである糖質、ポリオール、グリコシド、ポリマー、および
可溶性タンパク質を含む。図8および9に例示したように、より大きい分子量の化
合物は、比較的小さい化合物によって促進される温度よりも高い温度で、ガラス
形成を促進する傾向があり、このことは細胞のより高い温度での貯蔵を可能にす
る。
【００１３】
微量注入された保護剤による、および任意に外部保護剤による処理後、細胞は
貯蔵のために調製される。一般に細胞は、凍結および／または乾燥により貯蔵の
ために調製することができる。凍結乾燥技術に加え、超急速(plunge)凍結、真空
乾燥、風乾が使用される。典型的には、卵母細胞は、0.1〜10℃/分の速度で、好
ましくは0.3〜5℃/分、およびより好ましくは0.5〜2℃/分までの速度で冷却され
る。体細胞は、0.1〜200℃/分の速度で、好ましくは0.5〜100℃/分、およびより
好ましくは1〜10℃/分または10〜50℃/分までの速度で冷却される。細胞は、低
くとも-60、-50、-40、-30、-20、-10、0、10、または20℃(優先性を増すため)
の最終温度に冷却される。別の好ましい態様において、保存剤は、細胞凍結時の
、細胞内氷の核生成または成長を阻害または防止する。
貯蔵のために調製される。一般に細胞は、凍結および／または乾燥により貯蔵の
ために調製することができる。凍結乾燥技術に加え、超急速(plunge)凍結、真空
乾燥、風乾が使用される。典型的には、卵母細胞は、0.1〜10℃/分の速度で、好
ましくは0.3〜5℃/分、およびより好ましくは0.5〜2℃/分までの速度で冷却され
る。体細胞は、0.1〜200℃/分の速度で、好ましくは0.5〜100℃/分、およびより
好ましくは1〜10℃/分または10〜50℃/分までの速度で冷却される。細胞は、低
くとも-60、-50、-40、-30、-20、-10、0、10、または20℃(優先性を増すため)
の最終温度に冷却される。別の好ましい態様において、保存剤は、細胞凍結時の
、細胞内氷の核生成または成長を阻害または防止する。
【００１４】
細胞外保存剤は、細胞内保存剤の添加により生じる可能性がある細胞への浸透
圧ショックを減らすことができる。加えて、細胞外保存剤は、形質膜を安定化し
、かつ凍結または乾燥時に細胞へ力学的強度を提供する。
圧ショックを減らすことができる。加えて、細胞外保存剤は、形質膜を安定化し
、かつ凍結または乾燥時に細胞へ力学的強度を提供する。
【００１５】
一旦細胞が貯蔵のために調製されたならば、その調製に適した様式で貯蔵され
る。凍結細胞は極低温で貯蔵することができ、かつ乾燥細胞は、適宜周囲温度ま
たは他の温度で乾燥貯蔵することができる。貯蔵された細胞の回復は、貯蔵のた
めのそれらの調製法に合わせることができる。乾燥細胞は、再水和され、かつ凍
結細胞は解凍される。回復された細胞の少なくとも25、35、50、60、70、80、90
、95、または100％が生存していることが好ましい。細胞生存力は、製造業者(Mo
lecular Probes社)のプロトコールに従い、生細胞を示す緑色色素カルセイン-AM
および死細胞を示す赤色色素エチジウムホモ二量体を使用する「Live/Dead」ア
ッセイ法のような任意の標準アッセイ法を用いて測定することができる。別の好
ましい態様において、標準の体外受精技術を用い、回復された卵母細胞の少なく
とも5、10、15、25、35、50、60、70、80、90、または95％が受精することがで
きる(例えば、Summersら、Biol. Reprod.、53:431-437(1995)を参照のこと)。好
ましくは、受精した卵母細胞は、2細胞期胚、4細胞期胚、桑実胚、胚盤胞胚、胎
児期胚、または生存可能な胎児(viable offspring)へと発生する。
る。凍結細胞は極低温で貯蔵することができ、かつ乾燥細胞は、適宜周囲温度ま
たは他の温度で乾燥貯蔵することができる。貯蔵された細胞の回復は、貯蔵のた
めのそれらの調製法に合わせることができる。乾燥細胞は、再水和され、かつ凍
結細胞は解凍される。回復された細胞の少なくとも25、35、50、60、70、80、90
、95、または100％が生存していることが好ましい。細胞生存力は、製造業者(Mo
lecular Probes社)のプロトコールに従い、生細胞を示す緑色色素カルセイン-AM
および死細胞を示す赤色色素エチジウムホモ二量体を使用する「Live/Dead」ア
ッセイ法のような任意の標準アッセイ法を用いて測定することができる。別の好
ましい態様において、標準の体外受精技術を用い、回復された卵母細胞の少なく
とも5、10、15、25、35、50、60、70、80、90、または95％が受精することがで
きる(例えば、Summersら、Biol. Reprod.、53:431-437(1995)を参照のこと)。好
ましくは、受精した卵母細胞は、2細胞期胚、4細胞期胚、桑実胚、胚盤胞胚、胎
児期胚、または生存可能な胎児(viable offspring)へと発生する。
【００１６】
「胚」とは、母体宿主の子宮膜に移植されていない発生しつつある細胞塊を意
味する。従って「胚」という用語は、受精した卵母細胞、胚盤胞期前期に発生し
ている細胞塊、またはその他の母体宿主の子宮膜への移植前および生殖隆起の形
成前の発生段階にある発生しつつある細胞塊を意味する。胚は、細胞発生の複数
の期を表すことができる。例えば、ひとつの細胞胚は接合子と称され；卵割した
胚から生じる細胞の充実性球状塊は、桑実と称することができ、および胞胚腔を
有する胚は、胚盤胞と称することができる。
味する。従って「胚」という用語は、受精した卵母細胞、胚盤胞期前期に発生し
ている細胞塊、またはその他の母体宿主の子宮膜への移植前および生殖隆起の形
成前の発生段階にある発生しつつある細胞塊を意味する。胚は、細胞発生の複数
の期を表すことができる。例えば、ひとつの細胞胚は接合子と称され；卵割した
胚から生じる細胞の充実性球状塊は、桑実と称することができ、および胞胚腔を
有する胚は、胚盤胞と称することができる。
【００１７】
「胎児」または「胎児の」とは、母体宿主の子宮膜に移植された発生しつつあ
る細胞塊を意味する。胎児は、当業者により容易に確定される生殖隆起のような
規定の特徴を有する。
る細胞塊を意味する。胎児は、当業者により容易に確定される生殖隆起のような
規定の特徴を有する。
【００１８】
別の局面において本発明は、300、310、320、330、340、350、360、370、380m
osm、またはそれを超える浸透圧を有する高張培地において細胞をインキュベー
ションすることにより、哺乳類細胞をインビトロにおいて培養する方法を提供す
る。好ましくは、培地は、1種もしくは複数の図7に列記された成分を含有するか
、または本発明の1種もしくは複数の極低温保存剤を含有する。好ましくは、培
地は、アミノ酸、糖質、乳酸塩、またはピルビン酸塩などの栄養素を含有する。
この培地は、前記の好ましい細胞を含む任意の哺乳類細胞を培養するために使用
することができる。様々な好ましい態様において、この培地は、極低温保存の前
、最中、または後に細胞を培養するために使用される。
osm、またはそれを超える浸透圧を有する高張培地において細胞をインキュベー
ションすることにより、哺乳類細胞をインビトロにおいて培養する方法を提供す
る。好ましくは、培地は、1種もしくは複数の図7に列記された成分を含有するか
、または本発明の1種もしくは複数の極低温保存剤を含有する。好ましくは、培
地は、アミノ酸、糖質、乳酸塩、またはピルビン酸塩などの栄養素を含有する。
この培地は、前記の好ましい細胞を含む任意の哺乳類細胞を培養するために使用
することができる。様々な好ましい態様において、この培地は、極低温保存の前
、最中、または後に細胞を培養するために使用される。
【００１９】
本発明は、細胞の極低温保存に関連した多くの利点を提供する。例えばこれら
の方法は一般に、任意の哺乳動物からの任意の細胞の保存に適用することができ
る。これらの細胞は、必要とされるまでの期間、凍結または乾燥した状態で貯蔵
することができる。加えてこれらの極低温保存法は、貯蔵された細胞において存
在したとしても最小限の有害な副作用を引き起す無毒の保存剤の比較的低濃度で
の使用を含む。更にこの保存剤は、そうでなければ細胞に損傷を及ぼすと考えら
れる凍結時の細胞内氷晶の形成を減少または排除する。必要に応じて、細胞内お
よび細胞外の両方の保存剤を使用し、細胞内保存剤の細胞への添加により引き起
される浸透圧を低下させることができる。細胞外保存剤は、更に形質膜を安定化
し、かつ凍結または乾燥時に細胞に力学的強度を提供することができる。更に本
発明は、糖質のより高いTg'のために、従来型凍結保護剤(典型的には-80℃未満)
と比べより高い貯蔵温度(好ましくは-60℃より高い)を可能にすることができる
。
の方法は一般に、任意の哺乳動物からの任意の細胞の保存に適用することができ
る。これらの細胞は、必要とされるまでの期間、凍結または乾燥した状態で貯蔵
することができる。加えてこれらの極低温保存法は、貯蔵された細胞において存
在したとしても最小限の有害な副作用を引き起す無毒の保存剤の比較的低濃度で
の使用を含む。更にこの保存剤は、そうでなければ細胞に損傷を及ぼすと考えら
れる凍結時の細胞内氷晶の形成を減少または排除する。必要に応じて、細胞内お
よび細胞外の両方の保存剤を使用し、細胞内保存剤の細胞への添加により引き起
される浸透圧を低下させることができる。細胞外保存剤は、更に形質膜を安定化
し、かつ凍結または乾燥時に細胞に力学的強度を提供することができる。更に本
発明は、糖質のより高いTg'のために、従来型凍結保護剤(典型的には-80℃未満)
と比べより高い貯蔵温度(好ましくは-60℃より高い)を可能にすることができる
。
【００２０】詳細な説明
図1および図2に例示した本発明の生物学的組織を保存する方法は、保存される
べき細胞または組織の選択または単離から始まる(10)。本発明の方法は、脂質膜
を有する任意の生物学的材料の保存のために使用されると同時に、生存している
有核細胞、特に別の形では保存が困難な卵母細胞のような哺乳類細胞の保存に最
も有用である。
べき細胞または組織の選択または単離から始まる(10)。本発明の方法は、脂質膜
を有する任意の生物学的材料の保存のために使用されると同時に、生存している
有核細胞、特に別の形では保存が困難な卵母細胞のような哺乳類細胞の保存に最
も有用である。
【００２１】
卵母細胞は、卵管および／または卵巣の単離、および卵母細胞の放出により得
ることができる。卵母細胞は、余分な細胞を破壊する酵素であるヒアルロニダー
ゼに移される。その後卵母細胞は、HEPES-緩衝されたダルベッコ変法イーグル培
地／栄養素F-12(DMEM/F-12)混合液(Gibco社)およびBSA(ウシ血清アルブミン)で2
回洗浄される。その後卵母細胞は、胚-試験用鉱油(Sigma社)で被覆された変更等
張HTF、または任意の他の適当な培地へ移される。DMEM/F12培地には、4mg/mL BS
Aが補充されることが好ましい。望ましいならば、卵母細胞は、微量注入に予定
した量と同じ濃度で細胞外糖質と共にインキュベーションすることもできる。例
えば、0.1M糖質を注入するためには、卵母細胞は、0.1M糖質を含むDMEM/F-12で
平衡化することができる。図3A〜3Cに記したように、外部DMEM/F-12+糖質溶液の
高張性は、マウス卵母細胞に収縮を引き起す。この細胞容積の減少は、位相差顕
微鏡を用い細胞直径を肉眼で測定することにより、定量化することができる。細
胞容積の減少は、いかに多くの糖質が引き続き卵母細胞へ微量注入されるかを決
定することを容易にする。例えば、最初の等張容積(すなわち外部糖質と平衡に
なる前の細胞容積)への微量注入時の細胞の膨潤は、注入された糖質の濃度が、
細胞外糖質濃度と近いことを示す(図3A〜3D)。同様の結果が、ヒト卵母細胞が、
0.15M細胞外トレハロースと共にインキュベーションされ、その容積の減少を引
き起し、その後等張培地中の最初の卵母細胞の容積に戻るまでトレハロースが注
入される場合にも得られ、これは0.15Mトレハロースが注入されたことを示した(
図4A〜D)。あるいは卵母細胞は、選択的に微量注入前にそれらの細胞容積を低下
するために、NaClのような他の実質的に不透過性溶質と平衡化することができる
。この最初の細胞容積の減少は、微量注入前に高張培地でインキュベーションさ
れない卵母細胞と比較した場合に、微量注入された卵母細胞のより小さい最終容
積を生じる。このより小さい最終容積は、卵母細胞の膨潤からの有害作用の可能
性を最小化することができる。この微量注入のための細胞調製に関する一般的手
法は、他の細胞種にも使用することができる。
ることができる。卵母細胞は、余分な細胞を破壊する酵素であるヒアルロニダー
ゼに移される。その後卵母細胞は、HEPES-緩衝されたダルベッコ変法イーグル培
地／栄養素F-12(DMEM/F-12)混合液(Gibco社)およびBSA(ウシ血清アルブミン)で2
回洗浄される。その後卵母細胞は、胚-試験用鉱油(Sigma社)で被覆された変更等
張HTF、または任意の他の適当な培地へ移される。DMEM/F12培地には、4mg/mL BS
Aが補充されることが好ましい。望ましいならば、卵母細胞は、微量注入に予定
した量と同じ濃度で細胞外糖質と共にインキュベーションすることもできる。例
えば、0.1M糖質を注入するためには、卵母細胞は、0.1M糖質を含むDMEM/F-12で
平衡化することができる。図3A〜3Cに記したように、外部DMEM/F-12+糖質溶液の
高張性は、マウス卵母細胞に収縮を引き起す。この細胞容積の減少は、位相差顕
微鏡を用い細胞直径を肉眼で測定することにより、定量化することができる。細
胞容積の減少は、いかに多くの糖質が引き続き卵母細胞へ微量注入されるかを決
定することを容易にする。例えば、最初の等張容積(すなわち外部糖質と平衡に
なる前の細胞容積)への微量注入時の細胞の膨潤は、注入された糖質の濃度が、
細胞外糖質濃度と近いことを示す(図3A〜3D)。同様の結果が、ヒト卵母細胞が、
0.15M細胞外トレハロースと共にインキュベーションされ、その容積の減少を引
き起し、その後等張培地中の最初の卵母細胞の容積に戻るまでトレハロースが注
入される場合にも得られ、これは0.15Mトレハロースが注入されたことを示した(
図4A〜D)。あるいは卵母細胞は、選択的に微量注入前にそれらの細胞容積を低下
するために、NaClのような他の実質的に不透過性溶質と平衡化することができる
。この最初の細胞容積の減少は、微量注入前に高張培地でインキュベーションさ
れない卵母細胞と比較した場合に、微量注入された卵母細胞のより小さい最終容
積を生じる。このより小さい最終容積は、卵母細胞の膨潤からの有害作用の可能
性を最小化することができる。この微量注入のための細胞調製に関する一般的手
法は、他の細胞種にも使用することができる。
【００２２】
その後標的細胞には、生体-保存剤(bio-preservation agent)が微量注入され
る(30)。微量注入装置および手技は、当技術分野において良く特徴付けられてお
り、かつ細胞への小分子の注入での使用が公知である微量注入装置を本発明にお
いて使用することができる。例証的微量注入工程において、卵母細胞は、30ミリ
秒間圧力10psiで微量注入することができる。標準の微量注入技術の別の例は、N
akayamaおよびYanagimachiの論文(Nature Biotech.、16:639-642(1998))に記載
された方法である。
る(30)。微量注入装置および手技は、当技術分野において良く特徴付けられてお
り、かつ細胞への小分子の注入での使用が公知である微量注入装置を本発明にお
いて使用することができる。例証的微量注入工程において、卵母細胞は、30ミリ
秒間圧力10psiで微量注入することができる。標準の微量注入技術の別の例は、N
akayamaおよびYanagimachiの論文(Nature Biotech.、16:639-642(1998))に記載
された方法である。
【００２３】
保存剤の微量注入に関して、注入ピペットは、1-mmホウケイ酸塩の薄壁(B100-
75-10、Sutter社、ノバト、CA)ガラスキャピラリーから製造した。最初にピペッ
トを、水平マイクロピペット引き伸ばし機(モデルP-97、Sutter社)を用いて引き
伸ばし、これらは長い軸部(shank)を有した(〜1.3cm)。内径およそ0.5μmの鋭い
先端を得るために、研磨プレートの様々な回転速度が可能な改良型Sutterマイク
ロピペット面取り機(BV-10、Sutter社)上で、注入ピペットを40°の角度で面取
りした。
75-10、Sutter社、ノバト、CA)ガラスキャピラリーから製造した。最初にピペッ
トを、水平マイクロピペット引き伸ばし機(モデルP-97、Sutter社)を用いて引き
伸ばし、これらは長い軸部(shank)を有した(〜1.3cm)。内径およそ0.5μmの鋭い
先端を得るために、研磨プレートの様々な回転速度が可能な改良型Sutterマイク
ロピペット面取り機(BV-10、Sutter社)上で、注入ピペットを40°の角度で面取
りした。
【００２４】
望ましいならば、極低温保存剤の微量注入に使用したマイクロピペットは、注
入前にキャリブレーションすることができる(図5)。このキャリブレーションで
は、ジメチルポリシラキセン溶液中に懸濁したDMEM/F-12培地の微小液滴に、関
心のある糖質溶液を注入した。好ましくは微小液滴は、微量注入されるであろう
細胞と同様の大きさである。例えば直径70〜100の微小液滴を用い、卵母細胞の
微量注入のためのマイクロピペットをキャリブレーションすることができる。所
定の注入ピペットからの様々な注入容積を測定するために、微小液滴数滴に、注
入時間および圧力を変動しながら注入した。各微小液滴の像を、注入の前後に明
視野顕微鏡を用いて撮影し、液滴の容積の増加、その結果注入容積を計算した(
図16)。微小液滴はほとんど完全な球形であるので、液滴の容積は、液滴の直径
を用いて容易に計算することができる。例えば容積は、式V=O.75226(A)3/2(式中
、Aは微小液滴の断面積である）を用い、断面像から計算することができる。非
常に小さい注入容積を決定するために、微小液滴への10回の累積微量注入を用い
て、測定可能な容積を作り出した。この容積増加の合計を、10で除算し、1回注
入当りの平均容積を得た。所定の注入ピペットについて、注入圧およびパルス持
続期間(すなわち、注入持続期間)は、注入容積に影響を及ぼす二つの主要要因で
あった。注入ピペットのキャリブレーションのために、注入圧を適当な値に固定
し、パルス持続期間を変動させた。注入容積は、パルス持続期間増加の関数とし
て直線状に変動した(図17)。パルス持続期間を変動させ且つ十分なデータ点を収
集することにより、所定の注入ピペットについて勾配を定めた。この勾配は、実
際の実験について様々な注入容積を選択するために特に有用であった。キャリブ
レーション後、マイクロピペットを、蒸留水で吸引洗浄し、水分を吹き飛ばした
。次に残留ジメチルポリシラキサンを、マイクロピペットを塩化メチレン(Fishe
r社、ピッツバーグ、PA)中に浸すことにより除去し、かつこのマイクロピペット
を蒸留水および純エタノールで洗浄した。マイクロピペットを更に、デシケータ
ー内でヘキサメチルジシラゼンの蒸気にこれらを数時間曝露し、細胞破片のピペ
ットへの付着を防ぐことにより、実際の細胞微量注入のために調製した。
入前にキャリブレーションすることができる(図5)。このキャリブレーションで
は、ジメチルポリシラキセン溶液中に懸濁したDMEM/F-12培地の微小液滴に、関
心のある糖質溶液を注入した。好ましくは微小液滴は、微量注入されるであろう
細胞と同様の大きさである。例えば直径70〜100の微小液滴を用い、卵母細胞の
微量注入のためのマイクロピペットをキャリブレーションすることができる。所
定の注入ピペットからの様々な注入容積を測定するために、微小液滴数滴に、注
入時間および圧力を変動しながら注入した。各微小液滴の像を、注入の前後に明
視野顕微鏡を用いて撮影し、液滴の容積の増加、その結果注入容積を計算した(
図16)。微小液滴はほとんど完全な球形であるので、液滴の容積は、液滴の直径
を用いて容易に計算することができる。例えば容積は、式V=O.75226(A)3/2(式中
、Aは微小液滴の断面積である）を用い、断面像から計算することができる。非
常に小さい注入容積を決定するために、微小液滴への10回の累積微量注入を用い
て、測定可能な容積を作り出した。この容積増加の合計を、10で除算し、1回注
入当りの平均容積を得た。所定の注入ピペットについて、注入圧およびパルス持
続期間(すなわち、注入持続期間)は、注入容積に影響を及ぼす二つの主要要因で
あった。注入ピペットのキャリブレーションのために、注入圧を適当な値に固定
し、パルス持続期間を変動させた。注入容積は、パルス持続期間増加の関数とし
て直線状に変動した(図17)。パルス持続期間を変動させ且つ十分なデータ点を収
集することにより、所定の注入ピペットについて勾配を定めた。この勾配は、実
際の実験について様々な注入容積を選択するために特に有用であった。キャリブ
レーション後、マイクロピペットを、蒸留水で吸引洗浄し、水分を吹き飛ばした
。次に残留ジメチルポリシラキサンを、マイクロピペットを塩化メチレン(Fishe
r社、ピッツバーグ、PA)中に浸すことにより除去し、かつこのマイクロピペット
を蒸留水および純エタノールで洗浄した。マイクロピペットを更に、デシケータ
ー内でヘキサメチルジシラゼンの蒸気にこれらを数時間曝露し、細胞破片のピペ
ットへの付着を防ぐことにより、実際の細胞微量注入のために調製した。
【００２５】
このプレキャリブレーション法の精度は、微小液滴に加え卵母細胞へのオレゴ
ン-グリーン-(OG)標識したデキストラン(Molecular Probes社、ユージーン、OR)
の微量注入を伴う代替法を用いて確認した。卵母細胞の微量注入について、10mM
Tris(pH7.4)中に調製したDMEM/F12培地80μLおよびOG-標識したデキストラン溶
液(1mM)20μLを、60x10-mm Falconプラスチック培養皿(Fisher社)に入れ、かつ
鉱油で被覆した。次に卵母細胞を、注入液滴に移した。微量注入の前に、保持ピ
ペット(holding pipette)および注入ピペットの両方を、それらの先端部分が焦
点面に対し水平になるように折り曲げた。保持ピペットに培地を充填し、手動注
射器(Sutter社)に鉱油を充填したプラスチックチューブを介して接続した。同様
に注入ピペットを、プラスチックチューブを介してピコ・インジェクター（Pico
Injector）に接続し、デキストラン溶液を注入ピペットへ吸引した。その後こ
の微量注入手法により、わずかに陽平衡圧をこのシステムに加え、外側培地の注
入ピペットへの吸引を防止した。微量注入期間には、12または6時の位置に紡錘
体を伴う卵母細胞を、手動注射器を使って吸引することで保持ピペットの先端に
保持しながら、注入ピペットを反対側から卵母細胞へ挿入した。圧電噴射器(PM-
20、Stoelting社)を用い、突然の押し(thrusting)運動により注入ピペットの貫
通を促進した。次にOG-標識したデキストラン溶液を、適当な時間および圧力の
設定を用い、卵母細胞へ注入した。同様にDMEM/F12培地の微小液滴に、同じ時間
および圧力の設定、ならびに微量注入ピペットを用いて、OG-標識したデキスト
ラン溶液を注入した。微量注入後、注入した卵母細胞および微小液滴の蛍光画像
を、高圧水銀アーク灯、蛍光選択フィルターセット、およびCCDカメラを装着し
たニコンTMD倒立顕微鏡を用いて捕えた。水銀アーク灯出力の可能性のあるゆら
ぎによる誤差を最小化するために、各蛍光画像を、64フレームで平均化すること
により捕えた。図18は、前述のような微量注入後に捕えられた卵母細胞の典型的
蛍光画像を示している。捕えられた画像の蛍光強度は、パーソナルコンピュータ
上でMetamorphソフトウェアパッケージ(Universal Imaging社、ウェストチェス
ター、PA)を用い、細胞または液滴の中心の小さいスポットについて測定した。
次に微小液滴内の様々な濃度のOG-標識したデキストランを用い、標準曲線を作
成した(図19)。卵母細胞および微小液滴内の微量注入したデキストラン濃度を、
この標準曲線を用いて推定した。最後に、微量注入した卵母細胞および微小液滴
において認められたデキストラン濃度から、注入容積を計算した。注入容積の評
価は、微小液滴への注入が、pL-範囲感度における卵母細胞への注入容積を反映
していることを示した(図5)。
ン-グリーン-(OG)標識したデキストラン(Molecular Probes社、ユージーン、OR)
の微量注入を伴う代替法を用いて確認した。卵母細胞の微量注入について、10mM
Tris(pH7.4)中に調製したDMEM/F12培地80μLおよびOG-標識したデキストラン溶
液(1mM)20μLを、60x10-mm Falconプラスチック培養皿(Fisher社)に入れ、かつ
鉱油で被覆した。次に卵母細胞を、注入液滴に移した。微量注入の前に、保持ピ
ペット(holding pipette)および注入ピペットの両方を、それらの先端部分が焦
点面に対し水平になるように折り曲げた。保持ピペットに培地を充填し、手動注
射器(Sutter社)に鉱油を充填したプラスチックチューブを介して接続した。同様
に注入ピペットを、プラスチックチューブを介してピコ・インジェクター（Pico
Injector）に接続し、デキストラン溶液を注入ピペットへ吸引した。その後こ
の微量注入手法により、わずかに陽平衡圧をこのシステムに加え、外側培地の注
入ピペットへの吸引を防止した。微量注入期間には、12または6時の位置に紡錘
体を伴う卵母細胞を、手動注射器を使って吸引することで保持ピペットの先端に
保持しながら、注入ピペットを反対側から卵母細胞へ挿入した。圧電噴射器(PM-
20、Stoelting社)を用い、突然の押し(thrusting)運動により注入ピペットの貫
通を促進した。次にOG-標識したデキストラン溶液を、適当な時間および圧力の
設定を用い、卵母細胞へ注入した。同様にDMEM/F12培地の微小液滴に、同じ時間
および圧力の設定、ならびに微量注入ピペットを用いて、OG-標識したデキスト
ラン溶液を注入した。微量注入後、注入した卵母細胞および微小液滴の蛍光画像
を、高圧水銀アーク灯、蛍光選択フィルターセット、およびCCDカメラを装着し
たニコンTMD倒立顕微鏡を用いて捕えた。水銀アーク灯出力の可能性のあるゆら
ぎによる誤差を最小化するために、各蛍光画像を、64フレームで平均化すること
により捕えた。図18は、前述のような微量注入後に捕えられた卵母細胞の典型的
蛍光画像を示している。捕えられた画像の蛍光強度は、パーソナルコンピュータ
上でMetamorphソフトウェアパッケージ(Universal Imaging社、ウェストチェス
ター、PA)を用い、細胞または液滴の中心の小さいスポットについて測定した。
次に微小液滴内の様々な濃度のOG-標識したデキストランを用い、標準曲線を作
成した(図19)。卵母細胞および微小液滴内の微量注入したデキストラン濃度を、
この標準曲線を用いて推定した。最後に、微量注入した卵母細胞および微小液滴
において認められたデキストラン濃度から、注入容積を計算した。注入容積の評
価は、微小液滴への注入が、pL-範囲感度における卵母細胞への注入容積を反映
していることを示した(図5)。
【００２６】
先に説明したように、同じく注入された糖質の濃度を決定するために使用した
別の手法は、微量注入の前後に高張培地(すなわち、0.1Mトレハロース)中の卵母
細胞の容積を比較することに関与していた。注入緩衝液(これは典型的には800ま
たは1000mM糖質を含む)の総モル浸透圧濃度への寄与は無視できるので、糖質の
微量注入時に0.10M糖質/培地混合物中で収縮した卵母細胞の再拡張は、その細胞
への糖質の導入に起因し得る。従って微量注入後の再拡張の程度は、注入した糖
質の細胞内濃度を示している。実際、個々のマウス卵母細胞は、同量の注入され
たトレハロースに対して同様の容積反応を示した。このような実験を図3B〜3Dに
まとめたが、これは等張容積での典型的卵母細胞(図3B)、トレハロースの微量注
入前に高張培地中で収縮した卵母細胞(図3C)、および細胞外トレハロース濃度と
同等のトレハロースの微量注入後の高張培地中の再拡張された卵母細胞(図3D)を
示している。
別の手法は、微量注入の前後に高張培地(すなわち、0.1Mトレハロース)中の卵母
細胞の容積を比較することに関与していた。注入緩衝液(これは典型的には800ま
たは1000mM糖質を含む)の総モル浸透圧濃度への寄与は無視できるので、糖質の
微量注入時に0.10M糖質/培地混合物中で収縮した卵母細胞の再拡張は、その細胞
への糖質の導入に起因し得る。従って微量注入後の再拡張の程度は、注入した糖
質の細胞内濃度を示している。実際、個々のマウス卵母細胞は、同量の注入され
たトレハロースに対して同様の容積反応を示した。このような実験を図3B〜3Dに
まとめたが、これは等張容積での典型的卵母細胞(図3B)、トレハロースの微量注
入前に高張培地中で収縮した卵母細胞(図3C)、および細胞外トレハロース濃度と
同等のトレハロースの微量注入後の高張培地中の再拡張された卵母細胞(図3D)を
示している。
【００２７】
微量注入の前後の糖質の望ましい細胞質濃度および細胞の凍結または乾燥によ
る細胞内糖質のいずれかの濃度を達成するために、細胞に注入される保存剤の容
積、保存剤内の糖質の初期濃度のいずれかまたはこれら両方を調節することがで
きる。例えば微量注入後の糖質の比較的高い細胞質濃度を達成するためには、比
較的大容積の保存剤を注入するか、もしくは比較的高濃度の糖質を注入してよい
。あるいは、比較的低い糖質の細胞質濃度が望ましい場合は、注入される保存剤
の容積を減少するか、保存剤中の糖質の濃度を低下するか、もしくは両方の変更
を行うことができる。注入される保存剤の容積は、得られる細胞質容積の増加が
細胞溶解を生じる程容積があまりにも大きいことのないように選択することがで
きる。加えて保存剤の容積は、正確な測定および注入を行うには小さすぎること
がないよう選択することができる。
る細胞内糖質のいずれかの濃度を達成するために、細胞に注入される保存剤の容
積、保存剤内の糖質の初期濃度のいずれかまたはこれら両方を調節することがで
きる。例えば微量注入後の糖質の比較的高い細胞質濃度を達成するためには、比
較的大容積の保存剤を注入するか、もしくは比較的高濃度の糖質を注入してよい
。あるいは、比較的低い糖質の細胞質濃度が望ましい場合は、注入される保存剤
の容積を減少するか、保存剤中の糖質の濃度を低下するか、もしくは両方の変更
を行うことができる。注入される保存剤の容積は、得られる細胞質容積の増加が
細胞溶解を生じる程容積があまりにも大きいことのないように選択することがで
きる。加えて保存剤の容積は、正確な測定および注入を行うには小さすぎること
がないよう選択することができる。
【００２８】
同様に、細胞を含有する液体培地への希釈後に望ましい糖質の細胞外濃度を達
成するために、培地へ添加される保存剤の容積、培地へ添加される保存剤中の糖
質の初期濃度のいずれか、またはこれら両方を調節することができる。従って、
糖質の細胞外濃度は、より大きい容積またはより濃い溶液の液体培地への添加に
より増加することができる。寒天のような固形培地上で増殖される細胞に添加さ
れる保存剤に関して、望ましい細胞外糖質濃度は、望ましい濃度で糖質を含有す
る保存剤と細胞を接触することにより達成することができる。
成するために、培地へ添加される保存剤の容積、培地へ添加される保存剤中の糖
質の初期濃度のいずれか、またはこれら両方を調節することができる。従って、
糖質の細胞外濃度は、より大きい容積またはより濃い溶液の液体培地への添加に
より増加することができる。寒天のような固形培地上で増殖される細胞に添加さ
れる保存剤に関して、望ましい細胞外糖質濃度は、望ましい濃度で糖質を含有す
る保存剤と細胞を接触することにより達成することができる。
【００２９】
本方法において有用な生体-保存剤は、極低温-保護特性を有しかつ通常不透過
性であるような化学物質のいずれかを含む。特にこの生体-保存剤は、糖質を単
体でまたは他の従来の生体-保存剤と組合せてのいずれかで含むことができる。
トレハロース、スクロース、フルクトース、およびラフィノースのような炭水化
物系糖質は、濃度約1.0M未満またはこれと等しい、より好ましくは約0.4M未満ま
たはこれと等しい濃度で微量注入することができる。別の好ましい態様において
、この濃度は0.05〜0.20Mを含む値である。加えて、細胞外糖質または従来の生
体-保存剤は、貯蔵前に添加することができる。細胞が微量注入前に高張溶液中
でインキュベーションされる場合、実質的に不透過性の溶質は、微量注入後に培
地内に残存することができるか、または低濃度のこの溶質を含むかもしくは含ま
ない培地により細胞を洗浄することによって培地から除去することができる。
性であるような化学物質のいずれかを含む。特にこの生体-保存剤は、糖質を単
体でまたは他の従来の生体-保存剤と組合せてのいずれかで含むことができる。
トレハロース、スクロース、フルクトース、およびラフィノースのような炭水化
物系糖質は、濃度約1.0M未満またはこれと等しい、より好ましくは約0.4M未満ま
たはこれと等しい濃度で微量注入することができる。別の好ましい態様において
、この濃度は0.05〜0.20Mを含む値である。加えて、細胞外糖質または従来の生
体-保存剤は、貯蔵前に添加することができる。細胞が微量注入前に高張溶液中
でインキュベーションされる場合、実質的に不透過性の溶質は、微量注入後に培
地内に残存することができるか、または低濃度のこの溶質を含むかもしくは含ま
ない培地により細胞を洗浄することによって培地から除去することができる。
【００３０】
細胞膜を通過するにはあまりにも大きいために通常は細胞膜を透過しないよう
な糖質または多糖類は、極低温保存のために優れた生理化学的および生物学的特
性を有する。これらの糖質は通常はそれら自身細胞膜を透過しないにもかかわら
ず、本発明の方法を用いることで、これらの通常不透過性の糖質を細胞内に微量
注入し、有益な作用をもたらすことができる。
な糖質または多糖類は、極低温保存のために優れた生理化学的および生物学的特
性を有する。これらの糖質は通常はそれら自身細胞膜を透過しないにもかかわら
ず、本発明の方法を用いることで、これらの通常不透過性の糖質を細胞内に微量
注入し、有益な作用をもたらすことができる。
【００３１】
本発明の方法において保存剤として特に有用な細胞の安定化または保存作用を
有する不透過性糖質は、スクロース、トレハロース、フルクトース、デキストラ
ン、およびラフィノースを含む。これらの糖質の中で、グルコースの非還元二糖
であるトレハロースが、低濃度での細胞構造の安定化において格別に有効である
ことが示されている。トレハロースは、本発明の方法での使用について最も好ま
しい糖質である。これは、高温において安定したガラスを形成する一般的でない
能力に加え、タンパク質、ウイルス、および細菌を安定化および保存する例外的
能力を有する。トレハロースは、従来の凍結保護剤よりもはるかに優れた卵母細
胞の凍結保護剤(CPA)としての使用のための生理化学的特性を有する。更に多く
の食品中に含まれるトレハロースは、比較的無毒であり、かつCPA除去を必要と
しない、従って不融性の最終生成物を生じるような極低温保存プロトコールを可
能にすることができる。トレハロースの特性と類似した特性を有し、広範に入手
でき、かつ比較的安価であるようなスクロースも、ある種の適用に好ましい。デ
キストランを単体またはトレハロースもしくはスクロースのような他の糖質と組
合せてのいずれかで使用するという利点もある。デキストランは、非常に高いガ
ラス転移温度(Tg')を有するが、スクロースまたはトレハロースに存在するよう
ないくつかの利点、例えば生物学的成分を安定化する能力などは有さない。従っ
て、デキストラン・トレハロース混合物、またはデキストラン・スクロース混合
物は、更なる利点を有し得る。
有する不透過性糖質は、スクロース、トレハロース、フルクトース、デキストラ
ン、およびラフィノースを含む。これらの糖質の中で、グルコースの非還元二糖
であるトレハロースが、低濃度での細胞構造の安定化において格別に有効である
ことが示されている。トレハロースは、本発明の方法での使用について最も好ま
しい糖質である。これは、高温において安定したガラスを形成する一般的でない
能力に加え、タンパク質、ウイルス、および細菌を安定化および保存する例外的
能力を有する。トレハロースは、従来の凍結保護剤よりもはるかに優れた卵母細
胞の凍結保護剤(CPA)としての使用のための生理化学的特性を有する。更に多く
の食品中に含まれるトレハロースは、比較的無毒であり、かつCPA除去を必要と
しない、従って不融性の最終生成物を生じるような極低温保存プロトコールを可
能にすることができる。トレハロースの特性と類似した特性を有し、広範に入手
でき、かつ比較的安価であるようなスクロースも、ある種の適用に好ましい。デ
キストランを単体またはトレハロースもしくはスクロースのような他の糖質と組
合せてのいずれかで使用するという利点もある。デキストランは、非常に高いガ
ラス転移温度(Tg')を有するが、スクロースまたはトレハロースに存在するよう
ないくつかの利点、例えば生物学的成分を安定化する能力などは有さない。従っ
て、デキストラン・トレハロース混合物、またはデキストラン・スクロース混合
物は、更なる利点を有し得る。
【００３２】
細胞外糖脂質または糖タンパク質の添加も、細胞膜を安定化することができる
。本発明をいずれか特定の理論に限定する意味は持たないが、糖脂質の糖基は、
膜のリン脂質の親水性ヘッド基と水素結合し、凍結が誘導したストレスに対して
膜を安定化すると仮定される。加えて糖脂質は、脂質二重層へ組込むことができ
かつ膜の完全性を増加することが可能である。
。本発明をいずれか特定の理論に限定する意味は持たないが、糖脂質の糖基は、
膜のリン脂質の親水性ヘッド基と水素結合し、凍結が誘導したストレスに対して
膜を安定化すると仮定される。加えて糖脂質は、脂質二重層へ組込むことができ
かつ膜の完全性を増加することが可能である。
【００３３】
保存剤の微量注入後、細胞は貯蔵のために調製される(40)。凍結および／また
は乾燥の様々な方法を使用し、貯蔵用の細胞を調製することができる。特に3種
の方法が本明細書において説明されている：真空乾燥または風乾(50)、凍結乾燥
(60)、および凍結-解凍(70)のプロトコール。乾燥法は、安定化した生物学的材
料が周囲温度に輸送されかつ貯蔵される点で利点がある。
は乾燥の様々な方法を使用し、貯蔵用の細胞を調製することができる。特に3種
の方法が本明細書において説明されている：真空乾燥または風乾(50)、凍結乾燥
(60)、および凍結-解凍(70)のプロトコール。乾燥法は、安定化した生物学的材
料が周囲温度に輸送されかつ貯蔵される点で利点がある。
【００３４】
図6は、従来の浸透する凍結保護剤(DMSO)に対する共通の糖質(トレハロース)
の状態図を示している。典型的には1〜2M DMSOで負荷された卵母細胞は、非常に
緩徐な冷却速度(0.3〜0.5℃/分)で中間温度(-60℃〜-80℃)へと冷却され、その
後貯蔵のために液体窒素で超急速凍結される。緩徐な冷却速度の結果、卵母細胞
は、脱水のための十分な時間を有し、かつ-30℃〜-50℃の温度範囲に低下される
凍結保護剤溶液(例えばDMSO)の平衡融解曲線(Tm)に密に従う。水に対する形質膜
の透過性は、-50℃より低い温度で、低下する温度の関数として指数関数的に減
少するので、細胞の脱水は、実践目的においては無視できるようになる。温度は
更に貯蔵温度まで低下するので、卵母細胞内部の未凍結の溶液は、点Tg'で、温
度がTg曲線に到達するまで一層濃縮され始め、その結果この溶液はガラスとなり
始める。結果的に、細胞内に残留する細胞の水画分は、貯蔵温度(典型的にはガ
ラス転移温度Tg'を下回る)までの更なる冷却期間に結晶化する。細胞内部での氷
の形成は、氷相に転換された細胞の水画分がある限界を超える(通常5％)場合に
は、細胞死をもたらすと考えられている。他方トレハロースの状態図は、Tmおよ
びTg曲線がDMSO(およそ-80℃)と比べ、非常に高い氷点下の温度(およそ-30℃)で
、互いに交差するようなものである。結果として、卵母細胞を凍結することがで
き、かつそのガラス転移温度の非常に近くまで脱水する一方で、膜の透水性は依
然高く、その後液体窒素中の超急速凍結は試料をガラス状とする。その後この試
料は、この温度で貯蔵される。この方法は、卵母細胞が、ほとんどの従来型の浸
透性凍結保護剤において-50℃以下で認められるいわゆる「ボトルネック」作用
を克服することを可能にする。細胞に、細胞外糖質に加え、細胞外糖質を適用す
ることによっても、有益な結果が得られる。
の状態図を示している。典型的には1〜2M DMSOで負荷された卵母細胞は、非常に
緩徐な冷却速度(0.3〜0.5℃/分)で中間温度(-60℃〜-80℃)へと冷却され、その
後貯蔵のために液体窒素で超急速凍結される。緩徐な冷却速度の結果、卵母細胞
は、脱水のための十分な時間を有し、かつ-30℃〜-50℃の温度範囲に低下される
凍結保護剤溶液(例えばDMSO)の平衡融解曲線(Tm)に密に従う。水に対する形質膜
の透過性は、-50℃より低い温度で、低下する温度の関数として指数関数的に減
少するので、細胞の脱水は、実践目的においては無視できるようになる。温度は
更に貯蔵温度まで低下するので、卵母細胞内部の未凍結の溶液は、点Tg'で、温
度がTg曲線に到達するまで一層濃縮され始め、その結果この溶液はガラスとなり
始める。結果的に、細胞内に残留する細胞の水画分は、貯蔵温度(典型的にはガ
ラス転移温度Tg'を下回る)までの更なる冷却期間に結晶化する。細胞内部での氷
の形成は、氷相に転換された細胞の水画分がある限界を超える(通常5％)場合に
は、細胞死をもたらすと考えられている。他方トレハロースの状態図は、Tmおよ
びTg曲線がDMSO(およそ-80℃)と比べ、非常に高い氷点下の温度(およそ-30℃)で
、互いに交差するようなものである。結果として、卵母細胞を凍結することがで
き、かつそのガラス転移温度の非常に近くまで脱水する一方で、膜の透水性は依
然高く、その後液体窒素中の超急速凍結は試料をガラス状とする。その後この試
料は、この温度で貯蔵される。この方法は、卵母細胞が、ほとんどの従来型の浸
透性凍結保護剤において-50℃以下で認められるいわゆる「ボトルネック」作用
を克服することを可能にする。細胞に、細胞外糖質に加え、細胞外糖質を適用す
ることによっても、有益な結果が得られる。
【００３５】
次に懸濁された材料を、望ましい時間、例えばLN2中にバイアルを放置するこ
とにより、極低温保存温度で貯蔵することができる(90、100)。好ましくは、こ
れらの細胞は、凍結保護剤のTg'と等しいかまたはそれ未満の温度で貯蔵され、
その結果これらの細胞はガラス状態であり続ける。好ましい貯蔵温度は、Tg'よ
りも少なくとも5、10、15、20、30、または40℃低い。更にこれらの細胞は、貯
蔵期間は比較的一定の温度に維持されることが好ましい。好ましくは、貯蔵温度
は、貯蔵期間中に20、10、5、または3℃未満変化する。その後懸濁細胞は、貯蔵
(110)から、37℃水浴中での連続した緩やかな攪拌を5分間行う解凍(120)により
、回復することができる。
とにより、極低温保存温度で貯蔵することができる(90、100)。好ましくは、こ
れらの細胞は、凍結保護剤のTg'と等しいかまたはそれ未満の温度で貯蔵され、
その結果これらの細胞はガラス状態であり続ける。好ましい貯蔵温度は、Tg'よ
りも少なくとも5、10、15、20、30、または40℃低い。更にこれらの細胞は、貯
蔵期間は比較的一定の温度に維持されることが好ましい。好ましくは、貯蔵温度
は、貯蔵期間中に20、10、5、または3℃未満変化する。その後懸濁細胞は、貯蔵
(110)から、37℃水浴中での連続した緩やかな攪拌を5分間行う解凍(120)により
、回復することができる。
【００３６】
タンパク質の真空乾燥または風乾(50)および凍結乾燥(60)のプロトコールは、
当技術分野において良く特徴付けられており[Franksら、「材料科学および貯蔵
安定性生物製剤の作成(Materials Science and the Production of Shelf-Stabl
e Biologicals)」、BioPharm社、1991年10月、39頁；Shalaevら、「凍結・乾燥
時のモデル混合物の物理状態の変化：製品品質への影響(Changes in the Physic
al State of Model Mixtures during Freezing and Drying: Impact on Product
Quality)」、Cryobiol.、33:14-26(1996)]、ならびにこのようなプロトコール
を、本発明の方法により貯蔵する細胞懸濁液の調製に使用することができる。風
乾に加え、細胞懸濁液から水分を除去するために使用することができるその他の
対流乾燥法は、窒素または他の気体の対流流れを含む。ある好ましい態様におい
て、対流乾燥に使用される気体は、ある種の細胞を劣化させることがある酸素は
含まない。
当技術分野において良く特徴付けられており[Franksら、「材料科学および貯蔵
安定性生物製剤の作成(Materials Science and the Production of Shelf-Stabl
e Biologicals)」、BioPharm社、1991年10月、39頁；Shalaevら、「凍結・乾燥
時のモデル混合物の物理状態の変化：製品品質への影響(Changes in the Physic
al State of Model Mixtures during Freezing and Drying: Impact on Product
Quality)」、Cryobiol.、33:14-26(1996)]、ならびにこのようなプロトコール
を、本発明の方法により貯蔵する細胞懸濁液の調製に使用することができる。風
乾に加え、細胞懸濁液から水分を除去するために使用することができるその他の
対流乾燥法は、窒素または他の気体の対流流れを含む。ある好ましい態様におい
て、対流乾燥に使用される気体は、ある種の細胞を劣化させることがある酸素は
含まない。
【００３７】
本発明の方法で有用な蒸発性真空乾燥プロトコール(130)の例は、12ウェルプ
レート上のウェルに各20μlを入れること、および周囲温度で2時間真空乾燥する
ことを含む。当然、バイアル内の細胞の乾燥を含む、その他の乾燥法を使用する
ことができる。この方法で調製した細胞は、乾燥貯蔵(140)されるか、DMEMまた
は他の適当な培地中に希釈することにより再水和(160)される。
レート上のウェルに各20μlを入れること、および周囲温度で2時間真空乾燥する
ことを含む。当然、バイアル内の細胞の乾燥を含む、その他の乾燥法を使用する
ことができる。この方法で調製した細胞は、乾燥貯蔵(140)されるか、DMEMまた
は他の適当な培地中に希釈することにより再水和(160)される。
【００３８】
貯蔵(40)のための細胞を調製するために凍結乾燥(60)を使用する本発明の方法
は、細胞懸濁液の凍結(80)から始まる。先行技術の凍結法を用いることができる
一方で、凍結解凍法について本明細書に説明された簡単な超急速凍結法も、この
凍結乾燥プロトコールの凍結工程(80)のために使用することができる。
は、細胞懸濁液の凍結(80)から始まる。先行技術の凍結法を用いることができる
一方で、凍結解凍法について本明細書に説明された簡単な超急速凍結法も、この
凍結乾燥プロトコールの凍結工程(80)のために使用することができる。
【００３９】
凍結後、二工程乾燥法(150)が使用される。第一の工程において、昇華エネル
ギーが凍結した水を蒸発させるために加えられる。細胞が凍結乾燥する場合、一
次乾燥相の温度の選択のための一次判定基準は、崩壊および望ましくない化学反
応を避けるために、凍結濃縮された溶液のガラス相転移温度よりも低くなければ
ならないことである。一般に、試料に損傷を及ぼさない可能性の最も高い温度が
、昇華を迅速に生じるために使用されなければならない。典型的には、一次乾燥
は、凍結濃縮された溶液についてガラス転移温度より低く維持された一定温度で
生じる。
ギーが凍結した水を蒸発させるために加えられる。細胞が凍結乾燥する場合、一
次乾燥相の温度の選択のための一次判定基準は、崩壊および望ましくない化学反
応を避けるために、凍結濃縮された溶液のガラス相転移温度よりも低くなければ
ならないことである。一般に、試料に損傷を及ぼさない可能性の最も高い温度が
、昇華を迅速に生じるために使用されなければならない。典型的には、一次乾燥
は、凍結濃縮された溶液についてガラス転移温度より低く維持された一定温度で
生じる。
【００４０】
二次乾燥は、試料中の純粋な氷晶が昇華された後に行われる。二次乾燥は、温
度が凍結濃縮された溶質のガラス相転移温度を上回らない限りは生じることはな
いが、試料温度は、粘性流のためにその試料が機械的に崩壊すると考えられる崩
壊点を上回って上昇することはないことは重要である。
度が凍結濃縮された溶質のガラス相転移温度を上回らない限りは生じることはな
いが、試料温度は、粘性流のためにその試料が機械的に崩壊すると考えられる崩
壊点を上回って上昇することはないことは重要である。
【００４１】
凍結乾燥した細胞は、先に真空乾燥について説明した方法と同様に、貯蔵(140
)および水和(160)することができる。その後生細胞が回復される(170)。
)および水和(160)することができる。その後生細胞が回復される(170)。
【００４２】
凍結または乾燥状態からの細胞の回復後、任意に外部極低温保存を、培養培地
から取除くことができる。例えば培地を、比較的低濃度の極低温保存剤を相当す
る培地に添加することにより希釈することができる。例えば、回復された細胞は
、細胞貯蔵に使用される濃度よりもより低い濃度の糖質を含有する培地内で、お
よそ5分間インキュベーションすることができる。このインキュベーションのた
めに、培地は、極低温保存剤として使用されたものと同じ糖質；ガラクトースの
ような異なる極低温保存剤；または、いずれか他の実質的に不透過性の溶質を含
有することができる。培地のモル浸透圧濃度を低下することにより誘導された浸
透圧ショックを最小化するために、各回より低い濃度の極低温保存剤で、この希
釈工程を複数回行うことにより、細胞外極低温保存剤の濃度をゆっくり低下させ
ることができる(図2)。これらの希釈工程は、細胞外極低温保存剤が存在しなく
なるまでまたは極低温保存剤の濃度または培地のモル浸透圧濃度が望ましいレベ
ルに低下するまで反復することができる。
から取除くことができる。例えば培地を、比較的低濃度の極低温保存剤を相当す
る培地に添加することにより希釈することができる。例えば、回復された細胞は
、細胞貯蔵に使用される濃度よりもより低い濃度の糖質を含有する培地内で、お
よそ5分間インキュベーションすることができる。このインキュベーションのた
めに、培地は、極低温保存剤として使用されたものと同じ糖質；ガラクトースの
ような異なる極低温保存剤；または、いずれか他の実質的に不透過性の溶質を含
有することができる。培地のモル浸透圧濃度を低下することにより誘導された浸
透圧ショックを最小化するために、各回より低い濃度の極低温保存剤で、この希
釈工程を複数回行うことにより、細胞外極低温保存剤の濃度をゆっくり低下させ
ることができる(図2)。これらの希釈工程は、細胞外極低温保存剤が存在しなく
なるまでまたは極低温保存剤の濃度または培地のモル浸透圧濃度が望ましいレベ
ルに低下するまで反復することができる。
【００４３】
繊維芽細胞のように、比較的迅速に分裂している細胞について、糖質の内部濃
度は、母細胞と娘細胞の間で糖質が分割されるので速やかに低下する。従ってこ
れらの細胞の内部モル浸透圧濃度は、従来の等張培地の濃度に近いレベルにまで
低下し、回復された細胞が、細胞の内外間のモル浸透圧濃度の差異によって引き
起される顕著な膨潤または有害な作用を伴うことなく等張培地において培養され
ることを可能にする。
度は、母細胞と娘細胞の間で糖質が分割されるので速やかに低下する。従ってこ
れらの細胞の内部モル浸透圧濃度は、従来の等張培地の濃度に近いレベルにまで
低下し、回復された細胞が、細胞の内外間のモル浸透圧濃度の差異によって引き
起される顕著な膨潤または有害な作用を伴うことなく等張培地において培養され
ることを可能にする。
【００４４】
卵母細胞のような、分裂しないかもしくはゆっくり分裂する回復された細胞の
培養について、高張培地を用いることで、それらが等張培地に回復される場合に
は生じるであろう細胞の膨潤を防ぐまたは低下することができる。従って、ある
種の回復された細胞の培養のための高張培地は、二面(two-prong)手法を用いて
開発される。第一に、HTF(ヒト卵管液培地)と称される標準の培養培地を、電解
質濃度を最小化し(図7参照、下向きの矢印で示した成分)、ならびに他の栄養素
およびアミノ酸を増加する(図7参照、上向きの矢印で示した成分)ように変更し
た。この培地のモル浸透圧濃度は、浸透圧計を用いて決定した。この培地のモル
浸透圧濃度はおよそ285mosmであり、これは正常な細胞の内部モル浸透圧濃度と
近いので、この培地を変更等張HTFと称する。第二に、この培地の含水量を低下
し、最終モル浸透圧濃度320mosmを達成するよう各成分の濃度を同等に増加した
。この培地は、変更高張HTFと称する(図7参照、最後の欄)。
培養について、高張培地を用いることで、それらが等張培地に回復される場合に
は生じるであろう細胞の膨潤を防ぐまたは低下することができる。従って、ある
種の回復された細胞の培養のための高張培地は、二面(two-prong)手法を用いて
開発される。第一に、HTF(ヒト卵管液培地)と称される標準の培養培地を、電解
質濃度を最小化し(図7参照、下向きの矢印で示した成分)、ならびに他の栄養素
およびアミノ酸を増加する(図7参照、上向きの矢印で示した成分)ように変更し
た。この培地のモル浸透圧濃度は、浸透圧計を用いて決定した。この培地のモル
浸透圧濃度はおよそ285mosmであり、これは正常な細胞の内部モル浸透圧濃度と
近いので、この培地を変更等張HTFと称する。第二に、この培地の含水量を低下
し、最終モル浸透圧濃度320mosmを達成するよう各成分の濃度を同等に増加した
。この培地は、変更高張HTFと称する(図7参照、最後の欄)。
【００４５】
変更等張HTFおよび高張培地の卵母細胞の受精および発生を支援する能力を調
べるために、これらの培地を用い、極低温保存されていない新鮮なマウス中期II
卵母細胞を培養した。図8に示したように、変更等張HTFまたは変更高張HTF培地
のいずれか中で培養した細胞内トレハロースを含まない対照マウス卵母細胞は、
高頻度の受精(90％)および胚盤胞期への発生(85％を上回る)を示した。O.07Mト
レハロースを注入したマウス卵母細胞も、変更高張HTF培地において、高頻度の
受精および胚盤胞発生を示した。細胞内トレハロースが0.15Mで、受精および胚
盤胞形成の頻度は低下したが、依然有意であった。望ましいならば、この培養培
地の組成および高張性を、形成された胚盤胞または生存可能な胎児の数を増加す
るように更に最適化することができる。例えば、比較的高いモル浸透圧濃度(例
えば330、340、350、360、370、または380mosm)を有する培養培地は、より一層
卵管液(これは少なくとも360mosmのモル浸透圧濃度を有する)に類似し、その結
果更に生存可能な胎児の発生を促進する(Van Winkleら、J. Expt Zool.、253:21
5-219(1990))。モル浸透圧濃度が少なくとも300、310、320、330、340、350、36
0、370、380mosm、またはそれ以上である他の適当な高張培地を、細胞のインビ
トロ培養に好ましい方法において使用することができる。これらの方法は、細胞
内糖質を含むまたは含まない細胞を培養するために使用することができる。これ
らの好ましい培地は、極低温保存された細胞の貯蔵前、貯蔵時または貯蔵後に使
用することができる。
べるために、これらの培地を用い、極低温保存されていない新鮮なマウス中期II
卵母細胞を培養した。図8に示したように、変更等張HTFまたは変更高張HTF培地
のいずれか中で培養した細胞内トレハロースを含まない対照マウス卵母細胞は、
高頻度の受精(90％)および胚盤胞期への発生(85％を上回る)を示した。O.07Mト
レハロースを注入したマウス卵母細胞も、変更高張HTF培地において、高頻度の
受精および胚盤胞発生を示した。細胞内トレハロースが0.15Mで、受精および胚
盤胞形成の頻度は低下したが、依然有意であった。望ましいならば、この培養培
地の組成および高張性を、形成された胚盤胞または生存可能な胎児の数を増加す
るように更に最適化することができる。例えば、比較的高いモル浸透圧濃度(例
えば330、340、350、360、370、または380mosm)を有する培養培地は、より一層
卵管液(これは少なくとも360mosmのモル浸透圧濃度を有する)に類似し、その結
果更に生存可能な胎児の発生を促進する(Van Winkleら、J. Expt Zool.、253:21
5-219(1990))。モル浸透圧濃度が少なくとも300、310、320、330、340、350、36
0、370、380mosm、またはそれ以上である他の適当な高張培地を、細胞のインビ
トロ培養に好ましい方法において使用することができる。これらの方法は、細胞
内糖質を含むまたは含まない細胞を培養するために使用することができる。これ
らの好ましい培地は、極低温保存された細胞の貯蔵前、貯蔵時または貯蔵後に使
用することができる。
【００４６】
図9Aおよび9Bは、各々、-15°および-30°での、細胞外トレハロース濃度の関
数としての、変更高張HTF培地中で一晩培養後の冷却した中期IIマウス卵母細胞
の生存を示すグラフのセットである。これらの実験は、冷却速度1℃/分を用い、
およそ0.10〜0.15Mの細胞内トレハロースを含むまたは含まずに行った。細胞の
生存力は、本明細書に記したLive/Deadアッセイ法を用いて評価した。加えて光
学顕微鏡を用いて、生存可能な卵母細胞が完全な膜を有するかどうかならびに分
解および断片化の徴候を欠いているかどうかを肉眼により決定した。-15および-
30℃の両方で、卵母細胞内部への約0.10〜0.15Mトレハロースの添加は、生存率
を劇的に増加した。更に-30℃において、内部トレハロースの非含有は、凍結後
にほとんど生存卵母細胞を生じなかった。細胞外トレハロースの量は、生存に対
し劇的な用量依存型の作用を有していた。凍結溶液中の細胞外トレハロース量は
0.15M(細胞内トレハロースとほぼ同量)から0.30Mまたは0.50Mへ増加したので、
生存率は、各々、約18％から55％または85％へとそれぞれ改善された。この結果
は、細胞の冷却時に内部および外部極低温保存剤を使用する利益を示している。
数としての、変更高張HTF培地中で一晩培養後の冷却した中期IIマウス卵母細胞
の生存を示すグラフのセットである。これらの実験は、冷却速度1℃/分を用い、
およそ0.10〜0.15Mの細胞内トレハロースを含むまたは含まずに行った。細胞の
生存力は、本明細書に記したLive/Deadアッセイ法を用いて評価した。加えて光
学顕微鏡を用いて、生存可能な卵母細胞が完全な膜を有するかどうかならびに分
解および断片化の徴候を欠いているかどうかを肉眼により決定した。-15および-
30℃の両方で、卵母細胞内部への約0.10〜0.15Mトレハロースの添加は、生存率
を劇的に増加した。更に-30℃において、内部トレハロースの非含有は、凍結後
にほとんど生存卵母細胞を生じなかった。細胞外トレハロースの量は、生存に対
し劇的な用量依存型の作用を有していた。凍結溶液中の細胞外トレハロース量は
0.15M(細胞内トレハロースとほぼ同量)から0.30Mまたは0.50Mへ増加したので、
生存率は、各々、約18％から55％または85％へとそれぞれ改善された。この結果
は、細胞の冷却時に内部および外部極低温保存剤を使用する利益を示している。
【００４７】
図10は、変更HTF培地等張において一晩培養後の冷却した中期IIマウス卵母細
胞の生存を示している。図11は、HTF培地＋0.1M細胞外トレハロースにおいて一
晩培養した後の冷却したヒト卵母細胞の生存を示している。細胞生存は、Live/D
eadアッセイ法を用いて測定した。光学顕微鏡を使用し、生存可能な卵母細胞が
完全な膜を有するかどうかならびに分解および断片化の徴候を欠いているかどう
かを肉眼により決定した。図10および図11において括弧で印したTg'は、トレハ
ロースが細胞の内部および外部の両方に存在する場合に可能な長期貯蔵温度を示
している。図10において、卵母細胞は、非常にゆっくりとした冷却速度で、中間
温度(-60℃)にまで冷却した。トレハロースを含まない卵母細胞は、生存率0％を
生じた。0.50M細胞外トレハロースを負荷した卵母細胞は、対照を上回る若干の
改善を示したが、温度の低下に伴う生存率の一様の減少により損なわれた。他方
で、0.15M細胞内および0.50M細胞外トレハロースが負荷された卵母細胞は、80〜
100％の生存率を維持した。対照および細胞外トレハロース溶液中の卵母細胞と
の比較において、細胞内トレハロースを含む卵母細胞は、生存率の顕著な増加を
経験した。
胞の生存を示している。図11は、HTF培地＋0.1M細胞外トレハロースにおいて一
晩培養した後の冷却したヒト卵母細胞の生存を示している。細胞生存は、Live/D
eadアッセイ法を用いて測定した。光学顕微鏡を使用し、生存可能な卵母細胞が
完全な膜を有するかどうかならびに分解および断片化の徴候を欠いているかどう
かを肉眼により決定した。図10および図11において括弧で印したTg'は、トレハ
ロースが細胞の内部および外部の両方に存在する場合に可能な長期貯蔵温度を示
している。図10において、卵母細胞は、非常にゆっくりとした冷却速度で、中間
温度(-60℃)にまで冷却した。トレハロースを含まない卵母細胞は、生存率0％を
生じた。0.50M細胞外トレハロースを負荷した卵母細胞は、対照を上回る若干の
改善を示したが、温度の低下に伴う生存率の一様の減少により損なわれた。他方
で、0.15M細胞内および0.50M細胞外トレハロースが負荷された卵母細胞は、80〜
100％の生存率を維持した。対照および細胞外トレハロース溶液中の卵母細胞と
の比較において、細胞内トレハロースを含む卵母細胞は、生存率の顕著な増加を
経験した。
【００４８】
図12Aは、様々な冷却速度での温度の関数としての、マウス卵母細胞の含水量
を示す複数の曲線のグラフであり、これは凍結時の水輸送速度に関する下記の良
く確立された式を基にしている(Karlssonら、Human Reproduction、11:1296-130
5(1996)；Tonerら、J. of Membrane Biology、115:261-272(1990))。 式中、Rは気体含量であり；Tは温度であり；Bは冷却速度であり；vwは、水の部
分モル容量であり、ならびにaw exおよびaw inは、各々、細胞外および細胞内の溶
液中の水活性である。Lpは、下記式で得られる透水性である。 式中Lpgは、TRでの参照透水性であり；ELpは、活性化エネルギーまたは透水性の
温度依存性であり、ならびにTRは参照温度(典型的には0℃)である。
を示す複数の曲線のグラフであり、これは凍結時の水輸送速度に関する下記の良
く確立された式を基にしている(Karlssonら、Human Reproduction、11:1296-130
5(1996)；Tonerら、J. of Membrane Biology、115:261-272(1990))。 式中、Rは気体含量であり；Tは温度であり；Bは冷却速度であり；vwは、水の部
分モル容量であり、ならびにaw exおよびaw inは、各々、細胞外および細胞内の溶
液中の水活性である。Lpは、下記式で得られる透水性である。 式中Lpgは、TRでの参照透水性であり；ELpは、活性化エネルギーまたは透水性の
温度依存性であり、ならびにTRは参照温度(典型的には0℃)である。
【００４９】
これらの曲線により示されるように、卵母細胞の脱水の程度は、冷却速度に依
存している。例えば、非常に遅い冷却速度は、卵母細胞の過剰な脱水を生じる。
あるいは、非常に迅速な冷却速度(例えば、30または60℃/分)は、最小の脱水を
生じることがある。従って0.1〜5℃/分であるような中間の冷却速度が好ましい
。これらの速度について、水輸送モデルは、細胞内水容積は、最初に減少しその
後漸近的に一定値に近づくことを予測している。この図において例証されたよう
に、透水性は、活性化エネルギーによる温度の指数関数であり、マウス卵母細胞
についてELpは14.5kcal/molである。従って凍結時には温度は低下するので、Lp
は、急勾配で低下し、かつ温度-50℃/分未満ではほぼゼロに達する。マウス卵母
細胞ならびにラット、ウシおよびヒトのような他の哺乳類の卵母細胞の間のLpの
温度依存性(すなわちELp値)は類似しているので、同様の脱水挙動が他の卵母細
胞について予想される。例えば、ELpは、マウス卵母細胞について14.5kcal/mol
であるのに対し、ヒト卵母細胞について14.70kcal/molである(Paynterら、Human
Reproduction、14:2338-2342(1999))。
存している。例えば、非常に遅い冷却速度は、卵母細胞の過剰な脱水を生じる。
あるいは、非常に迅速な冷却速度(例えば、30または60℃/分)は、最小の脱水を
生じることがある。従って0.1〜5℃/分であるような中間の冷却速度が好ましい
。これらの速度について、水輸送モデルは、細胞内水容積は、最初に減少しその
後漸近的に一定値に近づくことを予測している。この図において例証されたよう
に、透水性は、活性化エネルギーによる温度の指数関数であり、マウス卵母細胞
についてELpは14.5kcal/molである。従って凍結時には温度は低下するので、Lp
は、急勾配で低下し、かつ温度-50℃/分未満ではほぼゼロに達する。マウス卵母
細胞ならびにラット、ウシおよびヒトのような他の哺乳類の卵母細胞の間のLpの
温度依存性(すなわちELp値)は類似しているので、同様の脱水挙動が他の卵母細
胞について予想される。例えば、ELpは、マウス卵母細胞について14.5kcal/mol
であるのに対し、ヒト卵母細胞について14.70kcal/molである(Paynterら、Human
Reproduction、14:2338-2342(1999))。
【００５０】
図12Bは、卵母細胞の容積を所定の温度で50％減少するのに必要な算出された
脱水時間を示すグラフである。このグラフは、先に記した水輸送式を用いて作成
し、かつ水輸送は低温で、特に-50℃未満の温度で顕著に低下されたことを明確
に示している。従って、顕著な速度で脱水を継続するためには、細胞は、本発明
の方法を用い、最終温度が低くとも-50、-40、-30、-20、または-10℃に冷却さ
れることが好ましい。脱水が完了した後、細胞は、必要時までガラス状態に細胞
を維持するように、この温度でまたはより低い温度で貯蔵することができる。
脱水時間を示すグラフである。このグラフは、先に記した水輸送式を用いて作成
し、かつ水輸送は低温で、特に-50℃未満の温度で顕著に低下されたことを明確
に示している。従って、顕著な速度で脱水を継続するためには、細胞は、本発明
の方法を用い、最終温度が低くとも-50、-40、-30、-20、または-10℃に冷却さ
れることが好ましい。脱水が完了した後、細胞は、必要時までガラス状態に細胞
を維持するように、この温度でまたはより低い温度で貯蔵することができる。
【００５１】
図13は、様々な温度で細胞内氷を有する卵母細胞の割合を示す曲線のセットの
グラフである。このアッセイ法について、標準の極低温顕微鏡(cryomicroscopy)
法を用い、卵母細胞を3.5℃/分の速度で冷却した(Cosmanら、Cryo-Letters、10:
17-38(1989))。これらの卵母細胞は、極低温顕微鏡を用いて観察し、細胞内氷が
形成されたかどうかを決定した。細胞内氷の存在は、氷晶により散乱した光のた
めに出現した黒色を基に容易に検出された。このアッセイ法を用い、等張培地単
独中でインキュベーションした対照卵母細胞、0.1M細胞外トレハロースを含む培
地中でインキュベーションした卵母細胞、および0.1Mトレハロースを注入しかつ
0.1M細胞外トレハロースを含む培地中でインキュベーションした卵母細胞を試験
した。図13に示したように、細胞外トレハロースは、卵母細胞における細胞内氷
の形成の頻度を低下させた。細胞内氷の頻度は、細胞外トレハロースに加え細胞
内トレハロースの存在により更に低下した。望ましいならば、細胞内氷の量は、
使用される細胞内または細胞外の糖質濃度の増加により、更に低下させることが
できる。トレハロースが顕著に内部氷を減少させる能力は、より急速な冷却速度
によりもたらされる。極低温生物学の分野において、致命的な細胞内氷の形成を
伴わないより急速な冷却速度は、より大きい細胞生存の機会をもたらすことは確
立されている。
グラフである。このアッセイ法について、標準の極低温顕微鏡(cryomicroscopy)
法を用い、卵母細胞を3.5℃/分の速度で冷却した(Cosmanら、Cryo-Letters、10:
17-38(1989))。これらの卵母細胞は、極低温顕微鏡を用いて観察し、細胞内氷が
形成されたかどうかを決定した。細胞内氷の存在は、氷晶により散乱した光のた
めに出現した黒色を基に容易に検出された。このアッセイ法を用い、等張培地単
独中でインキュベーションした対照卵母細胞、0.1M細胞外トレハロースを含む培
地中でインキュベーションした卵母細胞、および0.1Mトレハロースを注入しかつ
0.1M細胞外トレハロースを含む培地中でインキュベーションした卵母細胞を試験
した。図13に示したように、細胞外トレハロースは、卵母細胞における細胞内氷
の形成の頻度を低下させた。細胞内氷の頻度は、細胞外トレハロースに加え細胞
内トレハロースの存在により更に低下した。望ましいならば、細胞内氷の量は、
使用される細胞内または細胞外の糖質濃度の増加により、更に低下させることが
できる。トレハロースが顕著に内部氷を減少させる能力は、より急速な冷却速度
によりもたらされる。極低温生物学の分野において、致命的な細胞内氷の形成を
伴わないより急速な冷却速度は、より大きい細胞生存の機会をもたらすことは確
立されている。
【００５２】
図14は、-55℃よりも高いガラス転移温度を有する糖質の一覧表である。この
表に示されたように、より大きい分子量を持つ糖質は、より高いガラス転移温度
を有する傾向がある。直鎖ポリマーは更に、同じ分子量の分枝したポリマーより
もより高いガラス転移温度を有する傾向がある。直鎖および環状α-(1→4)-結合
したグルコース六量体を比べると、環状オリゴマー(シクロデキストリン、Tg'=-
9℃)は、直鎖状オリゴマー(マルトヘキサオース、Tg'=-14.5℃)よりもより高い
ガラス転移温度を有する(LevineおよびSlade、前掲)。
表に示されたように、より大きい分子量を持つ糖質は、より高いガラス転移温度
を有する傾向がある。直鎖ポリマーは更に、同じ分子量の分枝したポリマーより
もより高いガラス転移温度を有する傾向がある。直鎖および環状α-(1→4)-結合
したグルコース六量体を比べると、環状オリゴマー(シクロデキストリン、Tg'=-
9℃)は、直鎖状オリゴマー(マルトヘキサオース、Tg'=-14.5℃)よりもより高い
ガラス転移温度を有する(LevineおよびSlade、前掲)。
【００５３】
いくつかの糖質および従来の凍結保護剤の分子量の関数としてのTg'のグラフ
を図15に示した。84種の小さい糖質についてのLevineおよびSladeの論文(前掲)
中のより総合的図において、増大するTg'および分子量の間の単調関係は、線形
相関r=-0.93を生じた。従って、分子量が少なくとも120ダルトンである糖質につ
いて、それらのTg'は少なくとも-50℃である。
を図15に示した。84種の小さい糖質についてのLevineおよびSladeの論文(前掲)
中のより総合的図において、増大するTg'および分子量の間の単調関係は、線形
相関r=-0.93を生じた。従って、分子量が少なくとも120ダルトンである糖質につ
いて、それらのTg'は少なくとも-50℃である。
【００５４】他の態様
前記説明から、様々な用途および条件に適合させるために、本明細書に記され
た本発明に変更および修飾を行うことができることは明らかであると思われる。
このような態様も、特許請求の範囲内である。
た本発明に変更および修飾を行うことができることは明らかであると思われる。
このような態様も、特許請求の範囲内である。
【００５５】
本明細書において引用された全ての刊行物は、各個別の刊行物または特許出願
が具体的かつ個別に参照として組入れられることが示されているのと同程度に、
本明細書に参照として組入れられている。
が具体的かつ個別に参照として組入れられることが示されているのと同程度に、
本明細書に参照として組入れられている。
本発明は、添付図面を考慮した上で、上記の詳細な説明により完全に理解され
ると思われる。
ると思われる。
【図１】 図1は、本発明の方法の工程を示す流れ図である。
【図２】 図2は、本発明の極低温保存プロトコールの一つの態様を列記して
いる概略的流れ図である。このプロトコールは、当業者により、その他の極低温
保存剤、冷却速度、希釈工程、および培地を使用し、他の細胞の保存のために変
更することができる。
いる概略的流れ図である。このプロトコールは、当業者により、その他の極低温
保存剤、冷却速度、希釈工程、および培地を使用し、他の細胞の保存のために変
更することができる。
【図３】 図3Aは、0.1Mトレハロースの微量注入前の等張DMEM/F-12培地、微
量注入前の0.1M細胞外トレハロースを含むDMEM/F-12(高張培地)、および微量注
入後の0.1M細胞外トレハロースを含むDMEM/F-12(高張培地)における、マウス卵
母細胞の容積を示す図である。図3B〜3Dは、前記三種の各条件下での卵母細胞の
位相差顕微鏡写真である。
量注入前の0.1M細胞外トレハロースを含むDMEM/F-12(高張培地)、および微量注
入後の0.1M細胞外トレハロースを含むDMEM/F-12(高張培地)における、マウス卵
母細胞の容積を示す図である。図3B〜3Dは、前記三種の各条件下での卵母細胞の
位相差顕微鏡写真である。
【図４】 図4A〜4Dは、それぞれ、0.15Mトレハロースの、微量注入前の等張D
MEM/F-12培地、微量注入前の0.15M細胞外トレハロースを含むDMEM/F-12(高張培
地)、微量注入時の0.15M細胞外トレハロースを含むDMEM/F-12(高張培地)、およ
び微量注入後の0.15M細胞外トレハロースを含むDMEM/F-12(高張培地)における、
ヒト卵母細胞の明視野顕微鏡写真である。
MEM/F-12培地、微量注入前の0.15M細胞外トレハロースを含むDMEM/F-12(高張培
地)、微量注入時の0.15M細胞外トレハロースを含むDMEM/F-12(高張培地)、およ
び微量注入後の0.15M細胞外トレハロースを含むDMEM/F-12(高張培地)における、
ヒト卵母細胞の明視野顕微鏡写真である。
【図５】 図5は、本発明の極低温保存剤の微量注入に使用した微量ピペット
のキャリブレーションを示す棒グラフである。
のキャリブレーションを示す棒グラフである。
【図６】 図6Aおよび6Bは、DMSOおよびトレハロースの状態図である。
【図７】 図7は、HTF、変更等張HTF、および変更高張HTF培地の成分を列記し
ている表である。
ている表である。
【図８】 図8は、変更等張HTFおよび変更高張HTF培地で培養された、受精さ
れ胚盤胞へと発生している、細胞内トレハロースを含むまたは含まない中期IIマ
ウス卵母細胞の割合を記す表である。
れ胚盤胞へと発生している、細胞内トレハロースを含むまたは含まない中期IIマ
ウス卵母細胞の割合を記す表である。
【図９】 図9Aおよび9Bは、様々な濃度の細胞外トレハロースの存在下での、
0または0.10〜0.15M細胞内トレハロースを含む中期IIマウス卵母細胞の生存の割
合を示すグラフのセットである。
0または0.10〜0.15M細胞内トレハロースを含む中期IIマウス卵母細胞の生存の割
合を示すグラフのセットである。
【図１０】 図10は、一晩培養した後の冷却した中期IIマウス卵母細胞の生存
を示す。
を示す。
【図１１】 図11は、一晩培養した後の冷却したヒト卵母細胞の生存を示す。
【図１２】 図12Aは、様々な冷却速度についての温度の関数としての、正規
化された卵母細胞中の水容積を示す曲線のグラフのセットである。図12Bは、温
度の関数としての、算出された脱水時間を示すグラフである。脱水時間は、卵母
細胞が所定の温度で容積50％にまで収縮するのに必要な時間と定義される。
化された卵母細胞中の水容積を示す曲線のグラフのセットである。図12Bは、温
度の関数としての、算出された脱水時間を示すグラフである。脱水時間は、卵母
細胞が所定の温度で容積50％にまで収縮するのに必要な時間と定義される。
【図１３】 図13は、保存剤の存在または非存在下での、温度の関数としての
、細胞内氷晶累積発生率を示す曲線のセットである。
、細胞内氷晶累積発生率を示す曲線のセットである。
【図１４】 図14は、ガラス転移温度が-55℃よりも高い糖質の分子量および
ガラス転移温度の一覧表である(LevineおよびSlade、J. Chem. Soc., Faraday T
rans. 1、84:2619-2633(1988))。これらの糖質の多くは、Sigma社およびBritish
Sugar社などの供給業者から市販されている。
ガラス転移温度の一覧表である(LevineおよびSlade、J. Chem. Soc., Faraday T
rans. 1、84:2619-2633(1988))。これらの糖質の多くは、Sigma社およびBritish
Sugar社などの供給業者から市販されている。
【図１５】 図15は、いくつかの糖質および従来型凍結保護剤のTg'と分子量
との間の単調関係を示すグラフである。
との間の単調関係を示すグラフである。
【図１６】 図16は、トレハロース溶液の注入前および注入後の微小液滴の明
視野顕微鏡写真である。
視野顕微鏡写真である。
【図１７】 図17は、トレハロース溶液が注入された微小液滴についての、注
入圧3 PSIでの様々な注入時間(msec)についての注入容積(pL)のグラフである。
入圧3 PSIでの様々な注入時間(msec)についての注入容積(pL)のグラフである。
【図１８】 図18は、本明細書に記した蛍光糖質オレゴン-グリーン標識した
デキストランが1回(「1x」)または2回(「2x」)注入された卵母細胞の蛍光画像の
写真である。
デキストランが1回(「1x」)または2回(「2x」)注入された卵母細胞の蛍光画像の
写真である。
【図１９】 図19は、微小液滴内のOG-標識したデキストランの様々な濃度に
ついての蛍光強度の標準曲線のグラフである。
ついての蛍光強度の標準曲線のグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ
，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，
ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ
Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ
，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，
ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ
Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ
，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，
ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 トート トーマス
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 サ
ドベリー タバーン サークル 11
Ｆターム(参考） 4B065 AA90X BC12 BC18 BD09
BD11 BD12 BD35 BD36 BD38
Claims (35)
- 【請求項１】 生細胞を処理する方法であって、(a)(i)糖質を含有し、(ii)
哺乳類細胞膜に関して実質的に不透過性であり、および(iii)一時的休眠状態で
貯蔵でき且つ活動状態へ実質的に回復することができるように該細胞の生存力を
維持する保護剤を、該細胞の細胞質へ微量注入する工程；(b)該細胞を該休眠状
態へ入らせるようこれを処理する工程；ならびに(c)該細胞を該休眠状態で貯蔵
する工程を含む、方法。 - 【請求項２】 (d)該細胞を活動状態に回復するようにこれを処理する工程
を更に含む、請求項1記載の方法。 - 【請求項３】 前記細胞が哺乳類細胞である、請求項1記載の方法。
- 【請求項４】 前記細胞が卵母細胞である、請求項3記載の方法。
- 【請求項５】 前記細胞が、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、角化細胞、造
血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、B-細胞、T-細胞、赤血球、マクロファージ、
単球、繊維芽細胞、筋細胞、胚性幹細胞、または成体幹細胞である、請求項3記
載の方法。 - 【請求項６】 該細胞を、哺乳類細胞膜に関して実質的に不透過性でありか
つ該細胞の細胞膜を安定化させるような細胞外保護剤と接触させることを更に含
む、請求項1記載の方法。 - 【請求項７】 前記保護剤が、スクロース、トレハロース、フルクトース、
デキストラン、およびラフィノースからなる群より選択される糖質を少なくとも
一つ含有する、請求項1記載の方法。 - 【請求項８】 前記保護剤が、グルコース、ソルビトール、マンニトール、
ラクトース、マルトース、およびスタキオースからなる群より選択される糖質を
少なくとも一つ含有する、請求項1記載の方法。 - 【請求項９】 前記保護剤が、ガラス転移温度が-50℃よりも高い糖質を少
なくとも一つ含有する、請求項1記載の方法。 - 【請求項１０】 前記保護剤が、ガラス転移温度が-30℃よりも高い糖質を
少なくとも一つ含有する、請求項9記載の方法。 - 【請求項１１】 前記保護剤が、分子量が120ダルトンよりも大きい糖質を
少なくとも一つ含有する、請求項1記載の方法。 - 【請求項１２】 前記保護剤が、ガラス転移温度が-30℃よりも高く且つ分
子量が120ダルトンよりも大きい糖質を少なくとも一つ含有する、請求項1記載の
方法。 - 【請求項１３】 前記保護剤が、ガラス転移温度が-50℃よりも高い糖質に
由来した糖残基を少なくとも一つ含む糖脂質または糖タンパク質を含有する、請
求項1記載の方法。 - 【請求項１４】 前記糖質の細胞質濃度が、工程(a)の後および工程(b)の前
に約1.0M未満またはこれに等しい、請求項1記載の方法。 - 【請求項１５】 前記糖質の細胞質濃度が、工程(a)の後および工程(b)の前
に約0.2M未満またはこれに等しい、請求項14記載の方法。 - 【請求項１６】 前記細胞外保護剤が細胞外糖質を含有する、請求項6記載
の方法。 - 【請求項１７】 前記細胞が液体培地において維持され、該細胞外糖質の細
胞外濃度が該液体培地への希釈後約1.0M未満またはこれに等しい、請求項16記載
の方法。 - 【請求項１８】 前記細胞外糖質の細胞外濃度が、該液体培地への希釈後約
0.2M未満またはこれに等しい、請求項17記載の方法。 - 【請求項１９】 前記細胞が固形培地において維持され、該細胞外糖質の濃
度が該細胞への投与後約1.0M未満またはこれに等しい、請求項16記載の方法。 - 【請求項２０】 前記細胞外糖質の濃度が、該細胞への投与後約0.2M未満ま
たはこれに等しい、請求項19記載の方法。 - 【請求項２１】 工程(b)が、極低温への該細胞の凍結を含む、請求項1記載
の方法。 - 【請求項２２】 前記細胞が超急速凍結される、請求項21記載の方法。
- 【請求項２３】 前記細胞が、0.3〜6℃/分の速度で、低くとも-50℃の最終
温度まで冷却される、請求項21記載の方法。 - 【請求項２４】 前記細胞が、0.3〜3℃/分の速度で、-50〜-10℃の間の最
終温度まで冷却される、請求項23記載の方法。 - 【請求項２５】 工程(d)が該細胞の解凍を含む、請求項21記載の方法。
- 【請求項２６】 工程(b)が、該細胞を、乾燥貯蔵を可能にするのに十分な
レベルにまで乾燥することを含む、請求項1記載の方法。 - 【請求項２７】 工程(b)が該細胞の凍結乾燥を含む、請求項26記載の方法
。 - 【請求項２８】 工程(b)が該細胞の真空または対流乾燥を含む、請求項26
記載の方法。 - 【請求項２９】 工程(d)が該細胞の再水和を含む、請求項26記載の方法。
- 【請求項３０】 前記保護剤のみが使用される、請求項1記載の方法。
- 【請求項３１】 工程(a)の前に、該細胞が、300mosmよりも大きいモル浸透
圧濃度を有する高張培地中で維持される、請求項1記載の方法。 - 【請求項３２】 工程(d)の後に、該細胞が、300mosmよりも大きいモル浸
透圧濃度を有する高張培地中で培養される、請求項2記載の方法。 - 【請求項３３】 浸透性の凍結保護剤混合物が該保存剤に添加される、請求
項1記載の方法。 - 【請求項３４】 前記細胞を300mosmよりも大きいモル浸透圧濃度を有する
高張培地中でインキュベーションすることを含む、インビトロにおいて細胞を培
養する方法。 - 【請求項３５】 前記培地のモル浸透圧濃度が320mosmよりも大きい、請求
項34記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US20487700P | 2000-05-16 | 2000-05-16 | |
| US60/204,877 | 2000-05-16 | ||
| US09/798,327 | 2001-03-02 | ||
| US09/798,327 US20020045156A1 (en) | 2000-05-16 | 2001-03-02 | Microinjection of cryoprotectants for preservation of cells |
| PCT/US2001/015748 WO2001087062A2 (en) | 2000-05-16 | 2001-05-16 | Microinjection of cryoprotectants for preservation of cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003533192A true JP2003533192A (ja) | 2003-11-11 |
Family
ID=26899865
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001583540A Withdrawn JP2003533192A (ja) | 2000-05-16 | 2001-05-16 | 細胞保存のための凍結保護剤の微量注入 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20020045156A1 (ja) |
| EP (1) | EP1283670B1 (ja) |
| JP (1) | JP2003533192A (ja) |
| AT (1) | ATE284139T1 (ja) |
| AU (2) | AU6164401A (ja) |
| CA (1) | CA2409102A1 (ja) |
| DE (1) | DE60107672T2 (ja) |
| ES (1) | ES2232624T3 (ja) |
| HK (1) | HK1052835A1 (ja) |
| IL (2) | IL152745A0 (ja) |
| MX (1) | MXPA02011362A (ja) |
| PT (1) | PT1283670E (ja) |
| WO (1) | WO2001087062A2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006243727A (ja) * | 2005-02-28 | 2006-09-14 | Internatl Business Mach Corp <Ibm> | 分子レジスト |
| JP2012501187A (ja) * | 2008-08-29 | 2012-01-19 | ザ・キュレーターズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミズーリ | ブタ胚をガラス化する高スループットおよび非侵襲的方法 |
| JP2018068169A (ja) * | 2016-10-26 | 2018-05-10 | ヨダカ技研株式会社 | 細胞搬送システム |
| JP2019527050A (ja) * | 2016-06-29 | 2019-09-26 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | 生物学的物質の凍結保存および安定化のための氷核形成調合物 |
| JP2019533704A (ja) * | 2016-07-22 | 2019-11-21 | ティシュー テスティング テクノロジーズ エルエルシーＴｉｓｓｕｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｌｃ | 糖脂質による細胞凍結保存性の向上 |
| WO2020066991A1 (ja) * | 2018-09-28 | 2020-04-02 | 株式会社大塚製薬工場 | アカルボース又はスタキオースを含む哺乳動物細胞保存用液 |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6869757B2 (en) * | 2000-07-31 | 2005-03-22 | 21St Century Medicine, Inc. | Advantageous carrier solution for vitrifiable concentrations of cryoprotectants, and compatible cryoprotectant mixtures |
| US20080124787A1 (en) * | 2001-02-13 | 2008-05-29 | Avigenics, Inc. | Microinjection devices and methods of use |
| AU2003268033A1 (en) * | 2002-07-26 | 2004-02-16 | The General Hospital Corporation | Systems and methods for cell preservation |
| WO2004088460A2 (en) * | 2003-03-25 | 2004-10-14 | Tradeweb Group L.L.C. | Method and system for effecting straight-through-processing of trades of various financial instruments |
| JP2004350615A (ja) * | 2003-05-30 | 2004-12-16 | Univ Nihon | 単球株化細胞の凍結保存方法及び該方法に利用される培地 |
| US8552254B2 (en) | 2003-08-22 | 2013-10-08 | The Jackson Laboratory | Methods for maintaining genetic stability of inbred animal strains |
| WO2005032341A2 (en) * | 2003-09-29 | 2005-04-14 | Embryomics, Inc. | Methods of evaluating oocytes for storage or reproductive treatments |
| JP2007516706A (ja) * | 2003-12-01 | 2007-06-28 | バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 胎児肝臓細胞を含む組成物およびｈｃｖ感染で有用な方法 |
| US7935478B2 (en) | 2004-02-02 | 2011-05-03 | Core Dynamics Limited | Biological material and methods and solutions for preservation thereof |
| EP1711214A1 (en) | 2004-02-02 | 2006-10-18 | Interface Multigrad Technology (IMT) Ltd. | Device for directional cooling of biological matter |
| ATE460947T1 (de) | 2004-06-07 | 2010-04-15 | Core Dynamics Ltd | Verfahren zur sterilisation von biologischen präparaten |
| US8037696B2 (en) | 2004-08-12 | 2011-10-18 | Core Dynamics Limited | Method and apparatus for freezing or thawing of a biological material |
| WO2006079205A1 (en) * | 2005-01-28 | 2006-08-03 | Canadian Blood Services | A method of cryopreserving cells and tissues by liposomal delivery of sugars to enhance post-thaw viability |
| US8198085B2 (en) | 2005-08-03 | 2012-06-12 | Core Dynamics Limited | Somatic cells for use in cell therapy |
| US9538745B2 (en) * | 2006-04-14 | 2017-01-10 | The General Hospital Corporation | Methods for the cryopreservation of cells |
| US20080113431A1 (en) * | 2006-11-15 | 2008-05-15 | Mariposa Biotechnology, Inc. | Methods and compositions for cryopreserving oocytes |
| US20080113432A1 (en) * | 2006-11-15 | 2008-05-15 | Mariposa Biotechnology, Inc. | Methods and compositions for reanimating cryopreserved oocytes |
| US20100311036A1 (en) * | 2009-06-09 | 2010-12-09 | University Of South Carolina | Methods for Augmentation of Cell Cryopreservation |
| CN102781226B (zh) * | 2009-12-07 | 2015-05-20 | 朱伟星 | 通过超声波及温度控制的标准化组织样本保护 |
| ITMI20110678A1 (it) * | 2011-04-20 | 2012-10-21 | Consiglio Nazionale Ricerche | Composizione e metodo per la crioconservazione di cellule |
| US20130008191A1 (en) * | 2011-07-07 | 2013-01-10 | Suchak Naresh J | Methods for freezing and thawing proteins |
| WO2014085801A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-05 | The Broad Institute, Inc. | Cryo-treatment in a microfluidic device |
| US10918102B2 (en) | 2014-03-13 | 2021-02-16 | The General Hospital Corporation | Devices and methods to improve and assess viability of human livers |
| US10448631B2 (en) | 2015-09-22 | 2019-10-22 | East Carolina University | Cryopreservation using sucralose |
| TWI670371B (zh) | 2016-10-04 | 2019-09-01 | 全崴生技股份有限公司 | 用於細胞冷凍保存的組成物和方法 |
| WO2018085212A1 (en) | 2016-11-02 | 2018-05-11 | Velis Christopher J P | Devices and methods for slurry generation |
| US11324673B2 (en) | 2016-11-18 | 2022-05-10 | Miraki Innovation Think Tank Llc | Cosmetic appearance of skin |
| SG11201909303TA (en) | 2017-04-05 | 2019-11-28 | Miraki Innovation Think Tank Llc | Point of delivery cold slurry generation |
| CN110913781A (zh) | 2017-04-05 | 2020-03-24 | 米拉基创新智库有限责任公司 | 冷浆容纳物 |
| US10500342B2 (en) | 2017-08-21 | 2019-12-10 | Miraki Innovation Think Tank Llc | Cold slurry syringe |
| CN109566597A (zh) * | 2018-11-05 | 2019-04-05 | 北京世纪劲得生物技术有限公司 | 一种宫内膜干细胞保护液及其制备方法 |
| WO2020242970A1 (en) * | 2019-05-24 | 2020-12-03 | East Carolina University | Preservation using sugars |
| CN113925049B (zh) * | 2021-12-17 | 2022-04-29 | 广东乾晖生物科技有限公司 | 一种保持细胞活性的细胞保存液及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4724206A (en) * | 1984-02-13 | 1988-02-09 | Damon Biotech, Inc. | Protein production using hypertonic media |
| US5672502A (en) * | 1985-06-28 | 1997-09-30 | Celltech Therapeutics Limited | Animal cell culture |
| US5182299A (en) * | 1990-03-19 | 1993-01-26 | Brigham And Women's Hospital | Treatment of osmotic disturbance with organic osmolytes |
| US5496720A (en) | 1993-02-10 | 1996-03-05 | Susko-Parrish; Joan L. | Parthenogenic oocyte activation |
| AU3290097A (en) * | 1996-05-29 | 1998-01-05 | Universal Preservation Technologies, Inc. | Loading and unloading of permeating protectants for cell, tissue, and organ cryopreservation by vitrification |
| IL128855A0 (en) * | 1996-09-06 | 2000-01-31 | Universal Preservation Technologies Inc | Vitrification solutions for shelf preservation of cells tissues organs and organisms |
| US5827741A (en) | 1996-11-19 | 1998-10-27 | The Regents Of The University Of California | Cryopreservation of human adult and fetal pancreatic cells and human platelets |
| WO1999031977A1 (en) | 1997-12-22 | 1999-07-01 | President And Fellows Of Harvard College | Method for cryopreserving oocytes |
| ATE483017T1 (de) * | 1998-08-11 | 2010-10-15 | Univ Hawaii | Transgenese in säugetieren durch intracytoplasmatische injektion von spermien |
| US6127177A (en) | 1998-09-11 | 2000-10-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Controlled reversible poration for preservation of biological materials |
-
2001
- 2001-03-02 US US09/798,327 patent/US20020045156A1/en not_active Abandoned
- 2001-05-16 ES ES01935562T patent/ES2232624T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-16 PT PT01935562T patent/PT1283670E/pt unknown
- 2001-05-16 AU AU6164401A patent/AU6164401A/xx active Pending
- 2001-05-16 DE DE60107672T patent/DE60107672T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2001-05-16 AT AT01935562T patent/ATE284139T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-05-16 AU AU2001261644A patent/AU2001261644B2/en not_active Ceased
- 2001-05-16 WO PCT/US2001/015748 patent/WO2001087062A2/en active IP Right Grant
- 2001-05-16 US US09/859,105 patent/US6673607B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-16 MX MXPA02011362A patent/MXPA02011362A/es active IP Right Grant
- 2001-05-16 IL IL15274501A patent/IL152745A0/xx active IP Right Grant
- 2001-05-16 CA CA002409102A patent/CA2409102A1/en not_active Abandoned
- 2001-05-16 JP JP2001583540A patent/JP2003533192A/ja not_active Withdrawn
- 2001-05-16 EP EP01935562A patent/EP1283670B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-11-11 IL IL152745A patent/IL152745A/en not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-04-30 HK HK03103106A patent/HK1052835A1/xx not_active IP Right Cessation
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006243727A (ja) * | 2005-02-28 | 2006-09-14 | Internatl Business Mach Corp <Ibm> | 分子レジスト |
| JP2012042976A (ja) * | 2005-02-28 | 2012-03-01 | Internatl Business Mach Corp <Ibm> | 分子レジスト |
| JP2012501187A (ja) * | 2008-08-29 | 2012-01-19 | ザ・キュレーターズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミズーリ | ブタ胚をガラス化する高スループットおよび非侵襲的方法 |
| JP2019527050A (ja) * | 2016-06-29 | 2019-09-26 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | 生物学的物質の凍結保存および安定化のための氷核形成調合物 |
| US11477981B2 (en) | 2016-06-29 | 2022-10-25 | The General Hospital Corporation | Ice nucleation formulations for cryopreservation and stabilization of biologics |
| JP7486286B2 (ja) | 2016-06-29 | 2024-05-17 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | 生物学的物質の凍結保存および安定化のための氷核形成調合物 |
| JP2019533704A (ja) * | 2016-07-22 | 2019-11-21 | ティシュー テスティング テクノロジーズ エルエルシーＴｉｓｓｕｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｌｃ | 糖脂質による細胞凍結保存性の向上 |
| JP2018068169A (ja) * | 2016-10-26 | 2018-05-10 | ヨダカ技研株式会社 | 細胞搬送システム |
| WO2020066991A1 (ja) * | 2018-09-28 | 2020-04-02 | 株式会社大塚製薬工場 | アカルボース又はスタキオースを含む哺乳動物細胞保存用液 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MXPA02011362A (es) | 2004-08-12 |
| CA2409102A1 (en) | 2001-11-22 |
| IL152745A (en) | 2007-10-31 |
| ES2232624T3 (es) | 2005-06-01 |
| AU6164401A (en) | 2001-11-26 |
| US20020045156A1 (en) | 2002-04-18 |
| ATE284139T1 (de) | 2004-12-15 |
| PT1283670E (pt) | 2005-03-31 |
| WO2001087062A3 (en) | 2002-03-28 |
| AU2001261644B2 (en) | 2006-04-13 |
| US20020098470A1 (en) | 2002-07-25 |
| IL152745A0 (en) | 2003-06-24 |
| DE60107672T2 (de) | 2005-12-15 |
| EP1283670A4 (en) | 2003-09-17 |
| WO2001087062A2 (en) | 2001-11-22 |
| US6673607B2 (en) | 2004-01-06 |
| EP1283670A2 (en) | 2003-02-19 |
| DE60107672D1 (de) | 2005-01-13 |
| EP1283670B1 (en) | 2004-12-08 |
| HK1052835A1 (en) | 2003-10-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2003533192A (ja) | 細胞保存のための凍結保護剤の微量注入 | |
| AU2001261644A1 (en) | Microinjection of cryoprotectants for preservation of cells | |
| US10815456B2 (en) | Composition, kit and method for cryopreserving cells | |
| JP6561173B2 (ja) | 哺乳動物細胞投与用液 | |
| US7094601B2 (en) | Microinjection of cryoprotectants for preservation of cells | |
| US20230371499A1 (en) | Ice Nucleation Formulations for Cryopreservation and Stabilization of Biologics | |
| US20100137676A1 (en) | N-acetylcysteine amide (nac amide) for treatment of oxidative stress associated with infertility | |
| EP2605644B1 (en) | Method of forming vitrification droplets | |
| EP1516923A2 (en) | Method of culturing cells | |
| KR20210113649A (ko) | 생물학적 재료의 동결 보존용 조성물 | |
| Vanderzwalmen et al. | 10A. One decade of experience with vitrification of human embryos in straws, hemi-straws, and high security vitrification straws | |
| Larasati et al. | The Effect of Cryopreservation on the Sperm Ultrastructure of Mus Musculus Albinus Strain DDY: Comparison of Nakagata vs Modified vs Kitazato Cryoprotectants | |
| Jelínková et al. | 5. Influence of selected cryoprotectants on regeneration of cryopreserved cells properties | |
| JP2019110799A (ja) | 動物細胞のガラス化凍結保存方法 | |
| El-Shahat et al. | A comparative study of vitrification and slow freezing on subsequent developmental capacity of immature sheep oocytes | |
| Shamiah et al. | IN VIVO SURVIVAL RATE OF TRANSFERRED ZARIBI GOAT EMBRYOS CRYOPRESERVED BY OPEN PULLED STRAW-VITRIFICATION TECHNIQUE |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20050419 |
|
| A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20080805 |