JP6667792B2

JP6667792B2 - 抗癌剤の製造方法、抗癌剤及び医薬

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Description

本発明は、抗癌剤の製造方法、抗癌剤及び医薬に関する。

プラズマとは、気体分子が電離して陽イオンと電子に分かれて運動している状態をいい、物質の第４の状態とも言われている。最近では、室温かつ大気圧下でプラズマを生成するプラズマ発生装置も開発され、プラズマの応用分野が広がっている。

プラズマの応用分野の一つとして、近年、抗癌剤が注目されている。これは、ヒト細胞用の液体培地にプラズマを照射すると、液体培地が抗腫瘍活性を示すことが発見されたことが発端である。
例えば、非特許文献１には、プラズマ照射した細胞培地が、グリオブラストーマに対してアポトーシスを誘発するが、正常細胞（アストロサイト）は傷害しないことが記載されている。非特許文献２には、プラズマ照射した細胞培地を腫瘍細胞に接触させると腫瘍細胞に活性酸素が生じること、当該活性酸素への感受性は、正常細胞よりも腫瘍細胞の方が高いことが記載されている。

また、特許文献１は、細胞培地にプラズマ照射したものは、ヒトへの投与に適さないとして、乳酸等を含有するリンゲル輸液にプラズマ照射することを特徴とする抗癌剤の製造方法を記載している。

国際公開２０１６／１０３６９５号パンフレット

Ｆｒｉｄｍａｎｅｔａｌ．，ＰｌａｓｍａＣｈｅｍ．ＰｌａｓｍａＰｒｏｃｅｓｓ２７：１６３−１７６，２００７Ｓａｉｔｏｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ７：１９９１０−１９９２７，２０１６

しかしながら、特許文献１に記載されたリンゲル輸液は、乳酸や塩などから構成されるものであり、生体のエネルギー源を含んでいない。癌患者は、癌が生じた部位によっては通常の食事をとることができず、また、抗癌剤や放射線治療の影響で食欲が減退する例が多くみられる。そのような食欲が減退した癌患者にエネルギーを補給しつつ、抗腫瘍作用を発揮することのできる抗癌剤が求められている。また、特許文献１の抗癌剤の製造方法は、抗癌効果の点で未だ改善の余地があった。上記特性を有しつつ、簡便に製造することができ、副作用が少ない抗癌剤が実現できれば、癌治療に大きく貢献できることが期待できる。

そこで本発明の目的は、優れた抗腫瘍作用を発揮する抗癌剤を簡便に製造することのできる抗癌剤の製造方法、及び、簡便に製造することができ、優れた抗癌作用を発揮する抗癌剤、医薬を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ナトリウムイオンと、ブドウ糖及びＮＯ調節剤から選択される１種以上とを含有する水溶液をプラズマ照射することにより上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
ブドウ糖は、癌細胞の栄養源になると言われており、糖質制限が癌に有効であることが報告されている中で、ブドウ糖を含む水溶液にプラズマを照射することにより、優れた抗癌効果を奏し、かつ、正常細胞は傷害しない抗癌剤が得られるという発見は意外なものであった。
また、本発明者らは、ブドウ糖及び／又はナトリウムイオンを含む水溶液にプラズマ照射をする際に、水溶液中にＮＯ調節剤を含有させるか、あるいは、バブリングにより水溶液に空気を送り込むことによって、より効果の高い抗癌剤が得られることを見出した。
さらに、本発明者らは、ブドウ糖及び／又はナトリウムイオンを含む水溶液をプラズマ照射したものが、ＴＲＡＩＬ、サリノマイシン、グリベンクラミド、メトホルミン、パクリタキセル、ゲムシタビンといった薬剤と相乗効果を示すことも併せて見出し、本発明を完成した。
本発明者らの検討によれば、ブドウ糖や塩を含む水溶液をプラズマ照射してなるプラズマ照射液は、細胞のミトコンドリアの異常凝集、断片化や、オートファジーの亢進をもたらすことで、アポトーシスとは異なる経路により癌細胞や腫瘍細胞を死に至らしめており、これが故に、本発明の抗癌剤の製造方法によって製造される抗癌剤は、アポトーシス誘発剤に対して抵抗性を示す腫瘍に有効であると考えられる。

すなわち、本発明は以下の［１］〜［１０］である。
［１］ブドウ糖及びＮＯ調節剤から選択される１種以上を含有する水溶液にプラズマを照射する工程を備えることを特徴とする抗癌剤の製造方法。
［２］前記水溶液が、炭酸水素ナトリウムを含有する［１］の抗癌剤の製造方法。
［３］前記水溶液が、Ｌ−グルタミンを含有する［１］又は［２］の抗癌剤の製造方法。
［４］前記水溶液が、ヒト用輸液製剤、ヒト用輸液製剤にブドウ糖及びＮＯ調節剤から選択される１種以上を配合したもの、又は、フェノールレッドを含まないダルベッコ培地である［１］の抗癌剤の製造方法。
［５］前記プラズマを照射する工程が、前記水溶液に対して、大気圧下、室温〜１００℃の低温プラズマを照射する工程である［１］〜［４］のいずれかの抗癌剤の製造方法。
［６］前記抗癌剤が、アポトーシス誘発剤に対して抵抗性を示す腫瘍用の抗癌剤である［１］〜［５］のいずれかの抗癌剤の製造方法。
［７］細胞死受容体アゴニスト、サリノマイシン、グリベンクラミド、メトホルミン及びそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選ばれる１種以上の医薬と併用する、［１］〜［６］のいずれかの抗癌剤の製造方法により得られた抗癌剤。
［８］ＮＯ調節剤と併用する、［１］〜［７］のいずれかの抗癌剤の製造方法により得られた抗癌剤。
［９］（Ａ）水又はナトリウム水溶液にプラズマを照射することにより得られる抗癌剤と、（Ｂ）細胞死受容体アゴニスト、サリノマイシン、グリベンクラミド、メトホルミン、パクリタキセル、ゲムシタビン及びそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選ばれる１種以上の医薬とを組み合わせてなる癌の治療用医薬。
［１０］（Ａ）水又はナトリウム水溶液にプラズマを照射することにより得られる抗癌剤と、（Ｃ）ＮＯ調節剤とを組合せてなる癌の治療用医薬。
［１１］水又はナトリウム水溶液に空気をバブリングしながらプラズマ照射する工程を備えることを特徴とする抗癌剤の製造方法。
［１２］［１］〜［６］のいずれかの抗癌剤の製造方法により得られた抗癌剤で癌を治療する方法。

本発明の抗癌剤の製造方法は、抗腫瘍作用を発揮する抗癌剤を簡便に製造することができる。また、本発明の抗癌剤は、特定の抗癌剤と併用することで、優れた抗癌効果を奏する。また、本発明の医薬は、優れた抗癌効果を奏する。さらに、本発明の抗癌剤の製造方法により得られる抗癌剤は、正常細胞には影響を与えない。

実施例１の結果を示すグラフ図である。実施例２の結果を示すグラフ図である。実施例３の結果を示すグラフ図である。実施例４の結果を示すグラフ図である。実施例５の結果を示すグラフ図である。実施例６の結果を示すグラフ図である。実施例７の結果を示すグラフ図である。実施例８の結果を示すグラフ図である。実施例９の結果を示すグラフ図である。実施例１０の結果を示すグラフ図である。実施例１０の結果を示すグラフ図である。実施例１０の結果を示すグラフ図である。実施例１１の結果を示すグラフ図である。実施例１２の結果を示すグラフ図である。実施例１３の結果を示すグラフ図である。実施例１４の結果を示す写真図である。実施例１５の結果を示すグラフ図である。実施例１６の結果を示す写真図である。実施例１７の結果を示すグラフ図である。実施例１８の結果を示すグラフ図である。実施例１９の結果を示す写真図である。

［ブドウ糖］
本発明で用いられるブドウ糖を含む水溶液は、ブドウ糖を０．０１〜０．６ｇ／ｍＬ含有し、好ましくは、０．０３〜０．６ｇ／ｍＬ、より好ましくは０．０３〜０．５ｇ／ｍＬ、更に好ましくは、０．０３〜０．１ｇ／ｍＬ含有する。ブドウ糖は市販のものをいずれも使用することができる。

［ＮＯ調節剤］
ＮＯ調節剤は、細胞内にフリーラジカルである一酸化窒素（ＮＯ）を生じさせる化合物（ＮＯドナー）及び細胞内の一酸化窒素を除去する化合物（ＮＯ消去剤）の総称である。一酸化窒素（ＮＯ）は、生体内で合成され様々な機能を持つ窒素酸化物の一種であり、無色、無臭の気体である。不対電子を持つラジカル種ではあるが、ラジカルとしての反応性は低い。血管内皮細胞から産生されるＮＯには、血管拡張作用（降圧作用）があり、血管の内皮由来弛緩因子（ＥＤＲＦ：ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄｒｅｌａｘｉｎｇｆａｃｔｏｒ）と呼ばれていた。他に血小板凝集抑制作用（抗動脈硬化作用）、血管平滑筋細胞の増殖を抑制する作用、神経伝達などでの情報伝達作用、殺菌作用など多様な生理活性が報告されている。生体内では一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）によりアルギニンから合成されている。

本発明においてＮＯ調節剤には、ＮＯドナーとＮＯ消去剤の双方が含まれる。本発明者らの検討により、水又はナトリウム水溶液にプラズマ照射することにより得られる抗癌剤の抗腫瘍効果は、ＮＯ調節剤が存在することによってさらに増強されることが見出された。ＮＯ調節剤は、プラズマ照射対象の液に含まれていてもよく、プラズマ照射液と併用することでもよいが、好ましくは、ＮＯ調節剤はプラズマ照射液とは別に用意し、プラズマ照射液と併用して投与する。詳細なメカニズムは定かではないが、癌細胞内には至適な一酸化窒素レベルが存在し、それよりも一酸化窒素が多すぎても、少なすぎても、プラズマ照射液（水）と接触した際に生じる細胞障害が促進されることが考えられる。例えば、本発明者らの検討によれば、細胞内のミトコンドリアは、細胞をＮＯドナーに曝すと過剰に分裂してしまい、細胞をＮＯ消去剤に曝すと過剰に融合してしまうことが分かった。ただし、ＮＯドナーによるミトコンドリアの過剰分裂やＮＯ消去剤によるミトコンドリアの過剰融合は、癌細胞の細胞死の誘導に必要ではあるが、それだけでは不十分であり、そこに、水又は水溶液をプラズマ照射してなる抗癌剤の抗腫瘍効果が加わることで劇的に抗腫瘍効果が高まるのではないかと考えられる。

ＮＯ調節剤としては、例えば、ＮＯＲ−１：（±）−（Ｅ）−４−Ｍｅｔｈｙｌ−２−［（Ｅ）−ｈｙｄｒｏｘｙｉｍｉｎｏ］−５−ｎｉｔｒｏ−６−ｍｅｔｈｏｘｙ−３−ｈｅｘｅｎａｍｉｄｅ、ＮＯＲ−３：（±）−（Ｅ）−４−Ｅｔｈｙｌ−２−［（Ｅ）−ｈｙｄｒｏｘｙｉｍｉｎｏ］−５−ｎｉｔｒｏ−３−ｈｅｘｅｎａｍｉｄｅ、ＮＯＲ−４：（±）−Ｎ−［（Ｅ）−４−Ｅｔｈｙｌ−２−［（Ｚ）−ｈｙｄｒｏｘｙｉｍｉｎｏ］−５−ｎｉｔｒｏ−３−ｈｅｘｅｎｅ−１−ｙｌ］−３−ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ、ＮＯＲ−５：（±）−Ｎ−［（Ｅ）−４−Ｅｔｈｙｌ−３−［（Ｚ）−ｈｙｄｒｏｘｙｉｍｉｎｏ］−６−ｍｅｔｈｙｌ−５−ｎｉｔｒｏ−３−ｈｅｐｔｅｎｙｌ］−３−ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ、ＮＯＣ−５：１−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｏｘｏ−３−（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−３−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｒｉａｚｅｎｅ、ＮＯＣ−７：１−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｏｘｏ−３−（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｔｒｉａｚｅｎｅ、ＮＯＣ−１２：１−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｏｘｏ−３−（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−３−ｅｔｈｙｌ−１−ｔｒｉａｚｅｎｅ、ＮＯＣ−１８：１−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｏｘｏ−３，３−ｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−１−ｔｒｉａｚｅｎｅ、ＧＳＮＯ：Ｓ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅなどのＮＯドナー、ＤＴＣＳ−Ｎａ：Ｎ−（Ｄｉｔｈｉｏｃａｒｂｏｘｙ）ｓａｒｃｏｓｉｎｅ，ｄｉｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ，ｄｉｈｙｄｒａｔｅ、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＰＴＩＯ：２−（４−Ｃａｒｂｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−４，４，５，５−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｅ−１−ｏｘｙｌ−３−ｏｘｉｄｅ，などのＮＯ消去剤が挙げられる。ＮＯ調節剤を配合することによる抗腫瘍効果の増強効果は、ブドウ糖を含む水溶液だけではなく、リンゲル液などのブドウ糖を含まない輸液をプラズマ照射して得られる抗癌剤に対しても見られる。すなわち、水又はナトリウム水溶液にＮＯ調節剤を添加したものに対してプラズマ照射をすることにより得られる抗癌剤は、ＮＯ調節剤を含まない水又はナトリウム水溶液に対してプラズマ照射をすることにより得られる抗癌剤よりも抗腫瘍効果が高いことが期待できる。また、水又はナトリウム水溶液にプラズマ照射をすることにより得られる抗癌剤と、ＮＯ調節剤を併用することで、プラズマ照射液単独よりも高い抗腫瘍効果が得られることが期待できる。ＮＯ調節剤の形態は特に限定されないが、好ましくは水溶液の形態で投与される。ＮＯ調節剤の濃度は、水溶液中、１μＭ〜５０ｍＭが好ましく、１０μＭ〜１０ｍＭがより好ましく１０μＭ〜３０μＭがさらに好ましい。

また、ＮＯ調節剤として、化合物を添加する以外に、プラズマ照射時に水溶液に空気を送り込む、いわゆるバブリングを行うことも挙げられる。空気中には窒素が含まれることから、空気をバブリングすることがＮＯ調節剤添加と同様の効果をもたらすものと考えられる。バブリングの具体的な方法としては特に限定されず、エアーポンプを用いる方法など、水や水溶液に空気を送り込む一般的な方法を採用することができる。

［ナトリウムイオン］
本発明の抗癌剤の製造方法で用いられる水溶液は、ナトリウムイオンを含むものが好ましい。ナトリウムイオンを含むことで、体内に投与する際に、浸透圧を調整することができる。
ナトリウムイオン源としては、ヒトに投与することができるものであればいずれでもよく、例えば、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムを、本発明の水溶液に配合することができる。好ましくは、ナトリウムイオン濃度は、１０〜１８０ｍＥｑ／Ｌ、より好ましくは１２〜１５０ｍＥｑ／ｌである。

また、本発明の水溶液は、さらに、カリウムイオンを含有することが好ましい。カリウムイオン源としては、ヒトに投与することができるものであればいずれでもよく、例えば、塩化カリウム、乳酸カリウム、酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウムをブドウ糖を含む水溶液に配合することができる。好ましくは、カリウムイオン濃度は、２〜１８０ｍＥｑ／ｌ、より好ましくは３〜１６０ｍＥｑ／Ｌである。

本発明の水溶液は、さらに、乳酸イオン、炭酸イオン、炭酸水素イオン、塩化物イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオンを含有していてもよい。乳酸イオンを含有する場合、例えば、乳酸ナトリウムを０．０００１〜０．０１ｇ／ｍＬ配合することが好ましい。炭酸水素イオンは、水溶液中、０．１〜５０ｍＥｑ／Ｌ含まれることが好ましい。カルシウムイオンは、水溶液中、０．１〜５０ｍＥｑ／Ｌ含まれることが好ましい。マグネシウムイオンは、水溶液中、０．１〜５０ｍＥｑ／Ｌ含まれることが好ましい。

本発明の水溶液は、炭酸水素ナトリウムを含有することが好ましい。炭酸水素ナトリウムは、ダルベッコ培地の必須成分である。炭酸水素ナトリウムの含有量は、水溶液中、好ましくは１〜１００００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、５００〜５０００ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは、２０００〜４０００ｍｇ／ｍＬである。

本発明の水溶液は、L-グルタミンを含有することが好ましい。L-グルタミンのＮＯ含有量は、水溶液中、好ましくは、１０〜１０００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１００〜７００ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは、５００〜７００ｍｇ／ｍＬである。

本発明の水溶液は、さらに、ダルベッコ培地に用いられる成分のうち１種以上を含んでいてもよい。そのような成分としては、塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、アルギニン、シスチン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン等のアミノ酸（アミノ酸の好適な含有量は、それぞれ１０〜６００ｍｇ／ｍＬである。）、パントテン酸カルシウム、パントテン酸ナトリウム、塩化コリン、イノシトール、ナイアシン、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン等のビタミン（ビタミンの好適な含有量はそれぞれ１〜２０ｍｇ／ｍＬである。）などが挙げられる。

本発明の水溶液は、フェノールレッドを含まないダルベッコ培地であることが好ましい。フェノールレッドは人体に有害であるため、含まれないことが好ましい。ダルベッコ培地の組成は、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ７：１９９１０-１９９２７、２０１６に記載されたとおりである。

本発明の水溶液は、電解質液であることが好ましく、ヒト用の輸液製剤であることが好ましい。輸液製剤は、ヒトに対して、水分や電解質の補給のために頻繁に使用されており、安全性の観点から好ましい。輸液製剤としては、医療現場で使用されているものであれば特に制限されないが、例えば、開始液（１号液）、脱水補給液（２号液）、維持液（３号液）、術後回復液（４号液）といった低張性電解質液やそれにブドウ糖を添加したものが挙げられる。その他、ブドウ糖、電解質、アミノ酸、水溶性ビタミン液を含む抹消静脈栄養輸液や、ブドウ糖と電解質、あるいはこれらに加えてアミノ酸、ビタミン、微量元素等を含む高カロリー輸液が挙げられる。これらは、市販されているものをいずれも使用することができ、ブドウ糖を含むものはそのまま使用することができ、ブドウ糖を含まない輸液にはブドウ糖を添加することにより使用することができる。

［プラズマ照射］
本発明の抗癌剤の製造方法は、上記水溶液に対してプラズマを照射する工程を備える。プラズマを水溶液に照射する方法は、公知の方法をいずれも採用することができる。プラズマ照射のための装置としては、たとえば、国際公開第２０１４／１６７６２６号の図１２に示されるプラズマ処理装置を用いることができる。プラズマ処理条件は、既存のプラズマ処理装置の既知の処理条件の範囲のなかで、適切な条件を適宜選択して実施することができる。本発明においては、プラズマを照射する工程が、前記水溶液に対して、大気圧下、室温（２５℃）〜１００℃の低温プラズマを照射する工程であることが好ましい。ガス種としては、特に限定されず、アルゴン、ヘリウム、酸素、窒素などいずれも用いることができる。

本発明の抗癌剤の製造方法は、アポトーシス誘発剤に対して抵抗性を示す腫瘍用の抗癌剤を製造する方法であることが好ましい。本発明者らの検討によると、水又はナトリウム水溶液をプラズマ処理して得られる抗癌剤は、細胞のミトコンドリアの異常凝集、断片化や、オートファジーの亢進をもたらすことで、アポトーシスとは異なる経路により癌細胞や腫瘍細胞を死に至らしめており、これが故に、本発明の抗癌剤の製造方法によって製造される抗癌剤は、アポトーシス誘発剤に対して抵抗性を示す腫瘍に有効であると考えられる。アポトーシス誘発剤としては、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦｒｅｌａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇｌｉｇａｎｄ）、細胞死誘発型受容体（Ｄｅａｔｈｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＤＲ）のアゴニストやアゴニスト抗体、トポイソメラーゼ阻害剤、ドキソルビシン、アニソマイシン等が挙げられる。また、アポトーシス誘発剤に対して抵抗性を示す腫瘍、癌種として、悪性黒色腫（メラノーマ）、骨肉腫、神経芽腫、神経膠腫（グリオーマ）等が挙げられる。

本発明の抗癌剤の製造方法で得られる抗癌剤は、プラズマを照射した水溶液をそのまま使用することもできるが、希釈して使用することもできる。希釈して使用する場合の希釈倍率は、好ましくは、１．５〜８倍、より好ましくは２〜８倍、より好ましくは２〜６倍である。

［細胞死受容体アゴニスト］
本発明の抗癌剤は、細胞死受容体アゴニスト、サリノマイシン、グリベンクラミド、メトホルミン、パクリタキセル及びゲムシタビンからなる群から選ばれる１種以上の医薬と併用するものであることが好ましい。本発明者らは、水又はナトリウム水溶液にプラズマを照射したものと、細胞死受容体アゴニスト、サリノマイシン、グリベンクラミド、メトホルミン、パクリタキセル及びゲムシタビンからなる群から選ばれる１種以上の医薬とを併用すると、優れた抗癌効果が発揮されることを見出した。

細胞死受容体アゴニストは、ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃｒｅｃｅｐｔｏｒａｇｏｎｉｓｔ（ＰＡＲＡｓ）とも称される。
アポトーシスは、２つのシグナル伝達経路を通じて開始される。１つは細胞内のＢｃｌ−２タンパク質を通じて作動する経路であり、もう１つは細胞表面に存在する細胞死受容体（プロアポトーシス受容体とも称される。）を通じて作動する経路である。そして、近年、細胞死受容体アゴニスト（ＰＡＲＡ）の抗癌剤としての開発が進んでいる。これは、細胞死受容体アゴニストが、癌細胞のアポトーシスを誘導し、癌細胞を死滅させる効果が期待されているためである。ところが、上記のように、いくつかの癌腫は、アポトーシス誘発剤に対して抵抗性を有することが見出された。
細胞死受容体アゴニストの中には、ヒトのリコンビナントタンパク質のアポトーシス誘導リガンド２／ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ）、プロアポトーシス受容体にアゴニストとして作用するモノクローナル抗体、例えば抗ＤＲ４抗体や抗ＤＲ５抗体（ＤＳ−８２７３、ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ等）が含まれる。
ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦｒｅｌａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇｌｉｇａｎｄ）とは、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガントとも呼ばれる、腫瘍壊死因子（ＴｕｍｏｒＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ、ＴＮＦ）スーパーファミリーに属するサイトカインである。ＴＲＡＩＬは、ＴＲＡＩＬｒｅｃｅｐｔｒｏｒ１／ＤＲ４や、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２／ＤＲ５と結合して、外因性、内因性経路を活性化してアポトーシスを誘発する。癌細胞にアポトーシスを誘導して癌細胞を死に至らしめる一方、正常細胞には作用を及ぼさないことが知られている。ＴＲＡＩＬとしては、例えば、ＨｕｍａｎＴｕｍｏｒＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒＬｉｇａｎｄＳｕｐｅｒＦａｍｉｌｙＭｅｍｂｅｒ１０（ＴＮＦＳＦ１０）が挙げられる。ＴＲＡＩＬには複数のスプライスバリアントが存在することが知られているが、いずれのスプライスバリアントもＴＲＡＩＬに含まれる。
また、Ｅｎｚｏ社が販売しているＫｉｌｌｅｒＴＲＡＩＬ、ＳｕｐｅｒＫｉｌｌｅｒＴＲＡＩＬのような変異型ＴＲＡＩＬ、改良型ＴＲＡＩＬもＴＲＡＩＬに含まれる。ＴＲＡＩＬは、ヒトのＴＲＡＩＬが好ましいが、マウスＴＲＡＩＬ等の他の哺乳類のＴＲＡＩＬであってもよい。また、ＴＲＡＩＬの製造方法は特に限定されず、ヒト細胞由来のものや、マウスなどの哺乳類由来のものでもよく、また、ｉｎｖｉｔｒｏで合成したものであってもよい。
ＴＲＡＩＬと本発明の抗癌剤の製造方法で製造された抗癌剤を併用する場合、ＴＲＡＩＬと本発明の抗癌剤を別々に投与する際には、ＴＲＡＩＬの投与量は特に限定されず、例えば、医学的に認められたＴＲＡＩＬの通常の投与量で良く、本発明の抗癌剤は、原液でも希釈して用いてもよいが、２〜８倍に希釈して用いることが好ましい。また、ＴＲＡＩＬを本発明の抗癌剤に混合して用いる場合には、ＴＲＡＩＬの含有量は、例えば、１〜１００ｎｇ／ｍＬが好ましく、２５〜１００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、本発明の抗癌剤は原液でも希釈して用いてもよいが、２〜８倍、より好ましくは２〜６倍、に希釈して用いることが好ましい。

［サリノマイシン］
本発明において、サリノマイシンには、サリノマイシンのほか、サリノマイシンナトリウムなどのサリノマイシンの薬学的に許容される塩が含まれる。サリノマイシンは、抗原虫薬、抗コクシジウム薬として用いられている医薬である。サリノマイシンは、例えば、下記式で表される。サリノマイシンは、市販されているものをいずれも用いることができる。
サリノマイシンと本発明の抗癌剤の製造方法で製造された抗癌剤を併用する場合、サリノマイシンと本発明の抗癌剤を別々に投与する際には、サリノマイシンの投与量は特に限定されず、例えば、医学的に認められたサリノマイシンの通常の投与量で良く、本発明の抗癌剤は、原液でも希釈して用いてもよいが、２〜８倍に希釈して用いることが好ましい。また、サリノマイシンを本発明の抗癌剤に混合して用いる場合には、サリノマイシンの含有量は、例えば、１〜５μＭが好ましく、１〜３μＭがより好ましく、本発明の抗癌剤は原液でも希釈して用いてもよいが、２〜８倍、より好ましくは２〜６倍、に希釈して用いることが好ましい。

［グリベンクラミド］
本発明において、グリベンクラミドには、グリベンクラミドのほか、グリベンクラミドの薬学的に許容される塩が含まれる。グリベンクラミドは、２型糖尿病の治療用に用いられているスルフォニル尿素系の血糖降下薬である。グリベンクラミドは、例えば、下記式で表される。グリベンクラミドは、市販されているものをいずれも用いることができる。
グリベンクラミドと本発明の抗癌剤の製造方法で製造された抗癌剤を併用する場合、グリベンクラミドと本発明の抗癌剤を別々に投与する際には、グリベンクラミドの投与量は特に限定されず、例えば、医学的に認められたグリベンクラミドの通常の投与量で良く、本発明の抗癌剤は、原液でも希釈して用いてもよいが、２〜８倍に希釈して用いることが好ましい。また、グリベンクラミドを本発明の抗癌剤に混合して用いる場合には、グリベンクラミドの含有量は、例えば、１〜１００μＭが好ましく、３０〜１００μＭがより好ましく、本発明の抗癌剤は原液でも希釈して用いてもよいが、２〜８倍、より好ましくは２〜６倍、に希釈して用いることが好ましい。

［メトホルミン］
本発明において、メトホルミンには、メトホルミンのほか、メトホルミンの薬学的に許容される塩が含まれる。メトホルミンは、ビグアナイド系薬剤に分類される２型糖尿病治療薬の一つである。メトホルミンを含むビグアナイド系薬の標的はミトコンドリアの呼吸鎖複合体Ｉであると考えられており、その活性を阻害することにより、結果的に細胞内のＡＭＰ／ＡＴＰ比を増加させて細胞内のエネルギーバランスを変化させるものと考えられる。これにより、例えば肝細胞において、細胞内のエネルギーバランスのセンサーであるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を介する細胞内シグナル伝達系を刺激することにより、糖代謝を改善すると考えられている。メトホルミンは、例えば、下記式で表される。メトホルミンは市販されているものをいずれも用いることができる。
メトホルミンと本発明の抗癌剤の製造方法で製造された抗癌剤を併用する場合、メトホルミンと本発明の抗癌剤を別々に投与する際には、メトホルミンの投与量は特に限定されず、例えば、医学的に認められたメトホルミンの通常の投与量で良く、本発明の抗癌剤は、原液でも希釈して用いてもよいが、２〜８倍に希釈して用いることが好ましい。また、メトホルミンを本発明の抗癌剤に混合して用いる場合には、メトホルミンの含有量は、例えば、１〜３０ｍＭが好ましく、３〜３０ｍＭがより好ましく、本発明の抗癌剤は原液でも希釈して用いてもよいが、２〜８倍、より好ましくは２〜６倍、に希釈して用いることが好ましい。

［パクリタキセル］
パクリタキセルには、パクリタキセルのほか、パクリタキセルの薬学的に許容される塩が含まれる。パクリタキセルは、タキサン系の抗癌剤である。パクリタキセルは、非小細胞肺癌、膵臓癌、胆道癌、膀胱癌、卵巣癌、乳癌、胃癌、頭頸部癌、血管肉腫など多種の癌の治療に使用されている。本発明の抗癌剤とパクリタキセルが相乗効果を示すことは、これらの癌の治療効果の向上だけではなく、パクリタキセルによる副作用の軽減も期待できる。
パクリタキセルと本発明の抗癌剤の製造方法で製造された抗癌剤を併用する場合、パクリタキセルと本発明の抗癌剤を別々に投与する際には、パクリタキセルの投与量は特に限定されず、例えば、医学的に認められたパクリタキセルの通常の投与量で良く、本発明の抗癌剤は、原液でも希釈して用いてもよいが、２〜８倍に希釈して用いることが好ましい。また、パクリタキセルを本発明の抗癌剤に混合して用いる場合には、パクリタキセルの含有量は、例えば、１０〜１００ｎＭが好ましく、３〜３０ｎＭがより好ましく、本発明の抗癌剤は原液でも希釈して用いてもよいが、２〜８倍、より好ましくは２〜６倍、に希釈して用いることが好ましい。

［ゲムシタビン］
ゲムシタビンには、ゲムシタビンのほか、ゲムシタビンの薬学的に許容される塩が含まれる。ゲムシタビンは、抗癌剤として用いられる含フッ素ヌクレオシドである。ゲムシタビンは、非小細胞肺癌、膵臓癌、胆道癌、膀胱癌、卵巣癌、乳癌、胃癌、頭頸部癌、血管肉腫など多種の癌の治療に使用されている。本発明の抗癌剤とゲムシタビンが相乗効果を示すことは、これらの癌の治療効果の向上だけではなく、ゲムシタビンによる副作用の軽減も期待できる。
ゲムシタビンと本発明の抗癌剤の製造方法で製造された抗癌剤を併用する場合、ゲムシタビンと本発明の抗癌剤を別々に投与する際には、ゲムシタビンの投与量は特に限定されず、例えば、医学的に認められたゲムシタビンの通常の投与量で良く、本発明の抗癌剤は、原液でも希釈して用いてもよいが、２〜８倍に希釈して用いることが好ましい。また、ゲムシタビンを本発明の抗癌剤に混合して用いる場合には、ゲムシタビンの含有量は、例えば、０．１〜３μＭが好ましく、０．３〜１μＭがより好ましく、本発明の抗癌剤は原液でも希釈して用いてもよいが、２〜８倍、より好ましくは２〜６倍、に希釈して用いることが好ましい。

以下、本発明の実施例を示す。本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

＜試験手順＞
各実施例に共通する試験手順を以下に記載する。
［１．プラズマの作成：］
ヘリウムガスを周波数２０ｋＨｚ、ピーク電圧８ｋＶ，電流値２０ｍＡ，毎分流速３００ｍＬの条件下に低周波数プラズマジェットを用いて非対称誘電体バリアー放電させてプラズマを作成した。（以下、「ＣＡＰ−１」と称する。）
［２．低温大気圧プラズマの作成：］
低温大気圧プラズマジェットに室温でヘリウムガスを毎分流速３０Ｌで流し、周波数1０〜５０ｋＨｚ、ピーク電圧１〜１０ｋＶ、電流値最大３０ｍＡ、１気圧、室温（２５℃）の条件下に放電させプラズマを作成した。（以下、「ＣＡＰ−２」と称する。）
［３．培地、水溶液にＣＡＰ−１又はＣＡＰ−２を照射することによるプラズマ照射液の作製：］
従来技術ではｐＨ指示薬のフェノールレッドを含む培地にプラズマ照射をしているため生成したプラズマ照射液（ＰＡＭ）はこれを含む。化学品の危険有害性を世界的に統一された一定基準で分類したＧＨＳに基づく安全データシート（ＳＤＳ）によれば、ｐＨ指示薬として使用される０．１％（ｗ／ｖ）フェノールレッドは眼に対する重篤な損傷・眼刺激性：区分２Ａ、生殖細胞変異原性：区分１Ｂ、生殖毒性：区分１Ａ、特定標的臓器・全身毒性（反復暴露）区分１（肝臓）、区分２（神経）である。したがって、ＰＡＭはそのまま人体に投与できない。１０％ＦＣＳを含むＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製のダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（フェノールレッド含む）（以下「ＭＥＭ−１」と称する）１ｍＬに、液面より約５ｍｍ上からＣＡＰ−１を５分間照射した（以下「ＰＡＭ−１」と称する）。１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（フェノールレッド含まない）（以下「ＭＥＭ−２」と称する）１ｍＬに同様にＣＡＰ−１を５分間照射した（以下「ＰＡＭ−２」と称する）。ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ（フェノールレッド含まない）（以下「ＭＥＭ−３」と称する）１ｍＬに同様にＣＡＰ−１を５分間照射した（以下「ＰＡＭ−３」と称する）。
テルモ社製のソルデム３Ａ輸液（組成：２００ｍＬ中ブドウ糖８．６ｇ，塩化ナトリウム０．１８ｇ，塩化カリウム０．２９８ｇ，Ｌ−乳酸ナトリウム液：０．８９６ｇ（Ｌ−乳酸ナトリウムとして：０．４４８ｇを含むもの）１ｍＬに、液面より約５ｍｍ上からＣＡＰ−１を５分間照射した（以下「ＰＡＳＳ、ＰＬＡＳＴ又はＰＳＭ」と称する）。
［４．ナトリウム水溶液にＣＡＰ−２を照射することによる低温大気圧プラズマ照射液の作製：］
テルモ社製ソルデム３Ａ３０ｍＬを５０ｍＬファルコンチューブに入れて、液面より約５ｍｍ上からＣＡＰ−２を１分間照射した（以下「ＰＣ−１」と称する）。
［５．プラズマ照射液による培養細胞処理：］
各癌細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）にサスペンドして、９６穴マイクロプレートに１００μＬを播いた（１×１０^５個／ｍＬ）。細胞が接着後、培地を一旦廃棄し、プラズマ照射液１００μＬにＦＣＳ／ＤＭＥＭを加えて総量を２００μＬ／ウェルになるように調整後、ＣＯ_２インキュベーター（５％炭酸ガス９５％空気条件下）内で３７℃培養した。
プラズマ照射液としては、各実施例に記載のように、プラズマ（ＣＡＰ−１／ＣＡＰ−２）照射液原液またはプラズマ照射液を培地（ＭＥＭ）又はソルデム３Ａ輸液で２倍、４倍又は８倍に希釈したもの、あるいは、プラズマ照射液に、抗ＤＲ４抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社製ａｇｏｎｉｓｔｉｃａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＴＲＡＩＬ−Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ａａｎｔｉｂｏｄｙｃｌｏｎｅ６９０３６＃ＭＡＢ３４７−ＳＰ）、抗ＤＲ５抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社製ａｇｏｎｉｓｔｉｃａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＴＲＡＩＬ−Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂａｎｔｉｂｏｄｙ（ｃｌｏｎｅ７１９０３＃ＭＡＢ６３１−１００））、ＴＲＡＩＬ（ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ製ＫｉｌｌｅｒＴＲＡＩＬ^TM （ｓｏｌｕｂｌｅ）（ｈｕｍａｎ），（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）＃ＡＬＸ−２０１−０７３−３０２０）、サリノマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製＃Ｓ４５２６−５ＭＧ）、グリベンクラミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製＃ＰＨＲ１２８７−１Ｇ）、メトホルミン（アブカム製＃ａｂ１２０８４７）を添加して、ＦＣＳ／ＤＭＥＭを加えて総量を２００μＬに調整後、上記と同様の条件で培養した。以下の各実施例における各薬剤の濃度は、ＦＣＳ／ＤＭＥＭで総量を調整した後のプラズマ照射液中の濃度である。
［６．ＮＯ調節剤の添加：］
ＮＯ調節剤は各実施例に記載の終濃度となるよう薬剤を添加することにより、プラズマ照射液と併用した。
［７．細胞生存率の計測：］
プラズマ照射液等を含む９６穴マイクロプレート上で、３日間培養後、各癌細胞の細胞生存率を計測した。細胞生存率の計測方法は、水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−８）還元法を用いた。この方法は、水溶性テトラゾリウム塩がミトコンドリア酸化還元酵素活性によって水溶性ホルマザンに還元されることを利用して細胞増殖と相関するこの活性を測定する方法である。
［８．水中照射・バブリングの方法：］
バブリングは、観賞魚水槽用の市販の小型エアーポンプのチューブを滅菌し、その先端を、プラズマ照射前の水溶液を入れたファルコンチューブに差し込み、空気を送るという方法により行った。そして、空気をナトリウム水溶液に送りながら、水中でＣＡＰ−２を照射した。以下、「ＰＣ−２」と称する。）または空気を送らずに水中でＣＡＰ−２を照射した。以下、「ＰＣ−３」と称する。）

［実施例１］
プラズマ（ＣＡＰ−１）照射液（４倍希釈又は８倍希釈）と抗ＤＲ４抗体、抗ＤＲ５抗体又はサリノマイシンとの併用によるＭＧ６３細胞に対する抗癌効果を調べた。結果は図１に示す。
図１中、ＰＡＳＳ×４は、上記の方法で作製したプラズマ照射液を４倍希釈したもの、ＰＡＳＳ×８は、上記の方法で作製したプラズマ照射液を８倍希釈したもの、ＰＡＳＳ×１６は、上記の方法で作製したプラズマ照射液を１６倍希釈したもの、αＤＲ−４は抗ＤＲ４抗体、αＤＲ−５は抗ＤＲ５抗体を表す。水溶液中の各薬剤の濃度はグラフに記載のとおりである。「ＰＡＳＳ×４＋」、「ＰＡＳＳ×８＋」「ＰＡＳＳ×１６＋」の表記のないものは、プラズマ照射液の代わりに、プラズマ照射せずに輸液に各薬剤を添加したものを用いたことを表す。

図１の上側のグラフから明らかなように、抗ＤＲ４抗体、抗ＤＲ５抗体単独投与では、ＭＧ６３細胞の細胞生存率は、７０％程度に下がるにとどまった。また、プラズマ照射液を８倍希釈したもののみを投与した例では、細胞生存率は減少しなかった。
それに対して、抗ＤＲ５抗体と、プラズマ照射液を併用した場合、抗ＤＲ５抗体の濃度依存的に著しい抗癌効果を示した。
また、図１の下側のグラフから明らかなように、サリノマイシンの単独投与や、プラズマ照射液を８倍以上希釈したものを単独投与した場合には、殆どＨＯＳ細胞は死滅しなかった。細胞生存率が１００％を超えるものは、細胞が増殖したことによる。プラズマ照射液を４倍希釈したものは生存率を７０％低下させた。サリノマイシンはこの抗腫瘍効果をさらに増強した。プラズマ照射液を８倍希釈したものでもサリノマイシンと併用すると、生存率を３０％低下させたが、プラズマ照射液を１６倍希釈したものでは抗腫瘍効果は見られなかった。このことから、プラズマ照射液がサリノマイシンと相乗効果を発揮しており、８倍以上まで希釈してしまうとプラズマ照射液の効果は弱まることが明らかとなった。

［実施例２］
プラズマ（ＣＡＰ−１）照射液（ＰＬＡＳＴ２倍希釈又は４倍希釈）、ＣＡＰ−２照射液（２倍希釈又は４倍希釈）と、従来技術である培地にプラズマ（ＣＡＰ−１）照射した照射液（ＰＡＭと称する）の悪性黒色腫（Ａ２０５８）に対する抗癌効果を比較した。結果は図２に示す。

ＰＬＡＳＴは著しい抗癌効果を示し、４倍希釈でも細胞生存率は２０％以下に低下した。ＰＡＭ−１は２倍希釈のみで強い効果を示した。これに対してＰＡＭ−２、ＰＡＭ−３は２倍希釈でも抗癌効果が小さかった。この結果は、ＰＡＭの抗癌効果はフェノールレッド依存性であることを示す。コントロールの中でＭＥＭ−３だけが生存率を著しく低下させたが、これはＦＣＳがないためと考えられる。ＣＡＰ−２照射液では空気バブリングをしたＰＣ−２の方がＰＣ−１よりも抗癌効果が高かったことは、その効果に空気（Ｎ_２）が必要であることを示唆した。ＰＬＡＳＴ並びにＰＣ−１／ＰＣ−２が高い抗癌効果を持つことから、ナトリウム水溶液由来のプラズマ照射液の抗癌効果はＰＡＭとは異なり、フェノールレッドを必要としないことが分る。ＰＬＡＳＴがＰＣ−１，ＰＣ−２よりも抗癌効果が強いのは、ＰＬＡＳＴが小量（１ｍＬ）の輸液に長時間（５分）プラズマ（ＣＡＰ−１）を照射しているのに対して、ＰＣ−１、ＰＣ−２は大量（３０ｍＬ）の輸液に短時間（１分）プラズマ（ＣＡＰ−２）を照射しているためと考えられる。ただし、ＣＡＰ−１ではヘリウムガスの流速は毎分３００ｍＬに対して、ＣＡＰ−１では毎分３０Ｌである。

［実施例３］
プラズマ（ＣＡＰ−１）照射液（ＰＬＡＳＴ２倍希釈又は４倍希釈）、ＣＡＰ−２照射液（ＰＣ−１，ＰＣ−２２倍希釈又は４倍希釈）と、従来技術である培地にプラズマ（ＣＡＰ−１）照射した照射液（ＰＡＭと称する）の骨肉腫（ＨＯＳ）に対する抗癌効果を比較した。結果は図３に示す。

ＰＬＡＳＴは著しい抗癌効果を示し、４倍希釈でも細胞生存率は３０％以下に低下した。ＰＡＭ−１は２倍、４倍希釈両方で強い効果を示した（生存率３０％以下）。これに対してＰＡＭ−２、ＰＡＭ−３は２倍希釈でも抗癌効果を示さなかった。また、ＣＡＰ−２照射液では空気バブリングをしたＰＣ−２の方がＰＣ−１よりも抗癌効果が高かった。これらの結果は、Ａ２０５８細胞と同様に、（１）ＰＡＭの抗癌効果はフェノールレッド依存性である。（２）ナトリウム水溶液由来のプラズマ照射液の抗癌効果はフェノールレッドを必要としない。（３）プラズマ照射液の抗癌効果向上にＮＯドナー（空気（Ｎ_２））が有効であることを示唆する。

［実施例４］
プラズマ（ＣＡＰ−１）照射液（ＰＬＡＳＴ２倍希釈又は４倍希釈）、ＣＡＰ−２照射液（ＰＣ−１、ＰＣ−２２倍希釈又は４倍希釈）と、従来技術である培地にプラズマ（ＣＡＰ−１）照射した照射液（ＰＡＭと称する）の骨肉腫（ＳＡＯＳ−２）に対する抗癌効果を比較した。結果は図４に示す。

ＰＬＡＳＴは著しい抗癌効果を示し、４倍希釈でも細胞生存率は１０％以下に低下した。ＰＡＭ−１は２倍希釈のみで中程度の効果を示した（生存率４０％）。これに対してＰＡＭ−２、ＰＡＭ−３は２倍希釈でも抗癌効果を示さなかった。また、ＣＡＰ−２照射液では空気バブリングをしたＰＣ−２の方がＰＣ−１よりも抗癌効果が高かった。これらの結果は、他の細胞と同様に、（１）ＰＡＭの抗癌効果はフェノールレッド依存性である。（２）ナトリウム水溶液由来のプラズマ照射液の抗癌効果はフェノールレッドを必要としない。（３）プラズマ照射液の抗癌効果向上にＮＯドナー（空気（Ｎ_２））が有効であることを示唆する。

［実施例５］
プラズマ（ＣＡＰ−１）照射液（ＰＬＡＳＴ２倍希釈又は４倍希釈）、ＣＡＰ−２照射液（ＰＣ−１、ＰＣ−２２倍希釈又は４倍希釈）と、従来技術である培地にプラズマ（ＣＡＰ−１）照射した照射液（ＰＡＭと称する）の神経芽腫（ＮＢ−１）に対する抗癌効果を比較した。結果は図５に示す。

［実施例６］
プラズマ（ＣＡＰ−１）照射液（ＰＬＡＳＴ２倍希釈又は４倍希釈）、ＣＡＰ−２照射液（ＰＣ−１、ＰＣ−２、ＰＣ−３２倍希釈又は４倍希釈）と、従来技術である培地にプラズマ（ＣＡＰ−１）照射した照射液（ＰＡＭと称する）の骨肉腫（ＨＯＳ）に対する抗癌効果を比較した。結果は図６に示す。

ＰＬＡＳＴは著しい抗癌効果を示した。ＰＡＭ−１は２倍希釈のみで強い抗癌効果を示した（生存率２０％）がＰＡＭ−２は２倍希釈でも抗癌効果を示さなかった。また、ＣＡＰ−２照射液では空気バブリングをしたＰＣ−２は空気バブリングをしないＰＣ−１、ＰＣ−３よりも抗癌効果が高かった。これらの結果は、実施例の３の結果を再現しており、（１）ＰＡＭの抗癌効果はフェノールレッド依存性である。（２）ナトリウム水溶液由来のプラズマ照射液の抗癌効果はフェノールレッドを必要としない。（３）プラズマ照射液の抗癌効果向上にＮＯドナー（空気（Ｎ_２））が有効であることを示す。

［実施例７］
プラズマ（ＣＡＰ−１）照射液（ＰＬＡＳＴ２倍希釈又は４倍希釈）、ＣＡＰ−２照射液（ＰＣ−１，ＰＣ−２、ＰＣ−３２倍希釈又は４倍希釈）と、従来技術である培地にプラズマ（ＣＡＰ−１）照射した照射液（ＰＡＭと称する）の神経芽腫（ＮＢ−１）に対する抗癌効果を比較した。結果は図７に示す。

ＰＬＡＳＴは著しい抗癌効果を示した。ＰＡＭ−１は２倍希釈のみで中程度の抗癌効果を示した（生存率４０％）がＰＡＭ−２は２倍希釈でも抗癌効果を示さなかった。また、ＣＡＰ−２照射液では空気バブリングをしたＰＣ−２の方が空気バブリングをしないＰＣ−１、ＰＣ−３よりも明らかに効果が高かった。これらの結果は、実施例の５の結果を再現しており、ＨＯＳ細胞と同様に、（１）ＰＡＭの抗癌効果はフェノールレッド依存性である。（２）ナトリウム水溶液由来のプラズマ照射液の抗癌効果はフェノールレッドを必要としない。（３）プラズマ照射液の抗癌効果向上にＮＯドナー（空気（Ｎ_２））が有効であることを示す。

［実施例８］
プラズマ照射液（３倍希釈又は６倍希釈）をマウス骨肉腫ＬＭ８細胞Ｃ３Ｈマウス（マウス由来癌細胞ＬＭ８を移植されたマウス）に投与したときの体重の増加推移及び腫瘍の大きさの変化を調べた。結果を図８に示す。

プラズマ（ＣＡＰ−１）照射液（ＰＡＳＳ）を投与したマウスでは、コントロールマウスが２１日後及び２８日後に腫瘍が著しく増殖していたことに比べて腫瘍の増殖が著しく抑制された。一方、マウスの体重は４週間連続投与でもコントロールのそれに比べて全く変わらず、食欲不振などの全身状態の悪化がないことを示す。これらの結果はｉｎｖｉｔｒｏの抗腫瘍効果と一致して、ナトリウム水溶液から作成したプラズマ照射液はフェノールレッドなしでも抗腫瘍効果を示し、副作用が小さいことを示している。

［実施例９］
ＮＯ調節剤と併用した場合の大気圧低温プラズマ照射液の悪性黒色腫（Ａ２０５８）に対する抗癌効果を調べた。結果は図９に示す。

（図９）ＮＯＲ−３、ｃａｒｂｏｘｙ−ＰＴＩＯは単独でも濃度依存的に、細胞生存率を最大５０％までに低下させたが、ＮａＮＯ_２は単独では細胞生存に影響を与えなかった。ＮＯＲ−３、ｃａｒｂｏｘｙ−ＰＴＩＯ、ＮａＮＯ_２はいずれもそれ自身では生存率を低下させない濃度でもPASSの抗癌効果を著しく増強した。これらの結果はＮＯ調節剤の併用がプラズマ照射液のＡ２０５８に対する抗癌効果を増強することを示す。

［実施例１０］
実施例９と同様に、ＮＯ調節剤と併用した場合の大気圧低温プラズマ照射液の神経芽腫（ＮＢ−１）、骨肉腫（ＨＯＳ)に対する抗癌効果を調べた。結果は図１０、図１１及び図１２に示す。

（図１０）（上）空気バブリングをせず、ＣＡＰ−２を空中照射したＰＣ−１は２倍希釈で抗癌効果を示した。ｃａｒｂｏｘｙ−ＰＴＩＯ、ＮＯＲ−３、ＮａＮＯ_２は単独では細胞生存に影響を与えなかったがいずれもＰＣ−１の抗癌効果を増強し、その効果はＮＯＲ−３が最も高かった。（下）空気バブリングをしつつＣＡＰ−２を水中照射したＰＣ−２は、著しい抗癌効果を示した。ＮＯＲ−３、ｃａｒｂｏｘｙ−ＰＴＩＯ、ＮａＮＯ_２は単独では細胞生存に影響を与えなかったが、いずれもＰＣ−２の抗癌効果を増強し、その効果はＮＯＲ−３が最も高かった。これらの結果はＮＯ調節剤の併用がプラズマ照射液のＮＢ−１に対する抗癌効果を増強することを示す。
（図１１）空気バブリングをせず、ＣＡＰ−２を水中照射したＰＣ−３は２倍希釈でも抗癌効果が小さかった。ｃａｒｂｏｘｙ−ＰＴＩＯ、ＮＯＲ−３、ＮａＮＯ_２は単独では細胞生存に影響を与えなかったが、いずれもＰＣ−３の抗癌効果を増強し、その効果はＮＯＲ−３が最も高かった。これらの結果はＮＯ調節剤の併用がプラズマ照射液のＮＢ−１に対する抗癌効果を増強することを示す。
（図１２）空気バブリングをせず、ＣＡＰ−２を水中照射したＰＣ−３は２倍希釈でも抗癌効果が小さかった。ｃａｒｂｏｘｙ−ＰＴＩＯ、ＮＯＲ−３、ＮａＮＯ_２は単独では細胞生存に影響を与えなかったが、いずれもＰＣ−３の抗癌効果を増強し、その効果はＮＯＲ−３が最も高かった。これらの結果はＮＯ調節剤の併用がプラズマ照射液のＨＯＳに対する抗癌効果を増強することを示す。

［実施例１１］
グリベンクラミドを含む大気圧低温プラズマ照射液の悪性黒色腫（Ａ２０５８）に対する抗癌効果を調べた。また、プラズマ照射液で誘発される細胞死のモードを調べた。結果は図１３に示す。

（上）ＰＡＭは４倍希釈ではほとんど抗癌効果を示さなかったのに対して、本発明の抗癌剤であるＰＡＳＳの４倍希釈は抗癌効果を示した（生存率５０％）。グリベンクラミドは単独で弱い抗癌効果（生存率減少３０％）を示す一方で、ＰＡＭならびにＰＡＳＳの抗癌効果を著しく増強した。ＰＡＳＳの抗癌効果はカスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ−ＦＭＫ（ＺＶＡＤ）、ネクロトーシスの特異的阻害剤ネクロスタチン−１（ＮＳ−１）のいずれでも阻害されなかったことからアポトーシスやネクロトーシスとは異なる細胞死を誘発することによるものと考えられた。（下）ＴＲＡＩＬは中程度抗癌効果（生存率５０％）を示し、その効果はｚＶＡＤ−ＦＭＫ（ＺＶＡＤ）でほぼ完全に抑制されたがＮＳ−１による抑制は小さかった。またグリベンクラミドは、ＴＲＡＩＬの抗癌効果を強く阻害した。これらの結果からＴＲＡＩＬはアポトーシス細胞死を誘発し、グリベンクラミドによる抗癌効果増強はプラズマ照射液に特異的であると考えられた。

［実施例１２］
実施例１１と同様に、グリベンクラミドを含む大気圧低温プラズマ照射液の悪性黒色腫（Ａ２０５８）ならびに骨肉腫（ＳＡＯＳ−２）に対する抗癌効果を調べた。結果は図１４に示す。

いずれの細胞でもＰＡＭは４倍希釈ではほとんど抗癌効果を示さなかったのに対して、本発明の抗癌剤であるＰＡＳＳの４倍希釈は抗癌効果を示した（生存率５０％）。グリベンクラミドは単独で弱い抗癌効果（生存率減少３０％）を示す一方で、ＰＡＭならびにＰＡＳＳの抗癌効果を著しく増強した。

［実施例１３］
実施例１１と同様に、メトホルミンを含む大気圧低温プラズマ照射液の骨肉腫（ＨＯＳ）、悪性黒色腫（Ａ２０５８）に対する抗癌効果を調べた。結果は図１５に示す。

（上）本発明の抗癌剤であるＰＬＡＳＴの４倍希釈はＨＯＳ細胞に対して、弱い抗癌効果を示した。メトホルミンは２０ｍＭまで単独では抗癌効果を示さなかったが濃度依存的に、ＰＬＡＳＴの抗癌効果を著しく増強した。（下）ＰＬＡＳＴの４倍希釈はＡ２０５８細胞に対して、抗癌効果を示した。メトホルミン高濃度は、単独で弱い抗癌効果を示す一方で、それ自身が細胞毒性を示さない濃度でもＰＬＡＳＴの抗癌効果を濃度依存的に著しく増強した。

［実施例１４］
プラズマ照射液がオートファジー並びにミトコンドリア形態に与える影響を調べた。
健常（Ａ）ならびに過剰増殖したＡ３７５細胞（Ｂ）を１００％ＰＳＭを２倍希釈したもの（５０％終濃度）または１００ｎｇ／ｍＬＴＲＡＩＬで２４時間インキュベート後にオートファジーの誘発をオートファゴソーム検出染色剤ＣＹＴＯ−ＩＤを用いて調べた。また、ミトコンドリアをＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒＲｅｄＣＭＸＲｏｓで染色して形態を解析した。Ｂａｒ＝１００μｍである。結果は図１６に示す。

（Ａ）コントロール細胞でもかなりの数のＣＹＴＯ−ＩＤの斑点が認められた。ミトコンドリアはフィラメント状を呈して、ＣＹＴＯ−ＩＤとは異なる部位に存在した。ＰＳＭ添加でＣＹＴＯ−ＩＤの斑点が集合し、ミトコンドリアは断片化、凝集した。さらに、ＣＹＴＯ−ＩＤの斑点とミトコンドリアの凝集体は共存し、ミトコンドリアの特異的分解過程であるミトファジーの誘発が見られた。黄色の矢印は損傷された細胞を示す。（Ｂ）過剰増殖したＡ３７５細胞で（Ａ）と同様な実験を行った。このような条件下では無刺激のコントロール細胞でもかなりの細胞が損傷し（黄色矢印）、ＣＹＴＯ−ＩＤの斑点の集合とミトコンドリアの断片化、凝集と両者の共存が見られた。ＰＳＭ刺激によってさらに細胞が傷害され、ほとんどの細胞が剥離したため、観察できる細胞数が大幅に減少した。（Ｃ）ＴＲＡＩＬ添加でＣＹＴＯ−ＩＤの斑点が増加したが、ミトコンドリアは一部が断片化したが凝集は起こさなかった。また、ＣＹＴＯ−ＩＤとミトコンドリアの共存はほとんど認められなかった。これらの結果は、ＰＳＭが特異的にミトファジーを誘発し、このミトファジーが細胞死につながることを示唆する。

［実施例１５］
上記実施例１と同様にして、テルモ社製ソルデム３Ａ３０ｍＬに対して、ＣＡＰ−２を５分間照射した（以下「ＰＣＦ−Ｏ（５ｍｉｎ）」、「ＰＣＦ−Ｎ（５ｍｉｎ）」と称する）。「ＰＣＦ−Ｏ（５ｍｉｎ）」、「ＰＣＦ−Ｎ（５ｍｉｎ）」はどちらもヘリウムガスプラズマを照射したものであるが、使用したプラズマ発生器が異なる。前者は、ガス流量が０．３Ｌ／ｍｉｎのプラズマ発生器を用いたものであり、後者は、ガス流量が○○のプラズマ発生器を用いたものである。
ヒト骨肉腫細胞ＳＡＯＳ−２にＰＣＦ−Ｏ（５ｍｉｎ）単独または他の薬剤との併用投与を行い、７２時間後の生存率をＷＳＴ−８法で測定した。ＰＣＦ−Ｏ（５ｍｉｎ）×２は、ＰＣＦ−Ｏ（５ｍｉｎ）を２倍希釈したものであり、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（ＰＴＸ）はパクリタキセルである。Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ（ＧＥＭ）はゲムシタビンである。Ｃｏｎｔｒｏｌはプラズマ照射液を投与していないＦＣＳ／ＤＭＥＭである。結果を図１７に示す。

図１７から明らかなように、２倍希釈のＰＣＦ−Ｏ（５ｍｉｎ）、ＰＣＦ−Ｎ（５ｍｉｎ）を投与したヒト骨肉腫細胞の生存率は、４０％程度であり、顕著に生存率が減少した。一方、ＴＲＡＩＬ、パクリタキセル、ゲムシタビンの単剤投与は、ＳＡＯＳ−２に対しては殆ど効果がなかった。これに対して、ＰＣＦ−Ｏ（５ｍｉｎ）やＰＣＦ−Ｎ（５ｍｉｎ）とパクリタキセルとの併用、ＰＣＦ−Ｏ（５ｍｉｎ）やＰＣＦ−Ｎ（５ｍｉｎ）とゲムシタビンとの併用は、細胞生存率を２０％程度にまで減少させており、著しい相乗効果を示した（Ｍｅａｎ±ＳＤ、Ｎ＝３）。

［実施例１６］
実施例１５で作成したＰＣＦ−Ｎ（５ｍｉｎ）２倍希釈、ゲムシタビン（０．１μＭ）をそれぞれ単剤あるいは併用してヒト骨肉腫細胞ＨＯＳに投与し、２４時間後に細胞核、ミトコンドリアならびに小胞体をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒＲｅｄ、ＥＲＴＴｒａｃｋｅｒＧｒｅｅｎを用いて染色して、それらの形態を蛍光顕微鏡で観察、撮影した。Ｃｏｎｔｒｏｌはプラズマ照射液を投与していないＦＣＳ／ＤＭＥＭである。結果を図１８に示す。

図１８から明らかなように、ＰＣＦ−Ｎ（５ｍｉｎ）２倍希釈は、フィラメント状のミトコンドリアを断片化し、膨張させたが、小胞体の外観に与える影響はわずかであった。一方、ゲムシタビンは小胞体を強く傷害し、断片化、凝集させた。、ＰＣＦ−Ｎ（５ｍｉｎ）とゲムシタビンとの併用は、ミトコンドリアと小胞体の双方が著しく変形し、ミトコンドリアと小胞体の分離をもたらした。なお、写真中のバーは１０μｍである。

［実施例１７］
ダルベッコ変法イーグル培地（ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）（Sigma-Aldrich社製 D5796）に対して、上記と同様にして低温大気圧酸素プラズマを５分間照射した（以下「ＰＺ５ｗ−ＮＦ」と称する。）。
メラノーマ細胞Ａ２０５８にＰＺ５ｗ−ＮＦ単独または他の薬剤との併用投与を行い、７２時間後の生存率をＷＳＴ−８法で測定した。ＰＺ５ｗ−ＮＦ×２、×４、×８は、ＰＣＦ−Ｏ（５ｍｉｎ）をそれぞれ２倍、４倍、８倍希釈したものである。Ｃｏｎｔｒｏｌはプラズマ照射液を投与していないＦＣＳ／ＤＭＥＭである。結果を図１９に示す。

図１９から明らかなように、ＰＺ５ｗ−ＮＦは濃度依存的にメラノーマ細胞の生存率を低下させた。８倍希釈や１６倍希釈では殆ど効果がなかった。一方、ＰＺ５ｗ−ＮＦは、ＺＶＡＤやネクロスタチンによっては全く抑制されなかったことから、ＰＺ５ｗ−ＮＦの抗癌効果は、アポトーシスやネクローシス経路に依存するものではないことが示唆された。

［実施例１８］
実施例１７と同様にして、骨肉腫細胞ＨＯＳにＰＺ５ｗ−ＮＦ単独または他の薬剤との併用投与を行い、７２時間後の生存率をＷＳＴ−８法で測定した。結果を図２０に示す。

図２０から明らかなように、ＰＺ５ｗ−ＮＦは濃度依存的に骨肉腫細胞の生存率を低下させた。８倍希釈や１６倍希釈では殆ど効果がなかった。一方、ＰＺ５ｗ−ＮＦは、ＺＶＡＤやネクロスタチンによっては全く抑制されなかったことから、ＰＺ５ｗ−ＮＦの抗癌効果は、アポトーシスやネクローシス経路に依存するものではないことが示唆された。

［実施例１９］
実施例１７と同様にして作成したＰＺ５ｗ−ＮＦの２倍希釈液と４倍希釈液をそれぞれヒト骨肉腫細胞ＨＯＳに投与し、２４時間後に細胞核及びミトコンドリアをＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒＲｅｄを用いて染色して、それらの形態を蛍光顕微鏡で観察、撮影した。Ｃｏｎｔｒｏｌはプラズマ照射液を投与していないＦＣＳ／ＤＭＥＭである。結果を図２１に示す。

図２１から明らかなように、ＰＺ５ｗ−ＮＦは濃度依存的に骨肉腫細胞の細胞死を誘発し、細胞形態変化、核破壊、ならびにミトコンドリアネットワーク異常が観察された（Ｂａｒ＝１０μｍ）。また、２倍希釈液では細胞がちぎれ飛んで、まともな細胞はほとんど観察されなかった。また核は完全に破壊され、断片化した。

以上のように、本発明のプラズマ照射液は、様々な癌種に対して抗癌作用を発揮した。また、本発明のプラズマ照射液は、ＮＯ調節剤や、糖尿病薬、抗癌剤などと併用することによって、安定的かつ相乗的な抗癌効果を発揮した。この併用効果が発揮される原因としては定かではないが、一つは、細胞死を抑制するミトコンドリアの形態恒常性に付随するいくつかの経路が活性化されることによって抗癌剤に対する抵抗性が生じ得るところ、ＮＯ調節剤や糖尿病薬、抗癌剤などとの併用によってこのミトコンドリアに関連する経路を抑制することによって、抗癌効果が著しく増強されることが考えられる。

Claims

ブドウ糖を含有し、フェノールレッドを含有しないナトリウム水溶液にプラズマを照射する工程を備えることを特徴とする抗癌剤の製造方法であって、
前記ナトリウム水溶液が、Ｌ−グルタミンを含有する、抗癌剤の製造方法。
ブドウ糖を含有し、フェノールレッドを含有しないナトリウム水溶液にプラズマを照射する工程を備えることを特徴とする抗癌剤の製造方法であって、
前記抗癌剤が、細胞死受容体アゴニスト、サリノマイシン、グリベンクラミド、メトホルミン、パクリタキセル、ゲムシタビン及びそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選ばれる１種以上の医薬と併用される抗癌剤である、抗癌剤の製造方法。