KR20140059988A

KR20140059988A - 간엽줄기세포의 냉동보존용 배지 및 이를 이용한 간엽줄기세포의 냉동보존방법

Info

Publication number: KR20140059988A
Application number: KR1020120126535A
Authority: KR
Inventors: 김지향; 도병록; 한수연; 김진탁; 김철근; 강성호; 김학준
Original assignee: 주식회사 휴림바이오셀; 한국해양과학기술원
Priority date: 2012-11-09
Filing date: 2012-11-09
Publication date: 2014-05-19
Also published as: KR102024740B1

Abstract

본 발명은 특정 얼음-결합 단백질(ice-binding protein)을 함유함으로써 동결보존제 및 혈청의 사용량을 최소화시킨 간엽줄기세포의 냉동보존용 배지 및 이를 이용한 간엽줄기세포의 냉동보존방법을 제공한다.

Description

간엽줄기세포의 냉동보존용 배지 및 이를 이용한 간엽줄기세포의 냉동보존방법{Cryopreservation medium for mesenchymal stem cells and cryopreservation method for mesenchymal stem cells using the same}

본 발명은 간엽줄기세포의 냉동보존용 배지 및 이를 이용한 간엽줄기세포의 냉동보존방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 특정 얼음-결합 단백질(ice-binding protein)을 함유함으로써 동결보존제 및 혈청의 사용량을 최소화시킨 간엽줄기세포의 냉동보존용 배지 및 이를 이용한 간엽줄기세포의 냉동보존방법에 관한 것이다.

줄기세포를 이용한 난치성 질환의 치료에 대한 가능성으로 많은 임상적 시도가 이루어지고 있다. 줄기세포 중, 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)는 '중간엽줄기세포'라고도 칭해지며, 개체의 발생시기 배아의 중배엽(mesoderm)에서 유래하는 중간엽(mesenchyme)에서 유래된 결합조직에 존재하는 성체줄기세포를 말한다. 간엽줄기세포는 고유의 자가증식능과 다분화능을 갖고 있어, 신경, 근육, 골, 연골, 지방 등으로 분화를 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

한편, 간엽줄기세포는 분리 직후에 확보할 수 있는 순도 높은 세포의 수가 제한적이다. 특히, 생체로부터 분리된 순수한 간엽줄기세포를 기능의 저하 없이 적절한 조건에서 보관하는 것은 매우 중요하다. 부적절한 보관에 따른 세포 고유능의 변질은 직접적인 치료 효능이나 고유 분화능에 영향을 주어 원활한 치료제 제조를 곤란하게 하거나, 세포 기능 저하에 따른 부작용 등을 야기할 수 있다.

줄기세포 등을 포함한 세포의 보관을 위해서는 냉동보존(cryopreservation) 방법이 통상적으로 이용된다. 세포는 기원, 채취 조직 및 체내 미세환경에 따라 생리학적 특성이 다르기 때문에, 각각의 세포를 냉동보존 할 때에도 대상 세포에 적합한 냉동보존방법이 적용되어야 한다. 특히 줄기세포의 경우는 고유의 특이적 분열 능력과 분화능력을 유지하기 위해 최적화된 냉동보존 조건이 요구되며, 보관 직후 세포치료제로서 활용될 수 있기 때문에 저독성의 보존액을 사용하는 것이 필수적이다.

줄기세포의 냉동보존용 배지는 세포배양용 배지 중에 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등과 같은 동결보존제(cryoprotectant)를 포함하며, 줄기세포의 특성에 따라 혈청, 혈장(덱스트란과 같은 대용혈장), 이당류(sucrose, trehalose 등)나 PVP(Polyvinylpyrrolidone) 등 독성과 자극성을 감소시키는 물질 등을 추가로 포함하기도 한다. 그러나, 동결보존제 및 혈청 등은 세포에 많은 독성이나 부작용을 야기하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 디메틸 설폭사이드(DMSO)가 의학적 활용이 가장 높은 동결보존제이나, 일부 줄기세포의 경우는 DMSO가 세포독성뿐 아니라 특정 조직으로의 유도분화에 결정적인 역할을 하는 것이 보고된 바 있다(Woodbury et al. J. Neurosci. Res. 2000. 61:364-370). 따라서 DMSO를 사용한 줄기세포 냉동보존 및 해동은 줄기세포의 운명을 원하지 않는 방향으로 유도할 수 있다는 것이 당업계에 주지되어 있다. 또한, 혈청의 존재는 감염이나 면역반응 등을 나타낼 수 있다(Kocaoemer et al., Stem Cells. 2007 May;25(5):1270-1278). 특히, 구성성분이 일정하지 않은 혼합물로서, 사람을 포함한 동물에서 얻게 되므로 매번 생산될 때마다 그 구성성분의 비율이 달라질 수 있어 실험용도의 사용에서 뿐 아니라 산업적 사용에 있어서도 다양한 문제를 야기하고 있다. 따라서, 혈청의 사용을 최소화하거나 또는 아예 혈청이 없는 무혈청 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 그러므로, 냉동 전후의 회수율을 감안하여 동결보존제 및 혈청, 혈장 등은 최소한의 농도로 사용되고 있으며, 예를 들어 간엽줄기세포의 냉동보존을 위해서는 디메틸 설폭사이드 등의 동결보존제 약 10 w/v% 및 혈청(우태아혈청) 약 20 w/v%를 함유한 냉동보존용 배지가 사용되고 있다.

본 발명자들은 줄기세포, 특히 간엽줄기세포의 냉동보존에 있어서, 독성 및 부작용을 나타내는 동결보존제 및 혈청의 농도를 줄이면서 높은 냉동보존 효율을 달성할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 최근 학계에 보고되고 있는 얼음-결합 단백질(ice-binding proteins, IBPs)의 활용가능성을 주목하였으며, 특정 얼음-결합 단백질을 사용할 경우 동결보존제 및 혈청의 농도를 현저하게 낮추면서도 높은 냉동보존 효율을 달성할 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 상기 특정 얼음-결합 단백질을 포함하는 간엽줄기세포의 냉동보존용 배지를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 배지를 이용한 간엽줄기세포의 냉동보존방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질; 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 동결보존제; 및 우태아혈청을 포함하는 간엽줄기세포의 냉동보존용 배지가 제공된다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질; 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 동결보존제; 및 우태아혈청을 포함하는 배지 중에 간엽줄기세포를 가하는 단계, 및 얻어진 배양액을 냉동시키는 단계를 포함하는 간엽줄기세포의 냉동보존방법이 제공된다.

본 발명에 의해, 특정 얼음-결합 단백질 즉, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질을 사용할 경우 디메틸 설폭사이드 등의 동결보존제 및 우태아혈청 등의 혈청의 농도를 현저하게 낮추면서도 높은 냉동보존 효율을 달성할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 특히, 본 발명에 따른 간엽줄기세포의 냉동보존용 배지는 동결보존제 및 혈청의 농도를 각각 기존 사용농도의 약 50% 및 약 25%의 수준으로 크게 낮출 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 냉동보존용 배지 및 이를 이용한 냉동보존방법은 변형이 최소화된 간엽줄기세포를 안정적으로 얻는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 서열번호 1의 단백질(LeIBP)을 이용한 냉동보존시 냉동보관 효율을 평가한 결과이다 (*, p<0.05).
도 2는 서열번호 1의 단백질(LeIBP)을 이용한 냉동보존시 CSI 지수를 산출하여 비교한 결과이다 (*, p<0.05). 하단의 사진은 해동 직후 실험군별 배양 세포의 사진임 (scale bar = 200μm).
도 3은 해동 후 장기관찰을 통한 간엽줄기세포 성장 곡선을 비교한 결과이다.
도 4는 서열번호 1의 단백질(LeIBP)을 이용한 냉동보존액이 해동 후 간엽줄기세포의 총증폭수에 비치는 영향을 비교한 결과이다. X축은 해동 후 배양한 기간을 나타내며, y축은 각 실험군내 세포의 자가 분열된 누적총수를 나타낸다. 실험군은 도 1의 실험군과 동일하다.
도 5는 서열번호 1의 단백질(LeIBP)을 포함하는 냉동보존액을 이용한 간엽줄기세포의 해동 직후와 증폭배양 후의 줄기세포 표지자 mRNA의 발현을 비교한 결과이다. 실험군 1, 냉동보관 전 세포; 실험군 2, 양성대조군; 3, 대조군; 4, 0.01 w/v% 서열번호 1의 단백질(LeIBP) 함유군; 5, 0.005w/v% 서열번호 1의 단백질(LeIBP) 함유군을 나타냄.
도 6은 해동 후 계대에 따른 간엽줄기세포의 표면항원 발현을 나타낸다.
도 7은 간엽줄기세포를 지방세포로 유도 후 세포내 지방 액적(lipid droplet) 형성을 비교한 결과로서, 서열번호 1의 단백질(LeIBP)을 포함하는 냉동보존액을 사용한 세포를 비동결 간엽줄기세포와 비교하여 분화 결과를 비교한 결과이다. (Scale bar=100 ㎛).
도 8은. 비동결 간엽줄기세포와 서열번호 1의 단백질(LeIBP) 냉동보존 간엽줄기세포의 지방분화 유도 후 지방세포 특이 유전자의 발현을 나타낸다. A; PCR 결과 사진, B; 각 유전자 발현 비교 결과.
도 9는 분화 후 연골세포 특이 단백질 발현을 비교한 결과로서, 해동 후 간엽줄기세포를 일정기간 배양 후 micromass culture로 전환하여 연골세포 분화능을 시험한 결과이다. (Scale bar = 100 ㎛).
도 10은 분화 후 연골세포 특이 단백질의 발현 강도 측정한 결과이다. 서열번호 1의 단백질(LeIBP) 냉동보존 간엽줄기세포는 비동결 간엽줄기세포의 연골분화 후 특이 표지단백질 발현이 유사하게 관찰되었음을 보여준다.
도 11은 서열번호 1의 단백질(LeIBP) 또는 상용화된 결빙방지 단백질로 구성된 냉동보존액의 지방유래 간엽줄기세포의 냉동보존 효율에 대한 영향을 비교한 결과이다 (*, P<0.05; **, P<0.01).

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질; 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 동결보존제; 및 우태아혈청을 포함하는 간엽줄기세포의 냉동보존용 배지를 제공한다.

상기 간엽줄기세포는 인간의 지방조직 유래의 간엽줄기세포, 탯줄유래 간엽줄기세포, 골수유래 간엽줄기세포 등을 제한 없이 포함한다. 상기 간엽줄기세포의 분리방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질은 루코스포리듐 속 극지 효모 즉, 류코스포디듐 종(Leucosporidium sp .) AY30에서 단리된 단백질로서, 결빙방지 단백질(antifreeze protein)로서의 성질을 갖는다(Lee et al., Cryobiology. 2010. 60: 222-228). 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질은 다른 결빙방지 단백질과 달리 단 하나의 시스테인(cysteine) 아미노산 잔기도 가지고 있지 않은 구조적 특성을 가지고 있다. 본 발명자들은 결빙방지 단백질(혹은 '얼음-결합 단백질'로 칭해진다)의 특성에 주목하여, 간엽줄기세포의 냉동보존에 있어서의 활용가능성을 시험하였다. 특히, 독성 또는 부작용이 보고된 동결보존제 및/또는 혈청의 사용량을 낮추기 위하여 다양한 결빙방지 단백질들을 대상으로 시험한 결과, 종래의 동결보존제 및 혈청을 사용한 경우에 비하여 회수율(recovery rate) 및 생존율(viability)이 더 낮아 부적합하였다. 그러나, 놀랍게도, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질을 사용한 경우에는 특이하게 세포의 회수율 및 생존율을 현저하게 높일 수 있어, 동결보존제 및 혈청의 사용량을 50% 이상 줄일 수 있음을 발견하였다. 이는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질의 구조적 특성 및 간엽줄기세포와의 적합성에 기인하는 것으로 추정된다.

본 발명의 간엽줄기세포의 냉동보존용 배지에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질의 농도는 0.0005 내지 0.1 w/v%, 바람직하게는 0.005 내지 0.01 w/v%의 범위일 수 있다. 또한, 상기 동결보존제의 농도는 2 내지 8 w/v%, 바람직하게는 4 내지 5 w/v%, 더욱 바람직하게는 약 5 w/v% 일 수 있다. 또한, 상기 우태아혈청의 농도는 2 내지 10 w/v%, 바람직하게는 4 내지 7 w/v%, 더욱 바람직하게는 약 5 w/v% 일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 간엽줄기세포의 냉동보존용 배지는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질 0.0005 내지 0.1 w/v%; 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 동결보존제 2 내지 8 w/v%; 및 우태아혈청 2 내지 10 w/v%를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 간엽줄기세포의 냉동보존용 배지는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질 0.005 내지 0.01 w/v%; 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 동결보존제 약 5 w/v%; 및 우태아혈청 약 5 w/v%를 포함할 수 있다.

본 발명의 간엽줄기세포의 냉동보존용 배지는 인산완충식염수(phosphate buffed saline, PBS) 등의 생리학적으로 양립가능한 완충액(physiologically compatible buffer solution)이나 혹은 세포 배양에 통상적으로 사용되는 기본 배지(basal medium)일 수 있다. 상기 기본 배지는 예를 들어, DPBS, HBSS, DMEM, IMDM, RPMI, MEM 등의 배지를 제한 없이 포함한다. 일 구현예에서, 상기 기본 배지는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 일 수 있다.

본 발명은 또한 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질; 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 동결보존제; 및 우태아혈청을 포함하는 배지 중에 간엽줄기세포를 가하는 단계, 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 배양액을 냉동시키는 단계를 포함하는 간엽줄기세포의 냉동보존방법을 제공한다.

본 발명에 따른 간엽줄기세포의 냉동보존방법에 있어서, 단계(a)에 사용되는 배지는 상기에서 설명한 바와 같다. 단계(a)에서 배지에 가해지는 간엽줄기세포의 수는 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 배지 1 ml 당 1 x 10⁵ 내지 2 x 10⁷ cells의 범위일 수 있다.

단계(b)의 상기 냉동은 냉동보존 분야에서 사용되는 통상의 동결방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 냉동은 수작업(manual method), 자동동결기 사용법(automatic controlled rate freezing method), 급/완속 냉동법(rapid/slow freezing method), 유리화동결법(vitrification method) 등을 사용하여 수행될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

하기 시험에서 사용된 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질은 한국극지연구소로부터 공급받았다.

1. 시험방법

(1) 간엽줄기세포의 분리 및 배양

인간 지방조직에서 유래한 간엽줄기세포는 연구동의 의사를 서명으로 밝힌 건강한 성인 지원자를 대상으로 조직을 채취하였다. 간엽줄기세포의 분리는 Zuk 등에 의한 방법(Zuk et al., 2001)을 응용하였으며, 간엽줄기세포의 고유능을 유지하는 세포주를 확인하여 본 시험에 사용하였다. 간엽줄기세포의 배양에 사용된 배지는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)을 기본 배지로 사용하여 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 첨가하였다. 세포의 계대 및 수율 평가를 위한 세포 계수는 트리판 블루 익스클루젼(trypan blue exclusion) 방법을 사용하였다.

(2) 줄기세포의 냉동 및 해동 과정

DMEM에 서열번호 1의 단백질을 소정의 농도로 가하고, 동결보존제(디메틸 설폭사이드) 및 FBS를 소정의 농도로 가하여 냉동보존용 배지를 준비하였다. 얻어진 냉동보존용 배지를 1 ml씩 냉동바이알에 넣고, 냉동바이알 당 1 X 10⁶ cells의 간엽줄기세포를 가하여 부유시켰다. 얻어진 혼합물을 자동동결기(Ice cube, SY Lab.)를 사용하여 동결시켰다. 동결 후, 냉동바이알은 분석할 때까지 액화질소 탱크에 보관하였다.

냉동바이알의 해동은 37℃ 온수조를 이용하여 수행하였으며, 해동된 냉동바이알은 10% FBS가 함유된 DMEM으로 신속하게 세척하였다. 상기 세척은 3회 수행하였으며, 300 x g 10분간 원심분리 후 새로운 세척액에 세포층을 부유시켜 세포계수와 분석을 수행하였다.

(3) 해동 후 세포의 회수율 및 생존율

10 w/v% DMSO 및 20 w/v% FBS를 사용한 군을 제1군(양성대조군); 5 w/v% DMSO 및 5 w/v% FBS를 사용한 군을 제2군(대조군); 5 w/v% DMSO 및 5 w/v% FBS에 서열번호 1의 단백질을 0.005 w/v% 또는 0.01 w/v% 함유하는 시험군(각각, 제3군 및 제4군)의 냉동보존 수율의 비교를 위해 회수율 및 생존율을 평가하였다. 모든 실험군은 자동동결기를 이용하여 동결하고 액화질소통에 보관하였다. 해동 시험은 7일 이상 액화질소통에 보관된 후에 수행하였으며, 해동 직후 세포계수를 통해 회수율을 확인하고, 증식률 차이를 확인하기 위해 배양하였다. 배양 후 회수된 세포수를 확인하여 해동 후 회수율과 비교하여 세포생존지표를 산출하였다(Wusteman and Pegg, 2004).

(4) 해동 후 간엽줄기세포의 증식능

서열번호 1의 단백질의 세포증식율 영향을 평가하기 위해 단기시험과 장기시험으로 구분하여 진행하였다. 단기시험은 해동 후 3일 후에 배양된 세포를 계수하여 실험군간 비교하였으며, 해동 직후 확인된 회수율과 생존율과 함께 상대적 회수율을 산출하여 결과를 비교하였다. 장기배양은 간엽줄기세포의 해동 후 총생산 세포량을 확인하기 위해 수행되었으며, 대조군으로 비동결의 동일 세포주를 이용하여 증식곡선을 비교하였다. 동시에 해동 후 총누적 세포분열수를 확인하여 냉동보존액에 따른 총누적 세포분열수가 20회 이상 가능한지를 분석하였다. 총누적 세포분열수를 확인하기 위해 2.5x10³ cells/cm² 농도로 배양접시에 접종하였다. 계대 배양을 7일 간격으로 실시하면서 증식된 세포수를 확인하였으며, 총 분열수가 20 회를 초과할 때까지 수행하여 실험군간 비교하였다.

(5) 해동 후 줄기세포의 표지자 발현 조사

서열번호 1의 단백질을 함유한 냉동보존액을 이용한 간엽줄기세포의 해동 후 줄기세포 고유 표지자 발현의 변화가 발생하는가를 확인하기 위해 mRNA 발현변화와 표지항원 발현을 조사하였다. 해동 후 간엽줄기세포의 배양을 초기(5회 분열시점)와 후기(15회 분열시점)로 나누어 시료를 확보하고 간엽줄기세포 mRNA 표지자 분석을 위해 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하였다. 본 실험에 사용된 프라이머의 조건은 표 1과 같다.

표적(크기)	서열번호	서열
ADAM metallopeptidase domain 12 (291bp)	2	정방향	GCTGATGAAGTTGTCAGTGC
ADAM metallopeptidase domain 12 (291bp)	3	역방향	GAGACTGACTGCTGAATCAG
Alkaline phospatase (634bp)	4	정방향	GAGACTGACTGCTGAATCAG
Alkaline phospatase (634bp)	5	역방향	CCAAACAGGAGAGTCGCTTC
Human CD73 (304bp)	6	정방향	CGCAACAATGGCACAATTAC
Human CD73 (304bp)	7	역방향	CAGGAAGTTTGGGAGGATCA
Human CD90 (470bp)	8	정방향	AGCATCGCTCTCCTGCTAAC
Human CD90 (470bp)	9	역방향	CACAGGGACATGAAATCCG
CCAAT/enhancer binding protein alpha (cEBPalpha, 165bp)	10	정방향	TGCCTAGGAACACGAAGCAC
CCAAT/enhancer binding protein alpha (cEBPalpha, 165bp)	11	역방향	TGGTGGTTTAGCAGAGACGC
Adiponectin (258bp)	12	정방향	AGGAAACCACGACTCAAGGG
Adiponectin (258bp)	13	역방향	GTTCTCCTTTCCTGCCTTGG
Interleukin 6 (IL-6, 182 bp)	14	정방향	CCAGTACCCCCAGGAGAAGA
Interleukin 6 (IL-6, 182 bp)	15	역방향	TTGTTTTCTGCCAGTGCCTC
Peroxisome proliferative activated receptor, gamma (PPARgamma2, 512bp)	16	정방향	TATGCCAAAAGCATTCCTGG
	17	역방향	AGGAGCGGGTGAAGACTCAT
Fatty acid binding protein 4 (aP2, 125bp)	18	정방향	AACCTTAGATGGGGGTGTCCTG
Fatty acid binding protein 4 (aP2, 125bp)	19	역방향	TCGTGGAAGTGACGCCTTTC
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH, 240bp)	20	정방향	TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH, 240bp)	21	역방향	TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT

간엽줄기세포 표면항원 발현 조사를 위해서 세포를 동결 전, 해동 후 2계대, 해동 후 6계대에서 확보하여 유세포분석기(fluorescence activated cell sorter, FACS)를 이용하여 분석을 수행하였다. 각 항체의 음성 대조군으로 Mouse IgG-FITC와 Mouse IgG-PE를 이용하였다. 본 시험에 사용한 항체는 하기 표 2와 같다.

항체	제조사	Cat. No.	Fluorochrome
CD105	BD Pharmingen	560839	PE
CD117	BD Pharmingen	555714	PE
CD31	BD Pharmingen	555445	FITC
CD34	MACS	130-081-001	FITC
CD45RA	BD Pharmingen	555489	PE
CD73	BD Pharmingen	550257	PE
CD9	BD Pharmingen	555371	FITC
CD90	BD Pharmingen	555596	PE
Mouse IgG1,k	BD Pharmingen	555748	FITC
Mouse IgG2b,k	BD Pharmingen	555743	PE

(6) 해동 후 줄기세포의 분화능 조사

간엽줄기세포의 분화능력에 대한 냉동보존 후 변화 여부를 조사하였다. 본 시험을 위해 지방세포 분화와 연골세포 분화유도를 수행하였다. 다양한 조건을 이용하여 냉동 보존한 세포를 1x10⁴ cells/cm²으로 접종 3일후 StemPro Adipogenesis Differentiation Kit (Invitrogen)을 이용하여 3주간 지방세포 분화를 유도하였다. 분화대조군은 분화유도군과 동일한 기간 동안 기본 배지에서 배양하였다. 분화 유도율을 확인하기 위해 oil red O 염색을 수행하였다(Zul et al., 2001). 분화한 세포는 RT-PCR을 통해서 지방세포 특이 유전자 발현을 확인하였고, 사용한 프라이머 목록은 상기 표 1에 정리하였다. 연골세포로의 분화능을 확인하기 위해서 배양한 세포를 StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit (Invitrogen)을 이용하여 3주간 배양하였다. 분화한 세포는 동결 절편하여 collagen type I, collagen type II, proteoglycan 발현을 면역세포화학법을 이용하여 조사하였다 (Lin et al., 2006).

(7) 통계 분석

냉동 배지 조성별 증식효과를 확인하기 위해 실험 결과는 각 실험별 대조군 결과와의 유의성 분석을 수행하였다. 분석방법은 Paired t' test를 수행하였으며 P값이 0.05 보다 낮은 경우를 통계학적으로 유의하게 분리하고 결과에 별표(*)로 표시하였다.

2. 시험결과 및 고찰

10 w/v% DMSO 및 20 w/v% FBS를 사용한 제1군(양성대조군); 5 w/v% DMSO 및 5 w/v% FBS를 사용한 제2군(대조군); 5 w/v% DMSO 및 5 w/v% FBS에 서열번호 1의 단백질을 0.005 w/v% 또는 0.01 w/v% 함유하는 시험군(각각, 제3군 및 제4군)에 대하여 해동 후 세포생존지표(cell survival index), 세포증식지표(cell multiplication factor), 및 상대생존율(relative survival rate)을 측정하였으며, 그 결과는 도 1과 같다. 도 1의 결과는 10 w/v% DMSO 및 20 w/v% FBS를 사용한 양성대조군(제1군)의 각각의 값을 100%로 하여, 환산한 결과이다. 도 1의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 5 w/v% DMSO 및 5 w/v% FBS를 사용한 군(제2군, 대조군)은 세포생존지표, 세포증식지표, 및 상대생존율 모두 현저하게 감소하였다. 그러나, 대조군과 동일한 조건에서 서열번호 1의 단백질을 첨가한 경우, 대조군에 비해 세포생존지표, 세포증식지표 모두 상승하였으며, 특히 상대생존율은 통계적으로 유의하게 증가하였다, 즉, 서열번호 1의 단백질를 첨가한 경우 간엽줄기세포의 해동 후 줄기세포의 상태를 나타낼 수 있는 지표들이 모두 증가하는 것을 확인할 수 있다.

해동 후 간엽줄기세포의 배양능력과 모양 등을 비교하기 위해 세포 생존지수를 확인하였으며, 그 결과는 도 2와 같다. 대조군(제2군)의 결과값과 비교시 서열번호 1의 단백질을 포함하는 두 시험군은 양성대조군보다 높은 생존지수를 보였으며, 서열번호 1의 단백질 0.005 w/v%을 함유하는 시험군의 생존지수가 가장 증가된 수치를 나타내었다 p<0.05). 도 2의 하단부에 나타낸 세포의 사진은 지방유래 간엽줄기세포를 실험군별 조성의 냉동보존액에 보관한 후 배양을 실시하여, 단기 배양능력을 비교하기 위해 촬영한 것이다. 모든 실험군에서 전형적인 간엽줄기세포의 크기와 형태가 관찰되나, 단기 배양과정 동안의 증식율이 실험군간 차이가 나타나는 것을 세포 사진을 통해 확인할 수 있다. 서열번호 1의 단백질을 함유하는 시험군에서 관찰되는 세포의 증식 형태는 양성대조군과 유사한 것을 확인할 수 있다.

해동 후 간엽줄기세포는 단기배양능력 뿐만 아니라 장기 배양능을 유지하여야 한다. 따라서 서열번호 1의 단백질을 포함하는 냉동보존액을 사용한 세포를 냉동보관하지 않은 동일 세포주와 비교하여 세포생산총량을 장기간 관찰하였다(도 3). 동일 기간 동안 배양된 세포가 분열을 통해 생산해 낸 세포의 수는 유사한 총량을 보였으며, 증식곡선의 형태도 직선화구간의 지표가 냉동보관하지 않은 경우에 0.977, 서열번호 1의 단백질을 사용하여 냉동한 경우는 0.982로 확인되었다. 즉, 5계대 동안 증가된 총세포수가 비동결 세포의 경우는 25.23배 생산되고, 서열번호 1의 단백질을 포함한 냉동보존액 실험군의 세포는 22.61배 증가함을 확인하였다. 따라서 서열번호 1의 단백질을 사용하여 냉동보관을 수행할 경우, 해동 후 간엽줄기세포의 고유 분열능과 생산능력에는 영향을 주지 않는 것을 확인할 수 있다.

간엽줄기세포의 해동 후 증식능력을 보기 위해 배양 기간별 자가 분열된 누적총수를 실험군별로 비교하였다(도 4). 해동 후 총분열수 20회를 초과하는가를 확인하여 27일간의 배양을 통해 비교하였으며, 동일 세포주를 사용했을 때 냉동보존액의 조성별로 실험군간 차이가 관찰되지 않았다. 따라서 세포의 해동 후 고유증식능이 안정적으로 유지되었음을 확인하였다. 이 관찰기간 동안에 세포를 수집하여 발현하는 mRNA 표지자 분석을 수행하였다(도 5). 해동 후 배양 초기 단계와 후기 단계로 구분하여 발현을 비교하였으며, 각 5회 분열시와 15회 분열시의 세포를 사용하였다. 역전사발현효소를 이용한 중합반응을 통해 ADAM12, ALP, CD73, CD90 mRNA 표지자 발현을 비교하였다. 안정적인 표지자 발현을 비교하기 위해 냉동보관전 세포(실험군 1), 냉동보존액 양성대조군(실험군 2), 냉동보존액 대조군(실험군 3), 서열번호 1의 단백질 0.01 w/v% 함유 냉동보존액 실험군(실험군 4), 서열번호 1의 단백질 0.005 w/v% 함유 냉동 보존액 실험군(실험군 5)의 결과를 비교하였다. 대상 표지자 발현이 냉동보관 전후 혹은 냉동 보존액에 따라 상이하게 관찰되는 경우는 없었고, 분열 횟수에 따른 차이도 관찰되지 않았다. 따라서 본 실험에서 사용한 서열번호 1의 단백질을 함유한 냉동 보존액을 이용할 경우 지방유래 간엽줄기세포의 표지자 발현에 대한 영향 없이 안정적인 보관이 가능함을 확인할 수 있다.

유세포분석기를 사용하여 해동 후 지방유래 간엽줄기세포의 표면항원 발현을 측정하였다. 추적을 위한 표면항원의 설정은 국제줄기세포학회에서 지방유래 간엽줄기세포의 표면항원으로 제시한 목록을 참고하여 8종을 선택하였다. 선택한 항원은 CD9, CD31, CD73, CD90, CD34, CD45, CD105, CD117 이다. 배양기간을 동결전, 해동 후 초기(해동 후 추가 2계대), 해동 후 후기(해동 후 추가 6계대)의 3단계로 나누어 표면항원 8종을 추적하여 조사하였다. 그 결과는 도 6과 같다. 미동결 간엽줄기세포는 총 8계대 동안 변화없이 표면항원 발현을 안정적으로 유지하는 것을 확인하였다. 서열번호 1의 단백질을 사용한 동결 간엽줄기세포 실험군은 해동 후 동결 전과 동일한 표면 항원 발현을 보였으며 이 후 6계대 동안 특성을 유지하였다. 따라서, 서열번호 1의 단백질이 간엽 줄기세포의 특성에 영향을 주지 않아 고유의 표면항원 발현(CD9, CD90, CD105의 항원은 양성 발현을 보이고, CD31, CD34, CD45, CD73, CD117 항원은 음성 발현을 나타냄)을 유지함을 확인할 수 있다.

줄기세포는 자가분열을 통한 특이적 분열능력과 함께 신경세포, 지방세포, 골세포, 연골세포 등의 계열로의 분화능력을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 실험에서는 서열번호 1의 단백질을 함유한 냉동보존액을 이용하여 간엽줄기세포 혹은 조혈줄기세포를 보관하였을 때 고유의 분화능력이 달라지는가를 확인하였다. 도 7의 지방분화 유도 결과에서 비분화 대조군은 분화유도액을 사용하지 않고 기본 증식배양액(control medium 실험군)을 사용한 결과이고, 분화를 유도한 경우에는 분화유도액을 사용한 실험군(Adipogenic medium 실험군)으로 3주간 유도한 결과이다. 지방세포의 특이적 세포내 구조체인 지방 액적(lipid droplets)을 붉게 염색하여 육안으로 확인하였으며, 서열번호 1의 단백질을 이용하여 냉동보존된 세포의 분화군에서도 비동결 간엽줄기세포와 유사하게 분화가 진행되었음을 확인할 수 있다. 염색된 양을 정량적으로 비교하였을 때 비동결 간엽줄기세포 분화율은 70.7%, 서열번호 1의 단백질 냉동 간엽줄기세포는 70.8%로 유사한 결과를 보였다. 지방 분화에 따른 지방세포 특이 유전자의 발현정도를 RT-PCR을 통하여 비교하였으며, 정량값은 GAPDH 발현량을 기준으로 하여 나타내었다(도 8). 서열번호 1의 단백질 동결 세포와 비동결 간엽줄기세포의 지방 분화 유도 후 후기 지방분화 조절인자인 CCAAT/enhancer-binding protein alpha (cEBPα)와 adipocyte Protein 2 (aP2) 그리고 성숙한 지방세포에서 분비하는 것으로 알려진 adiponectin와 peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2(PPARγ2) 발현이 유사하게 나타남을 확인할 수 있다.

서열번호 1의 단백질 냉동보존 간엽줄기세포의 분화능력을 연골세포로 유도하여 비동결 간엽줄기세포를 이용한 유도 결과와 비교하였다(도 9). 연골세포로의 분화를 확인하기 위해 면역염색화학법을 수행하여 연골 특이적 표지자인 collagen type I(Col I), collagen type II(Col II), proteoglycan(PG)의 발현을 조사하였다. 3주동안 연골분화를 유도하였으며 3일(D3)과 21일(D21)의 분화된 시료를 채취하여 표지자 발현을 비교하였다. 3일자의 분화 초기 세포에서는 대상 단백질이 약하게 발현하였고, 21일간 유도한 분화 세포에서 micromass 전반에 걸쳐 연골세포 특이 단백질인 proteoglycan과 collagen type I을 강하게 발현하고 collagen type II는 약하게 발현하였다. 분화정도를 비교하기 위하여 Image J RGB counter(NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 Green fluorescent의 평균 형광 강도를 분석하였으며 그 결과는 도 10과 같다. 도 10은 D3의 micromass를 대조군에 대비하여 상대값을 비교하였다. 비동결 간엽줄기세포의 분화 후 Col I의 강도는 평균 7.48배 증가하였고 서열번호 1의 단백질 냉동보존 간엽줄기세포는 평균 7.80배 증가하였다. 비동결 간엽줄기세포의 분화 후 Col II의 강도는 평균 3.45배 증가하였고 서열번호 1의 단백질 냉동보존 간엽줄기세포는 평균 3.49배 증가하였다. Proteoglycan의 발현에 대한 형광 강도는 비동결 간엽줄기세포군에서 평균 5.65배 증가하였고 서열번호 1의 단백질 냉동보존 간엽줄기세포는 평균 6.11배 증가하였다. 연골분화 유도 21일 후 Type I collagen, type II collagen 그리고 proteoglycan의 발현 모두 증가하였으며 동결여부에 따른 발현강도 차이에는 통계학적 유의성은 나타나지 않았다. 따라서 서열번호 1의 단백질 냉동보존이 간엽줄기세포의 연골분화 능력에 영향을 주지 않아 안정적인 냉동보관이 가능한 것으로 확인하였다.

줄기세포 냉동보존을 위한 서열번호 1의 단백질과 상업적으로 구입가능한 결빙방지 단백질(Type III, A/F Protein Inc.)를 비교하였다. 5 w/v% DMSO 및 5 w/v% FBS에 서열번호 1의 단백질을 0.005 w/v% 또는 상기 결빙방지 단백질(Type III, A/F Protein Inc.) 0.005 w/v% 농도로 포함된 각 냉동보존액에, 지방유래 간엽줄기세포를 보관 후 회수율 및 생존율을 비교하였다(도 11). 서열번호 1의 단백질을 포함하는 냉동보존액을 사용한 경우 대조군에 비해 회수율이 유의하게 증가하였으나, 상용 결빙방지단백질을 사용한 실험군의 경우는 오히려 대조군에 비해 유의하게 감소된 회수율과 생존율을 나타내었다. 따라서, 서열번호 1의 단백질은 다른 상용화된 결빙방지 단백질에 비하여 지방유래 간엽줄기세포의 냉동보관에 특히 적합함을 알 수 있으며, 이는 서열번호 1의 단백질의 구조적 특성 및 간엽줄기세포와의 적합성에 기인하는 것으로 추정된다.

3. 결론

서열번호 1의 단백질을 냉동보존에 사용할 경우, 독성을 일으킬 수 있는 동결보존제의 농도와 우태아혈청과 같은 외래성 물질의 농도를 낮추면서, 간엽줄기세포의 안정적인 냉동 보관이 가능한 것이 본 연구를 통해 밝혀졌다. 즉, 서열번호 1의 단백질을 포함하는 냉동보존용 배지를 이용할 경우, 세포의 형태, 증식분열능, 분화능에 대한 영향없이, 간엽줄기세포의 안정적이고 고효율의 냉동보관이 가능하다.

<110> HURIMBIOCELL CO. LTD. Korea Institute of Ocean Science and Technology <120> Cryopreservation medium for mesenchymal stem cells and cryopreservation method for mesenchymal stem cells using the same <130> PN0605 <160> 21 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 261 <212> PRT <213> Leucosporidium sp. AY30 <400> 1 Met Ser Leu Leu Ser Ile Ile Thr Ile Gly Leu Ala Gly Leu Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Asn Gly Gln Arg Asp Leu Ser Val Glu Leu Gly Val Ala Ser 20 25 30 Asn Phe Ala Ile Leu Ala Lys Ala Gly Ile Ser Ser Val Pro Asp Ser 35 40 45 Ala Ile Leu Gly Asp Ile Gly Val Ser Pro Ala Ala Ala Thr Tyr Ile 50 55 60 Thr Gly Phe Gly Leu Thr Gln Asp Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Thr Ser 65 70 75 80 Pro Gln Val Thr Gly Leu Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Ser Thr Pro Thr 85 90 95 Pro Asn Tyr Leu Ala Ala Ala Val Ala Asn Ala Glu Thr Ala Tyr Asn 100 105 110 Gln Ala Ala Gly Phe Val Asp Pro Asp Phe Leu Glu Leu Gly Ala Gly 115 120 125 Glu Leu Arg Asp Gln Thr Leu Val Pro Gly Leu Tyr Lys Trp Thr Ser 130 135 140 Ser Val Ser Val Pro Thr Asp Leu Thr Phe Glu Gly Asn Gly Asp Ala 145 150 155 160 Thr Trp Val Phe Gln Ile Ala Gly Gly Leu Ser Leu Ala Asp Gly Val 165 170 175 Ala Phe Thr Leu Ala Gly Gly Ala Asn Ser Thr Asn Ile Ala Phe Gln 180 185 190 Val Gly Asp Asp Val Thr Val Gly Lys Gly Ala His Phe Glu Gly Val 195 200 205 Leu Leu Ala Lys Arg Phe Val Thr Leu Gln Thr Gly Ser Ser Leu Asn 210 215 220 Gly Arg Val Leu Ser Gln Thr Glu Val Ala Leu Gln Lys Ala Thr Val 225 230 235 240 Asn Ser Pro Phe Val Pro Ala Pro Glu Val Val Gln Lys Arg Ser Asn 245 250 255 Ala Arg Gln Trp Leu 260 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 gctgatgaag ttgtcagtgc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gagactgact gctgaatcag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 gagactgact gctgaatcag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 ccaaacagga gagtcgcttc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 cgcaacaatg gcacaattac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 caggaagttt gggaggatca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 agcatcgctc tcctgctaac 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 cacagggaca tgaaatccg 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 tgcctaggaa cacgaagcac 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 tggtggttta gcagagacgc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 aggaaaccac gactcaaggg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 gttctccttt cctgccttgg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 ccagtacccc caggagaaga 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 ttgttttctg ccagtgcctc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 tatgccaaaa gcattcctgg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 aggagcgggt gaagactcat 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 aaccttagat gggggtgtcc tg 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 tcgtggaagt gacgcctttc 20 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 tgatgacatc aagaaggtgg tgaag 25 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 tccttggagg ccatgtgggc cat 23

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질; 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 동결보존제; 및 우태아혈청을 포함하는 간엽줄기세포의 냉동보존용 배지.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질의 농도가 0.0005 내지 0.1 w/v%인 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 냉동보존용 배지.
제2항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질의 농도가 0.005 내지 0.01 w/v%인 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 냉동보존용 배지.
제1항에 있어서, 상기 동결보존제의 농도가 2 내지 8 w/v%인 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 냉동 보존용 배지.
제4항에 있어서, 상기 동결보존제의 농도가 4 내지 5 w/v%인 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 냉동 보존용 배지.
제1항에 있어서, 상기 우태아혈청의 농도가 2 내지 10 w/v%인 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 냉동 보존용 배지.
제6항에 있어서, 상기 우태아혈청의 농도가 4 내지 7 w/v%인 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 냉동 보존용 배지.
서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질; 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 동결보존제; 및 우태아혈청을 포함하는 배지 중에 간엽줄기세포를 가하는 단계, 및 얻어진 배양액을 냉동시키는 단계를 포함하는 간엽줄기세포의 냉동보존방법.
제8항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질의 농도가 0.0005 내지 0.1 w/v%인 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 냉동보존방법.
제9항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질의 농도가 0.005 내지 0.01 w/v%인 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 냉동보존방법.
제8항에 있어서, 상기 동결보존제의 농도가 2 내지 8 w/v%인 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 냉동보존방법.
제11항에 있어서, 상기 동결보존제의 농도가 4 내지 5 w/v%인 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 냉동보존방법.
제8항에 있어서, 상기 우태아혈청의 농도가 2 내지 10 w/v%인 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 냉동보존방법.
제13항에 있어서, 상기 우태아혈청의 농도가 4 내지 7 w/v%인 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 냉동보존방법.