KR20220050493A - 환원성 이당류를 포함하는 모유두 세포의 동결보존용 조성물 - Google Patents

환원성 이당류를 포함하는 모유두 세포의 동결보존용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따른 모유두 유사 세포의 동결보존용 조성물은 세포 치료제를 인체에 적용하는데 안정성이 우려될 수 있는 동물 유래 물질인 우태아혈청(Fetal bovine serum; FBS) 및 디메틸설폭사이드(Dimethyl sulfoxide; DMSO)를 사용하지 않음에도 불구하고, 동결보존 이후 해동시에 세포 생존율이 85% 이상을 유지할 수 있을 뿐만 아니라, 모유두 세포와 비교하여 고유한 항원의 발현율을 90% 이상 유지할 수 있도록 하는 효과를 가진다. 이에, 이와 같은 동결보존용 조성물을 이용하는 경우에는 인체에 무해하고, 세포 치료제의 유효성분에 해당하는 세포 자체를 안정적으로 장기간 보관하여 세포 치료제의 상용화에 매우 적합하게 사용될 수 있다.

Description

환원성 이당류를 포함하는 모유두 세포의 동결보존용 조성물{A Cryoprotective composition for Dermal papilla-like cell comprising reducing disaccharide}
본 발명은 환원성 이당류를 포함하는 모유두 세포의 동결보존용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 줄기세포로부터 분화가 유도된 모유두 유사 세포의 동결보존을 위하여 환원성 이당류를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
모낭은 태아 상태에서 완전히 형성되어 출생 이후에는 더 이상 생성되지 않고 세월이 흐를수록 감소된다. 모낭이 감소되어 발생하는 탈모의 치료 중에서, 약물치료 또는 모발 이식의 경우 원천적으로 모낭이 존재하는 경우에만 효과가 발휘될 수 있다. 따라서, 탈모를 근본적으로 치료하기 위해서는 궁극적으로 모낭을 신생시키는 것이 중요하다. 그러나, 두피에 모낭이 존재하지 않는 탈모 환자의 경우에는 외부에서 모낭을 신생 및 이식하는 방식만이 궁극적으로 탈모를 해결할 수 있다.
최근 본 출원의 출원인은 지방유래 중간엽 줄기세포에서 모유두 유사 세포(Dermal papilla-like cell)로 분화될 수 있는 분화 기술을 성공적으로 확립하였다. 이와 같은 성공에 따라, 모낭을 신생시킬 수 있는 재료를 안정적으로 공급하여 치료제 생산 효율을 극대화할 수 있으며, 자가 지방을 사용함으로써 이식에 따른 면역 거부 반응을 원천 차단할 수 있는 기반이 마련되었다. 이를 통해, 신생 모낭을 이식함으로써 탈모를 근본적으로 치료할 수 있으며, 역 분화 만능 줄기세포(Induced pluripotent stem cell; iPS)를 사용하여 모유두 세포로 분화시키는 경우와 비교하여 지방유래 중간엽 줄기세포를 이용하는 경우에 분화에 소요되는 기간이 짧기 때문에 기술의 우위성이 있다. 나아가, 이러한 기술의 개발은 신속한 치료와 치료제에 대한 환자의 접근성을 대폭 높일 수 있다.
이러한 치료가 더욱 성공적이기 위해서는 분화 기술을 이용하여 개발된 세포 치료제가 적시에 공급될 수 있도록 해야 하며, 불가피한 사정으로 세포를 보관해야 하는 경우 등의 돌발 변수에 대응하기 위해, 세포 치료제 혹은 주 재료인 세포를 보관하는 것이 매우 중요한 실정이다.
기존의 동결보존제의 조성은 디메틸설폭사이드(Dimethyl sulfoxide; DMSO) 및 글리세롤(Glycerol) 등에 동물유래 물질인 우태아혈청 (Fetal Bovine Serum; FBS)을 혼합하며, 세포의 동결보존제로 오랫동안 사용되어져 왔고, 그 성능은 다수의 논문이 증명하였다. 그러나, 사람을 대상으로 사용하는 세포 치료제의 주 재료인 목적하는 세포의 동결보존에 생물학적 연구용으로 개발된 기존의 동결보존제의 조성을 그대로 가져다 쓰는 것은 안전성에 분명한 문제가 있다. 구체적으로, 디메틸설폭사이드가 줄기세포에서 분화를 유도할 수 있는 능력을 증명한 문헌이 존재하고, 동물유래 물질인 우태아혈청(FBS)의 체내 주입에 대한 영향을 심도 있게 진행한 임상 연구가 없다. 현재, 사용되고 있는 동결보존용 조성물은 동물유래 물질과 화학물질인 디메틸설폭사이드가 주를 이루며, 이와 같은 물질이 체내 주입 시에 어떠한 영향을 미치는 지 심도 있는 연구가 진행된 바는 없다. 이를 통해, 환자는 동결보존된 세포 혹은 이를 이용하여 제조된 세포 치료제가 과연 안전한가에 대한 의문을 가지는 것은 자명한 사실이다. 그에 따라, 기존에 사용되던 동결보존용 조성물에 대한 안전성 논란은 아직 진행형이며, 세포 치료제의 개발과 함께, 이러한 문제도 해결되어야 상용화 단계로 진입할 수 있을 것이라 기대한다.
특허문헌 1은, 줄기세포 초자화 동결보존액과 관련된 기술을 제안하였다.
보다 구체적으로, 특허문헌 1에 개시된 기술은 PBS(Phosphate buffered saline) 용액 중 0.2M 내지 0.4M의 수크로오스(Sucrose), 60 부피% 범위 내에서 40 부피% 초과의 에틸렌글리콜(Ethylene glycol) 및 10 부피% 내지 30 부피%의 폴리비닐피롤리돈(Polyvinylpyrrolidone)을 포함하는 동결보존 조성물이다.
그러나, 이와 같은 동결보존액은 일반적인 줄기세포에 사용되기 위하여 비환원성 이당류를 사용하고 있으므로, 모유두 유사 세포에 최적화된 동결보존 조성물에 대한 필요성이 여전한 실정이다.
특허문헌 1: 한국 공개특허문헌 제10-2012-0117209호(2012. 10. 24.)
본 발명은 상기와 같은 기술적 필요성에 의해 도출된 것으로, 모유두 유사 세포의 동결보존용 조성물 및 이를 이용한 동결보존하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
전술한 과제 해결을 위해, 본 발명은 에틸렌 글리콜, 레시틴, 인간 혈청 알부민 및 환원성 이당류를 포함하는, 모유두 유사 세포의 동결보존용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 환원성 이당류가 멜리비오스(Melibiose)인, 모유두 유사세포의 동결보존용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 에틸렌 글리콜 20%(v/v) 내지 50%(v/v), 상기 레시틴 0.5%(v/v) 내지 3%(v/v), 상기 인간 혈청 알부민 0.5%(v/v) 내지 3%(v/v) 및 환원성 이당류 10mM 내지 55mM로 포함하는, 모유두 유사 세포의 동결보존용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 모유두 유사 세포가 중간엽 줄기세포로부터 분화된 것인, 모유두 유사 세포의 동결보존용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 혈청 알부민이 재조합 인간 혈청 알부민인, 모유두 유사 세포의 동결보존용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 디메틸설폭사이드(Dimethyl sulfoxide; DMSO) 및 우태아혈청을 포함하지 않는, 모유두 유사 세포의 동결보존용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 분화된 모유두 유사 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 얻는 단계; 및 상기 세포 침전물과 본 발명에 따른 상기 동결보존용 조성물을 혼합하고 동결보존하는 단계;를 포함하는 모유두 유사 세포를 동결보존하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 동결보존하는 단계가 영하 180℃내지 200℃환경에서 수행되는 것인, 모유두 유사 세포를 동결보존하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 동결보존하는 방법이 세포의 단기 동결보존 생존율이 85% 이상인, 모유두 유사 세포를 동결보존하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 동결보존하는 단계는 앰플을 이용하는, 모유두 유사 세포를 동결보존하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 모유두 유사 세포의 동결보존용 조성물은 세포 치료제를 인체에 적용하는데 안정성이 우려될 수 있는 동물 유래 물질인 우태아혈청(Fetal bovine serum; FBS) 및 디메틸설폭사이드(Dimethyl sulfoxide; DMSO)를 사용하지 않음에도 불구하고, 동결보존 이후 해동시에 세포 생존율이 85% 이상을 유지할 수 있을 뿐만 아니라, 모유두 세포와 비교하여 고유한 항원의 발현율을 90% 이상 유지할 수 있도록 하는 효과를 가진다. 이에, 이와 같은 동결보존용 조성물을 이용하는 경우에는 인체에 무해하고, 세포 치료제의 유효성분에 해당하는 세포 자체를 안정적으로 장기간 보관하여 세포 치료제의 상용화에 매우 적합하게 사용될 수 있다.
첨부된 도면은 해당 기술 분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 기술적 사상이 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1의 A 및 B는, 본 발명의 실험예 1에서 CCK(Cell counting kit)를 이용하여, 모유두 유사 세포주(Dermal papilla-like cell)에서 농도에 따른 멜리비오스(Melibiose) 또는 라피노오스(Raffinose)의 독성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는, 본 발명의 실험예 2에서 제조예 1 내지 4를 이용하여 모유두 유사 세포주를 동결보존한 뒤, 해동하고 생 세포 수를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은, 본 발명의 실험예 3에서 제조예 1 내지 4를 이용하여 모유두 유사 세포주를 동결보존한 뒤, 해동하고 세포생존율을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4 내지 6은, 제조예 3(NCM 3)을 이용하여 지방유래 중간엽 줄기세포(p1), 모유두 세포(p3), 분화 직후인 모유두 유사 세포(p1), 동결보존한 뒤에 바로 해동된 모유두 유사 세포(p1) 및 동결보존한 뒤에 해동하고 3일 배양된 모유두 유사 세포(p2)에서 Corin(도 4), LEF-1(도 5) 및 Wnt5a(도 6)의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 실험예 5에서 비교예 1 내지 4를 이용하여 모유두 유사 세포주를 동결보존한 뒤, 해동하고 세포 생존율을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 따른 모유두 유사 세포의 동결보존용 조성물 및 이를 이용한 모유두 유사 세포를 동결보존하는 방법에 대하여 상세히 설명하나, 상기 모유두 유사 세포의 동결보존용 조성물 및 이를 이용한 모유두 유사 세포를 동결보존하는 방법의 범위가 하기 설명에 의해 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은 종래 세포 동결보존에 사용되던 동물 유래 물질인 우태아혈청 및 디메틸설폭사이드를 사용하지 않으면서, 인체에 무해하고 동결보존 후 해동시에도 세포 생존율 및 그 특성을 매우 효과적으로 유지할 수 있는 동결보존용 조성물을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 모유두 유사 세포의 동결보존용 조성물에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 동결보존용 조성물은 에틸렌 글리콜, 레시틴, 인간 혈청 알부민 및 환원성 이당류를 포함하는 모유두 유사 세포의 동결보존용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 동결보존용 조성물은 디메틸설폭사이드(Dimethyl sulfoxide; DMSO) 및 우태아혈청(Fetal bovine serum; FBS)을 포함하지 않는다. 이와 같이, 유해한 화학물질과, 타 동물로부터 유래된 단백질을 포함하지 않기 때문에 동결보존의 대상이 되는 세포를 세포 치료제로 안정성 있게 적용할 수 있다.
본 명세서상의 용어 "모유두 유사 세포(Dermal papilla cell-like cells)"라 함은, 줄기세포 예를 들면, 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 분화된 모유두 세포로서, 모유두 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 발현이 유사하거나, 그 기능이 유사한 세포를 의미한다. 진피 세포층에 존재하는 모유두 세포는 개체의 발생 단계부터 그 수가 결정되어 있고, 이를 두피로부터 분리해내기도 어려우며, 배양 조건이 까다로워 세포 치료제로 사용하기에 적합한 수로 증식시키는 것에도 한계점이 존재한다. 그러나, 지방 유래 줄기세포를 모유두 유사 세포로 분화시키는 경우에는 지방 유래 줄기세포를 얻기 쉬울 뿐만 아니라, 대량 배양이 가능하다는 장점이 존재한다.
본 명세서상의 용어 "동결보존"이라 함은, 세포주를 오랫동안 시험관 내에서 배양하는 경우 처음 상태와 비교하여 형태학적 및 생화학적 특징이 변화되는 것을 방지하고, 양호한 상태의 세포를 확보하기 위한 방편으로서, 영하 180℃내지 200℃ 환경, 바람직하게는 영하 196℃의 액체질소에서 세포를 보존하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 상기 동결보존용 조성물은 상기 동결보존 시에도 세포의 손상을 방지하고, 해동 후에도 형태학적 및 생화학적 특징을 유지시킬 수 있도록 보조하는 성분으로서, 동결 보존제, 동결 보호제, 동결보존액과 동일한 의미로 사용된다.
본 명세서상의 용어 "에틸렌 글리콜(Ethylene glycol)"이라 함은, C2H4(OH)2로 표시되는 2가 알코올 중 가장 간단한 형태의 화합물로서, 분자량이 낮고, 독성이 낮으며, 물에 대한 용해성이 높다는 등의 요건을 갖춘 물질에 해당한다. 이와 같이, 에틸렌 글리콜을 동결보존용 조성물에 사용하는 경우에는 2-메틸-2,4-펜탄디올(2-methyl-2,4-pentanediol)을 사용한 경우와 비교하여 동결보존 후 해동된 세포의 생존율 및 표현형적 특징을 매우 효과적으로 유지할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 에틸렌 글리콜은 20(v/v) 내지 50%(v/v)로 포함되는 것이 바람직하고, 30%(v/v)로 포함되는 것이 가장 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 에틸렌 글리콜의 함량이 20%(v/v) 미만으로 포함되는 경우에는 세포의 해동 후 생존율을 85% 이상으로 유지할 수 없고, 50%(v/v) 초과로 포함되는 경우에는 세포 독성이 발생될 수 있다.
본 명세서상의 용어 "레시틴(Lecithin)"이라 함은, 인산, 콜린, 지방산, 글리세롤, 당지질, 트라이글리세라이드, 인지질로 구성된 동식물 조직에서 발생되는 황갈빛의 지방 물질군을 의미한다.
본 발명에 따른 상기 레시틴은 0.5(v/v) 내지 3%(v/v)로 포함되는 것이 바람직하고, 1%(v/v)로 포함되는 것이 가장 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 레시틴이 0.5%(v/v) 이상 및 3%(v/v) 이하의 함량으로 포함되는 경우에는 냉각 쇼크 및 희석 효과의 충격을 매우 효과적으로 감소시킬 수 있다.
본 명세서상의 용어 "인간 혈청 알부민(Human Serum Albumin; rHSA)"이라 함은, 혈청에 다량으로 존재하는 단백질로서, 분자량 약 66,000의 가용성 구상 단백질에 해당한다. 이와 같은 단백질은 프레프로알부민으로부터 프로 알부민을 거쳐 생성되며, 혈청 알부민의 농도는 혈장이나 간질액의 침투압 조절에 큰 역할을 하고, 혈중의 난용성 물질과 결합하여 운반하는 역할을 할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 인간 혈청 알부민은 천연 사람 혈청 알부민으로부터 유래된 것일 수 있고, 유전자 조작 기술에 의해 재조합된 재조합 인간 혈청 알부민인 것일 수 있다. 구체적으로, 혈장 성분으로부터 단리 정제된 혈장 유래의 인간 혈청 알부민일 수 있고, 또는 유전자 재조합 기술에 의해 미생물, 동물 또는 식물세포를 사용하여 유전자 조작 기술을 통해 제작되어 단리 정제된 재조합 인간 혈청 알부민인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 인간 혈청 알부민은 혈액 공급의 한계점 및 바이러스 감염 등으로부터 자유로운 재조합 인간 혈청 알부민인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 인간 혈청 알부민은 0.5(v/v) 내지 3%(v/v)로 포함되는 것이 바람직하고, 1%(v/v)로 포함되는 것이 가장 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 인간 혈청 알부민의 함량이 0.5%(v/v) 미만으로 포함되는 경우에는 동결보존제로서의 효과가 발휘되도록 할 수 없고, 3%(v/v) 초과로 포함되는 경우에는 동결보존 시에 유해세균 번식 우려가 발생될 수 있다.
본 명세서상의 용어 "환원성 이당류"라 함은, 두 개의 환원당 중 하나의 단당류가 환원성 알데히드로 작용할 수 있는 유리 헤미아세탈 단위를 갖는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 상기 환원성 이당류는 갈락토스(Galactose), 포도당(Glucose)를 포함하는 멜리비오스(Melibiose)인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이와 같은 멜리비오스는 식물계에 널리 존재하는 물질로서, 체내에서 장내 미생물에 의해 쉽게 분해될 수 있다는 장점을 갖는다.
본 발명에 따른 상기 환원성 이당류는 10mM 내지 55mM로 포함되는 것이 바람직하고, 50mM로 포함되는 것이 가장 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 환원성 이당류의 함량이 10mM 미만인 경우에는 동결보존 효과가 충분히 발휘되지 않으며, 55mM 초과로 포함되는 경우에는 당의 점도가 높아져 해동 시에 세포가 충분히 분주될 수 없다.
본 발명에 따른 상기 동결보존용 조성물은 완충액을 더 포함할 수 있다. 상기 완충액은 헤페스(HEPES), HBSS(Hank's Balanced Salt Solution), EBSS (Earle's balanced salt solution), 트리신(Tricine), 트리스(tris), 테스(TES), 피페스(PIPES), 구연산 나트륨(Sodium Citrate), 아세트산 나트륨(Sodium Acetate), 인산 나트륨(Sodium phosphate), 소듐 β-글리세로포스페이트 (Sodium β-glycerophosphate), 트리에탄올아민(Triethylamine), 중탄산수소나트륨(Sodium Bicarbonate), 염화 나트륨(Sodium Chloride), 염화칼륨(Pottasium Chloride), 염화칼슘(Calcium Chloride), 인산완충생리식염수(Phosphate-buffered saline) 및 이들의 혼합물일 수 있고, 인산완충생리식염수인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 모유두 유사 세포를 동결보존하는 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 분화된 모유두 유사 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 얻는 단계; 및 상기 세포 침전물과 본 발명에 따른 상기 모유두 유사 세포의 동결보존용 조성물을 혼합하고 동결보존하는 단계;를 포함하는 모유두 유사 세포를 동결보존하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 동결보존하는 방법에서, 상기 동결보존하는 단계는 영하 180℃내지 200℃환경에서 수행되는 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 온도 범위를 벗어나는 경우에는 세포의 형태를 유지할 수 없고, 세균이 번식하는 등의 문제점이 발생될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 동결보존하는 방법은 세포의 단기 동결보존 생존율이 85% 이상인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 동결보존하는 방법에서, 상기 동결보존하는 단계는 앰플을 이용하는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1 내지 4. 동결보존 조성물의 제조
하기 표 1에 기재된 성분 및 용량으로 동결보존 조성물인 NCM(New Cryoprotective Mixture)를 제조하였다. 여기서, 각각의 성분에 대한 용매는 멸균된 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)를 사용하였다.
구분 물질명 용량(Volume; ㎖)
NCM 1
(제조예 1)		 에틸렌 글리콜(Ethylene glycol) 0.5
100mM 멜리비오스(Melibiose) 0.3
10% 재조합 인간 혈청 알부민(10% Recombinant Human Serum Albumin; rHSA) 0.1
10% 레시틴(Lecithin) 0.1
NCM 2
(제조예 2)		 2-메틸-2,4-펜탄디올
(2-methyl-2,4-pentanediol)		 0.5
100mM 멜리비오스 0.3
10% rHSA 0.1
10% 레시틴 0.1
NCM 3
(제조예 3)		 에틸렌 글리콜 0.3
100mM 멜리비오스 0.5
10% rHSA 0.1
10% 레시틴 0.1
NCM 4
(제조예 4)		 에틸렌 글리콜 0.4
100mM 멜리비오스 0.4
10% rHSA 0.1
10% 레시틴 0.1
1. 멜리비오스: 시그마알드리치, M5885
2. 레시틴: TCI, L0022
3. 재조합 인간 혈청 알부민: TCI, L0022
4. 에틸렌 글리콜: 시그마알드리치, 102466
5. 2-메틸-2,4-멘탄디올(헥실렌 글리콜): 시그마 알드리치, 76892
비교예 1 내지 4. 삼당류/비환원당을 이용한 동결 보존용 조성물의 제조
하기 표 2에 기재된 성분 및 용량으로 비교예 1 내지 4를 제조하였다. 여기서, 각각의 성분에 대한 용매는 멸균된 DPBS(0.1㎖)를 사용하였다.
구분 물질명 용량(Volume; ㎖)
비교예 1 30% 2-메틸-2,4-펜탄디올 0.3
30mM 라피노오스(Raffinose) 0.3
2% rHSA 0.2
1% 레시틴 0.1
비교예 2 15% 에틸렌 글리콜 0.15
15% 2-메틸-2,4-펜탄디올 0.15
30mM 라피노오스 0.3
2% rHSA 0.2
1% 레시틴 0.1
비교예 3 15% 프로필렌 글리콜 0.15
15% 2-메틸-2,4-펜탄디올 0.15
30mM 라피노오스 0.3
2% rHSA 0.2
1% 레시틴 0.1
비교예 4 15% 에틸렌 글리콜 0.15
15% 프로필렌 글리콜 0.15
30mM 라피노오스 0.3
2% rHSA 0.2
1% 레시틴 0.1
1. 라피노오스: 시그마알드리치, 0250
2. 레시틴: TCI, L0022
3. 재조합 인간 혈청 알부민: 시그마알드리치. 9511
4. 에틸렌 글리콜: 시그마알드리치, 102466
5. 2-메틸-2,4-멘탄디올(헥실렌 글리콜): 시그마알드리치, 76892
6. 프로필렌 글리콜: 시그마알드리치, 398039
실험예 1. 멜리비오스 및 라피노오스의 세포 독성 평가
지방 유래 줄기세포로부터 분화가 유도된 모유두 유사 세포주(Dermal papilla-like cell)를 96웰 플레이트에 5 Х 103 cells/㎖의 농도로 접종하고, 37℃ CO2 조건의 세포 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
그런 다음, 10mM, 30mM, 50mM, 70mM 또는 100mM 농도로 세포 배양배지인 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium)에 멜리비오스를 희석한 뒤, 상기 모유두 유사 세포주에 처리하고 24시간, 48시간 또는 72시간 동안 배양하였다. 이후, DMEM과 CCK-8(Cell Counting Kit-8) 시약을 9:1의 비율로 혼합한 혼합액을 상기 모유두 유사 세포주에 처리한 뒤에 ELISA 리더기를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하고, 세포 생존율을 도 1의 A에 나타내었다. 또한, 10mM, 30mM, 50mM, 70mM 또는 100mM 농도로 세포 배양 배지인 DMEM에 라피노오스를 희석하고, 멜리비오스와 동일한 방법으로 세포 생존율을 측정하여 그 결과를 도 1의 B에 나타내었다.
도 1의 A를 참조하면, 멜리비오스의 세포 독성 평가 결과 10mM, 30mM 및 50mM 농도의 멜리비오스에서는 세포 생존율이 90% 이상 유지되었으나, 70mM 농도 이상에서는 세포 생존율이 80% 이하로 감소되었다.
또한, 도 2의 B를 참조하면, 라피노오스의 세포 독성 평가 결과, 10mM뿐만 아니라, 100mM 모두에서 세포 생존율이 90% 이상 유지되었다.
상기 결과를 통해 멜리비오스의 경우 50mM 농도까지는 세포 독성을 나타내지 않고, 라피노오스의 경우 100mM에서까지 세포 독성을 나타내지 않는 것을 알 수 있다.
실험예 2. 세포주 해동 후, 총 세포 수 측정
상기 실험예 1. 에 기재된 바와 같이, 지방 유래 줄기세포로부터 분화가 유도된 모유두 유사 세포주를 1 Х 105 cells/㎖의 농도로 1 바이알에 분주하였다. 그런 다음, 상기 제조예 1 내지 4. 에서 제조된 NCM 1 내지 4, 또는 대조군(Control, FBS in 10% DMSO)을 이용하여 상기 모유두 유사 세포주를 동결보존하고, 영하 80℃ 초저온 냉동고(Deep freezer)에 24시간 동안 보관한 뒤, 영하 196℃ 액체질소 보관 용기에 3일 동안 보관하였다. 이후, 상기 보관된 바이알을 꺼내 해동한 뒤, 트립판 블루(Trypan blue) 용액을 넣고 혈구 계수기를 통해 생 세포 수를 측정하였다.
도 2를 참조하면, 대조군(Control)의 경우에는 77±2.8 Х 103 cells/㎖로 확인되었으며, NCM 1은 71±2.1 Х 103 celsl/㎖, NCM 2는 81±1.4 Х 103 cells/㎖, NCM 3은 86.5±0.7 Х 103 cells/㎖, 및 NCM 4는 78±2.8 Х 103 cells/㎖로 확인되었다.
상기 결과를 통해 NCM 3은 제조예 중에서도 가장 세포의 동결보존 성능이 우수하였으며, 기존에 사용되는 FBS가 포함된 DMSO를 이용한 경우와 비교하여도 그 동결보존 성능이 현저하게 우수한 것을 알 수 있다.
실험예 3. 세포주 해동 후, 세포 생존율 평가
상기 실험예 2. 와 동일한 방법으로 모유두 유사 세포주를 동결보존한지 3일째, 상기 세포주를 해동하고 96웰 플레이트에 5 Х 103 cells/100㎕의 농도로 접종하고, 37℃ 5% CO2 조건의 세포 배양기에서 3일 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 실험예 1.에 기재된 CCK-8 시약을 이용한 세포 증식 정도를 분석하였다.
도 3을 참조하면, 대조군(Control, FBS in 10% DMSO)에서 측정된 흡광도를 100.0%로 기준으로 할 때, NCM 1의 경우 65.20±0.62%, NCM 2의 경우 83.45±1.71%, NCM 3의 경우 90.99±0.36%, NCM 4의 경우 80.46±0.66%로 측정되었다.
상기 결과를 통해 NCM 3이 동결보존 과정에서 세포주에 미치는 영향이 가장 적으며, 생존율 및 총 세포수의 비율이 85% 이상이 충족되는 최적의 조건에 해당함을 알 수 있다.
실험예 4. 동결보존 후 세포 표현형 발현 분석
상기 실험예 3. 에서 최적의 조건에 해당하는 NCM 3를 이용하여, 상기 실험예 2.와 동일한 방법으로 모유두 유사 세포주를 동결보존하고, 3일 뒤에 해동하고, 해동 직후 또는 3일간 배양(2번 계대 배양, p2)한 뒤에 Corin, LEF-1 및 Wnt5a의 유전자의 발현 수준을 다음의 방법으로 확인하였다. 여기서, 대조군으로는 지방유래 중간엽 줄기세포(첫번째 컬럼)와, 3번 계대 배양된 모유두 세포주(두번째 컬럼) 및 분화 직후인 모유두 유사 세포주(1번 계대 배양, p1, 세번째 컬럼)를 사용하였다.
구체적으로, 배양된 모유두 유사 세포주를 0.05% 트립신/0.02% EDTA를 처리하여 세포주를 떼어낸 후, 2 Х 105 cells/㎖의 농도로 맞춘 세포주가 포함된 용액에 대하여 Fc 수용체 블로킹(blocking)을 수행하였다. 그런 다음, 고정화/투과 용액 키트(Fixation/Permeabilization solution kit, BDCytofix/Cytoperm?社)의 고정용액(Fixation solution)을 이용하여 세포주를 고정시키고, 삼투성 용액(Permeabilization solution)을 이용하여 모유두 세포주에 특이적 유전자인 LEF-1, Corin, Wnt5a 유전자를 각각 염색시켰다. 염색이 완료된 세포를 착색 용액(Staining solution)으로 세척하고, 새로운 착색 용액(Staining solution)으로 세포를 현탁시킨 뒤, 유세포 측정기(FACScalibur, BD science) 및 셀퀘스트(CELLQUEST software; BD science)를 이용하여 각각의 유전자의 발현 수준을 분석하였다.
도 4 내지 6을 참조하면, 지방유래 중간엽 줄기세포(p1)에서는 Corin 48.96%, LEF-1 30.97%, Wnt5a 38.94%의 항원 발현율을 나타내었고, 모유두 세포주(p3)의 발현율은 Corin 79.88%, LEF-1 79.81%, Wnt5a 97.15%를 나타내어 최대 2.5배까지 증가된 것을 확인하였다. 이를 통해, 상기 Corin, LEF-1 및 Wnt5a는 모유두 세포주에 특이적인 표지자로 신뢰성이 있는 것을 알 수 있다. 또한, 분화 직후인 모유두 유사 세포주(p1)에서 Corin 76.94%, LEF-1 82.64%, Wnt5a 95.82%의 항원 발현율을 나타낸 것을 통해, 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 분화된 모유두 유사 세포주는 모유두 세포와 유사한 수준의 표지자 항원의 발현 수준을 나타내는 것을 확인하였다.
또한, 해동 직후 모유두 유사 세포주(p1, 네번째 컬럼) 및 해동되고 3일 동안 배양된 모유두 유사 세포주(p2, 다섯번째 컬럼)에서는 각각 Corin 81.19%, LEF-1 91.62%, Wnt5a 99.57% 및 Corin 92.84%, LEF-1 94.43%, Wnt5a 94.61%의 항원 발현율을 나타내었다.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 동결보존 조성물을 이용하는 경우에는 동결보존을 한 경우에도 모유두 유사 세포주로 특성을 유지할 수 있을 뿐만 아니라, 동결보존 후 계대배양을 수행한 경우에도 그 특성을 매우 효과적으로 유지할 수 있음을 알 수 있다.
실험예 5. 비교예들의 세포주 해동 후, 세포 생존율 평가
상기 실험예 2. 와 동일한 방법으로 모유두 유사 세포주를 동결보존한지 3일째, 상기 세포주를 해동하고 96웰 플레이트에 5 Х 103 cells/100㎕의 농도로 접종하고, 37℃ 5% CO2 조건의 세포 배양기에서 4일 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 실험예 1. 에 기재된 CCK-8 시약을 이용한 세포 증식 정도를 분석하였다.
도 7을 참조하면, 대조군(Control, FBS in 10% DMSO)에서 측정된 흡광도를 100.0%로 기준으로 할 때, 비교예 1의 경우 72.8%, 비교예 2의 경우 61.8%, 비교예 3의 경우 58.2%, 비교예 4의 경우 60.9%로 측정되었다.
상기 결과를 통해 삼당류/비환원당인 라피노오스를 사용한 경우에는 아무리 조성물을 최적화한다고 하여도 본 발명에 따른 동결보존 조성물과 달리 세포 생존율이 최대 70%에 불과한 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 동결보존 조성물은 환원성 다당류, 예를 들면 멜리비오스를 사용함으로써 이를 사용하지 않는 다른 동결보존 조성물에 비하여 매우 높은 수준의 세포 생존율을 유지할 수 있음을 알 수 있다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 에틸렌 글리콜, 레시틴, 인간 혈청 알부민 및 환원성 이당류를 포함하는, 모유두 유사 세포의 동결보존용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 환원성 이당류는 멜리비오스(Melibiose)인, 모유두 유사세포의 동결보존용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 에틸렌 글리콜 20%(v/v) 내지 50%(v/v), 상기 레시틴 0.5%(v/v) 내지 3%(v/v), 상기 인간 혈청 알부민 0.5%(v/v) 내지 3%(v/v) 및 환원성 이당류 10mM 내지 55mM로 포함하는, 모유두 유사 세포의 동결보존용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 인간 혈청 알부민은 재조합 인간 혈청 알부민인, 모유두 유사 세포의 동결보존용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 모유두 유사 세포는 중간엽 줄기세포로부터 분화된 것인, 모유두 유사 세포의 동결보존용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 디메틸설폭사이드(DMSO) 및 우태아혈청을 포함하지 않는, 모유두 유사 세포의 동결보존용 조성물.
  7. 분화된 모유두 유사 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 얻는 단계; 및
    상기 세포 침전물과 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 동결보존용 조성물을 혼합하고 동결보존하는 단계;를 포함하는 모유두 유사 세포를 동결보존하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 동결보존하는 단계는 영하 180℃ 내지 200℃ 환경에서 수행되는 것인, 모유두 유사 세포를 동결보존하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 동결보존하는 방법은 세포의 단기 동결보존 생존율이 85% 이상인, 모유두 유사 세포를 동결보존하는 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 동결보존하는 단계는 앰플을 이용하는, 모유두 유사 세포를 동결보존하는 방법.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN109497044A (zh) * 2018-12-28 2019-03-22 深圳市昱杰生物科技有限公司 一种哺乳动物早期胚胎冻存液及冻存方法
WO2020161273A1 (en) * 2019-02-07 2020-08-13 Vitricell Sa Compositions for cryopreservation of a biological material

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120117209A (ko) 2011-04-14 2012-10-24 이효종 줄기세포 동결보존액 및 이를 이용하는 줄기세포 동결보존방법
CN109497044A (zh) * 2018-12-28 2019-03-22 深圳市昱杰生物科技有限公司 一种哺乳动物早期胚胎冻存液及冻存方法
WO2020161273A1 (en) * 2019-02-07 2020-08-13 Vitricell Sa Compositions for cryopreservation of a biological material

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