CN109964922A - 一种骨髓间充质干细胞冻存液及冻存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制剂技术领域，具体公开了一种骨髓间充质干细胞冻存液及冻存方法。所述的骨髓间充质干细胞冻存液，其包含如下重量份的组分：DMEM培养基80～100份；人血白蛋白注射液30～50份；DMSO 10～20份；人参提取物5～10份；芦荟提取物5～10份；青霉素0.1～1份。该干细胞冻存液是专门针对骨髓间充质干细胞而开发的；其可以显著提高骨髓间充质干细胞的冻存活率。

Description

一种骨髓间充质干细胞冻存液及冻存方法
技术领域
本发明所述的一种骨髓间充质干细胞冻存液及冻存方法；具体属于生物制剂技术领域。
背景技术
间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力；存在于如骨髓、脐带血和脐带、胎盘、脂肪等组织中。骨髓间充质干细胞是存在哺乳动物的骨髓基质中的一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群。间充质干细胞的临床研究已经在许多国家开展，随着间充质干细胞技术的日益成熟，我国也批准了多项临床试验。目前间充质干细胞主要应用于造血干细胞移植、组织损伤修复、自身免疫性疾病或作为基因治疗的载体。
骨髓间充质干细胞冻存是其保存的主要方法之，但现有的冻存液都是通用型的冻存液，缺乏专门骨髓间充质干细胞冻存液，这就会造成骨髓间充质干细胞冻存效果不好，尤其是长时间冻存。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种骨髓间充质干细胞冻存液；该细胞冻存液是专门针对骨髓间充质干细胞而开发的，对于骨髓间充质干细胞的冻存能显著提高骨髓间充质干细胞的细胞活率。
本发明所述的技术方案如下：
一种骨髓间充质干细胞冻存液，其特征在于，包含如下重量份的组分：DMEM培养基80～100份；人血白蛋白注射液30～50份；DMSO 10～20份；人参提取物5～10份；芦荟提取物5～10份；青霉素0.1～1份。
作为一种优选地方案，所述的骨髓间充质干细胞冻存液，包含如下重量份的组分：DMEM培养基90～100份；人血白蛋白注射液40～50份；DMSO 15～20份；人参提取物8～10份；芦荟提取物8～10份；青霉素0.1～0.5份。
作为一种最优选地方案，所述的骨髓间充质干细胞冻存液，其包含如下重量份的组分：DMEM培养基90份；人血白蛋白注射液40份；DMSO 15份；人参提取物8份；芦荟提取物8份；青霉素0.1份。
作为一种优选地方案，所述的人参提取物通过如下方法制备得到：
将人参加入到体积分数为50％～70％的乙醇水溶液中提取，得提取物；再将所述的提取物浓缩、干燥后即得所述的人参提取物；所述人参与乙醇水溶液的用量比为1g：5～10mL；
所述的芦荟提取物通过如下方法制备得到：
将芦荟加入到水中提取，得提取物；再将所述的提取物浓缩、干燥后即得所述的芦荟提取物；所述芦荟与水的用量比为1g：10～15mL。
作为一种最优选地方案，所述的人参提取物通过如下方法制备得到：
将人参加入到体积分数为60％的乙醇水溶液中提取，得提取物；再将所述的提取物浓缩、干燥后即得所述的人参提取物；所述人参与乙醇水溶液的用量比为1g：8mL；
所述的芦荟提取物通过如下方法制备得到：
将芦荟加入到水中提取，得提取物；再将所述的提取物浓缩、干燥后即得所述的芦荟提取物；所述芦荟与水的用量比为1g：12mL。
作为一种优选地方案，所述的提取为超声提取。
作为一种优选地方案，所述的干燥为冷冻干燥，所述的冷冻干燥方法为：将提取物浓缩至固含物为20％～40％，然后在1～5℃下预冷10～20min，接着在-30～-40℃下进行冷冻成固体；最后进行抽真空干燥即得。
作为一种最优选地方案，所述的冷冻干燥方法为：将提取物浓缩至固含物为30％，然后在3℃下预冷15min，接着在-35℃下进行冷冻成固体；最后进行抽真空干燥即得。
本发明还提供一种骨髓间充质干细胞的冻存方法，其包含如下步骤：将骨髓间充质干细胞放入上述骨髓间充质干细胞冻存液中，先在-20～-30℃下预冻2～3h；然后以2～4℃的温度降至-70～-80℃，继续预冻3～5h；预冻完成后转移至液氮中保存。
作为一种优选地方案，所述的骨髓间充质干细胞的冻存方法，其包含如下步骤：将骨髓间充质干细胞放入上述骨髓间充质干细胞冻存液中，先在-25℃下预冻2.5h；然后以3℃的温度降至-75℃，继续预冻4h；预冻完成后转移至液氮中保存。
作为一种优选地方案，髓间充质干细胞在冻存液中的密度为为1×105～1×108个/ml。
有益效果：本发明提供了一种全新配方的骨髓间充质干细胞冻存液，该配方是专门针对骨髓间充质干细胞而开发的；尤其是在配方中加入了人参提取物和芦荟提取物，可以显著提高细胞的活率，经试验表明，所述的骨髓间充质干细胞在本发明所述的冻存液中冻存2年，其细胞活率达95％以上；此外，本发明所述的细胞冻存液成分简单，原料便宜易得，可以降低骨髓间充质干细胞的冻存成本。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，然而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。
实施例1骨髓间充质干细胞的冻存方法
(1)配制骨髓间充质干细胞冻存液的制备
将DMEM培养基90份(重量份，下同)、人血白蛋白注射液40份、DMSO15份、人参提取物8份、芦荟提取物8份以及青霉素0.1份混合均匀即得所述的骨髓间充质干细胞冻存液；
所述的人参提取物通过如下方法制备得到：将人参加入到体积分数为60％的乙醇水溶液中进行超声提取，得提取物；再将所述的提取物浓缩至固含物为30(重量)％，然后在3℃下预冷15min，接着在-35℃下进行冷冻成固体；最后进行抽真空干燥即得所述的人参提取物；所述人参与乙醇水溶液的用量比为1g：8mL；
所述的芦荟提取物通过如下方法制备得到：
将芦荟加入到水中进行超声提取，得提取物；再将所述的提取物浓缩至固含物为30(重量)％，然后在3℃下预冷15min，接着在-35℃下进行冷冻成固体；最后进行抽真空干燥即得；所述芦荟与水的用量比为1g：12mL。
(2)骨髓间充质干细胞的冻存方法
将骨髓间充质干细胞放入上述骨髓间充质干细胞冻存液中，先在-25℃下预冻2.5h；然后以3℃的温度降至-75℃，继续预冻4h；预冻完成后转移至液氮中保存；所述髓间充质干细胞在冻存液中的密度为为1×106个/ml。
实施例2骨髓间充质干细胞的冻存方法
(1)配制骨髓间充质干细胞冻存液的制备
将DMEM培养基80份(重量份，下同)、人血白蛋白注射液50份、DMSO10份、人参提取物5份、芦荟提取物5份以及青霉素0.3份混合均匀即得所述的骨髓间充质干细胞冻存液；
所述的人参提取物通过如下方法制备得到：将人参加入到体积分数为50％的乙醇水溶液中进行超声提取，得提取物；再将所述的提取物浓缩至固含物为20(重量)％，然后在1℃下预冷10min，接着在-30℃下进行冷冻成固体；最后进行抽真空干燥即得所述的人参提取物；所述人参与乙醇水溶液的用量比为1g：10mL；
所述的芦荟提取物通过如下方法制备得到：
将芦荟加入到水中进行超声提取，得提取物；再将所述的提取物浓缩至固含物为20(重量)％，然后在1℃下预冷10min，接着在-30℃下进行冷冻成固体；最后进行抽真空干燥即得；所述芦荟与水的用量比为1g：10mL。
(2)骨髓间充质干细胞的冻存方法
将骨髓间充质干细胞放入上述骨髓间充质干细胞冻存液中，先在-20℃下预冻3h；然后以3℃的温度降至-80℃，继续预冻3h；预冻完成后转移至液氮中保存；所述髓间充质干细胞在冻存液中的密度为为1×106个/ml。
实施例3骨髓间充质干细胞的冻存方法
(1)配制骨髓间充质干细胞冻存液的制备
将DMEM培养基100份(重量份，下同)、人血白蛋白注射液30份、DMSO20份、人参提取物10份、芦荟提取物10份以及青霉素0.5份混合均匀即得所述的骨髓间充质干细胞冻存液；
所述的人参提取物通过如下方法制备得到：将人参加入到体积分数为70％的乙醇水溶液中进行超声提取，得提取物；再将所述的提取物浓缩至固含物为40(重量)％，然后在3℃下预冷15min，接着在-40℃下进行冷冻成固体；最后进行抽真空干燥即得所述的人参提取物；所述人参与乙醇水溶液的用量比为1g：5mL；
所述的芦荟提取物通过如下方法制备得到：
将芦荟加入到水中进行超声提取，得提取物；再将所述的提取物浓缩至固含物为40(重量)％，然后在3℃下预冷15min，接着在-40℃下进行冷冻成固体；最后进行抽真空干燥即得；所述芦荟与水的用量比为1g：15mL。
(2)骨髓间充质干细胞的冻存方法
将骨髓间充质干细胞放入上述骨髓间充质干细胞冻存液中，先在-30℃下预冻2h；然后以3℃的温度降至-70℃，继续预冻5h；预冻完成后转移至液氮中保存；所述髓间充质干细胞在冻存液中的密度为为1×106个/ml。
对比例1骨髓间充质干细胞的冻存方法
(1)配制骨髓间充质干细胞冻存液的制备
将DMEM培养基90份(重量份，下同)、人血白蛋白注射液40份、DMSO15份以及青霉素0.1份混合均匀即得所述的骨髓间充质干细胞冻存液；
(2)骨髓间充质干细胞的冻存方法
将骨髓间充质干细胞放入上述骨髓间充质干细胞冻存液中，先在-25℃下预冻2.5h；然后以3℃的温度降至-75℃，继续预冻4h；预冻完成后转移至液氮中保存；所述髓间充质干细胞在冻存液中的密度为为1×106个/ml。
对比例1与实施例1的区别在于骨髓间充质干细胞冻存液中不加入人参提取物和芦荟提取物。
对比例2骨髓间充质干细胞的冻存方法
(1)配制骨髓间充质干细胞冻存液的制备
将DMEM培养基90份(重量份，下同)、人血白蛋白注射液40份、DMSO15份、人参提取物8份以及青霉素0.1份混合均匀即得所述的骨髓间充质干细胞冻存液；
所述的人参提取物通过如下方法制备得到：将人参加入到体积分数为60％的乙醇水溶液中进行超声提取，得提取物；再将所述的提取物浓缩至固含物为30(重量)％，然后在3℃下预冷15min，接着在-35℃下进行冷冻成固体；最后进行抽真空干燥即得所述的人参提取物；所述人参与乙醇水溶液的用量比为1g：8mL；
(2)骨髓间充质干细胞的冻存方法
将骨髓间充质干细胞放入上述骨髓间充质干细胞冻存液中，先在-25℃下预冻2.5h；然后以3℃的温度降至-75℃，继续预冻4h；预冻完成后转移至液氮中保存；所述髓间充质干细胞在冻存液中的密度为为1×106个/ml。
对比例2与实施例1的区别在于骨髓间充质干细胞冻存液中不加入芦荟提取物。
对比例3骨髓间充质干细胞的冻存方法
(1)配制骨髓间充质干细胞冻存液的制备
将DMEM培养基90份(重量份，下同)、人血白蛋白注射液40份、DMSO15份、芦荟提取物8份以及青霉素0.1份混合均匀即得所述的骨髓间充质干细胞冻存液；
所述的芦荟提取物通过如下方法制备得到：
将芦荟加入到水中进行超声提取，得提取物；再将所述的提取物浓缩至固含物为30(重量)％，然后在3℃下预冷15min，接着在-35℃下进行冷冻成固体；最后进行抽真空干燥即得；所述芦荟与水的用量比为1g：12mL。
(2)骨髓间充质干细胞的冻存方法
将骨髓间充质干细胞放入上述骨髓间充质干细胞冻存液中，先在-25℃下预冻2.5h；然后以3℃的温度降至-75℃，继续预冻4h；预冻完成后转移至液氮中保存；所述髓间充质干细胞在冻存液中的密度为为1×106个/ml。
对比例3与实施例1的区别在于骨髓间充质干细胞冻存液中不加入人参提取物。
实施例4细胞活率实验
将骨髓间充质干细胞按实施例1～3以及对比例1～3所述的方法分别冻存2年后在37℃水浴复苏，采用台盼蓝经典染色法测试细胞活率；测试结果见表1。
表1.骨髓间充质干细胞细胞活率实验结果
表1数据显示，骨髓间充质干细胞在本发明所述的骨髓间充质干细胞冻存液中2年的细胞活率达95％以上，这说明本发明所述的骨髓间充质干细胞冻存液对骨髓间充质干细胞具有优异的冻存性能。
通过实施例1和对比例1的对比可以发现，骨髓间充质干细胞在实施例1所述的骨髓间充质干细胞冻存液中的细胞活率活率显著高于对比例1，这说明骨髓间充质干细胞冻存液中加入人参提取物和芦荟提取物可以大幅提高骨髓间充质干细胞的活率。
通过实施例1和对比例2和3的对比可以发现，骨髓间充质干细胞在实施例1所述的骨髓间充质干细胞冻存液中的细胞活率活率同样高于对比例2和3；这说明骨髓间充质干细胞冻存液中单独加入人参提取物或芦荟提取物对骨髓间充质干细胞的活率提高得不是很明显，同时加入人参提取物和芦荟提取物才能显著提高骨髓间充质干细胞的活率。

Claims (10)

1.一种骨髓间充质干细胞冻存液，其特征在于，包含如下重量份的组分：DMEM培养基80～100份；人血白蛋白注射液30～50份；DMSO 10～20份；人参提取物5～10份；芦荟提取物5～10份；青霉素0.1～1份。
2.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞冻存液，其特征在于，包含如下重量份的组分：DMEM培养基90～100份；人血白蛋白注射液40～50份；DMSO 15～20份；人参提取物8～10份；芦荟提取物8～10份；青霉素0.1～0.5份。
3.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞冻存液，其特征在于，包含如下重量份的组分：DMEM培养基90份；人血白蛋白注射液40份；DMSO 15份；人参提取物8份；芦荟提取物8份；青霉素0.1份。
4.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞冻存液，其特征在于，
所述的人参提取物通过如下方法制备得到：
将人参加入到体积分数为50％～70％的乙醇水溶液中提取，得提取物；再将所述的提取物浓缩、干燥后即得所述的人参提取物；所述人参与乙醇水溶液的用量比为1g：5～10mL；
所述的芦荟提取物通过如下方法制备得到：
将芦荟加入到水中提取，得提取物；再将所述的提取物浓缩、干燥后即得所述的芦荟提取物；所述芦荟与水的用量比为1g：10～15mL。
5.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞冻存液，其特征在于，
所述的人参提取物通过如下方法制备得到：
将人参加入到体积分数为60％的乙醇水溶液中提取，得提取物；再将所述的提取物浓缩、干燥后即得所述的人参提取物；所述人参与乙醇水溶液的用量比为1g：8mL；
所述的芦荟提取物通过如下方法制备得到：
将芦荟加入到水中提取，得提取物；再将所述的提取物浓缩、干燥后即得所述的芦荟提取物；所述芦荟与水的用量比为1g：12mL。
6.根据权利要求4所述的骨髓间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述的提取为超声提取；所述的干燥为冷冻干燥，所述的冷冻干燥方法为：将提取物浓缩至固含物为20％～40％，然后在1～5℃下预冷10～20min，接着在-30～-40℃下进行冷冻成固体；最后进行抽真空干燥即得。
7.根据权利要求6所述的骨髓间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述的干燥为冷冻干燥，所述的冷冻干燥方法为：将提取物浓缩至固含物为30％，然后在3℃下预冷15min，接着在-35℃下进行冷冻成固体；最后进行抽真空干燥即得。
8.一种骨髓间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，包含如下步骤：将骨髓间充质干细胞放入权利要求1～7任一项所述的骨髓间充质干细胞冻存液中，先在-20～-30℃下预冻2～3h；然后以2～4℃的温度降至-70～-80℃，继续预冻3～5h；预冻完成后转移至液氮中保存。
9.根据权利要求8所述的骨髓间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，包含如下步骤：将骨髓间充质干细胞放入权利要求1～7任一项所述的骨髓间充质干细胞冻存液中，先在-25℃下预冻2.5h；然后以3℃的温度降至-75℃，继续预冻4h；预冻完成后转移至液氮中保存。
10.根据权利要求8所述的骨髓间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，髓间充质干细胞在冻存液中的密度为为1×105～1×108个/ml。
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