CN109221089A - 一种脂肪组织的冻存液及脂肪组织冻存的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脂肪组织的冻存液及脂肪组织冻存的方法，冻存液包括1‑2mol/L的DMSO和0‑1mol/L的海藻糖，剩余加培养基，所述的培养基为DMEM，一种脂肪组织冻存的方法的步骤包括脂肪组织冻存前准备、脂肪组织交接和脂肪组织冻存，能够使脂肪组织在长达一年的储存时间内仍具有较高的活性，建立完善样本采集规范，延长脂肪保存时间，保证冻存的脂肪活性不会降低，提高使用灵活性，一次抽脂，多次使用，减轻患者的经济负担和医生劳动量。

Description

一种脂肪组织的冻存液及脂肪组织冻存的方法

【技术领域】

本发明涉及生物医药的技术领域，特别是一种脂肪组织的冻存液及脂肪组织冻存的方法的技术领域。

【背景技术】

脂肪组织由大量群集的脂肪细胞构成，聚集成团的脂肪细胞由薄层疏松结缔组织分隔成小叶。关节处的脂肪有缓冲肌肉运动的功能，在臂部及足底的脂助有支垫作用。

自体脂肪被称为液体黄金，是国际公认的最安全、最经济、最健康自然的填充材料，是面部及形体填充改善的“绝佳圣品”。

脂肪组织具有来源丰富、取材容易、操作简单、充盈外形好、无排异反应等优点，且自体脂肪组织相容性优于人工组织替代品，是一种非常理想的软组织凹陷填充材料，20世纪80年代吸脂术的出现，使得通过移植脂肪修复软组织凹陷变得流行起来。脂肪填充是指从人体自身如腰腹、臀部、大腿等脂肪含量较多的部位抽取多余皮下脂肪颗粒，采用脂肪分离装置——提纯、净化出高活性的完整脂肪细胞颗粒，将提取的活性脂肪细胞颗粒多层次、全方位、深入准确的注入需要改善的部位，例如面部、乳房、臀部等，术后不仅能使面部饱满年轻化，重塑形体曲线，更能达到极高的脂肪成活率，促使术区快速达到理想效果。

目前脂肪填充仍需要通过少量、多次的脂肪移植来达到使患者满意的填充效果。多次脂肪抽吸和注射一方面增加了医生的工作量和手术风险，另一方面也给患者带来了身心上的痛苦和经济上的负担。近年来人们对脂肪体外冷冻储存及再移植进行了一定的研究，通过对冷冻脂肪组织观察发现，其细胞能维持完整的形态，与正常细胞无明显差异。冷冻脂肪复温移植后能维持一定体积，组织学证实移植物内有完整的脂肪细胞因此。但是，现有的脂肪冻存技术存在脂肪组织保存时间不够长和活性较低的问题，因此本领域迫切需要开发新颖有效的且适合脂肪组织的冻存方法。

【发明内容】

本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种脂肪组织的冻存液及脂肪组织冻存的方法，脂肪组织冻存液对于脂肪组织冻存有良好的效果，能够使脂肪组织在长达一年的储存时间内仍具有较高的活性，建立完善样本采集规范，延长脂肪保存时间，保证冻存的脂肪活性不会降低，提高使用灵活性，一次抽脂，多次使用，减轻患者的经济负担和医生劳动量。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：

一种脂肪组织的冻存液，包括1-2mol/L的DMSO和0-1mol/L的海藻糖，剩余加培养基，所述的培养基为DMEM。

作为优选，包括1mol/L的DMSO和0.4mol/L的海藻糖，剩余加培养基，所述的培养基为DMEM。

一种脂肪组织冻存的方法，包括如下步骤：

S1.脂肪组织冻存前准备：

①实验室温度在15-30℃；

②实验室湿度在20-80％；

③洁净区与非洁净区的压差≥10Pa；

④实验开始前，空间及生物安全柜需在紫外和风机开启30min后进去。

S2脂肪组织交接：

①接收前准备一个托盘和离心管架，用75％酒精进行消毒后待用；

②实验室人员与运输人员交接，核对采集套装中的物品是否齐全且一致，并在确认无误后签字确认，所述的采集套装中的物品为采集登记表、脂肪采集瓶、母血管和封口膜；

③核对自体库脂肪、母血管及采集登记表上面外部码是否一致，如不一致，以采集登记表的外部码为准进行更换并记录；

④在采集登记表、脂肪采集瓶及母血管上面粘贴内部码；

⑤根据采集登记表信息完成《自体库脂肪接收登记表》；

⑥接收结束后，将母血管样本放到4℃冰箱保存，将脂肪、条码和采集登记表放置到传递窗；

⑦样本在采集后应在5-6h内运送到接收室。

S3.脂肪组织冻存；

①在制备档案上记录环境状况和脂肪信息；

②将脂肪采集瓶内的脂肪转移至无菌瓶中；

③在生物安全柜中将脂肪分装到50ml离心管中；

④使用生理盐水洗涤血渍，离心；

⑤弃掉上层的油性成分和下层的血细胞；

⑥吸取中间的脂肪组织转移到冻存管或冻存袋中；

⑦取一定量的冻存液在4℃的冰箱中预冷10min，冻存液与所取的脂肪组织的重量比为1:1；

⑧在冻存管或冻存袋中缓慢添加预冷的冻存液并充分混合，在4℃情况下平衡10min；

⑨采用程序降温盒或程序降温仪进行程序降温冻存后转入-80℃冰箱；

⑩送检客户血液以及样本菌检，待所有检测结果合格后，转入液氮保存直至冻存结束。

作为优选，所述冻存后的脂肪组织的复苏方法为开启电热恒温水浴锅，使水温保持在40℃，将冻存管或冻存袋从深低温冰箱取出，或者从液氮中转移至深低温冰箱后再取出，将冻存管或冷冻袋放入电热恒温水浴锅中，快速搅动使其尽快融化解冻，将解冻脂肪转移至50ml离心管中，缓慢添加预冷盐水至50ml离心管中，定容至40ml，离心，弃上清，添加生理盐水，重复一次洗涤。

作为优选，所述脂肪组织质控标准为血液检测无HBV、HCV、CMV、EBV、HIV、HTLV等污染，脂肪组织细菌检测、脂肪组织真菌检测和脂肪组织支原体检测结果均呈阴性，脂肪组织内毒素检测结果≤0.25EU/ml，DMSO含量检测结果≤10％，海藻糖≧15.2％。

本发明的有益效果：本发明提供一种脂肪组织冻存液，该脂肪组织冻存液对于脂肪组织冻存有良好的效果，能够使脂肪组织在长达一年的储存时间内仍具有较高的活性，并提供一种脂肪组织冻存的工艺，建立完善样本采集规范，延长脂肪保存时间，保证冻存的脂肪活性不会降低，提高使用灵活性，一次抽脂，多次使用，减轻患者的经济负担和医生劳动量。

本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。

【附图说明】

图1-a是采用冻存管进行冻存的脂肪组织冻存样本；

图1-b是采用冻存袋进行冻存的脂肪组织冻存样本；

图2-a是未冻存的脂肪组织提取脂肪干细胞的原代细胞状态图；

图2-b是冻存一年后的脂肪组织提取脂肪干细胞的原代细胞状态图；

图2-c是未冻存的脂肪组织提取脂肪干细胞培养第11天的细胞状态图；

图2-d是冻存一年后的脂肪组织提取脂肪干细胞培养第11天的细胞状态图；

图3-a是未冻存的脂肪组织提取脂肪干细胞的流式结果图；

图3-b是冻存一年后的脂肪组织提取脂肪干细胞的流式结果图。

【具体实施方式】

本发明一种脂肪组织的冻存液，包括1-2mol/L的DMSO和0-1mol/L的海藻糖，剩余加培养基，所述的培养基为DMEM。

一种脂肪组织冻存的方法包括如下步骤：

S1.脂肪组织冻存前准备：

①实验室温度在15-30℃；

②实验室湿度在20-80％；

③洁净区与非洁净区的压差≥10Pa；

④实验开始前，空间及生物安全柜需在紫外和风机开启30min后进去。

S2脂肪组织交接：

①接收前准备一个托盘和离心管架，用75％酒精进行消毒后待用；

②实验室人员与运输人员交接，核对采集套装中的物品是否齐全且一致，并在确认无误后签字确认，所述的采集套装中的物品为采集登记表、脂肪采集瓶、母血管和封口膜；

③核对自体库脂肪、母血管及采集登记表上面外部码是否一致，如不一致，以采集登记表的外部码为准进行更换并记录；

④在采集登记表、脂肪采集瓶及母血管上面粘贴内部码；

⑤根据采集登记表信息完成《自体库脂肪接收登记表》；

⑥接收结束后，将母血管样本放到4℃冰箱保存，将脂肪、条码和采集登记表放置到传递窗；

⑦样本在采集后应在5-6h内运送到接收室。

S3.脂肪组织冻存；

①在制备档案上记录环境状况和脂肪信息；

②将脂肪采集瓶内的脂肪转移至无菌瓶中；

③在生物安全柜中将脂肪分装到50ml离心管中；

④使用生理盐水洗涤血渍，离心；

⑤弃掉上层的油性成分和下层的血细胞；

⑥吸取中间的脂肪组织转移到冻存管或冻存袋中；

⑦取一定量的冻存液在4℃的冰箱中预冷10min，冻存液与所取的脂肪组织的重量比为1:1；

⑧在冻存管或冻存袋中缓慢添加预冷的冻存液并充分混合，在4℃情况下平衡10min；

⑨采用程序降温盒或程序降温仪进行程序降温冻存后转入-80℃冰箱；

⑩送检客户血液以及样本菌检，待所有检测结果合格后，转入液氮保存直至冻存结束。

实施例一：

制备冻存液，冻存液包括1mol/L的DMSO和0.4mol/L的海藻糖，剩余加DMEM培养基。按照采集规范，采集客户脂肪以及血液，冻存样本并送检。脂肪组织质控标准为血液检测无HBV、HCV、CMV、EBV、HIV、HTLV等污染，脂肪组织细菌检测、脂肪组织真菌检测和脂肪组织支原体检测结果均呈阴性，脂肪组织内毒素检测结果≤0.25EU/ml，DMSO含量检测结果≤10％，海藻糖≧15.2％。同时留取未冻存脂肪提取脂肪干细胞，培养并进行流式检测，脂肪组织冻存的方法同上，脂肪冻存样本如图1。取冻存一年的脂肪组织提取脂肪干细胞，培养并进行流式检测。冻存后的脂肪组织的复苏方法为开启电热恒温水浴锅，使水温保持在40℃，将冻存管或冻存袋从深低温冰箱取出，将冻存管或冷冻袋放入电热恒温水浴锅中，快速搅动使其尽快融化解冻，将解冻脂肪转移至50ml离心管中，缓慢添加预冷盐水至50ml离心管中，定容至40ml，离心，弃上清，添加生理盐水，重复一次洗涤。图2为未冻存脂肪组织提取脂肪干细胞以及冻存一年后脂肪组织提取脂肪干细胞的原代细胞和培养第11天的细胞的状态图，细胞状态良好，对比之下，冻存的脂肪组织原代细胞较少，未冻存脂肪组织细胞较多，但在同样培养11天后，细胞状态呈现梭形，有差别，但差别不大。图3为未冻存脂肪组织提取脂肪干细胞以及冻存一年后脂肪组织提取脂肪干细胞流式检测结果。

本发明提供一种脂肪组织冻存液，该脂肪组织冻存液对于脂肪组织冻存有良好的效果，能够使脂肪组织在长达一年的储存时间内仍具有较高的活性。其中的海藻糖又称漏芦糖和蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类。海藻糖是由两个葡萄糖分子以1，1-糖苷键构成的非还原性糖，有3种异构体即海藻糖(α，α)、异海藻糖(β，β)和新海藻糖(α，β)，并对多种生物活性物质具有非特异性保护作用。海藻糖在自然界中许多可食用动植物及微生物体内都广泛存在，如人们日常生活中食用的蘑菇类、海藻类、豆类、虾、面包、啤酒及酵母发酵食品中都有含量较高的海藻糖。海藻糖属于非渗透性冻存保护剂。二甲基亚砜(DMSO)是一种含硫有机化合物，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体。具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子和与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”。DMSO属于渗透性冻存保护剂。通过冻存液中两种冻存保护剂的协同作用，可保护脂肪细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。冻存保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成，同时冻存保护剂可以通过在脂肪细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低脂肪细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使脂肪细胞免受溶质的损伤。同时提供一种脂肪组织冻存的工艺，建立完善样本采集规范，延长脂肪保存时间，保证冻存的脂肪活性不会降低，提高使用灵活性，一次抽脂，多次使用，减轻患者的经济负担和医生劳动量。

上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种脂肪组织的冻存液，其特征在于：包括1-2mol/L的DMSO和0-1mol/L的海藻糖，剩余加培养基，所述的培养基为DMEM。

2.如权利要求1所述的一种脂肪组织的冻存液，其特征在于：包括1mol/L的DMSO和0.4mol/L的海藻糖，剩余加培养基，所述的培养基为DMEM。

3.一种脂肪组织冻存的方法，其特征在于包括如下步骤：

S1.脂肪组织冻存前准备：

①实验室温度在15-30℃；

②实验室湿度在20-80％；

③洁净区与非洁净区的压差≥10Pa；

④实验开始前，空间及生物安全柜需在紫外和风机开启30min后进去。

S2脂肪组织交接：

①接收前准备一个托盘和离心管架，用75％酒精进行消毒后待用；

②实验室人员与运输人员交接，核对采集套装中的物品是否齐全且一致，并在确认无误后签字确认，所述的采集套装中的物品为采集登记表、脂肪采集瓶、母血管和封口膜；

③核对自体库脂肪、母血管及采集登记表上面外部码是否一致，如不一致，以采集登记表的外部码为准进行更换并记录；

④在采集登记表、脂肪采集瓶及母血管上面粘贴内部码；

⑤根据采集登记表信息完成《自体库脂肪接收登记表》；

⑥接收结束后，将母血管样本放到4℃冰箱保存，将脂肪、条码和采集登记表放置到传递窗；

⑦样本在采集后应在5-6h内运送到接收室。

S3.脂肪组织冻存；

①在制备档案上记录环境状况和脂肪信息；

②将脂肪采集瓶内的脂肪转移至无菌瓶中；

③在生物安全柜中将脂肪分装到50ml离心管中；

④使用生理盐水洗涤血渍，离心；

⑤弃掉上层的油性成分和下层的血细胞；

⑥吸取中间的脂肪组织转移到冻存管或冻存袋中；

⑦取一定量的冻存液在4℃的冰箱中预冷10min，冻存液与所取的脂肪组织的重量比为1:1；

⑧在冻存管或冻存袋中缓慢添加预冷的冻存液并充分混合，在4℃情况下平衡10min；

⑨采用程序降温盒或程序降温仪进行程序降温冻存后转入-80℃冰箱；

⑩送检客户血液以及样本菌检，待所有检测结果合格后，转入液氮保存直至冻存结束。

4.如权利要求3所述的一种脂肪组织冻存的方法，其特征在于：所述冻存后的脂肪组织的复苏方法为开启电热恒温水浴锅，使水温保持在40℃，将冻存管或冻存袋从深低温冰箱取出，或者从液氮中转移至深低温冰箱后再取出，将冻存管或冷冻袋放入电热恒温水浴锅中，快速搅动使其尽快融化解冻，将解冻脂肪转移至50ml离心管中，缓慢添加预冷盐水至50ml离心管中，定容至40ml，离心，弃上清，添加生理盐水，重复一次洗涤。

5.如权利要求3所述的一种脂肪组织冻存的方法，其特征在于：所述脂肪组织质控标准为血液检测无HBV、HCV、CMV、EBV、HIV、HTLV等污染，脂肪组织细菌检测、脂肪组织真菌检测和脂肪组织支原体检测结果均呈阴性，脂肪组织内毒素检测结果≤0.25EU/ml，DMSO含量检测结果≤10％，海藻糖≧15.2％。