CN114558119A - 一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了皮肤创伤修复技术领域的一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，包括以下步骤：S1、脐带间充质干细胞上清液的收集；S2、胶原蛋白的提取；S3、胶原蛋白对角质形成细胞细胞毒性作用检测；S4、胶原蛋白和MSC‑CM对角质形成细胞划痕愈合作用评估；S5、胶原蛋白和MSC‑CM对小鼠活体皮肤伤口愈合疗效评估，本发明将脐带间充质干细胞上清液和胶原蛋白相结合来治疗皮肤伤口愈合；解决了现有手段由于单独使用脐带间充质干细胞上清液，无法将其长时间的固定于机体损伤部位，导致治疗效率偏低的问题。
Description
技术领域
本发明涉及皮肤创伤修复技术领域，具体为一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法。
背景技术
皮肤是动物机体最大的组织器官，约占机体表面积的70％，具有参与机体免疫反应，保护身体，排汗，感觉调节外界气温变化等功能。皮肤经常由于急性和慢性创伤而受损，这些创伤破坏了皮肤的屏障功能，严重者可导致患者死亡。皮肤创伤修复是一个非常复杂的过程，需要多种组织细胞的协调作用。目前临床上常用的治疗皮肤损伤修复的方法是常规清创缝合结合全身抗菌消炎治疗和自体皮肤移植结合抗菌消炎治疗。但是，目前的治疗方法存在治疗效率低、血管功能恢复差，容易形成疤痕等缺陷。
胶原蛋白是细胞外基质的重要组成部分，广泛存在于动物机体的皮肤、骨骼、肌腱以及软骨等处，是哺乳动物体内含量最多的蛋白质。胶原蛋白同时也是一种天然的生物材料，不仅具有独特的三螺旋结构、良好的生物相容性和可生物降解性，同时还具有低毒性、低免疫原性等优点，其在生物医用材料和高分子复合材料等方面的应用越来越备受关注。
间充质干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，由于其来源广泛，免疫原性低，易于获得等优点，已经成为临床疾病细胞治疗的首选细胞，并且在皮肤损伤修复中具有良好的应用前景。间充质干细胞通过其旁分泌机制促进肉芽组织形成、调节炎症、增加皮肤细胞增殖和迁移，抑制细胞凋亡等来促进皮肤再生。在间充质干细胞培养过程中，其向培养液中分泌的外泌体具有促进机体损伤修复的能力，因此，近些年来间充质干细胞外泌体作为一种新型的无细胞疗法在皮肤损伤修复中的应用逐渐受到广泛的关注。
目前，间充质干细胞上清液在皮肤伤口愈合治疗中的用途有，将上清液注射于皮肤伤口周围的正常组织和直接外敷于皮肤伤口处，这两种方法均有一定的局限性，很难达到理想的效果；在伤口面积较大时，注射上清液无法实现整个伤口的全覆盖，而外敷由于间充质干细胞上清液呈液体状，流动性较强，其在创面停留的时间短，很难发挥有效的作用。
基于此，本发明设计了一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，通过将其与胶原蛋白结合制作混合剂，既可有效增加上清液在伤口处的停留时间，也可发挥上清液中外泌体对伤口愈合的促进作用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，包括以下步骤：
S1、脐带间充质干细胞上清液的收集
首先准备2个10cm细胞培养皿，每个皿中按2x105个/mL的浓度，接种 6mL脐带间充质干细胞悬液，离心收集并培养上清液，将收集的上清液过滤后冷冻备用；
S2、胶原蛋白的提取
所用的胶原蛋白来源采用酸酶结合法提取得到；
S3、胶原蛋白对角质形成细胞细胞毒性作用检测
首先，取一新的96孔板，将不同的胶原蛋白样品接种于孔中，并进行培育处理；将培养皿中的细胞消化后计数，制备12mL细胞悬液，吹打混匀后接种于96孔板中，每孔100uL，于37℃培养箱中孵育；
然后，观察96孔板中每孔细胞汇合度达70％左右时，每孔加入10uL 5 mg/mL MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育4h；每孔加入100uL Formazan溶解液，用100uL移液枪适当吹打混匀，在细胞培养箱内继续孵育30分钟至紫色结晶溶解；使用酶标仪测定各组特定点的吸光度值，并通过软件进行数据分析；
S4、胶原蛋白和MSC-CM对角质形成细胞划痕愈合作用评估
整个试验分为4个组，即低浓度血清培养基组、胶原蛋白+低浓度血清培养基组、MSC-CM组、胶原蛋白+MSC-CM组；
首先在6孔板中相应的试验孔中按2ug/cm2的量进行胶原铺板，在37℃培养箱放置2h后进行细胞接种，制备4mL细胞悬液，接种于6孔板中的4 孔中，制作细胞划痕，加入MSC-CM及DMEM-F12培养基，并进行拍照，最后用image-j软件处理分析图片，即相应时间点的划痕面积，并计算划痕愈合率。
S5、胶原蛋白和MSC-CM对小鼠活体皮肤伤口愈合疗效评估
对胶原蛋白和脐带间充质干细胞上清液进行PH值中性调节，设置4个试验组，在小鼠背部制作全层皮肤伤口模型，在创口处敷实验组修复液，分别在治疗后第5d、10d、15d观察伤口愈合情况并拍照，图片继续使用image J 软件分析处理。
优选的，在步骤S1中，上清液收集获取的方式为：将接种的脐带间充质干细胞悬液24h后收集上清液于50mL离心管中，添加新的培养基，继续培养24h，期间细胞长满皿底消化传代后继续收集，连续收集7天。
优选的，在步骤S1中，收集的上清液使用0.22um过滤器进行过滤，放于负20℃冰箱冻存。
优选的，在步骤S2中，胶原蛋白从牛跟腱中提取得到，已经验证其完全符合I型胶原蛋白的相应特征。
优选的，在步骤S2中，胶原蛋白样品的培育方式为：待胶原蛋白液平铺于孔底后将96孔板放于37℃培养箱中孵育1h，用PBS清洗96孔板中铺有胶原蛋白的孔。
优选的，在步骤S3中，特定点为570nm处；最后将各组的吸光度值输入GraphPadprism软件中分析处理结果。
优选的，在步骤S4中，在制备细胞悬液前将10cm细胞培养皿中的细胞消化后计数，制备的悬液通过吹打混匀后平均接种于6孔板中的4孔中，保温培育。
优选的，在步骤S4中，制作细胞划痕前，待6孔板中每孔细胞汇合度接近100％时，于超净台中使用10uL枪头制作细胞划痕，每孔用PBS清洗2 遍后，分别向相应的试验孔中加入含3％FBS的MSC-CM及DMEM-F12培养基；使用倒置显微镜对细胞划痕进行拍照后，将6孔板放于37℃培养箱中，并在一定的时间内拍照观察并保存照片。
优选的，在步骤S5中，按10:7的比例将胶原蛋白和脐带间充质干细胞上清液混合，并使用NaOH溶液调节PH值至中性。
优选的，在步骤S5中，用4％水合氯醛按10mL/kg麻醉小鼠后，使用电推剪剃毛，再用手术刀刮毛，用镊子及眼科剪在背部制作直径为1cm全层皮肤伤口模型。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明将脐带间充质干细胞上清液和胶原蛋白相结合来治疗皮肤伤口愈合；
解决了现有手段由于单独使用脐带间充质干细胞上清液，无法将其长时间的固定于机体损伤部位，导致治疗效率偏低的问题，利用了较高浓度的胶原蛋白其黏附性较高的特性，可长时间保持于皮肤损伤部位，并且此种胶原蛋白对机体组织和脐带间充质干细胞都不会产生任何的不良反应，将两者结合使用可大幅度的提高治疗皮肤损伤修复的效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同胶原蛋白样品对角质形成细胞毒性作用；
图2为不同时间段角质形成细胞划痕愈合情况；
图3为6h、12h、24h和38h时角质形成细胞划痕愈合情况；
图4为不同时间段的小鼠皮肤伤口愈合情况；
图5为第5d、10d、15d时小鼠伤口愈合情况。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，包括以下具体实施的步骤：
S1、脐带间充质干细胞上清液的收集
首先准备2个10cm细胞培养皿，每个皿中按2x105个/mL的浓度，接种 6mL脐带间充质干细胞悬液，24h后收集上清液于50mL离心管中，添加新的培养基，继续培养24h后收集上清并换液，期间细胞长满皿底消化传代后继续收集，连续收集7天，将收集的上清液用0.22um过滤器过滤后放于负 20℃冰箱冻存备用。
S2、胶原蛋白的提取
本试验所用的胶原蛋白来源于本实验室采用酸酶结合法从牛跟腱中提取得到，已经验证其完全符合I型胶原蛋白的相应特征。
S3、胶原蛋白对角质形成细胞细胞毒性作用检测
取一新的96孔板，将不同的胶原蛋白样品接种于孔中，每种胶原样品5 个重复，每孔30uL，即2ug/cm2,连做3组，胶原蛋白液平铺于孔底后将96 孔板放于37℃培养箱中孵育1h；用PBS清洗96孔板中铺有胶原蛋白的孔，每孔50uL，连续清洗2遍。
将培养皿中的细胞消化后计数，制备12mL含有6x105个细胞的悬液，吹打混匀后接种于96孔板中，每孔100uL(共120孔，105孔用胶原蛋白铺板，15孔为对照)，于37℃培养箱中孵育60h后，取出96孔板(每孔细胞汇合度达70％左右)，每孔加入10uL 5mg/mL MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育4h。
每孔加入100uL Formazan溶解液，用100uL移液枪适当吹打混匀，在细胞培养箱内继续孵育30分钟至紫色结晶溶解，使用酶标仪在570nm处测吸光度值，最后将各组的吸光度值输入GraphPad prism软件中分析处理结果。
S4、胶原蛋白和MSC-CM对角质形成细胞划痕愈合作用评估
整个试验分为4个组，即低浓度血清培养基组、胶原蛋白+低浓度血清培养基组、MSC-CM组、胶原蛋白+MSC-CM组。
首先在6孔板中相应的试验孔中按2ug/cm2的量进行胶原铺板，在37℃培养箱放置2h后进行细胞接种。将细胞培养皿中的细胞消化后计数，制备4 mL含有4x106个细胞的悬液，吹打混匀后接种于6孔板中的4孔中，每孔1mL (共4个孔，即对照组、胶原组、MSC-CM组、胶原+MSC-CM组)，于37℃培养箱中孵育。
24h后取出6孔板(每孔细胞汇合度接近100％)，于超净台中使用10uL 枪头制作细胞划痕，每孔制作3条划痕，即3个重复，吸弃掉6孔板中的上清液，每孔用PBS洗3遍，每遍1mL；分别向相应的试验孔中加入MSC-CM 及DMEM-F12培养基(含3％FBS)。
使用倒置显微镜对细胞划痕进行拍照后，将6孔板放于37℃培养箱中，此时记录时间为0h。分别在规定时间内于显微镜下再次观察6孔板中细胞划痕的愈合情况并拍照保存，用image-j软件处理分析图片，即相应时间点的划痕面积，并计算划痕愈合率(划痕愈合率(％)＝(AO–At)/AO×100％，其中AO为初始划痕面积，At为相应时间点的划痕面积)。
S5、胶原蛋白和MSC-CM对小鼠活体皮肤伤口愈合疗效评估
按10:7的比例将浓度为0.5mg/mL的胶原蛋白和脐带间充质干细胞上清液混合，并使用NaOH溶液调节PH值至中性。将20只昆明小白鼠随机分为 4个不同的治疗组，每组5只：即A、自然恢复组(对照)B、MSC-CM组C、胶原蛋白组D、胶原蛋白+MSC-CM组。
用4％水合氯醛按10mL/kg麻醉小鼠后，使用电推剪剃毛，再用手术刀刮毛，确保小鼠背部相应部位无毛残留，用镊子及眼科剪在背部制作直径为1 cm全层皮肤伤口模型。
各组用生理盐水清创；A组为对照，小鼠创面不做处理；B组将MSC-CM 滴于创面处，使其流经创面的每一个部位；C组将胶原蛋白敷于伤口处，使其填充整个创面；D组将胶原+MSC-CM混合液敷于伤口处，使其填充整个创面。
每天更换两次胶原蛋白液及MSC-CM；分别在治疗后第5d、10d、15d 观察伤口愈合情况并拍照，图片继续使用image J软件分析处理。
伤口愈合率(％)＝(AO–At)/AO×100％，其中AO为初始伤口面积，At为伤口治疗后第5、10、15d的伤口区域面积。
(上述操作过程中用到的试剂以及生厂厂家有，FBS--hyclone、高糖 DMEM/12--GIBICO、胰酶--GIBICO、PBS--hyclone)
实验结果：
1.使用MTT细胞毒性试剂盒检测胶原蛋白对角质形成细胞的细胞毒性，结合图1可观察到，提取的几批胶原蛋白样品对角质形成细胞均无细胞毒性作用。
2.角质形成细胞划痕试验中，在6h、12h、24h和38h时，各组划痕愈合率依次为胶原+MSC-CM组＞胶原组＞MSC-CM组＞对照组，表明胶原蛋白和MSC-CM对细胞划痕愈合具有一定的促进作用，但不是特别明显(图2、图3、表1)。
3.小鼠活体伤口试验中，各实验组伤口愈合率分别为胶原+MSC-CM组＞胶原组＞MSC-CM组＞对照组(图4、表2)；在第15d时胶原+MSC-CM组和胶原组相比于对照组，伤口愈合情况均有一定的显著性存在(图5)； MSC-CM组可能由于流动性较强的缘故，其在伤口表面停留时间过短，很难发挥到有效的作用。
表1不同时间各重复组角质形成细胞划痕面积愈合率
表2不同时间各小鼠伤口面积愈合率
本试验将脐带间充质干细胞上清液和胶原蛋白相结合来治疗皮肤伤口愈合，胶原蛋白作为一种新型的天然生物材料，近些年来，在生物医疗方面广受关注；由于单独使用脐带间充质干细胞上清液，无法将其长时间的固定于机体损伤部位，导致治疗效率偏低，而较高浓度的胶原蛋白其黏附性较高，可长时间保持于皮肤损伤部位，并且此种胶原蛋白对机体组织和脐带间充质干细胞都不会产生任何的不良反应，将两者结合使用可大幅度的提高治疗皮肤损伤修复的效率。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
Claims (10)
1.一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、脐带间充质干细胞上清液的收集
首先准备2个10cm细胞培养皿，每个皿中按2x105个/mL的浓度，接种6mL脐带间充质干细胞悬液，离心收集并培养上清液，将收集的上清液过滤后冷冻备用；
S2、胶原蛋白的提取
所用的胶原蛋白来源采用酸酶结合法提取得到；
S3、胶原蛋白对角质形成细胞细胞毒性作用检测
首先，取一新的96孔板，将不同的胶原蛋白样品接种于孔中，并进行培育处理；将培养皿中的细胞消化后计数，制备12mL细胞悬液，吹打混匀后接种于96孔板中，每孔100uL，于37℃培养箱中孵育；
然后，观察96孔板中每孔细胞汇合度达70％左右时，每孔加入10uL 5mg/mL MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育4h；每孔加入100uL Formazan溶解液，用100uL移液枪适当吹打混匀，在细胞培养箱内继续孵育30分钟至紫色结晶溶解；使用酶标仪测定各组特定点的吸光度值，并通过软件进行数据分析；
S4、胶原蛋白和MSC-CM对角质形成细胞划痕愈合作用评估
整个试验分为4个组，即低浓度血清培养基组、胶原蛋白+低浓度血清培养基组、MSC-CM组、胶原蛋白+MSC-CM组；
首先在6孔板中相应的试验孔中按2ug/cm2的量进行胶原铺板，在37℃培养箱放置2h后进行细胞接种，制备4mL细胞悬液，接种于6孔板中的4孔中，制作细胞划痕，加入MSC-CM及DMEM-F12培养基，并进行拍照，最后用image-j软件处理分析图片，即相应时间点的划痕面积，并计算划痕愈合率。
S5、胶原蛋白和MSC-CM对小鼠活体皮肤伤口愈合疗效评估
对胶原蛋白和脐带间充质干细胞上清液进行PH值中性调节，设置4个试验组，在小鼠背部制作全层皮肤伤口模型，在创口处敷实验组修复液，分别在治疗后第5d、10d、15d观察伤口愈合情况并拍照，图片继续使用image J软件分析处理。
2.根据权利要求1所述的一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，其特征在于：在步骤S1中，上清液收集获取的方式为：将接种的脐带间充质干细胞悬液24h后收集上清液于50mL离心管中，添加新的培养基，继续培养24h，期间细胞长满皿底消化传代后继续收集，连续收集7天。
3.根据权利要求1所述的一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，其特征在于：在步骤S1中，收集的上清液使用0.22um过滤器进行过滤，放于负20℃冰箱冻存。
4.根据权利要求1所述的一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，其特征在于：在步骤S2中，胶原蛋白从牛跟腱中提取得到，已经验证其完全符合I型胶原蛋白的相应特征。
5.根据权利要求1所述的一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，其特征在于：在步骤S2中，胶原蛋白样品的培育方式为：待胶原蛋白液平铺于孔底后将96孔板放于37℃培养箱中孵育1h，用PBS清洗96孔板中铺有胶原蛋白的孔。
6.根据权利要求1所述的一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，其特征在于：在步骤S3中，特定点为570nm处；最后将各组的吸光度值输入GraphPad prism软件中分析处理结果。
7.根据权利要求1所述的一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，其特征在于：在步骤S4中，在制备细胞悬液前将10cm细胞培养皿中的细胞消化后计数，制备的悬液通过吹打混匀后平均接种于6孔板中的4孔中，保温培育。
8.根据权利要求1所述的一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，其特征在于：在步骤S4中，制作细胞划痕前，待6孔板中每孔细胞汇合度接近100％时，于超净台中使用10uL枪头制作细胞划痕，每孔用PBS清洗2遍后，分别向相应的试验孔中加入含3％FBS的MSC-CM及DMEM-F12培养基；使用倒置显微镜对细胞划痕进行拍照后，将6孔板放于37℃培养箱中，并在一定的时间内拍照观察并保存照片。
9.根据权利要求1所述的一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，其特征在于：在步骤S5中，按10:7的比例将胶原蛋白和脐带间充质干细胞上清液混合，并使用NaOH溶液调节PH值至中性。
10.根据权利要求1所述的一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，其特征在于：在步骤S5中，用4％水合氯醛按10mL/kg麻醉小鼠后，使用电推剪剃毛，再用手术刀刮毛，用镊子及眼科剪在背部制作直径为1cm全层皮肤伤口模型。
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