CN105412990A - 一种川续断皂苷壳聚糖促进骨粉聚乳酸相融合骨料支架的制备方法 - Google Patents

一种川续断皂苷壳聚糖促进骨粉聚乳酸相融合骨料支架的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种川续断皂苷壳聚糖促进骨粉聚乳酸相融合骨料支架的制备方法，属于生物材料制备领域。针对聚乳酸骨料本身缺乏活性的功能团，不易与细胞发生特异性相互作用的识别信号，不利于细胞在材料表面的黏附、增殖以及分化，通过骨粉复合时，与人体产生排异反应的问题，通过将猪骨脱脂脱蛋白处理与川续断皂苷混合制备改性骨粉，随后在壳聚糖包裹作用下，与聚乳酸材料复合，制备一种川续断皂苷壳聚糖促进骨粉聚乳酸相融合骨料支架，改善其与细胞的亲和性，满足细胞在材料上的吸附、增殖及分化的生物学要求，通过天然壳聚糖和川续断皂苷制备骨料支架，绿色环保无污染。

Description

一种川续断皂苷壳聚糖促进骨粉聚乳酸相融合骨料支架的制备方法
技术领域
本发明涉及一种川续断皂苷壳聚糖促进骨粉聚乳酸相融合骨料支架的制备方法，属于生物材料制备领域。
背景技术
聚乳酸具有良好的生物相容性、降解性和力学强度等性能，在生物医用材料领域中广泛应用。但是由于其本身亲水性差、降解的酸性产物在使机体产成炎症、降解的速率不容易掌控，尤为突出的缺点是聚乳酸缺乏活性的功能团，不易与细胞发生特异性相互作用的识别信号，不利于细胞在材料表面的黏附、增殖以及分化，限制了聚乳酸在生物医学工程中的应用范围。骨粉，顾名思义是生物衍生骨的粉末状态，被认为是成骨诱导能力最佳的生物衍生骨存在形式，对于细胞与移植物之间，骨粉有着较大的表面积。羟基憐灰石是脱韩骨粉的主要成分，具有良好的生物相容性和骨传导作用，可引导骨的生长，并与骨组织牢固结合，是公认性能良好的骨修复代替材料，但是由于其制作困难、手术后缺乏稳定性等问题限制了骨粉的临床应用。
川续断皂苷能控制分化的成骨细胞进一步成骨，控制分化成骨细胞的成骨速率，具有明显地促成骨分化作用，可诱导人骨髓间充质干细胞表达碱性磷酸酶和骨钙素，并形成成骨细胞所特有的钙化结节，其机制主要与上调成骨相关基因和成骨相关蛋白的表达有关。本研究也已经证明，川续断皂苷可促进向成骨细胞分化，通过壳聚糖与人体优良的适应性，提高骨粉聚乳酸相融合骨料支架在人体中的作用，在不产生人体排异反应的同时，促进成骨发育。
发明内容
本发明所要解决的技术问题：针对聚乳酸骨料本身缺乏活性的功能团，不易与细胞发生特异性相互作用的识别信号，不利于细胞在材料表面的黏附、增殖以及分化，通过骨粉复合时，与人体产生排异反应的问题，提供了一种通过将猪骨脱脂脱蛋白处理与川续断皂苷混合制备改性骨粉，随后在壳聚糖包裹作用下，与聚乳酸材料复合，制备一种川续断皂苷壳聚糖促进骨粉聚乳酸相融合骨料支架，提高其骨料支架在人体中的适应性。
为解决上述技术问题，本发明采用如下所述的技术方案是：
（1）取新鲜猪骨，对其剔除骨膜和表面软组织，用40～50℃温水洗涤3～5次，除去骨髓和血性成分，随后将其切割制备得0.5cm3的骨头小块，随后将其置于甲醇和丙酮按质量比1:1的混合溶液中，在20～30℃下，对其浸泡处理，每隔6～8h后换液一次，使其脱脂处理48h；
（2）待脱脂完成后，用质量浓度为10%的过氧化氢溶液浸泡脱蛋白处理22～24h，随后每隔8h换液一次，待脱蛋白完成后，将骨块取出并用蒸馏水洗涤3～5次，随后将其置于60～80℃下干燥6～8h；
（3）待干燥完成后，对其碾磨并过筛处理，制备得60～80目的颗粒骨料，随后再在球磨机中，采用无水乙醇为湿磨剂进行湿磨处理2～3h，随后对其过滤并收集滤渣，将其置于80～100℃下干燥3～4h，并将其置于紫外灯下灭菌处理1～2h，制备得脱脂脱蛋白骨粉备用；
（4）按重量份数计，选取5～35份壳聚糖粉末、15～30份质量分数为36％的乙酸溶液、30～40份的液体石蜡和20～25份的失水山梨糖醇脂肪酸酯混合配制形成乳化剂，随后缓慢滴加0.8mol/L的NaOH溶液调节pH至8～10，加热升温至60℃反应2～3h，待反应完成后，对其抽滤并收集滤饼，分别用石油醚和丙酮在索式抽提器中抽提20～24h后，取出滤饼在50℃下真空干燥20～30min，制备得壳聚糖微小球；
（5）按0.01mol/L的浓度，将川续断皂苷添加至100mL的无水乙醇中，搅拌混合10～15min后，制备得川续断皂苷乙醇溶液中，随后将10g步骤（3）制备的脱脂脱蛋白骨粉加入至川续断皂苷乙醇溶液中，在200～300W的超声分散10～15min，并在30～40℃下干燥3～4h，制备得改性骨粉；
（6）按固液质量比1:10，将聚乳酸颗粒溶解至乙酸乙酯中，随后将其置于55～60℃下磁力搅拌25～30min，制备得10%的聚乳酸溶液，随后再按固液质量比1:5，将上述制备的改性骨粉添加至上述制备的聚乳酸溶液中，随后在300～400r/min下，搅拌混合至骨粉颗粒呈凝胶状；
（7）待叫搅拌完成后，将其置于铺满步骤（4）制备的壳聚糖微小球模具中，在1200～1500r/min下离心10～15min，随后对其真空干燥20～24h，并将其切成1mm的骨料支架，随后将其置于环己烷溶液中，气浴振荡72h，每隔12h换液一次，随后将其置于40～50℃烘箱中干燥6～8h，即可制备得一种川续断皂苷壳聚糖促进骨粉聚乳酸相融合骨料支架。
本发明的应用方法为：用钛质钢尺放置于患肢旁用于标记，经X线、MRI检查确定病灶范围，根据受伤部位选取合适入路盐水纱垫保护周围软组织，随后凿除合适骨窗，充分显露手术区域，反复冲洗干净后，内壁用磨钻再次清理病灶至影像学显示范围以外1～2cm，电刀烧灼囊腔壁1或2遍。根据人体体表面积计算图及囊腔的大小给予50～100mg/m2川续断皂苷壳聚糖促进骨粉聚乳酸相融合骨料支架，必要时取适量自体髂骨移植，充分填塞囊腔，根据情况决定内固定或者非内固定。待手术完成后，常规换药，预防性使用抗生素3～5d，上肢尽量早期功能锻炼，下肢1～2个月后拄拐不负重步行。
本发明与其他方法相比，有益技术效果是：
（1）本发明制备的骨料支架，改善其与细胞的亲和性，满足细胞在材料上的吸附、增殖及分化的生物学要求；
（2）通过天然壳聚糖和川续断皂苷制备骨料支架，绿色环保无污染。
具体实施方式
首先取新鲜猪骨，对其剔除骨膜和表面软组织，用40～50℃温水洗涤3～5次，除去骨髓和血性成分，随后将其切割制备得0.5cm3的骨头小块，随后将其置于甲醇和丙酮按质量比1:1的混合溶液中，在20～30℃下，对其浸泡处理，每隔6～8h后换液一次，使其脱脂处理48h；待脱脂完成后，用质量浓度为10%的过氧化氢溶液浸泡脱蛋白处理22～24h，随后每隔8h换液一次，待脱蛋白完成后，将骨块取出并用蒸馏水洗涤3～5次，随后将其置于60～80℃下干燥6～8h；待干燥完成后，对其碾磨并过筛处理，制备得60～80目的颗粒骨料，随后再在球磨机中，采用无水乙醇为湿磨剂进行湿磨处理2～3h，随后对其过滤并收集滤渣，将其置于80～100℃下干燥3～4h，并将其置于紫外灯下灭菌处理1～2h，制备得脱脂脱蛋白骨粉备用；按重量份数计，选取5～35份壳聚糖粉末、15～30份质量分数为36％的乙酸溶液、30～40份的液体石蜡和20～25份的失水山梨糖醇脂肪酸酯混合配制形成乳化剂，随后缓慢滴加0.8mol/L的NaOH溶液调节pH至8～10，加热升温至60℃反应2～3h，待反应完成后，对其抽滤并收集滤饼，分别用石油醚和丙酮在索式抽提器中抽提20～24h后，取出滤饼在50℃下真空干燥20～30min，制备得壳聚糖微小球；按0.01mol/L的浓度，将川续断皂苷添加至100mL的无水乙醇中，搅拌混合10～15min后，制备得川续断皂苷乙醇溶液中，随后将10g制备的脱脂脱蛋白骨粉加入至川续断皂苷乙醇溶液中，在200～300W的超声分散10～15min，并在30～40℃下干燥3～4h，制备得改性骨粉；按固液质量比1:10，将聚乳酸颗粒溶解至乙酸乙酯中，随后将其置于55～60℃下磁力搅拌25～30min，制备得10%的聚乳酸溶液，随后再按固液质量比1:5，将上述制备的改性骨粉添加至上述制备的聚乳酸溶液中，随后在300～400r/min下，搅拌混合至骨粉颗粒呈凝胶状；待叫搅拌完成后，将其置于铺满制备的壳聚糖微小球模具中，在1200～1500r/min下离心10～15min，随后对其真空干燥20～24h，并将其切成1mm的骨料支架，随后将其置于环己烷溶液中，气浴振荡72h，每隔12h换液一次，随后将其置于40～50℃烘箱中干燥6～8h，即可制备得一种川续断皂苷壳聚糖促进骨粉聚乳酸相融合骨料支架。
实例1
首先取新鲜猪骨，对其剔除骨膜和表面软组织，用40℃温水洗涤3次，除去骨髓和血性成分，随后将其切割制备得0.5cm3的骨头小块，随后将其置于甲醇和丙酮按质量比1:1的混合溶液中，在20℃下，对其浸泡处理，每隔6h后换液一次，使其脱脂处理48h；待脱脂完成后，用质量浓度为10%的过氧化氢溶液浸泡脱蛋白处理22h，随后每隔8h换液一次，待脱蛋白完成后，将骨块取出并用蒸馏水洗涤3次，随后将其置于60℃下干燥6h；待干燥完成后，对其碾磨并过筛处理，制备得60目的颗粒骨料，随后再在球磨机中，采用无水乙醇为湿磨剂进行湿磨处理2h，随后对其过滤并收集滤渣，将其置于80℃下干燥3h，并将其置于紫外灯下灭菌处理1h，制备得脱脂脱蛋白骨粉备用；按重量份数计，选取5份壳聚糖粉末、30份质量分数为36％的乙酸溶液、40份的液体石蜡和25份的失水山梨糖醇脂肪酸酯混合配制形成乳化剂，随后缓慢滴加0.8mol/L的NaOH溶液调节pH至8～10，加热升温至60℃反应2h，待反应完成后，对其抽滤并收集滤饼，分别用石油醚和丙酮在索式抽提器中抽提20h后，取出滤饼在50℃下真空干燥20min，制备得壳聚糖微小球；按0.01mol/L的浓度，将川续断皂苷添加至100mL的无水乙醇中，搅拌混合10min后，制备得川续断皂苷乙醇溶液中，随后将10g制备的脱脂脱蛋白骨粉加入至川续断皂苷乙醇溶液中，在200W的超声分散10min，并在30℃下干燥3h，制备得改性骨粉；按固液质量比1:10，将聚乳酸颗粒溶解至乙酸乙酯中，随后将其置于55℃下磁力搅拌25min，制备得10%的聚乳酸溶液，随后再按固液质量比1:5，将上述制备的改性骨粉添加至上述制备的聚乳酸溶液中，随后在300r/min下，搅拌混合至骨粉颗粒呈凝胶状；待叫搅拌完成后，将其置于铺满制备的壳聚糖微小球模具中，在1200r/min下离心10min，随后对其真空干燥20h，并将其切成1mm的骨料支架，随后将其置于环己烷溶液中，气浴振荡72h，每隔12h换液一次，随后将其置于40℃烘箱中干燥6h，即可制备得一种川续断皂苷壳聚糖促进骨粉聚乳酸相融合骨料支架。
用钛质钢尺放置于患肢旁用于标记，经X线、MRI检查确定病灶范围，根据受伤部位选取合适入路盐水纱垫保护周围软组织，随后凿除合适骨窗，充分显露手术区域，反复冲洗干净后，内壁用磨钻再次清理病灶至影像学显示范围以外1cm，电刀烧灼囊腔壁。根据人体体表面积计算图及囊腔的大小给予50mg/m2川续断皂苷壳聚糖促进骨粉聚乳酸相融合骨料支架，必要时取适量自体髂骨移植，充分填塞囊腔，根据情况决定内固定或者非内固定。待手术完成后，常规换药，预防性使用抗生素3d，上肢尽量早期功能锻炼，下肢1个月后拄拐不负重步行。
实例2
首先取新鲜猪骨，对其剔除骨膜和表面软组织，用45℃温水洗涤4次，除去骨髓和血性成分，随后将其切割制备得0.5cm3的骨头小块，随后将其置于甲醇和丙酮按质量比1:1的混合溶液中，在25℃下，对其浸泡处理，每隔7h后换液一次，使其脱脂处理48h；待脱脂完成后，用质量浓度为10%的过氧化氢溶液浸泡脱蛋白处理23h，随后每隔8h换液一次，待脱蛋白完成后，将骨块取出并用蒸馏水洗涤4次，随后将其置于70℃下干燥7h；待干燥完成后，对其碾磨并过筛处理，制备得70目的颗粒骨料，随后再在球磨机中，采用无水乙醇为湿磨剂进行湿磨处理2.5h，随后对其过滤并收集滤渣，将其置于90℃下干燥3.5h，并将其置于紫外灯下灭菌处理1.5h，制备得脱脂脱蛋白骨粉备用；按重量份数计，选取20份壳聚糖粉末、20份质量分数为36％的乙酸溶液、35份的液体石蜡和25份的失水山梨糖醇脂肪酸酯混合配制形成乳化剂，随后缓慢滴加0.8mol/L的NaOH溶液调节pH至9，加热升温至60℃反应2.5h，待反应完成后，对其抽滤并收集滤饼，分别用石油醚和丙酮在索式抽提器中抽提22h后，取出滤饼在50℃下真空干燥25min，制备得壳聚糖微小球；按0.01mol/L的浓度，将川续断皂苷添加至100mL的无水乙醇中，搅拌混合12min后，制备得川续断皂苷乙醇溶液中，随后将10g制备的脱脂脱蛋白骨粉加入至川续断皂苷乙醇溶液中，在250W的超声分散12min，并在35℃下干燥3.5h，制备得改性骨粉；按固液质量比1:10，将聚乳酸颗粒溶解至乙酸乙酯中，随后将其置于57℃下磁力搅拌27min，制备得10%的聚乳酸溶液，随后再按固液质量比1:5，将上述制备的改性骨粉添加至上述制备的聚乳酸溶液中，随后在350r/min下，搅拌混合至骨粉颗粒呈凝胶状；待叫搅拌完成后，将其置于铺满制备的壳聚糖微小球模具中，在1350r/min下离心12min，随后对其真空干燥22h，并将其切成1mm的骨料支架，随后将其置于环己烷溶液中，气浴振荡72h，每隔12h换液一次，随后将其置于45℃烘箱中干燥7h，即可制备得一种川续断皂苷壳聚糖促进骨粉聚乳酸相融合骨料支架。
用钛质钢尺放置于患肢旁用于标记，经X线、MRI检查确定病灶范围，根据受伤部位选取合适入路盐水纱垫保护周围软组织，随后凿除合适骨窗，充分显露手术区域，反复冲洗干净后，内壁用磨钻再次清理病灶至影像学显示范围以外1.5cm，电刀烧灼囊腔壁。根据人体体表面积计算图及囊腔的大小给予80mg/m2川续断皂苷壳聚糖促进骨粉聚乳酸相融合骨料支架，必要时取适量自体髂骨移植，充分填塞囊腔，根据情况决定内固定或者非内固定。待手术完成后，常规换药，预防性使用抗生4d，上肢尽量早期功能锻炼，下肢2个月后拄拐不负重步行。
实例3
首先取新鲜猪骨，对其剔除骨膜和表面软组织，用50℃温水洗涤5次，除去骨髓和血性成分，随后将其切割制备得0.5cm3的骨头小块，随后将其置于甲醇和丙酮按质量比1:1的混合溶液中，在30℃下，对其浸泡处理，每隔8h后换液一次，使其脱脂处理48h；待脱脂完成后，用质量浓度为10%的过氧化氢溶液浸泡脱蛋白处理24h，随后每隔8h换液一次，待脱蛋白完成后，将骨块取出并用蒸馏水洗涤5次，随后将其置于80℃下干燥8h；待干燥完成后，对其碾磨并过筛处理，制备得80目的颗粒骨料，随后再在球磨机中，采用无水乙醇为湿磨剂进行湿磨处理3h，随后对其过滤并收集滤渣，将其置于100℃下干燥4h，并将其置于紫外灯下灭菌处理2h，制备得脱脂脱蛋白骨粉备用；按重量份数计，选取35份壳聚糖粉末、15份质量分数为36％的乙酸溶液、30份的液体石蜡和20份的失水山梨糖醇脂肪酸酯混合配制形成乳化剂，随后缓慢滴加0.8mol/L的NaOH溶液调节pH至10，加热升温至60℃反应3h，待反应完成后，对其抽滤并收集滤饼，分别用石油醚和丙酮在索式抽提器中抽提24h后，取出滤饼在50℃下真空干燥30min，制备得壳聚糖微小球；按0.01mol/L的浓度，将川续断皂苷添加至100mL的无水乙醇中，搅拌混合15min后，制备得川续断皂苷乙醇溶液中，随后将10g制备的脱脂脱蛋白骨粉加入至川续断皂苷乙醇溶液中，在200～300W的超声分散15min，并在40℃下干燥4h，制备得改性骨粉；按固液质量比1:10，将聚乳酸颗粒溶解至乙酸乙酯中，随后将其置于60℃下磁力搅拌30min，制备得10%的聚乳酸溶液，随后再按固液质量比1:5，将上述制备的改性骨粉添加至上述制备的聚乳酸溶液中，随后在400r/min下，搅拌混合至骨粉颗粒呈凝胶状；待叫搅拌完成后，将其置于铺满制备的壳聚糖微小球模具中，在1500r/min下离心15min，随后对其真空干燥24h，并将其切成1mm的骨料支架，随后将其置于环己烷溶液中，气浴振荡72h，每隔12h换液一次，随后将其置于50℃烘箱中干燥8h，即可制备得一种川续断皂苷壳聚糖促进骨粉聚乳酸相融合骨料支架。
用钛质钢尺放置于患肢旁用于标记，经X线、MRI检查确定病灶范围，根据受伤部位选取合适入路盐水纱垫保护周围软组织，随后凿除合适骨窗，充分显露手术区域，反复冲洗干净后，内壁用磨钻再次清理病灶至影像学显示范围以外2cm，电刀烧灼囊腔壁2遍。根据人体体表面积计算图及囊腔的大小给予100mg/m2川续断皂苷壳聚糖促进骨粉聚乳酸相融合骨料支架，必要时取适量自体髂骨移植，充分填塞囊腔，根据情况决定内固定或者非内固定。待手术完成后，常规换药，预防性使用抗生素5d，上肢尽量早期功能锻炼，下肢2个月后拄拐不负重步行。

Claims (1)

1.一种川续断皂苷壳聚糖促进骨粉聚乳酸相融合骨料支架的制备方法，其特征在于具体制备步骤为：
（1）取新鲜猪骨，对其剔除骨膜和表面软组织，用40～50℃温水洗涤3～5次，除去骨髓和血性成分，随后将其切割制备得0.5cm3的骨头小块，随后将其置于甲醇和丙酮按质量比1:1的混合溶液中，在20～30℃下，对其浸泡处理，每隔6～8h后换液一次，使其脱脂处理48h；
（2）待脱脂完成后，用质量浓度为10%的过氧化氢溶液浸泡脱蛋白处理22～24h，随后每隔8h换液一次，待脱蛋白完成后，将骨块取出并用蒸馏水洗涤3～5次，随后将其置于60～80℃下干燥6～8h；
（3)待干燥完成后，对其碾磨并过筛处理，制备得60～80目的颗粒骨料，随后再在球磨机中，采用无水乙醇为湿磨剂进行湿磨处理2～3h，随后对其过滤并收集滤渣，将其置于80～100℃下干燥3～4h，并将其置于紫外灯下灭菌处理1～2h，制备得脱脂脱蛋白骨粉备用；
（4）按重量份数计，选取5～35份壳聚糖粉末、20～40份质量分数为36％的乙酸溶液、30～40份的液体石蜡和15～25份的失水山梨糖醇脂肪酸酯混合配制形成乳化剂，随后缓慢滴加0.8mol/L的NaOH溶液调节pH至8～10，加热升温至60℃反应2～3h，待反应完成后，对其抽滤并收集滤饼，分别用石油醚和丙酮在索式抽提器中抽提20～24h后，取出滤饼在50℃下真空干燥20～30min，制备得壳聚糖微小球；
（5）按0.01mol/L的浓度，将川续断皂苷添加至100mL的无水乙醇中，搅拌混合10～15min后，制备得川续断皂苷乙醇溶液中，随后将10g步骤（3）制备的脱脂脱蛋白骨粉加入至川续断皂苷乙醇溶液中，在200～300W的超声分散10～15min，并在30～40℃下干燥3～4h，制备得改性骨粉；
（6）按固液质量比1:10，将聚乳酸颗粒溶解至乙酸乙酯中，随后将其置于55～60℃下磁力搅拌25～30min，制备得10%的聚乳酸溶液，随后再按固液质量比1:5，将上述制备的改性骨粉添加至上述制备的聚乳酸溶液中，随后在300～400r/min下，搅拌混合至骨粉颗粒呈凝胶状；
（7）待叫搅拌完成后，将其置于铺满步骤（4）制备的壳聚糖微小球模具中，在1200～1500r/min下离心10～15min，随后对其真空干燥20～24h，并将其切成1mm的骨料支架，随后将其置于环己烷溶液中，气浴振荡72h，每隔12h换液一次，随后将其置于40～50℃烘箱中干燥6～8h，即可制备得一种川续断皂苷壳聚糖促进骨粉聚乳酸相融合骨料支架。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021169759A1 (zh) * 2020-02-27 2021-09-02 华东理工大学 中药调控型复合活性骨支架及其制备方法和应用
CN113350179A (zh) * 2021-06-08 2021-09-07 青岛杰圣博生物科技有限公司 一种聚乳酸软组织填充微米粒冷冻低温球磨制备方法
CN114028613A (zh) * 2021-10-21 2022-02-11 潍坊医学院 一种功能性骨修复复合支架、制备方法及应用

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