CN105013015A

CN105013015A - 一种组织工程学修复神经缺损的方法

Info

Publication number: CN105013015A
Application number: CN201410157219.2A
Authority: CN
Inventors: 陈露露; 沈尊理; 秦金保
Original assignee: Shanghai First Peoples Hospital
Current assignee: Shanghai First Peoples Hospital
Priority date: 2014-04-20
Filing date: 2014-04-20
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2034-04-20
Also published as: CN105013015B

Abstract

本发明属于细胞生物学领域，涉及组织工程学修复神经缺损的方法<b>，</b>具体涉及一种采用脂肪来源的许旺细胞修复人工周围神经缺损的方法及其应用。本发明利用从废弃的脂肪组织中获得的许旺细胞修复损伤的神经以及应用大量脂肪来源的许旺细胞和少量的脂肪干细胞共同修复神经缺损，经动物实验证实，能有效的促进损伤神经的再生。本方法提供了一种组织工程学中修复神经缺损的新方法，为损伤神经的修复提供了一种更优质的治疗参考方法。具有临床应用前景和临床价值。

Description

一种组织工程学修复神经缺损的方法

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及组织工程学修复神经缺损的方法，具体涉及一种采用脂肪来源的许旺细胞修复人工周围神经缺损的方法及其应用。

背景技术

现有技术公开了许旺细胞是周围神经系统的胶质细胞，在神经损伤修复中具有非常重要的作用。神经受损时，许旺细胞能分泌很多细胞外基质成分、神经生长因子等促进神经的再生。当轴突缺失和脱髓鞘发生瓦勒氏变性时，许旺细胞会发生增殖和去分化，吞噬髓鞘碎片并且在神经内膜管内形成纵向排列的柱状细胞突起或特有的Bungner带指引轴突再生。

许旺细胞作为人工神经的种子细胞，其来源一般分为两类：其中，一类来源于自体神经，然而，研究实践显示，自体神经来源有限，且往往会造成供区运动、感觉障碍甚至神经瘤的形成；另一类来源于干细胞的体外诱导，但是干细胞的诱导率低、诱导周期长、步骤繁琐，分化结果多不稳定并且定向分化仍是一个难点。有研究证实，完全分化的干细胞能够通过修饰基因表达谱而又恢复到原有的干细胞样的状态或重新转分化为另一种细胞。此外，干细胞的致瘤性是目前存在的一个棘手缺陷，这些问题严重限制了干细胞的临床实践应用。

研究显示，脂肪组织成分复杂，其含有脂肪细胞和血管相关细胞以及其他细胞，且脂肪组织中分布着丰富的自主神经网络；这些信息说明脂肪组织中有许旺细胞的存在，专利（申请号201010124579.4）公开了有关纯化方法以及获得大量高纯度的许旺细胞。

本申请的发明人拟提供一种组织工程学中修复神经缺损的新方法，该方法中从废弃的脂肪中提取许旺细胞进行组织工程学中修复神经缺损，具有非常广阔的临床应用前景和临床价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种简易、方便、高效的组织工程学修复神经缺损的方法，具体涉及一种采用脂肪来源的许旺细胞修复人工周围神经缺损的方法及其应用。

本发明方法中采用硅胶管作为损伤的周围神经人工神经支架，将从脂肪组织中获得的许旺细胞为种子细胞注入其中， 3个月和6个月后，通过荧光大体显微镜，显示损伤的神经已经完全再生，荧光显微镜下有大量GFP的许旺细胞存在；以及，

本发明方法中基于许旺细胞修复神经缺损的一个重要作用是分泌神经生长因子如脑源性神经生长因子、睫状神经生长因子，鉴于许旺细胞自身分泌该些因子的量很有限，所以本发明还应用大量脂肪来源的许旺细胞和少量的脂肪干细胞共同修复缺损的神经，取得显著好的效果。

具体的，本发明的用脂肪来源的许旺细胞修复周围神经缺损的方法，其包括，从脂肪组织中提取出高纯度许旺细胞后（采用专利号201010124579.4纯化方法），用0.25%胰酶消化细胞，离心，将此细胞按1x10⁶/100μl 重悬浮到许旺细胞培养液（SCCM）和Matrigel胶的混合溶液中，SCCM和Matrigel胶按1:1比例制成混合液，最后将带有脂肪来源许旺细胞的混悬液用于修复损伤的神经。本发明的一个实施例中，用从脂肪组织中提取的许旺细胞进行修复小鼠坐骨神经缺损实验，术后3个月和6个月大体观察，结果显示缺损的神经已经完全再生，再生神经生长良好，无粘连、无血管畸形、无神经瘤、无瘢痕形成；免疫荧光证实所述的脂肪来源的许旺细胞在损伤处能包绕轴突形成髓鞘，具有许旺细胞特有的功能。

更具体的，本发明的组织工程学修复神经缺损的方法，利用从脂肪组织中提取的许旺细胞修复周围神经缺损，其包括下述步骤：

1. 无菌剥离离体的脂肪组织，用10-15ml 0.2% NB4和5-10ml 0.2% Dispase酶溶液消化脂肪组织碎块45~90分钟，将溶解的组织1500rpm，离心5分钟，弃上清，得到细胞团块；

2. 用许旺细胞培养液重悬步骤1得到的细胞，以1x10⁴-5x10⁴个/cm₂接种于培养皿；

3. 上述细胞培养48-72小时，用0.2%Dispase酶纯化细胞，收集细胞混悬液，以600g离心5-10分钟，弃去上清；

4. 用许旺细胞培养液重悬步骤3得到的细胞，培养48-72小时得到大量许旺细胞；

5. 采用0.25%胰酶消化上述许旺细胞，消化1分钟，DMEM中和胰酶，收集细胞悬液，离心；

6. 随后将细胞重悬浮于许旺细胞培养液（SCCM）和Matrigel胶的混合液，SCCM和Matrigel胶按1:1比例制成混合液；

7. 将步骤6得到的混悬液用吸管反复吹打3~5分钟，充分混匀细胞；

8. 采用硅胶管制作人工神经室，置损伤神经中；

9. 将带有许旺细胞的混悬液注入损伤神经的人工神经室中；

10. 对再生神经进行免疫荧光检测。

本发明方法中，所述的脂肪组织为离体的脂肪组织，本发明的实施例中，取5-7天C57小鼠的腹部脂肪组织，脂肪组织碎块体积为0.5-1mm³ ；

上述方法中，采用GFP小鼠的脂肪组织，得到GFP的许旺细胞，修复野生型C57小鼠3mm的坐骨神经缺损，便于观察GFP许旺细胞在修复坐骨神经缺损时起的作用。

本发明中，NB4又被称为胶原酶，Dispase又被称为分散酶、中性蛋白酶，均购自sigma公司；

本发明方法中，许旺细胞按1x10⁶/100μl在SCCM和Matrigel胶混合液中混匀，装入1ml胰岛素针筒中，置于冰上，解剖显微镜下将混合液注射到人工神经室中；本发明的实施例中，采用内径0.8mm，外径2mm的硅胶管作为损伤的周围神经人工神经支架，

本发明方法中，尤选在体外快速、大量的培养出许旺细胞并且迅速的构建复合种子细胞的仿生神经导管，

所述的许旺细胞作为种子细胞，在工程化的周围神经损伤修复中起着关键性的作用，构建人工神经时，只有在合成导管或者生物导管中加入足够量的许旺细胞，才能够明显促进周围神经的再生；本发明实验显示，许旺细胞数量上至少达到1×10⁶/100 ul才能够保证其保护神经元、促进神经轴突再生的作用；许旺细胞中如果混杂有成纤维细胞，则会显著阻碍许旺细胞介导的神经轴突再生，因此神经损伤修复中所需的许旺细胞必须要大量而且高纯度；而在神经损伤后，必须在尽可能短的时间内修复，才能最大限度的恢复其支配区感觉及运动功能，否则容易造成不可逆的关节僵硬，肌肉萎缩，因此，本发明中，在体外快速、大量的培养出许旺细胞并且迅速的构建复合种子细胞的仿生神经导管；

本发明中，Matrigel胶购自BD公司，所述的Matrigel胶是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中分离出的Matrigel 基底膜基质，其主要成分由层粘连蛋白，Ⅳ型胶原，巢蛋白，硫酸肝素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等；所述的BD Matrigel基底膜基质在室温条件下，聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于细胞的培养和分化，以及对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达的研究；Matrigel胶在4℃呈液态，在22-35℃温度环境下快速成胶，使用前需置于冰浴，使用预冷的移液管、吸头及小管操作Matrigel，成胶后的Matrigel可在4℃24－48小时后重新呈液态；

本发明中，为避免Matrigel胶的凝固，在4℃冰上操作所述细胞重悬浮于许旺细胞培养液（SCCM）和Matrigel胶的混合液的步骤；

本发明中，许旺细胞培养液是指含2μM forskolin 、 10ng/mlheregulinβ1和 10ng/ml BFGF的DMEM培养基；

本发明中，对再生神经进行组织学检测观察，可采用常规的操作方法或者按照下面的方法进行：

组织样本固定：心脏灌注固定实验小鼠，取出再生神经，放置于4%PFA ，2h后，移入30%蔗糖溶液，4 ◦C过夜。随后OCT包埋组织，冰冻切片机（Thermo Shandon, Cheshire, UK)切取10μm薄片；

再生神经免疫荧光染色：组织经PBS洗去OCT，采用10%羊血清常温封闭30min吸掉羊血清，加入兔抗MBP (1:50; Abcam; UK)、兔抗S100 (1:500; Dako; Denmark)、4 ◦C过夜。PBS冲洗后，样本中加入Alexa Fluor® 555羊抗兔IgG (1:500; Invitrogen; USA) ，37 ◦C、 45 min。DAPI (1:500; Invitrogen; USA)染细胞核，90s。PBS洗涤后，激光共聚焦显微镜拍照（Leica; Germany）；

本发明中，还检测再生神经的许旺细胞标志物S100、MBP。

本发明利用从废弃的脂肪组织中获得的许旺细胞修复损伤的神经以及应用大量脂肪来源的许旺细胞和少量的脂肪干细胞共同修复神经缺损，经动物实验证实，能有效的促进损伤神经的再生。本发明中的许旺细胞作为周围神经系统的主要细胞形态，对周围神经系统有着非常重要的作用。许旺细胞之间能够形成郎飞结，加快有髓神经的信号传导。在外周和中枢神经损伤修复中也起到重要的作用，它们能够分泌多种神经生长因子营养神经，促进外周神经的轴突生长延长，保持损伤神经元活性及重新建立突触连接。

本方法提供了一种组织工程学中修复神经缺损的新方法，为损伤神经的修复提供了一种更优质的治疗参考方法。具有非常广阔的临床应用前景和临床价值。

本发明方法方法，具有明显的优点：

1.取材简单方便，细胞来源丰富，不需要损伤自体神经，不会造成供区感觉功能障碍；

2.避免了采用干细胞治疗时引起的致瘤性等一系列不良问题；

3.不存在伦理问题。

附图说明

图1：原代脂肪来源许旺细胞；图2：纯化两次后的脂肪来源许旺细胞；图3：移植到损伤坐骨神经处的种子细胞，可见大量许旺细胞；图4：荧光显微镜下的图3;其中，（图1、2为100X，图3、4为40X），箭头标记的为许旺细胞，星号标记的为脂肪干细胞。

图5：术后3个月，损伤神经已经完全再生，无粘连、无血管畸形、无神经瘤；图6：荧光显微镜下的图5；图7：神经再生3个月， 10μm组织薄片的显微镜观察；图8：荧光显微镜下的图7；

其中，三角形之间的为再生神经，箭头标记的为移植的GFP种子细胞。

图9：许旺细胞修复神经缺损，神经再生3月，许旺细胞标志物S100免疫荧光染色，可见绿色GFP许旺细胞和S100染色重叠；图10：图9中相应的GFP细胞；图11：图9中相应的S100免疫荧光染色；图12：神经再生6月，许旺细胞标志物MBP免疫荧光染色图，可见GFP许旺细胞形成髓鞘和髓鞘相关蛋白MBP共染（黄色部分）；图13：图12中方框区域局部放大图，可见GFP许旺细胞形成环状髓鞘和MBP共染；图14：图13中的GFP许旺细胞，细胞呈环状；

图15：图13中相应的MBP免疫荧光染色，呈现环状结构，（200X）；

其中：箭头指示许旺细胞特异性标志物S100、MBP和GFP的许旺细胞共染部位。

具体实施方式

实施例1 ：分离、纯化、富集脂肪来源的许旺细胞

新生7天 C57小鼠，常规处理后，放入75%酒精中，浸泡5-10分钟。

1. 无菌条件下取林提的小鼠的脂肪组织，剪碎，用5-20倍组织量的质量体积比为0.1~0.2%的复合胶原酶NB4和0.05~0.1%的Dispase混合酶溶液消化碎块60分钟；

2. 将步骤1中已经溶解的组织1500r，离心5分钟，弃上清，得到细胞团块；

3. 用许旺细胞培养液（含2μM forskolin , 10ng/ml heregulin-β-1、10ng/ml BFGF的DMEM培养基）重悬步骤2得到的细胞，计数，按1x10⁴-5x10⁴个/cm₂接种于培养皿。置37℃，5%CO²培养箱培养；

4. 细胞培养48-72小时，用0.2%DIspase酶溶液纯化细胞，37℃、15分钟后，收集含有细胞的上清液，以600g离心5-10分钟，弃去上清；

5. 用许旺细胞培养液重悬步骤4得到的细胞，培养48-72小时即可得到大量许旺细胞；

显微镜下可见脂肪来源的许旺细胞生长状态好，纯度高。

实施例 2 ：脂肪来源的许旺细胞修复小鼠坐骨神经缺损实验

a) 实施例1中步骤5中细胞培养48-72小时后，吸去培养液，采用0.25%胰酶消化许旺细胞，消化1分钟，DMEM中和胰酶，收集细胞悬液；

b) 将步骤a得到的细胞悬液100r，离心5分钟，弃去上清；

c) 将步骤b得到的细胞重悬浮于许旺细胞培养液（SCCM）和Matrigel胶的混合液，SCCM和Matrigel胶按1:1比例制成混合液；

d) 将步骤c得到的混悬液用吸管反复吹打3~5分钟，充分混匀细胞，步骤c和d均需在4℃冰上操作；

e) 采用5%水合氯醛（6ml/kg）腹腔麻醉小鼠，暴露右侧坐骨神经；

f) 在损伤神经处采用硅胶管制作人工神经室；

g) 最后将带有许旺细胞的混悬液注射到损伤神经处的人工神经室中，注射量为10ml左右；

h) 3月和6月后，观察神经再生状态。

解剖显微镜观察结果显示：再生神经生长良好，无粘连、无血管畸形、无神经瘤、无瘢痕形成。

实施例 3 脂肪来源的许旺细胞和脂肪干细胞分别修复坐骨神经缺损

一）脂肪来源许旺细胞和脂肪干细胞的获取

许旺细胞的获取：如实施例1中所述方法。

脂肪干细胞的获取：

1. 小鼠常规处理，于75％酒精中浸泡10 min后，无菌条件下取脂肪组织，置入一次性离心管中，剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小；

2. 加入10-15ml 0.2％NB4和5-10 ml 0.2% Dispase ，振荡消化约60分钟；

3. 将步骤2中已经溶解的组织1500rpm，离心5分钟，弃上清，得到细胞团块；

4. 加入DMEM培养液8ml重悬细胞，按大约1×10⁴/cm²密度将细胞接种到培养瓶中，置于37℃、5％CO2孵育箱培养；

5. 待原代细胞长满至80％左右，吸去上清液。PBS漂洗一次后，加37℃、0.25％胰酶消化约1分钟，加入含血清的DMEM培养基终止胰酶消化；

6. 收集步骤5所得上清液，以1500 rpm、37℃、离心5 min，用DMEM培养液重悬，1:2的比例进行传代接种，置于37℃、5％CO2培养箱继续培养；

7. 待细胞增殖并覆盖瓶底80％左右时，用同样方法消化传代。

二）两种细胞修复神经缺损：步骤如实施例2中所述

三）再生神经的鉴定

再生神经取材：神经再生3个月和6个月时，将再生神经放置于4%PFA ，2h后，移入30%蔗糖溶液，4 ◦C过夜，随后OCT包埋组织，冰冻切片机（Thermo Shandon, Cheshire, UK)切取10μm薄片，组织薄片置于阴凉处，过夜阴干；

免疫荧光法：组织经PBS洗去OCT，采用10%羊血清常温封闭30min吸掉羊血清，加入兔抗MBP (1:50; Abcam; UK)、兔抗S100 (1:500; Dako; Denmark)、4 ◦C过夜。PBS冲洗后，样本中加入Alexa Fluor® 555羊抗兔IgG (1:500; Invitrogen; USA) ，37 ◦C、 45 min。DAPI (1:500; Invitrogen; USA)染细胞核，90s。PBS洗涤后，激光共聚焦显微镜拍照（Leica; Germany）。观察MBP、S100和GFP许旺细胞以及GFP脂肪干细胞间的定位关，。分析许旺细胞和脂肪干细胞的作用；

激光共聚焦纤维镜观察结果显示：GFP许旺细胞和S100和MBP均存在共染现象，并且许旺细胞形成了典型的环状髓鞘结构，促进损伤神经的修复；脂肪干细胞和S100、MBP均不共染，说明脂肪干细胞没有形成髓鞘，没有发挥许旺细胞的生理功能。

上述实施例2和3的结果表明脂肪来源许旺细胞能成功修复缺损坐骨神经。

Claims

1.一种组织工程学修复神经缺损的方法，其特征在于，利用从脂肪组织中提取的许旺细胞修复周围神经缺损，其包括步骤：

1）无菌剥离离体的脂肪组织，用10-15ml 0.2% NB4和5-10ml 0.2% Dispase酶溶液消化脂肪组织碎块45~90分钟，将溶解的组织1500rpm，离心5分钟，弃上清，得到细胞团块；

2）用许旺细胞培养液重悬步骤1）得到的细胞，以1x10⁴-5x10⁴个/cm₂接种于培养皿；

3）上述细胞培养48-72小时，用0.2%Dispase酶纯化细胞，收集细胞混悬液，以600g离心5-10分钟，弃去上清；

4）用许旺细胞培养液重悬步骤3）得到的细胞，培养48-72小时得到大量许旺细胞；

5）采用0.25%胰酶消化上述许旺细胞，消化1分钟，DMEM中和胰酶，收集细胞悬液，离心；

6）随后将细胞重悬浮于许旺细胞培养液（SCCM）和Matrigel胶的混合液，SCCM和Matrigel胶按1:1比例制成混合液；

7）将步骤6）得到的混悬液用吸管反复吹打3~5分钟，充分混匀细胞；

8）采用硅胶管制作人工神经室，置损伤神经中；

9）将带有许旺细胞的混悬液注入损伤神经的人工神经室中；

10）对再生神经进行免疫荧光检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脂肪组织是5-7天C57小鼠的离体的腹部脂肪组织。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的消化酶的溶剂是DMEM培养基。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的纯化细胞通过：吸去培养液，加入2~3ml质量体积比为0.2%的Dispase酶，置37℃、5%CO₂培养箱作用15~30分钟；然后水平轻轻振荡所得细胞。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤9中，将许旺细胞按1x10⁶/100μl在SCCM和Matrigel胶混合液中混匀，装入1ml胰岛素针筒中，置于冰上，解剖显微镜下将混合液注入到神经导管中。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤：检测再生神经的许旺细胞标志物S100、MBP。

7.根据权利要求1所述的方法，其中的脂肪来源许旺细胞作为神经种子细胞在制备组织工程再生神经中的用途。