CN113304111A - 一种将脂肪组织制备成纳米囊泡的方法及该纳米囊泡的应用 - Google Patents

一种将脂肪组织制备成纳米囊泡的方法及该纳米囊泡的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种将脂肪组织制备成纳米囊泡的方法及该纳米囊泡的应用。所述方法具体是将临床获取的新鲜脂肪组织依次经过漂洗、剪碎后装入两个通过螺纹连接器连接的螺口注射器中，在两分钟内快速来回推挤形成均一黄色的悬混液态，转入无菌离心管内离心去掉上层油脂后吹打均匀，然后超声获得乳白色产物，再次离心去除上层油脂后，使用多重过滤膜推挤装置的注射器吸取上述离心后下层的水质层，并挤压过滤得到直径为60～400nm纳米囊泡产物；本发明制备的纳米囊泡具有促进脂肪再生功能，将其与真皮微颗粒混合成组织移植物用于软组织缺损填充，减轻了脂肪中油滴引起的炎症反应，提高了软组织填充后的体积保留率，同时也降低了真皮直接填充的硬度。

Description

一种将脂肪组织制备成纳米囊泡的方法及该纳米囊泡的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体是一种将脂肪组织制备成纳米囊泡的方法及该纳米囊泡的应用。
背景技术
纳米囊泡是一种直径在纳米级别的脂质包膜包裹的囊泡，其内容物可为蛋白质、核酸及药物等物质，起到影响细胞行为和治疗疾病的作用。纳米囊泡从获取方式上可分为细胞自然分泌的细胞外囊泡和人工合成的囊泡两种类型，但是在目前的实际应用中，细胞外囊泡由于细胞分泌而来，存在着获取复杂、产率低等问题；人工囊泡存在价格昂贵等不足。近年来，通过多重过滤膜反复挤压细胞导致细胞膜破裂然后重组为纳米囊泡的方式提高了囊泡产率，但是该技术需要在体外培养扩增细胞，增加了污染风险，并存在致瘤可能。目前还没有将机体组织通过反复机械推挤直接制备成纳米囊泡的报道。
自体脂肪移植是治疗机体软组织缺损的常用方法，但是移植后体积保留率低是目前脂肪移植技术急需解决的难题，影响了脂肪填充的治疗效果。使用自体真皮组织也是一种填充手术方法，真皮具有体积保留率较高的优点，但是不如脂肪组织柔软，同时组织来源也比脂肪少，在临床上填充应用领域有限。
发明内容
本发明针对目前纳米囊泡因产率低、价格高、临床转化慢等原因导致临床应用的不足问题提供了一种将脂肪组织制备成纳米囊泡的方法及该纳米囊泡的应用，该方法制备的纳米囊泡有促进脂肪再生功能，将其与真皮微颗粒混合成组织移植物，可以提高软组织填充时的体积保留率，同时也可以降低真皮直接填充的硬度。
为了达到上述技术目的，本发明提供了一种将脂肪组织制备成纳米囊泡的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)通过临床手术获取新鲜脂肪组织标本，并用生理盐水漂洗；
(2)将脂肪组织剪碎成小块，装入5～50毫升的螺口注射器中，注射器通过螺纹连接器与另一螺口注射器相连；
(3)在两分钟内快速来回推挤注射器中的脂肪组织，将脂肪推挤成均一黄色的悬混液态，转入无菌离心管内；
(4)使用离心机以2000g±200g的离心力对步骤(3)中的黄色液态悬混物离心5～10分钟，使其离心分层为上部的油脂层和下部的淡黄色颗粒物；
(5)去掉离心分层后上部的油脂层，留取底层淡黄色颗粒状物，并加入1～ 3毫升生理盐水后吹打均匀；
(6)使用无菌超声波发生探头，以40～80瓦功率对淡黄色颗粒状物进行超声3～5分钟，获得乳白色产物；
(7)再次使用离心机以2000g±200g离心力离心乳白色产物5-10分钟，使其离心分层为上部的白色油脂层和下部的水质层，并去除白色油脂层；
(8)使用多重过滤膜推挤装置的注射器吸取上述离心后下层的水质层，然后挤压过滤得到直径为60～400nm纳米囊泡产物。
本发明较优的技术方案：所述步骤(8)中的挤压过滤过程是：组装好多重过滤膜推挤装置，首先使用10微米孔径的过滤膜，来回推挤注射器10次，后将过滤膜更换为孔径5微米的过滤膜，继续来回推挤注射器10次，后将过滤膜更换为孔径1微米的过滤膜来回推挤注射器10次后，静置2小时以上得到纳米囊泡产物。
本发明较优的技术方案：所述步骤(1)中获取的临床手术获取脂肪组织标本不超过六小时。
本发明较优的技术方案：所述步骤(6)中超声过程中，每超声2秒后暂停2秒。
为了达到上述技术目的，本发明还提供了一种按照上述方法制备的纳米囊泡的应用，其特征在于：将上述方法制备的纳米囊泡与微颗粒真皮组织按照体积比2：3的比例混合均匀后制备组织填充物用于脂肪注射中进行软组织填充。
本发明较优的技术方案：所述微颗粒真皮组织是通过手术剪将手术中获取的真皮组织剪成粒径范围在100um～500um的微颗粒形态。
本发明中螺口注射器和多重过滤膜推挤装置均为现有实验室常用试验装置，可以直接购买得到。
本发明将脂肪组织通过离心、超声乳化、推挤等物理作用方式直接制备成纳米囊泡，去除了脂肪组织中油滴成分，其获得的纳米囊泡具有促进脂肪再生功能，将其与真皮微颗粒混合成组织移植物，用于对乳房发育不良、凹陷性瘢痕、半面颜面萎缩等软组织缺失疾病进行组织填充治疗，可提高软组织填充时的体积保留率，同时也降低了真皮直接填充的硬度，由于全过程均为自体组织通过物理方式操作，其可在临床上可直接转化。
附图说明
图1是本发明实施例中制备的纳米囊泡生理盐水溶液形态视图；
图2是本发明实施例中制备的纳米囊泡水溶液光学显微镜下形态视图；
图3是本发明实施例中制备的纳米囊泡在透射电子显微镜下的形态视图；
图4是本发明实施例中制备的纳米囊泡的直径分布区间曲线图；
图5是不同浓度纳米囊泡作用于干细胞后进行油红O染色结果对比图；
图6是本发明实施例中的制备的纳米囊泡进行组织填充物移植后(4周)组织学周脂素(Perilipin)荧光染色结果对比图；
图7是本发明实施例中的制备的纳米囊泡进行组织填充物移植后(6周)组织学周脂素(Perilipin)荧光染色结果对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
以下实施例中使用的螺口注射器、离心机、无菌超声波发生探头均为实验室中可以常规的试验工具，可以直接购买已有产品。多重过滤膜推挤装置采用直接购买的型号为Avanti Polar Lipids的脂质体挤出仪，其产品编号 610023。
实施例提供了一种将脂肪组织制备成纳米囊泡的方法，其具体步骤如下：
(1)临床手术中获取新鲜的脂肪组织标本，存放不超过六小时，采用生理盐水漂洗去除沾有的血液；
(2)将步骤(1)中漂洗后的脂肪组织剪碎成小块，装入20毫升螺口注射器中，注射器通过螺纹连接器与另一螺口注射器相连；
(3)在2分钟内快速来回推挤注射器中的脂肪组织，将脂肪推挤成均一黄色的悬混液态，转入无菌离心管内；
(4)使用离心机以2000g离心力离心黄色液态悬混物5分钟，使其离心分层为上部的油脂层和下部的淡黄色颗粒物；
(5)去掉离心分层后上部的油脂层，留取底层淡黄色颗粒状物，向内加入 1毫升生理盐水并吹打均匀；
(6)使用无菌超声波发生探头，以60瓦功率对淡黄色颗粒状物进行超声 5分钟，每超声2秒后暂停2秒，获得乳白色产物；
(7)再次使用离心机以2000g离心力离心乳白色产物5分钟,使其离心分层为上部的白色油脂层和下部的水质层，并去除白色油脂层；
(8)使用多重过滤膜推挤装置的注射器吸取上述离心后下层的水质层，组装好多重过滤膜推挤装置，首先使用10微米孔径的过滤膜，来回推挤注射器10次，后将过滤膜更换为孔径5微米的过滤膜，继续来回推挤注射器10 次，最后将过滤膜更换为孔径1微米的过滤膜，来回推挤注射器10次后，静置2小时以上得到直径为60～400nm纳米囊泡产物。
将实施例中制备的纳米囊泡产物置于生理盐水中得到的生理盐水溶液如图1所示，纳米囊泡产物置于生理盐水中呈淡粉红色澄清的液体，表面未漂浮有油沫等物质；并对实施例中制备的纳米囊泡产物水溶液在光学显微镜下观察，其形态如图2所示，光镜下见纳米囊泡产物溶液内呈现分布有较均一的颗粒状物质，普通光镜的分辨率不足以看清颗粒物质形态。将实施例中制备的纳米囊泡在透射电子显微镜下观察，其形态如图3所示，透射电子显微镜下观察到多个囊泡(箭头所示)，囊壁呈现高电子密度区域的连续性膜结构，而囊泡内部的电子密度稍低于囊壁。本申请的发明人使用Nanosight纳米颗粒跟踪分析检测纳米囊泡溶液里面的纳米粒子直径，检测结果如图4所示，发现制备的纳米囊泡直径分布区间约为60-400nm。
本申请的发明人将施例中的制备的纳米囊泡采用生理盐水配制成不同浓度作用于干细胞后进行油红O染色试验，其具体过程如下：首先将经过不同浓度的纳米囊泡干预的细胞进行多聚甲醛固定10分钟，再用去离子水洗涤两遍；再使用60％异丙醇溶液浸洗细胞30s，后用去离子水洗涤两遍；最后使用配好的油红O染色液对上述洗涤后的细胞染色10min，再次使用60％异丙醇溶液浸洗细胞30s去除染液，使用去离子水洗涤两遍后在光学显微镜下观察拍照。对照组为未经纳米囊泡干预的细胞。其对比结果如图5所示，镜下可见纳米囊泡干预过的细胞内出现油脂颗粒，可被油红O染成橘红色，对照组细胞未合成油脂，不被油红O染色，并且随着干预的纳米囊泡浓度增加，细胞内产生的油脂更多，油红O染成橘红色区域更多。通过对比试验可以看出，本发明中制备的纳米囊泡具有促进成脂分化生物效果。
应用实施例：将上述实施例中制备的纳米囊泡应用于组织填充中，其具体过程如下：通过手术中获取真皮组织(其真皮组织放置时间不超过六小时)，将其采用生理盐水洗干净，使用手术剪将真皮剪成100um-500um微颗粒形态，即使用手术镊不能夹起真皮组织。将获得的纳米囊泡和剪成微颗粒的真皮组织以2：3体积比例混合，混合均匀后作为组织填充物，使用18G大小的脂肪注射针注射裸鼠皮下。对照组为生理盐水和剪成微颗粒的真皮组织以2：3体积比例混合，混合均匀后也使用18G大小的脂肪注射针注射到裸鼠背部皮下部位。
对移植4周后取材标本组织进行周脂素免疫荧光染色，结果如图6所示，显示对照组和实验组标本内均可见特异性标记的脂肪细胞存在。对照组脂肪细胞大多分布于标本外围，围绕组织边缘生长，在中心部分生长的脂肪细胞较少。而实验组中脂肪细胞可生长在离组织边缘约3000μm处深部，且总脂肪细胞数目明显大于对照组。
对移植6周后取材标本进行周脂素免疫荧光染色，结果显示如图7所示，对照组内脂肪细胞数量较少，仅围绕组织外围分布，中心区域缺乏；而实验组标本广泛分布着荧光标记的脂肪细胞，中心区域仍可见大量脂肪细胞存在。而相比于移植4周后(图6)实验组染色结果，移植6周后(图7)脂肪细胞已广泛出现在实验组真皮微颗粒支架内，总数量也明显增加。
通过应用实施可以看出，本发明制备的纳米囊泡具有促进脂肪再生功能，将其与真皮微颗粒混合成组织移植物，可以将其用于对乳房发育不良、凹陷性瘢痕、半面颜面萎缩等软组织缺失疾病进行组织填充治疗，提高了软组织填充时的体积保留率。
以上所述，只是本发明的一个实施例，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种将脂肪组织制备成纳米囊泡的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)通过临床手术获取新鲜脂肪组织标本，并用生理盐水漂洗；
(2)将脂肪组织剪碎成小块，装入5～50毫升的螺口注射器中，注射器通过螺纹连接器与另一螺口注射器相连；
(3)在两分钟内快速来回推挤注射器中的脂肪组织，将脂肪推挤成均一黄色的悬混液态，转入无菌离心管内；
(4)使用离心机以2000g±200g的离心力对步骤(3)中的黄色液态悬混物离心5～10分钟，使其离心分层为上部的油脂层和下部的淡黄色颗粒物；
(5)去掉离心分层后上部的油脂层，留取底层淡黄色颗粒状物，并加入1～3毫升生理盐水并吹打均匀；
(6)使用无菌超声波发生探头，以40～80瓦功率对淡黄色颗粒状物进行超声3～5分钟，获得乳白色产物；
(7)再次使用离心机以2000g±200g离心力离心乳白色产物5-10分钟，使其离心分层为上部的白色油脂层和下部的水质层，并去除白色油脂层；
(8)使用多重过滤膜推挤装置的注射器吸取上述离心后下层的水质层，并挤压过滤得到直径为60～400nm纳米囊泡产物。
2.根据权利要求1所述的一种将脂肪组织制备成纳米囊泡的方法，其特征在于所述步骤(8)中的挤压过滤过程是：组装好多重过滤膜推挤装置，首先使用10微米孔径的过滤膜，来回推挤注射器10次，后将过滤膜更换为孔径5微米的过滤膜，继续来回推挤注射器10次，后将过滤膜更换为孔径1微米的过滤膜来回推挤注射器10次后，静置2小时以上后得到纳米囊泡产物。
3.根据权利要求1或2所述的一种将脂肪组织制备成纳米囊泡的方法，其特征在于：所述步骤(1)中获取的临床手术获取脂肪组织标本不超过六小时。
4.根据权利要求1或2所述的一种将脂肪组织制备成纳米囊泡的方法，其特征在于：所述步骤(6)中超声过程中，每超声2秒后暂停2秒。
5.一种按照权利要求1或2中的方法制备的纳米囊泡的应用，其特征在于：将上述方法制备的纳米囊泡与微颗粒真皮组织按照体积比2：3的比例混合均匀后制备组织填充物用于软组织缺损填充。
6.根据权利要求5所述的一种按照将脂肪组织制备成纳米囊泡的方法制备的纳米囊泡的应用，其特征在于：所述微颗粒真皮组织是通过手术剪将手术中获取的真皮组织剪成粒径范围在100um～500um的微颗粒形态。
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