CN114272265A - 来源于正常组织间隙的胞外囊泡及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了来源于正常组织间隙的胞外囊泡及其用途，具体地，本发明提供了一种用于预防和/或治疗炎症性疾病的胞外囊泡制剂，包括：胞外囊泡，所述胞外囊泡的直径为20‑300nm，所述胞外囊泡来源于正常组织间隙，所述正常组织选自下组：肾脏组织、肺脏组织、肝脏组织、心脏组织、皮肤组织、脂肪组织、或其组合；和药学上可接受的载体，并且本发明的含有来源于正常组织(比如肾脏组织、肺脏组织、肝脏组织、心脏组织、皮肤组织、脂肪组织)的直径为20‑300nm的胞外囊泡的制剂可有效治疗巨噬细胞介导的炎症反应相关性疾病。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及一种来源于正常组织间隙的胞外囊泡及其用途。
背景技术
随着人口老龄化，人们生活方式改变，工作节奏加快以及恶化的环境因素的影响，心脑血管疾病、代谢性疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病的发生率均显著升高，成为影响人类健康的主要问题，而且，患者的生活质量减低，相关的社会医疗负担日益加重。
炎症反应是有机体在受到损伤刺激或者应激时发生的一种局部和全身性的反应，适度的炎症反应有利于组织的修复和器官稳态的维持，持续或者过度的炎症反应则导致组织和器官的功能障碍，甚至机体的死亡。主要的炎症性疾病的示例包括组织缺血性梗死和再灌注后的无菌性炎症反应，各种感染所致的败血症，心肌炎，消化系统疾病，例如胃炎和炎性肠炎；口腔疾病，例如牙周炎；呼吸道疾病，例如慢性阻塞性肺疾病(COPD)，肺炎，肺纤维化；鼻炎；皮肤病，例如特应性皮炎、脱发和牛皮癣；关节炎，例如退行性关节炎和类风湿性关节炎；以及代谢性疾病，例如肥胖、糖尿病和肝硬化等。
免疫系统是参与炎症反应的关键。巨噬细胞是参与固有免疫反应的主要效应细胞，其作为抗原提呈细胞，也是连接固有免疫反应与适应性免疫反应的桥梁。巨噬细胞在不同的器官和组织中均发挥重要作用，除了维持器官和组织的生理稳态之外，其极化和功能与疾病的发生和发展密切相关。经典激活的M1型巨噬细胞产生多种炎症因子参与并加重炎症反应，而替代激活的M2型巨噬细胞主要参与组织的损伤后修复。最近的研究发现，通过调控巨噬细胞的极化和功能可以减轻或者改善多种疾病的病理改变。
胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)是由活细胞分泌的具有脂质双层的小囊泡(～30-1000nm)。它存在于细胞培养的上清以及各种生物体液中，包括血液、尿液、脑脊液、腹水和组织间隙等。
以往研究大多采用从单一种类的细胞的培养上清中分离的EVs进行疾病治疗相关的研究。疾病通常是一个由多种细胞参与的复杂的病理过程，单一种类细胞培养上清中的EVs仅由某一种细胞产生，其EVs的来源单一，因此其内容物有效成分相对简单，作用也较局限。然而，目前尚未见有关从正常组织分离到的存在于组织间隙中的胞外囊泡是否可以改善炎症性疾病的相关报道。
因此，本领域迫切需要开发使用正常组织来源的EVs进行疾病治疗的方法，这种EVs由组织中的多种细胞产生，因此可针对疾病的多个病理生理变化进行干预，提高治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供使用正常组织来源的EVs进行疾病治疗的方法，这种EVs由组织中的多种细胞产生，因此可针对疾病的多个病理生理变化进行干预，提高治疗效果。
本发明的另一目的是提供一种用于预防、减轻或治疗选自心肌缺血再灌注损伤,心肌梗死，心力衰竭、肾脏缺血再灌注损伤，肺脏缺血再灌注损伤，糖尿病，中风，败血症等炎症性疾病组成的群组中的一种或多种疾病的组合物，该组合物包含作为有效成分的来源于正常组织间隙的胞外囊泡。
本发明第一方面提供了一种用于预防和/或治疗炎症性疾病的胞外囊泡制剂，包括：
胞外囊泡，所述胞外囊泡的直径为20-300nm，较佳地，50-250nm，更佳地，100-200nm，所述胞外囊泡来源于正常组织间隙，所述正常组织选自下组：肾脏组织、肺脏组织、肝脏组织、心脏组织、皮肤组织、脂肪组织、或其组合；和
药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述制剂中，所述胞外囊泡的含量(wt％)为0.001％-10％,较佳地，0.005％-5％，更佳地，0.02％-2％，更佳地，0.01％-1％，按所述制剂的总重计。
在另一优选例中，所述正常组织间隙为分离的正常组织间隙。
在另一优选例中，所述制剂的剂型选自下组：液态剂型、固态剂型(如冻干剂型)。
在另一优选例中，所述制剂的剂型包括注射剂、喷剂、和/或涂剂。
在另一优选例中，所述药学上可接受的载体选自下组：氯化钠、磷酸钠、聚乙二醇、壳聚糖、玻璃酸钠、海藻糖、肝素、或其组合。
在另一优选例中，所述炎症性疾病选自下组：心脏缺血再灌注损伤、心肌梗死、肾脏缺血再灌注损伤、肺脏缺血再灌注损伤、糖尿病、败血症、败血性休克、特应性皮炎、痤疮、牛皮癣、鼻窦炎、鼻炎、结膜炎、皮炎、炎性胶原血管病、脑炎、慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化、关节炎、由病毒性或细菌性感染引起的慢性炎症性疾病、结肠炎、溃疡性结肠炎、炎症性肠病、硬皮病、骨质疏松症、动脉粥样硬化症、心肌炎、心内膜炎、心包炎、桥本甲状腺炎、麻风病、梅毒、肺结核、结节病、狼疮、冻疮样狼疮、狼疮样结核病、狼疮性肾炎、系统性红斑狼疮、黄斑变性、葡萄膜炎、克罗恩病、干燥综合征、慢性疲劳综合症、慢性疲劳免疫缺陷综合征、肌痛性脑脊髓炎、帕金森氏病、多发性硬化症、或其组合。
在另一优选例中，所述炎症性疾病为巨噬细胞介导的炎症反应相关性疾病。
本发明第二方面提供了一种本发明第一方面所述的胞外囊泡制剂的用途，用于制备预防和/或治疗炎症性疾病的药物或制剂。
在另一优选例中，所述炎症性疾病选自下组：心脏缺血再灌注损伤、心肌梗死、肾脏缺血再灌注损伤、肺脏缺血再灌注损伤、糖尿病、败血症、败血性休克、特应性皮炎、痤疮、牛皮癣、鼻窦炎、鼻炎、结膜炎、皮炎、炎性胶原血管病、脑炎、慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化、关节炎、由病毒性或细菌性感染引起的慢性炎症性疾病、结肠炎、溃疡性结肠炎、炎症性肠病、硬皮病、骨质疏松症、动脉粥样硬化症、心肌炎、心内膜炎、心包炎、桥本甲状腺炎、麻风病、梅毒、肺结核、结节病、狼疮、冻疮样狼疮、狼疮样结核病、狼疮性肾炎、系统性红斑狼疮、黄斑变性、葡萄膜炎、克罗恩病、干燥综合征、慢性疲劳综合症、慢性疲劳免疫缺陷综合征、肌痛性脑脊髓炎、帕金森氏病、多发性硬化症、或其组合。
在另一优选例中，所述炎症性疾病为巨噬细胞介导的炎症反应相关性疾病。
在另一优选例中，所述炎症性疾病选自下组：心肌缺血再灌注损伤，心肌梗死，肾脏缺血再灌注损伤、肺脏缺血再灌注损伤、细菌感染所致的败血症等感染性疾病。也适用于巨噬细胞介导的其他的炎症性疾病，包括：糖尿病、败血性休克、特应性皮炎、痤疮、牛皮癣、鼻窦炎、鼻炎、结膜炎、皮炎、炎性胶原血管病、脑炎、慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化、关节炎、由病毒性或细菌性感染引起的慢性炎症性疾病、结肠炎、溃疡性结肠炎、炎症性肠病、硬皮病、骨质疏松症、动脉粥样硬化症、心肌炎、心内膜炎、心包炎、桥本甲状腺炎、麻风病、梅毒、肺结核、结节病、狼疮、冻疮样狼疮、狼疮样结核病、狼疮性肾炎、系统性红斑狼疮、黄斑变性、葡萄膜炎、克罗恩病、干燥综合征、慢性疲劳综合症、慢性疲劳免疫缺陷综合征、肌痛性脑脊髓炎、帕金森氏病、多发性硬化症、或其组合。
在另一优选例中，所述药物或制剂还用于选自下组的一种或多种用途：
(i)降低LPS诱导的巨噬细胞产生多种M1极化相关的炎症因子(比如，NOS，IL-1β，IL-6和TNF-ɑ)的水平；
(ii)降低心肌组织中炎症细胞的浸润，并改善心脏缺血再灌注损伤后不同时间点的心脏功能；
(iii)减轻肺脏的病理改变，并显著降低腹腔细胞表达M1型巨噬细胞相关炎症因子的水平，升高M2极化相关分子的表达；
(iv)抑制盲肠结扎穿孔建立的小鼠败血症模型腹腔中菌落的增殖。
本发明第三方面提供了一种治疗炎症性疾病的方法，包括步骤：
向给需要治疗的对象施用本发明第一方面所述的胞外囊泡制剂。
在另一优选例中，所述的对象为人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述对象为人或非人哺乳动物的巨噬细胞，如小鼠原代腹腔巨噬细胞。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物，如小鼠。
在另一优选例中，所述对象包括患有炎症性疾病的人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述胞外囊泡制剂的施用量为0.01-5mg/kg，较佳地为0.1-2mg/kg，更佳地为0.2-1mg/kg体重。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了正常心脏，肺脏，肝脏，肾脏组织来源的胞外囊泡的形态和大小。
图2显示了正常心脏，肺脏，肝脏，肾脏组织来源的胞外囊泡在体外抑制LPS诱导的巨噬细胞产生多种炎症因子。
图3显示了正常心脏和肾脏组织来源的胞外囊泡心肌内注射减轻心肌缺血再灌注损伤后的炎症反应。
图4显示了正常心脏和肾脏组织来源的胞外囊泡心肌内注射改善缺血再灌注后的心脏功能。
图5显示了正常心脏组织来源的胞外囊泡腹腔注射后显著减轻败血症小鼠肺脏的病理改变。
图6显示了正常心脏组织来源的胞外囊泡腹腔注射后显著降低败血症小鼠模型腹腔细胞表达M1型巨噬细胞功能相关分子的水平，升高M2极化相关分子的表达。
图7显示了正常心脏组织来源的胞外囊泡治疗也明显抑制盲肠结扎穿孔建立的小鼠败血症模型腹腔中菌落的增殖。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，含有来源于正常组织(比如肾脏组织、肺脏组织、肝脏组织、心脏组织、皮肤组织、脂肪组织)间隙的直径为20-300nm(较佳地，50-250nm，更佳地，100-200nm)的胞外囊泡的制剂可有效治疗巨噬细胞介导的炎症反应相关性疾病。并且本发明首次发现，存在于正常器官和组织中的EVs由该器官和组织中的多种细胞类型产生，在维持器官和组织在病理情况下的稳态和功能中发挥重要作用。在此基础上，本发明人完成了本发明。
本文所使用的术语“心脑血管疾病”是指哺乳动物的心脑血管系统中发生的疾病，例如心肌梗塞、心肌病、心肌炎和心绞痛；血管炎；以及脑血管疾病，例如痴呆和中风。在本发明中，心脑血管疾病优选包括心肌梗塞和再灌注损伤，但是本发明不限于此。
本文所用的术语“代谢性疾病”是指由于哺乳动物体内的代谢异常(例如高脂血症和糖尿病等代谢异常及其并发症)而引起的伴随各种器官的并发症的疾病。在本发明中，代谢疾病优选包括糖尿病，但是本发明不受限于此。
本文所用的术语“自身免疫性疾病”指机体对自身成分发生免疫应答而导致组织损伤的疾病状态。在本发明中，自身免疫性疾病优选包括类风湿性关节炎，但是本发明不受限于此。
本文所用的术语“感染性疾病”是指由于机体抵抗力降低，发生的病毒，细菌等病原体大量繁殖产生毒素所致的疾病，在本发明中，感染性疾病优选包括败血症、败血症休克、心肌炎、脑炎，但是本发明不受限于此。
本文中使用的术语“炎症性疾病”是指由巨噬细胞介导的的哺乳动物体内的炎性反应引起的疾病，本发明中，炎症性疾病可以是选自由以下疾病组成的群组中的一或多种疾病：心肌缺血再灌注损伤、心肌梗死、心力衰竭、肾脏缺血再灌注损伤、肺脏缺血再灌注损伤、糖尿病、中风、败血症、特应性皮炎、痤疮、牛皮癣、鼻窦炎、鼻炎、结膜炎、皮炎、炎性胶原血管病、肾小球肾炎、脑炎、炎性肠炎、慢性阻塞性肺疾病、败血症、败血性休克、肺纤维化、关节炎、炎症性骨溶解、由病毒性或细菌性感染引起的慢性炎症性疾病、结肠炎、溃疡性结肠炎、炎症性肠病、类风湿性关节炎、反应性关节炎、骨关节炎、硬皮病、骨质疏松症、动脉粥样硬化症、心肌炎、心内膜炎、心包炎、囊性纤维化、桥本甲状腺炎、麻风病、梅毒、莱姆病、莱姆疏螺旋体病、肺结核、结节病、狼疮、冻疮样狼疮、狼疮样结核病、狼疮性肾炎、系统性红斑狼疮、葡萄膜炎、肠易激综合症、克罗恩病、干燥综合征、纤维肌痛、慢性疲劳综合症、慢性疲劳免疫缺陷综合征、肌痛性脑脊髓炎、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、帕金森氏病和多发性硬化症，但不受限于此。
本文所用的术语“正常组织”指正常生理状态下的器官和组织。在本发明中，正常组织优先指心脏、肺脏、肝脏、肾脏、皮肤组织、脂肪组织，但不受限于此。
本文所用的术语“胞外囊泡”指由纳米级膜形成、从细胞或者细菌产生和释放的囊膜结构。不同来源的胞外囊泡的特点与其母体有关，胞外囊泡包含多种蛋白质和核酸。在本发明中，胞外囊泡是由正常的器官和组织中提取得到，呈球形，平均直径在20至300nm之间。
本文中提取的胞外囊泡可通过使用选自由组织剪碎、酶组织消化、梯度离心、超高速离心、分子排阻、差速离心、免疫亲和捕获组成的群组中的一种或多种的常规方法，或者将以上方法进行适当的组合从组织中分离的囊泡。此外，包括进一步诸如用于去除杂质的洗涤和浓缩所获得的囊泡之类的方法。
在一优选实施方式中，本文使用的正常组织来源的胞外囊泡,分离步骤如下:1)使用PBS和含0.1％胶原酶II的消化酶灌注后获取心脏和肾脏组织，清洗后剪碎,加入5-10倍体积滤过的含0.1％胶原酶I I的消化酶进行37℃消化30分钟；2)消化过程中可吹打组织悬液，促进心肌组织的消化；3)消化结束后对组织悬液进行梯度离心,取上清并进行超速离心；4)将沉淀进行重悬和超速离心,最终得到悬液A；5)将悬液A进行适当悬浮并进行体外细胞实验，或者治疗心肌缺血再灌注损伤和败血症等炎症性疾病。
如本文所使用的，术语“预防”是指通过施用根据本发明的组合物来抑制心肌缺血再灌注损伤、心肌梗死、心力衰竭、肾脏缺血再灌注损伤、肺脏缺血再灌注损伤、糖尿病、中风、败血症或者炎症性疾病发生或者延迟发作的作用。
如本文所使用的，术语“治疗”是指通过施用根据本发明的组合物来减轻或有益地改变心肌缺血再灌注损伤、心肌梗死、心力衰竭、肾脏缺血再灌注损伤、肺脏缺血再灌注损伤、糖尿病、中风、败血症或者炎症性疾病的症状的所有作用。
如本文所使用的，术语“减轻”是指至少减少与该疾病相关的的症状或者相关的参数(例如症状的程度)的所有作用。
胞外囊泡制剂
本发明的胞外囊泡制剂，含有安全有效量的胞外囊泡以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。
在本发明中，所述胞外囊泡的直径为20-300nm，较佳地，50-250nm，更佳地，100-200nm，并且所述胞外囊泡来源于分离的正常组织(比如肾脏组织、肺脏组织、肝脏组织、心脏组织、皮肤组织、脂肪组织)间隙，可有效治疗巨噬细胞介导的炎症反应相关性疾病。
在本发明的一个实施方案中，提取分离的正常组织间隙中的囊泡，并在体外评估其对LPS诱导的腹腔原代巨噬细胞产生炎症因子的抑制作用。使用正常心脏，肺脏，肝脏和肾脏来源的囊泡预处理巨噬细胞12小时，然后给与LPS刺激3小时，比较M1和M2型巨噬细胞极化相关的基因的表达水平。结果发现，心脏，肺脏，肝脏和肾脏组织来源的囊泡显著抑制巨噬细胞产生M1极化相关的炎症因子(NOS，IL-1β，IL-6和TNF-ɑ)的水平，上调M2功能相关的Arg1，Fizz1和Ym1的基因表达水平。
在本发明的一个实施方案中，为了评估来源于正常组织间隙的囊泡在体内的疗效，通过对小鼠心肌缺血再灌注损伤模型心肌组织中注射分离到的来源于正常组织间隙的囊泡，观察该囊泡注射后小鼠心脏的病理改变和心脏功能，结果显示，与对照组相比，接受囊泡治疗的小鼠心肌组织中炎症反应显著降低，心功能明显改善。
在本发明的另一个实施方案中，为了评估来源于正常组织间隙的囊泡在体内的疗效，对败血症小鼠给与腹腔注射囊泡，评价对照组和治疗组小鼠全身的炎症反应水平和腹腔的菌荷量，结果显示，治疗组小鼠全身炎症反应显著降低，且腹腔菌荷量减少。
本发明的制剂可以包含药学上通常可以接受的载体。药学上可接受的载体通常用于制剂中，包括生理盐水(saline)、林格氏溶液、缓冲盐水、环糊精、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、脂质体等，但不限于此，并且如果需要，还可包括其他典型的添加剂，例如抗氧化剂和缓冲剂。此外，可通过另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂、润滑剂等将组合物配制成可注射的制剂，例如水溶液、悬浮液和乳剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。关于合适的药学上可接受的载体和制剂，可以优选地通过使用Remington’sliterature(雷明顿文献)中公开的方法根据每种成分来配制组合物。本发明的药物组合物的制剂没有特别限制，但可以配制成注射剂、吸入剂、皮肤外用剂、口服剂等。
本发明的制剂可以根据所希望的方法经口或胃肠外(例如肌肉内、腹腔内、静脉内、皮下、皮内、皮肤外用、鼻内或气管内)施用，并且剂量可以根据患者的体重、疾病严重程度、药物制剂、给药途径和持续时间的选择而变化，可以由本领域普通技术人员适当地选择。
本发明的制剂以药学有效量进行使用。在本发明中，药学有效量是指足以以适用于医疗的合理利益/风险比治疗疾病的量，并且有效剂量水平可根据以下因素确定：患者的疾病类型、疾病的严重程度、药物活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径、排泄率、治疗期和同时使用的其他药物，以及其他医学领域众所周知的因素。根据本发明的组合物可以作为单独的治疗剂施用或与其他治疗剂组合施用，可以与相关技术中的治疗剂顺序或同时施用，并且可以单剂量或多剂量施用。考虑到所有上述因素，重要的是以可以在没有任何副作用的情况下获得最大效果的最小量施用组合物，可以由本领域普通技术人员适当地确定。
具体地，根据患者的年龄、性别和体重，根据本发明的药物组合物的有效量可以变化，并且通常，该药物组合物可以以0.016至160mg，优选0.2至100mg/kg体重/天或/两天，或1至3次/天的量施用。但是，由于可以通过给药途径、肥胖的严重程度、性别、体重或年龄来增加或减少剂量，因此上述剂量不以任何方式限制本发明的范围。
本发明的制剂可以被制成液态制剂，其制备可通过常规方法进行,液态制剂宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约50毫克/千克体重，约5微克/千克体重-约10毫克/千克体重，约10微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明制剂还可与其他治疗剂一起使用。
使用本发明的制剂时，是将安全有效量的药物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明的含有来源于正常组织(比如肾脏组织、肺脏组织、肝脏组织、心脏组织、皮肤组织、脂肪组织)间隙的直径为20-300nm的胞外囊泡的制剂可有效治疗巨噬细胞介导的炎症反应相关性疾病。
(2)本发明的胞外囊泡的制剂还可显著(i)降低LPS诱导的巨噬细胞产生多种M1极化相关的炎症因子(比如，NOS，IL-1β，IL-6和TNF-ɑ)的水平；和/或(ii)降低心肌组织中炎症细胞的浸润，并改善心脏缺血再灌注损伤后不同时间点的心脏功能；和/或(iii)减轻肺脏的病理改变，并显著降低腹腔细胞表达M1型巨噬细胞功能相关分子的水平，升高M2极化相关分子的表达；和/或(iv)也可显著抑制盲肠结扎穿孔建立的小鼠败血症模型腹腔中菌落的增殖。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非特别说明，否则本发明说明书中所用的试剂和材料均为市售产品。除非特别说明，否则本发明说明书中所使用的方法均为常规方法。
实施例1正常组织间隙来源的囊泡在体外对原代巨噬细胞极化和产生炎症因子的作用分析
为了评价正常组织间隙来源的囊泡在体外对巨噬细胞功能的作用，使用以下方法进行了实验。首先，使用PBS和含0.1％胶原酶II的消化酶灌注后获取正常成年C57BL/6小鼠的心脏，肺脏，肝脏和肾脏组织，清洗后剪碎，加入5-10倍体积滤过的含0.1％胶原酶II的消化酶进行37℃消化30分钟；消化过程中可吹打组织悬液，促进组织的消化；消化结束后对组织悬液进行梯度离心,取上清并进行超速离心；将沉淀进行重悬和超速离心,最终得到悬液A；将悬液A进行适当悬浮得到囊泡悬液试验操作参考已发表的文献(Ge,et al.,2019)。使用透射电镜(Hitachi,HT7700)对囊泡的形态进行分析，使用纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA，ZetaView)对囊泡的粒径进行分析。如图1A和B所示，正常组织来源的囊泡呈球型，直径在20-300nm之间，其中90％以上的囊泡直径在100-200nm之间。然后，使用上述正常心脏，肺脏，肝脏和肾脏来源的囊泡(分别为cEVs，pEVs，hEVs和nEVs)1ug/ml预处理腹腔巨噬细胞12小时，然后给与100ng/mL的LPS刺激3小时，使用荧光定量PCR技术比较巨噬细胞表达M1和M2型极化相关基因的水平。如图2，A-D所示，上述正常组织来源的囊泡显著抑制M1极化相关的炎症因子(NOS，IL-1β，IL-6和TNF-ɑ)的水平，上调M2功能相关的Arg1，Fizz1和Ym1的基因表达水平。
实施例2正常心脏和肾脏组织来源的胞外囊泡心肌内注射减轻心肌缺血再灌注损伤后炎症反应，并改善心脏功能的作用分析
为了评价正常组织来源的囊泡在体内对无菌性炎症反应和缺血再灌注损伤的作用，进行了如下实验。首先，通过结扎小鼠心脏左前降支冠状动脉45分钟后进行再灌注建立缺血再灌注损伤的小鼠模型，试验操作参考已发表的文献(Ge,et al.,2019)，再灌注后给与心肌内注射实施例1所述的正常心脏(cEVs)和肾脏组织来源的EVs(nEVs)，注射剂量为每克小鼠体重注射2ug囊泡，注射体积为50ul，在缺血周边分三点注射，术后第3天，14天和28天检测心脏功能，并于不同时间点取材评价心脏组织的炎症反应。如图3所示，使用抗CD45抗体标记心肌组织中的免疫细胞，抗F4/80抗体标记心肌组织中的巨噬细胞，DAPI标记细胞核进行免疫荧光染色，结果显示，实施例1所述的正常心脏和肾脏组织来源的EVs治疗明显减轻缺血再灌注后第3天心肌组织的炎症反应，CD45+免疫细胞和F4/80+巨噬细胞的比例均较对照组显著降低。而且，小动物心脏超声检测结果显示，治疗组小鼠左室射血分数(EF)和左室短轴缩短率(FS)在术后第3天，14天和28天均较对照组得到显著的改善(图4，A-B)。
实施例3正常心脏组织来源的胞外囊泡腹腔注射后治疗败血症的作用分析
为了评价正常组织来源的囊泡在体内对严重的感染性炎症反应的作用，进行了如下实验。首先将小鼠盲肠1/3处进行结扎，经两次穿孔后冲洗关腹建立CLP小鼠败血症模型，试验操作参考已发表的文献(Ge,et al.,2016)，术前24小时给与腹腔注射PBS 200ul或者实施例1所述的心脏组织来源的EVs 100ug(溶解于200ul PBS)中，术后24小时取材，评价EVs治疗对败血症的影响。肺脏组织的H&E染色结果如图5所示，腹腔注射实施例1所述的心脏组织来源的EVs显著改善败血症小鼠的肺脏组织病理改变。荧光定量PCR结果显示，腹腔注射实施例1所述的心脏组织来源的EVs显著降低腹腔细胞表达M1极化相关的炎症因子NOS，IL-1β，IL-6和TNF-ɑ的表达水平，同时上调M2极化相关的Arg1和MRC1的基因表达水平(图6)。CLP建模1天后，注射无菌PBS10ml并取腹腔灌洗液，1:100稀释后有氧条件下培养18小时进行菌落计数，结果如图7所示，心脏组织来源的EVs治疗也明显抑制小鼠败血症模型腹腔中菌落的增殖。
参考文献
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在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种用于预防和/或治疗炎症性疾病的胞外囊泡制剂，其特征在于，包括：
胞外囊泡，所述胞外囊泡的直径为20-300nm，较佳地，50-250nm，更佳地，100-200nm，所述胞外囊泡来源于正常组织间隙，所述正常组织选自下组：肾脏组织、肺脏组织、肝脏组织、心脏组织、皮肤组织、脂肪组织、或其组合；和
药学上可接受的载体。
2.如权利要求1所述的胞外囊泡制剂，其特征在于，所述制剂中，所述胞外囊泡的含量(wt％)为0.001％-10％,较佳地，0.005％-5％，更佳地，0.02％-2％，更佳地，0.01％-1％，按所述制剂的总重计。
3.如权利要求1所述的胞外囊泡制剂，其特征在于，所述正常组织为分离的正常组织。
4.如权利要求1所述的胞外囊泡制剂，其特征在于，所述炎症性疾病选自下组：心脏缺血再灌注损伤、心肌梗死、肾脏缺血再灌注损伤、肺脏缺血再灌注损伤、糖尿病、败血症、败血性休克、特应性皮炎、痤疮、牛皮癣、鼻窦炎、鼻炎、结膜炎、皮炎、炎性胶原血管病、脑炎、慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化、关节炎、由病毒性或细菌性感染引起的慢性炎症性疾病、结肠炎、溃疡性结肠炎、炎症性肠病、硬皮病、骨质疏松症、动脉粥样硬化症、心肌炎、心内膜炎、心包炎、桥本甲状腺炎、麻风病、梅毒、肺结核、结节病、狼疮、冻疮样狼疮、狼疮样结核病、狼疮性肾炎、系统性红斑狼疮、黄斑变性、葡萄膜炎、克罗恩病、干燥综合征、慢性疲劳综合症、慢性疲劳免疫缺陷综合征、肌痛性脑脊髓炎、帕金森氏病、多发性硬化症、或其组合。
5.如权利要求1所述的胞外囊泡制剂，其特征在于，所述炎症性疾病为巨噬细胞介导的炎症反应相关性疾病。
6.一种权利要求1所述的胞外囊泡制剂的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗炎症性疾病的药物或制剂。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述炎症性疾病选自下组：心脏缺血再灌注损伤、心肌梗死、肾脏缺血再灌注损伤、肺脏缺血再灌注损伤、糖尿病、败血症、败血性休克、特应性皮炎、痤疮、牛皮癣、鼻窦炎、鼻炎、结膜炎、皮炎、炎性胶原血管病、脑炎、慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化、关节炎、由病毒性或细菌性感染引起的慢性炎症性疾病、结肠炎、溃疡性结肠炎、炎症性肠病、硬皮病、骨质疏松症、动脉粥样硬化症、心肌炎、心内膜炎、心包炎、桥本甲状腺炎、麻风病、梅毒、肺结核、结节病、狼疮、冻疮样狼疮、狼疮样结核病、狼疮性肾炎、系统性红斑狼疮、黄斑变性、葡萄膜炎、克罗恩病、干燥综合征、慢性疲劳综合症、慢性疲劳免疫缺陷综合征、肌痛性脑脊髓炎、帕金森氏病、多发性硬化症、或其组合。
8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述炎症性疾病为巨噬细胞介导的炎症反应相关性疾病。
9.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述炎症性疾病选自下组：心肌缺血再灌注损伤，心肌梗死，肾脏缺血再灌注损伤、肺脏缺血再灌注损伤、细菌感染所致的败血症等感染性疾病。也适用于巨噬细胞介导的其他的炎症性疾病，包括：糖尿病、败血性休克、特应性皮炎、痤疮、牛皮癣、鼻窦炎、鼻炎、结膜炎、皮炎、炎性胶原血管病、脑炎、慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化、关节炎、由病毒性或细菌性感染引起的慢性炎症性疾病、结肠炎、溃疡性结肠炎、炎症性肠病、硬皮病、骨质疏松症、动脉粥样硬化症、心肌炎、心内膜炎、心包炎、桥本甲状腺炎、麻风病、梅毒、肺结核、结节病、狼疮、冻疮样狼疮、狼疮样结核病、狼疮性肾炎、系统性红斑狼疮、黄斑变性、葡萄膜炎、克罗恩病、干燥综合征、慢性疲劳综合症、慢性疲劳免疫缺陷综合征、肌痛性脑脊髓炎、帕金森氏病、多发性硬化症、或其组合。
10.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述药物或制剂还用于选自下组的一种或多种用途：
(i)降低LPS诱导的巨噬细胞产生多种M1极化相关的炎症因子(比如，NOS，IL-1β，IL-6和TNF-ɑ)的水平；
(ii)降低心肌组织中炎症细胞的浸润，并改善心脏缺血再灌注损伤后不同时间点的心脏功能；
(iii)减轻肺脏的病理改变，并显著降低腹腔细胞表达M1型巨噬细胞相关炎症因子的水平，升高M2极化相关分子的表达；
(iv)抑制盲肠结扎穿孔建立的小鼠败血症模型腹腔中菌落的增殖。
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