CN113795261A - 针对纤维化、炎症、及/或衰老症的治疗药 - Google Patents
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Abstract
在一个实施方式中，本发明以提供肺纤维症等纤维化疾病、炎症疾病、及/或衰老症的治疗及/或预防剂为课题。在一个实施方式中，本发明涉及纤维化疾病、炎症疾病、及衰老症中的至少1种疾病的治疗及/或预防剂，所述治疗及/或预防剂包含来源于可发生所述疾病的组织或其周围组织的细胞的细胞外囊泡，所述细胞为分化细胞，还涉及包含该治疗及/或预防剂的医药组合物。
Description
技术领域
在一个实施方式中，本发明涉及纤维化疾病、炎症疾病、及衰老症中的至少1种疾病的治疗及/或预防剂，以及包含该治疗及/或预防剂的医药组合物。
背景技术
组织纤维化是指在器官或组织的修复或者治愈过程中发生的、纤维结缔组织的过度形成。这样的组织纤维化可发生于各种器官中，作为纤维化疾病，已知例如肺纤维症及肝硬化等。纤维化疾病的患者在日本国内已达数十万人，但尚不存在有效的治疗方法。
肺纤维症是一种代表性的纤维化疾病，也可以称为一种炎症疾病或衰老症。肺纤维症之中，无法确定原因的特发性肺纤维症(IPF)在诊断后的平均寿命为3～5年，预后极差。日本的IPF的患病率是每10万人为约20人，认为70岁以上的老年人中的频率是前述患病率的10倍。作为肺纤维症的治疗方法，可使用吡非尼酮、尼达尼布这类抗纤维化药、甾体、免疫抑制剂等(非专利文献1～2)，但效果有限。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Azuma A等，Am.J.Respir.Crit.Care Med.,2005,171,1040-1047.
非专利文献2：Richeldi L等，N.Engl.J.Med.,2011,22,365(12),1079-1087.
发明内容
发明要解决的课题
在一个实施方式中，本发明的课题为提供肺纤维症等纤维化疾病、炎症疾病、及/或衰老症的治疗及/或预防剂。
用于解决课题的手段
本申请的发明人发现，来源于可发生上述疾病的组织或其周围组织的细胞的细胞外囊泡对于上述疾病具有优异的治疗及/或预防效果，从而完成了本发明。
本发明包含以下实施方式。
(1)纤维化疾病、炎症疾病、及衰老症中的至少1种疾病的治疗及/或预防剂，前述治疗及/或预防剂包含来源于可发生前述疾病的组织或其周围组织的细胞的细胞外囊泡，前述细胞为分化细胞。
(2)(1)所述的治疗及/或预防剂，其中，供给前述细胞外囊泡的细胞所来源的组织与接受前述细胞外囊泡的细胞的组织不同。
(3)(1)所述的治疗及/或预防剂，其中，前述细胞为上皮细胞、内皮细胞、间皮细胞、肌细胞、或神经细胞。
(4)(3)所述的治疗及/或预防剂，其中，前述上皮细胞为气道上皮细胞、小气道上皮细胞、或肺泡上皮细胞。
(5)(1)所述的治疗及/或预防剂，其中，前述组织或其周围组织选自由肺或气道；眼；肾脏或肾小球；肝脏、胆囊或胆管；肠道；胰腺；心脏；血管；甲状腺；脑或神经；腹腔内；子宫；皮肤；肌肉；骨；及关节组成的组。
(6)(5)所述的治疗及/或预防剂，其中，前述组织或其周围组织为肺或气道。
(7)(4)或(6)所述的治疗及/或预防剂，其中，前述疾病选自由硬皮病、肺纤维症、COPD(慢性阻塞性肺病)、支气管哮喘、ARDS(急性呼吸窘迫综合征)、肺动脉高压(pulmonaryhypertension)、放射性肺炎、肺结节病、胶原病伴随性肺泡出血、间质性肺炎、支气管扩张症、囊性纤维化、或支气管肺发育不良组成的组。
(8)(1)～(7)中任一项所述的治疗及/或预防剂，其中，前述细胞来源于健康正常者。
(9)(1)～(8)中任一项所述的治疗及/或预防剂，其中，前述细胞外囊泡为外泌体。
(10)医药组合物，其包含(1)～(9)中任一项所述的治疗及/或预防剂作为有效成分。
(11)(10)所述的医药组合物，其被制剂化为吸入、喷雾施予、注射、滴注、经口、经皮、经鼻、经局部、经阴道、经粘膜、或经直肠用途。
本说明书包括作为本申请优先权基础的日本专利申请号2019-074263的公开内容。
发明效果
通过本发明，能够提供纤维化疾病、炎症疾病、及/或衰老症的治疗及/或预防剂。
附图简介
图1：图1示出通过超速离心法从人原代气道上皮细胞HBEC、及人气道上皮细胞株BEAS-2B的培养上清液中回收而得的外泌体的、基于NTA的分析结果(A：HBEC，B：BEAS-2B)。深色线示出各种大小的比例，所记载的数字(A:76nm，B:86nm)表示比例最高的大小。此外，浅色线示出累计比例。
图2：图2A示出以TGF-β1及/或外泌体刺激原代肺成纤维细胞后，通过Western印迹对各种肌成纤维细胞标志物的表达进行确认而得的结果。图2B～D示出将各蛋白质的表达量除以β-肌动蛋白的表达量而得的相对值。*表示显著差异(*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001)。EV表示细胞外囊泡(Extracellular vesicle)。
图3：图3示出以TGF-β1及/或外泌体(来源于人气道上皮细胞HBEC的外泌体、来源于人小气道上皮细胞HSAEC的外泌体、或来源于源自骨髓的间充质干细胞BM-MSC的外泌体)刺激原代肺成纤维细胞后的SA-β-Gal阳性率(A)及p21的相对表达(B-D)。*表示显著差异(***：p<0.001)。
图4：图4示出以TGF-β1及/或外泌体刺激气道上皮细胞后的、通过Western印迹对活化β-连环蛋白的表达进行确认而得的结果，及其相对表达。A示出分级前的结果，B示出核的结果，C示出细胞质的结果。
图5：图5示出对外泌体与吡非尼酮(PFD)及尼达尼布的效果进行比较而得的结果。以所记载浓度的各成分刺激原代肺成纤维细胞后，通过Western印迹对各种肌成纤维细胞标志物的表达进行确认。
图6：图6示出无处置小鼠(对照)、通过施予博来霉素而制作得到的肺纤维化模型小鼠(BLM对照)、及施予了外泌体的肺纤维化模型小鼠(BLM+EV)中的Ashcroft分数(A)、以及HE染色和Masson三色染色(B)的结果。
图7：图7示出无处置小鼠(对照)、通过施予博来霉素而制作得到的肺纤维化模型小鼠(BLM对照)、及施予了外泌体的肺纤维化模型小鼠(BLM+EV)中的左肺的羟脯氨酸量(A)、以及针对细胞衰老标志物p16及p21的肺组织染色(B-C)的结果。
图8：图8示出以TGF-β1及/或外泌体(来源于HBEC的外泌体或来源于源自骨髓的间充质干细胞(BM-MSC)的外泌体)刺激原代肺成纤维细胞后的、通过Western印迹对α-SMA的表达进行确认而得的结果。
图9：图9示出以TGF-β1及/或来源于各种细胞的外泌体刺激原代肺成纤维细胞后的、通过Western印迹对α-SMA的表达进行确认而得的结果(A)、及其相对表达(B)。外泌体所来源的细胞为人气道上皮细胞HBEC(human bronchial epithelial cell)、人气道上皮细胞株BEAS-2B、人胚胎肾细胞293(HEK293)、单核细胞白血病细胞株THP1、及来源于骨髓的间充质干细胞BM-MSC(bone marrow derived mesenchymal stem cell)。
图10：图10示出以TGF-β1及/或外泌体(来源于BEAS-2B的外泌体、来源于HBEC的外泌体、或来源于HSAEC的外泌体)刺激原代肺成纤维细胞后的、通过Western印迹对I型胶原蛋白及α-SMA的表达进行确认而得的结果。
图11：图11示出以TGF-β1及/或来源于HBEC的外泌体刺激人皮肤成纤维细胞NHDF后的、通过Western印迹对I型胶原蛋白及α-SMA的表达进行确认而得的结果。
图12：图12示出无处置小鼠(对照)、向气管中喷雾脂多糖(LPS)及合成双链RNA类似物poly I:C制作而得的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)模型小鼠(LPS+poly I:C)、以及施予了来源于HBEC的外泌体的ARDS模型小鼠(LPS+poly I:C+HBEC-EV)中的BALF嗜中性粒细胞数(B)、HE染色(C)以及肺炎症分数(D)的结果。*表示显著差异(*：p<0.05、***：p<0.001)。
具体实施方式
1、疾病的治疗及/或预防剂
在一个实施方式中，本发明涉及纤维化疾病、炎症疾病、及衰老症中的至少1种疾病的治疗及/或预防剂，前述治疗及/或预防剂包含来源于可发生前述疾病的组织或其周围组织的细胞的细胞外囊泡。
在本说明书中，“纤维化疾病”意指在器官或组织的修复或者治愈过程中可发生的、伴随着纤维结缔组织的过度形成的疾病。纤维化疾病可以是起因于瘢痕组织的异常沉积的疾病、或伴随其的疾病，可发生于多种组织中。并非限定，作为纤维化疾病的例子，可举出肺纤维症、肺动脉高压、肝硬化、心肌病、缺血性心脏病、瓣膜病、心内膜心肌纤维症、心肌纤维化、动脉硬化、肾纤维症、肾硬化、肾小球硬化、硬皮病、腹膜后纤维症、及子宫纤维症。
硬皮病是以皮肤硬化为主要症状的疾病。硬皮病包括局限性硬皮病和全身性硬皮病这2类。局限性硬皮病是仅皮肤受损伤的疾病。就全身性硬皮病而言，病变不仅发生于皮肤，还发生于全身的各种器官。
在本说明书中，“炎症疾病”意指呈现持续性或暂时性的炎症状态、且通过减轻其炎症能够使症状改善的疾病。并非限定，作为炎症疾病的例子，可举出COPD(慢性阻塞性肺病)、支气管哮喘、间质性肺炎急性加重、ARDS(急性呼吸窘迫综合征)、放射性肺炎、肺结节病、支气管扩张症、囊性纤维化、支气管肺发育不良、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、肝细胞癌、克罗恩病、溃疡性结肠炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、自身免疫性胰腺炎、大动脉炎、格雷夫斯病、桥本病、糖尿病、肾炎、胶原病(例如，类风湿关节炎、SLE(系统性红斑狼疮)、血管炎、干燥综合征、关节炎、结节病)、皮肌炎、及牛皮癣。
ARDS是以先发疾病为诱因而发病的严重呼吸损伤。成为ARDS诱因的先发疾病可举出细菌性肺炎、间质性肺炎、间质性肺炎急性加重、败血症、病毒感染症、多发外伤、烫伤、急性胰腺炎、有毒气体的吸入、药物中毒、溺水、肺挫伤、放射线肺损伤、输血等。成为ARDS诱因的病毒感染症可举出由流感病毒、COVID-19等冠状病毒导致的病毒感染症，但不限于此。
在本说明书中，“衰老症”意指起因于老化并伴随组织、个体中的稳态维持功能低下而发生的疾病。衰老的代表性表型为细胞衰老，上述衰老的细胞所积累、分泌的各种介体(mediator)与引发慢性炎症、以及纤维化等结构变化和功能损伤有关。并非限定，作为衰老症的例子，可举出阿兹海默病、痴呆、帕金森病、脊髓小脑变性、及多系统萎缩。
需要说明的是，上述疾病的分类并非是相互排斥的，1种疾病可以属于多个分类。例如，原发性硬化性胆管炎及肝细胞癌是炎症疾病之一，同时也可称为纤维化疾病之一。
本发明的治疗及/或预防剂包含来源于可发生上述疾病的组织或其周围组织的细胞的细胞外囊泡，或由上述细胞外囊泡组成，或实质上由上述细胞外囊泡组成。
在本说明书中，“细胞外囊泡(Extracellular vesicle；EV)”是指从细胞释放的囊泡。已知细胞外囊泡介导细胞间交流，并参与免疫应答、凝血、吞噬作用的诱导等各种生物学过程。细胞外囊泡根据细胞内的来源而主要分为外泌体、微小囊泡体(微囊泡)、及凋亡小体。
在一个方式中，构成本发明的治疗及/或预防剂的细胞外囊泡是外泌体，或者实质上是外泌体。
在本说明书中，“外泌体”是指从各种细胞释放的直径约20～200nm的细胞外囊泡。已知外泌体可具有以细胞间通讯、抗原呈递、蛋白质以及mRNA和miRNA等核酸的运输为代表的各种功能。
细胞外囊泡或外泌体的制备方法没有限定，例如可使用以往已知的方法进行制备。例如，可以在培养基中对本说明书中记载的细胞进行培养，从培养上清液中回收细胞外囊泡或外泌体。可以适当选择培养条件(温度及时间等)，例如，培养温度可设为约20℃～约40℃、约30℃～约40℃、约35℃～约39℃、约36℃～约38℃或约37℃。培养时间可以是例如6h～7天、12h～4天、1天～3天、或约2天。可以在CO2的存在下进行培养，此时CO2浓度可以是约2％～约10％、约4％～约6％、或约5％。此外，培养中使用的培养基可根据所使用的细胞种类选择。作为能使用的培养基，可举出市售的培养基(例如，BEGM、DMEM、MEM、BME、RPMI1640、Advanced RPMI 1640、F-10、F-12、DMEM-F12、α-MEM、IMDM、McCoy's 5A培养基、mTeSR1培养基或它们的混合物)或者制备而得的培养基。培养基中也可加入各种添加物(例如，血清或血清替代物、非必需氨基酸、青霉素及链霉素等抗生素)。培养基优选不含来源于血清等其他成分的细胞外囊泡或外泌体。
从培养液中回收细胞外囊泡或外泌体的方法没有限定，可使用已知的方法进行回收。例如，可举出超速离心分离法(例如，Thery C.,Curr.Protoc.Cell Biol.(2006)Chapter 3:Unit 3.22.)、聚合物沉淀法、免疫沉降法、FACS法、超滤法、凝胶过滤法、HPLC法、及利用抗体、凝集素使其吸附于珠子等担载体上的方法。此外，也可以使用市售的细胞外囊泡或外泌体分离用试剂盒回收细胞外囊泡或外泌体。
上述回收方法中，超速离心分离法是最常用于细胞外囊泡或外泌体的分离的标准方法。超速离心分离法中的离心力可以是例如50000×g以上、100000×g以上、或150000×g以上，还可以是300000×g以下、250000×g以下、或200000×g以下。离心时间没有限定，例如，可设为30分钟～120分钟、60分钟～90分钟、或70分钟～80分钟。此外，离心分离前，可以根据需要通过过滤器过滤及/或以更低离心力进行离心分离来除去或降低杂质。
可以按照已知的方法来确认细胞外囊泡或外泌体已得到回收、或者细胞外囊泡或外泌体的物性，例如可以通过电子显微镜在视觉上进行确认，或者使用NTA(纳米跟踪分析：Nano Tracking Analysis)技术来计数细胞外囊泡或外泌体的粒径和粒子数。或者，可以通过确认可成为细胞外囊泡或外泌体的标志物的蛋白质及/或基因的表达来确认细胞外囊泡或外泌体的存在。
在本说明书中，可成为细胞外囊泡或外泌体的来源的细胞为分化细胞。本说明书中“分化细胞”是指从干细胞等未分化状态的细胞分化成的细胞。本说明书中的“分化细胞”包括存在于血液、皮肤、肌肉、神经、脂肪、消化器官、呼吸器官、泌尿器官、生殖器官、及内分泌器官等生物体组织中的已分化的细胞。例如，可举出上皮细胞、内皮细胞、间皮细胞、肌细胞、及神经细胞。
在本说明书中，细胞可以是原代培养细胞、传代培养细胞、及冷冻细胞中的任何。此外，在本说明书中，细胞可以罹患上述疾病，或者可以未罹患上述疾病。在一个实施方式中。细胞来源于健康正常者。本说明书中，“健康正常者”是指处于健康状态的个体。但是，在本说明书中，健康正常细胞也包含于广义的健康正常者中。因此，不限于个体水平，只要如从罹患了上述疾病的患者采集的正常组织、或从罹患了上述疾病的患者采集的组织之中的正常部分那样，就细胞水平而言处于健康状态，即称其为健康正常者。
成为细胞来源的生物物种没有限定，例如，可以是与施予本发明的治疗及/或预防剂或者组合物的生物相同的生物物种，没有限定，可举出哺乳动物，例如人及黑猩猩等灵长类、大鼠及小鼠等实验动物、猪、牛、马、绵羊、及山羊等家畜动物，以及狗及猫等宠物动物，例如人或小鼠，优选为人。
如上所述，细胞外囊泡或外泌体可来源于可发生上述疾病的组织或其周围组织的细胞。供给细胞外囊泡的细胞所来源的组织与接受细胞外囊泡的细胞的组织可以是相同的，或者可以处于位于彼此周围的关系，或者也可以是不同的。在一个实施方式中，供给细胞外囊泡的细胞所来源的组织与接受其的细胞的组织是相同的。在其他实施方式中，供给细胞外囊泡的细胞所来源的组织与接受其的细胞的组织是不同的。
供给细胞外囊泡的细胞所来源的组织与接受其的细胞的组织是相同的，或处于位于彼此周围的关系时，作为上述疾病与可发生所述疾病的组织或其周围组织的细胞的非限定的组合，可举出以下：
对于可发生于肺或气道的疾病(例如，肺纤维症、肺动脉高压、COPD、支气管哮喘、ARDS、放射性肺炎、肺结节病、源自胶原病(例如，SLE(系统性红斑狼疮)或血管炎)的肺泡出血、胶原病(例如，SLE、血管炎、硬皮病、干燥综合征、类风湿关节炎、结节病)伴随性间质性肺炎、支气管扩张症、囊性纤维化、支气管肺发育不良)而言，可使用来源于气道上皮细胞(例如气管上皮细胞或支气管上皮细胞)、或来源于肺泡上皮细胞(例如I型肺泡上皮细胞或II型肺泡上皮细胞)的细胞外囊泡；
对于可发生于眼的疾病(例如，糖尿病性视网膜病变)而言，可使用来源于眼的上皮细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于耳鼻咽的疾病(例如，慢性鼻窦炎、慢性中耳炎、胆脂瘤型中耳炎、鼻息肉等)而言，可使用来源于耳鼻咽的上皮细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于肾脏或肾小球的疾病(例如，肾炎、肾纤维症、肾硬化、肾小球硬化、糖尿病性肾病、以及伴随SLE和硬皮病等的肾炎)而言，可使用来源于肾脏上皮细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于肝脏、胆囊或胆管的疾病(例如，病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、肝硬化、肝细胞癌)而言，可使用来源于肝上皮细胞、胆管上皮细胞、或胆囊上皮细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于肠道的疾病(例如，克罗恩病及溃疡性结肠炎)而言，可使用来源于肠道上皮细胞(例如小肠或大肠上皮细胞)的细胞外囊泡；
对于可发生于胰腺的疾病(例如，急性胰腺炎、慢性胰腺炎、及自身免疫性胰腺炎)而言，可使用来源于胰腺上皮细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于心脏的疾病(例如，心肌病、缺血性心脏病、瓣膜病、心内膜心肌纤维症、及心肌纤维化)而言，可使用来源于心脏上皮细胞、或心肌细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于血管的疾病(例如，动脉硬化、大动脉炎、及糖尿病伴随性血管病变)而言，可使用来源于血管上皮或内皮细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于甲状腺的疾病(例如，格雷夫斯病及桥本病)而言，可使用来源于甲状腺上皮细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于脑或神经的疾病(例如，阿兹海默病、痴呆、帕金森病，脊髓小脑变性、多系统萎缩、及糖尿病性神经损伤)而言，可使用来源于脑上皮细胞、脑室管膜细胞、或神经细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于腹腔内的疾病(例如，腹膜后纤维症)而言，可使用来源于腹膜上皮细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于子宫及卵巢的疾病(例如，子宫纤维症、卵巢肿瘤)而言，可使用来源于子宫上皮细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于皮肤的疾病(例如，硬皮病、皮肌炎)而言，可使用来源于皮肤上皮细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于骨或关节的疾病(例如，类风湿关节炎)而言，可使用来源于骨细胞或软骨细胞的细胞外囊泡；
需要说明的是，硬皮病也可发生于各种器官中，皮肌炎也可发生于肌肉中，在上述情况下，可使用来源于各自的组织的细胞的细胞外囊泡。
供给细胞外囊泡的细胞所来源的组织与接受其的细胞的组织不同时，上述疾病与可发生上述疾病的组织或其周围组织的细胞的组合没有限定。
例如，对于可发生于肺或气道的上述疾病而言，可使用来源于肺以外的细胞的细胞外囊泡，例如来源于肾脏的细胞的细胞外囊泡(例如，来源于肾脏上皮细胞的细胞外囊泡)等；
对于可发生于眼的上述疾病而言，可使用来源于眼以外的细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于耳鼻咽的上述疾病而言，可使用来源于耳鼻咽以外的细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于肾脏或肾小球的上述疾病而言，可使用来源于肾脏或肾小球以外的细胞的细胞外囊泡，例如来源于肺的细胞的细胞外囊泡(例如，来源于气道上皮细胞、气管上皮细胞、支气管上皮细胞、或肺泡上皮细胞的细胞外囊泡)等；
对于可发生于肝脏、胆囊或胆管的上述疾病而言，可使用肝脏以外的细胞外囊泡；
对于可发生于肠道的上述疾病而言，可使用来源于肠道以外的细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于胰腺的上述疾病而言，可使用来源于胰腺以外的细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于心脏的上述疾病而言，可使用来源于心脏以外的细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于血管的上述疾病而言，可使用来源于血管以外的细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于甲状腺的上述疾病而言，可使用来源于甲状腺以外的细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于脑或神经的上述疾病而言，可使用来源于脑或神经以外的细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于腹腔内的上述疾病而言，可使用来源于腹腔内以外的细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于子宫的上述疾病而言，可使用来源于子宫以外的细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于卵巢的上述疾病而言，可使用来源于卵巢以外的细胞的细胞外囊泡；
对于可发生于皮肤的上述疾病而言，可使用来源于皮肤以外的细胞的细胞外囊泡、例如来源于肾脏的细胞的细胞外囊泡(例如，来源于肾脏上皮细胞的细胞外囊泡)、来源于肺的细胞的细胞外囊泡(例如，来源于气道上皮细胞、气管上皮细胞、支气管上皮细胞、或肺泡上皮细胞的细胞外囊泡)等；
对于可发生于骨或关节的疾病而言，可使用来源于骨或关节以外的细胞的细胞外囊泡；
需要说明的是，硬皮病也可发生于各种器官中，皮肌炎也可发生于肌肉中，在上述情况下，可使用来源于罹患硬皮病的组织以外的细胞的细胞外囊泡。
在本说明书中，“治疗”包括已经具有症状的患者中的疾病或其伴随性症状的完全或部分性的治愈、减轻、或发展的防止。在本说明书中，“预防”包括具有罹患疾病的可能性的患者中的发病的抑制或发病率的降低。
2、组合物
在一个方式中，本发明涉及包含本说明书中记载的细胞外囊泡或外泌体、或者治疗及/或预防剂的、用于纤维化疾病、炎症疾病、及衰老症中的至少1种疾病的治疗及/或预防的组合物，例如医药组合物、食品组合物或补充剂。本发明的组合物可以是实质上由本说明书中记载的细胞外囊泡或外泌体、或者治疗及/或预防剂组成的。
就本发明的组合物中包含的细胞外囊泡或外泌体的量(例如治疗及/或预防有效量)而言，本领域技术人员可以考虑受试体的性别、体重、年龄、以及疾病等的经历和症状等各种因素而适当决定。例如，本发明的组合物中包含的细胞外囊泡或外泌体的量没有限定，例如，可以是被施予组合物的受试体的每1kg体重为例如约0.0001～100.0mg、约0.001～10.0mg、约0.01～1.0mg或约0.05～2.0mg。
除上述细胞外囊泡或外泌体、或者治疗及/或预防剂以外，本发明的组合物可以还含有其他成分、药学上可接受的担载体等担载体，例如无菌水、生理盐水、缓冲剂、赋形剂、粘结剂、崩解剂、乳化剂、表面活性剂、稳定剂、润滑剂、稀释剂、流动性增强剂、矫味剂、着色剂、及香料等。
本发明的组合物可通过常规方法进行制剂化。制剂化可参见例如雷明登氏药学全书(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(Merck Publishing Co.,Easton,Pa.)中记载的方法。
施予形态没有特别限制，可根据需要适当选择，但通常可作为片剂、胶囊剂、颗粒剂、细粒剂、散剂、液剂、糖浆剂、悬浮剂、乳剂、及酏剂等经口制剂，或者注射剂、滴注剂、栓剂、吸入剂、经皮吸收剂、经粘膜吸收剂、贴剂、及软膏剂等非经口制剂进行施予。
本发明的组合物的施予途径没有限定，例如，可通过吸入、喷雾施予用、注射、滴注、经口、经皮、经鼻、经局部、经阴道、经粘膜、或经直肠来施予。此外，本发明的组合物可制剂化为吸入、喷雾施予、注射、滴注、经口、经皮、经鼻、经局部、经阴道、经粘膜、或经直肠用途。施予途径可根据适用疾病而适当选择，例如，如果是肺病，则可以设为吸入或喷雾施予。
作为可施予本发明的治疗及/或预防剂或者组合物的受试体，没有限定，可举出哺乳动物，例如人及黑猩猩等灵长类；大鼠及小鼠等实验动物；猪、牛、马、绵羊、及山羊等家畜动物；以及狗及猫等宠物动物，例如人或小鼠，优选为人。
就本说明书中记载的细胞外囊泡或外泌体、治疗及/或预防剂、或者组合物的施予量、施予间隔和施予时间而言，本领域技术人员可以考虑受试体的性别、体重、年龄、以及疾病等的经历和症状等各种因素来适当决定。例如，细胞外囊泡或外泌体、治疗及/或预防剂、或者组合物的施予量可以是例如约0.0001～100.0mg/1kg体重、约0.001～10.0mg/1kg体重、约0.01～1.0mg/1kg体重或约0.05～2.0mg/1kg体重。此外，施予次数没有限定，可以是1天3次、1天2次、1天1次、2天1次、3天1次、1周1次、2周1次、1月1次等。此外，施予时间没有限定，可以是1天、2天、3天、1周、2周、1个月、半年、一年、或更久。
3、其他方式
在一个方式中，本发明涉及纤维化疾病、炎症疾病、及衰老症中的至少1种疾病的治疗及/或预防方法，所述方法包括向受试体施予本说明书中记载的细胞外囊泡或外泌体、治疗及/或预防剂、或者组合物的步骤。本方式中的施予对象、施予量、施予次数、及施予途径等如上述“2、组合物”中的记载。
在一个方式中，本发明涉及用于在纤维化疾病、炎症疾病、及衰老症中的至少1种疾病的治疗及/或预防中使用的、本说明书中记载的细胞外囊泡或外泌体、治疗及/或预防剂、或者组合物。
以下，参考实施例进一步详细地说明本发明，但本发明的范围不受实施例限定。
实施例
材料和方法
试验操作规程经过东京慈惠会医科大学的校内伦理委员会批准。此外，对于使用材料，全部获得书面同意。
(试样：人原代气道上皮细胞及人原代肺成纤维细胞)
人原代气道上皮细胞(HBEC)及人原代肺成纤维细胞均于东京慈惠会医科大学附属医院内从肺切除组织进行分离培养而获得。分离培养的方法如过往报道所述(Araya J.等，2007,J.Clin.Invest.,117,pp.3551～3562)。此外，人气道上皮细胞株BEAS-2B购自ATCC(美国马纳萨斯)，人小气道上皮细胞HSAEC购自Lonza，来源于骨髓的间充质干细胞BM-MSC购自RIKEN，人胚胎肾细胞293(HEK293)购自ATCC，单核细胞白血病细胞株THP1购自ATCC，人皮肤成纤维细胞NHDF购自Lonza。
(细胞培养)
于37℃、5％CO2，在含有10％热失活胎牛血清(FBS)及Antibiotic-Antimycotic(Thermo Fisher Scientific)的培养基中维持细胞。使用Advanced RPMI 1640培养基(Thermo Fisher Scientific)培养BEAS-2B，使用BEGM培养基(Lonza)培养人原代气道上皮细胞，使用DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)培养人原代肺成纤维细胞，使用SAGM培养基(Lonza)培养HSAEC，使用MessenPRO培养基(Thermo Fisher Scientific)培养BM-MSC，使用RPMI1640培养基(Thermo Fisher Scientific)培养HEK293，使用RPMI1640培养基(Thermo Fisher Scientific)培养THP1，使用DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)培养NHDF。
(外泌体回收方法)
进行如下培养2天，并回收培养上清液：使用Advanced RPMI1640培养基(ThermoFisher Scientific)培养人气道上皮细胞株BEAS-2B，使用BEGM培养基(Lonza)培养人原代气道上皮细胞HBEC，使用SAGM培养基(Lonza)培养HSAEC，使用STEMPRO培养基(ThermoFisher Scientific)培养BM-MSC，使用Advanced DMEM培养基(Thermo FisherScientific)培养HEK293，使用AdvancedRPMI1640培养基(Thermo Fisher Scientific)培养THP1。回收的培养上清液以0.22μm过滤器(Millipore)过滤后，使用超速离心法(35,000r.p.m.、70分钟、4℃、SW41Ti转子、Beckman公司)分离纯化外泌体。需要说明的是，超速离心法是通过将试样进行超速离心来使外泌体沉淀而分离的技术，是最常用于外泌体分离的标准方法。得到的外泌体使用NTA(Nano Tracking Analysis)技术测量粒径和粒子数(NanoSight)。
(Western印迹)
使用哺乳动物蛋白抽提试剂(Mammalian Protein Extract Reagent)(M-PER、Thermo Fisher Scientific)从添加了外泌体及/或转化生长因子-β(TGF-β)1的人原代气道上皮细胞、人原代肺成纤维细胞、人皮肤成纤维细胞中回收蛋白质。向得到的试样中添加样品缓冲液(Wako、198-13282或191-13272)，使用SDS-PAGE进行电泳。之后，进行膜转印(聚偏氟乙烯膜、Millipore)，和使用了Blocking One(Nacalai Tesque)的封闭。抗原抗体反应后，使用ImmunoStar LD(Wako)使其发光，进行定量。作为一抗，使用α平滑肌肌动蛋白(α-SMA、Sigma-Aldrich、A2547)、山羊抗-COL1/I型胶原蛋白(Southern Biotech、1310-01)、小鼠抗-FN1/含有额外结构域A的细胞纤连蛋白(Abcam、ab6328)、小鼠抗-ACTB/b-肌动蛋白(Sigma-Aldrich、A5316)、兔抗-p21Waf1/Cip1(Cell Signaling Technology、2947)、兔抗-β-连环蛋白(Cell Signaling Technology、8480)、兔抗-非磷酸化(活化)β-连环蛋白(CellSignaling Technology、19807)。将得到的条带的强度使用Image J进行数值化。
(衰老相关的β-半乳糖苷酶(Senescence associatedβ-galactosidase)染色)
向人原代气道上皮细胞添加TGF-β1及/或来源于气道上皮细胞的外泌体，使用衰老相关的β-半乳糖苷酶染色试剂盒(Sigma,CS0030)计数染色阳性细胞数。染色根据制造商的说明书进行。
(WNT/b-连环蛋白信号分析中的细胞成分分级)
核、细胞质蛋白质的分级使用细胞成分分级试剂盒(Nuclear and CytoplasmicExtraction Reagents、Thermo Fisher Scientific、78833)，根据制造商的说明书进行。
(动物实验)
动物实验根据东京慈惠会医科大学的实验动物研究机构的指南来实施。使用如下制得的肺纤维化模型小鼠：将2.5U/kg博来霉素(Nippon Kayaku Co.、4234400D4032)溶解于50μl生理盐水中，经气道施予至8-12周龄的C57BL/6J小鼠。在施予博来霉素后的第7、14天，经气道地施予来源于BEAS2B的外泌体3μg(50μl)。在施予后第17天处死，用于以下免疫组织染色。
(免疫组织染色)
将小鼠肺如过往报道所述地通过Masson三色染色、以及苏木精和曙红染色进行评价(Kobayashi K.等，J.Immunol.,2016,197(2),pp.504-16)。此外，使用Ashcroft方法由Masson三色染色的组织决定Ashcroft分数，评价纤维化。对于针对细胞衰老标志物p16的组织染色而言，作为一抗，使用抗-小鼠CDKN2A/p16INK4a抗体(abcam、ab54210)。对于针对细胞衰老标志物p21的组织染色而言，作为一抗，使用兔抗-p21Waf1/Cip1(Cell SignalingTechnology、2947)。
羟脯氨酸量的测定通过羟脯氨酸检测试剂盒(Chondrex、6017)进行。
(统计学分析)
实验均至少重复3次，其结果以平均±SEM的形式示出。就分析而言，3个的比较使用Student t检验，3个以上的比较使用ANOVA。使用Prism version 7(GraphPad Software,San Diego,CA)，将p值<0.05作为统计学显著差异。
(来源于HBEC的外泌体与来源于源自骨髓的MSC外泌体的比较)
向原代肺成纤维细胞中添加TGF-β1 2ng/ml及/或外泌体10μg/ml(来源于HBEC的外泌体或来源于源自骨髓的间充质干细胞(BM-MSC)的外泌体)，培养24小时，更换培养基并进一步培养48小时。然后，与上述同样地进行Western印迹。来源于BM-MSC的外泌体是将BM-MSC用StemPro MSC SFM(Thermo Fisher Scientific)进行培养，使用超速离心法从培养上清液中与上文中来源于HBEC的外泌体同样地进行回收而得的。
(ARDS模型小鼠)
通过将作为革兰氏阴性菌成分的、用于败血症模型的脂多糖(LPS)与作为模仿病毒RNA的合成双链RNA类似物的Poly I:C直接喷雾至小鼠(C57BL/6J、8周龄、雄性)的气管，制作急性呼吸窘迫综合征(ARDS)模型小鼠。具体而言，在喷雾LPS(5μg/mg)的4小时后喷雾Poly I:C(5μg/mg)，再过20小时后处死小鼠，进行BALF嗜中性粒细胞数的测定、HE染色、及肺炎症分数的测定。在使用来源于HBEC的外泌体的情况下，在Poly I:C喷雾的同时，每1个体经气道喷雾2x109个粒子(图12A)。
通过以下方法测定BALF(支气管肺泡清洗液)嗜中性粒细胞数。首先，使用台盼蓝测量BALF中的总细胞数。然后，将BALF用Auto smear离心机(CF-120、800rpm、5分钟)离心，将得到的上清液用迪夫快速(Diff-Quik)染色进行染色，计数相对于总细胞数而言的嗜中性粒细胞数的比例，由此算出BALF中的嗜中性粒细胞数。
参考Sun Y.Q.等，Stem Cells,30(12)；2692-9(2012)中记载的方法，通过以下方法测定肺炎症分数。在1只小鼠的肺切片中，随机地选择支气管周围的5个区域。针对各个区域，将支气管周围及血管周围的炎症细胞浸润分数化为0～3这4个阶段。将5个区域的分数平均值作为肺炎症分数。
＜结果＞
(制备的外泌体的分析)
从人原代气道上皮细胞HBEC及人气道上皮细胞株BEAS-2B的培养上清液中通过超速离心回收而得的外泌体的、基于NTA的分析结果(A：HBEC、B：BEAS-2B)示于图1中。
上述结果显示通过超速离心成功地回收了外泌体。此外，回收的外泌体的平均直径为约80nm左右。
(外泌体对TGF-β1诱导肌成纤维细胞分化造成的抑制)
在肺纤维症、COPD、及支气管哮喘等气道重建的病况形成中，向肌成纤维细胞的分化发挥了重要的作用。因此，研究了外泌体对肺成纤维细胞的影响。
向原代肺成纤维细胞添加TGF-β1 2ng/ml及/或外泌体10μg/ml(HBEC-EV)24小时，更换培养基，进一步培养48小时。之后，通过Western印迹对作为肌成纤维细胞的标志物的α-SMA、I型胶原蛋白及纤连蛋白、以及作为管家蛋白的肌动蛋白的表达进行确认，结果示于图2A中。此外，将各蛋白质的表达量除以肌动蛋白的表达量进行数值化而得的结果示于图2B～D中。被TGF-β1诱导的α-SMA、I型胶原蛋白及纤连蛋白的表达上升由于添加外泌体而下降，由此表明，来源于HBEC的外泌体抑制TGF-β1诱导肌成纤维细胞分化。
(外泌体对TGF-β1诱导肺上皮细胞衰老造成的抑制)
近年来，肺上皮细胞衰老在肺纤维症及COPD病况等中的参与逐渐广为人知。因此，研究了外泌体对肺上皮细胞的衰老的影响。
将TGF-β1 2ng/ml与来源于气道上皮细胞(HBEC)的外泌体10μg/ml一同添加至气道上皮细胞(HBEC)中，培养48小时。结果抑制了作为衰老标志物的SA-β-Gal(衰老相关的β-半乳糖苷酶，Senescence associatedβ-galactosidase)(图3A)及p21(图3B)的由TGF-β1导致的表达上升。当使用来源于人小气道上皮细胞(HSAEC)的外泌体时，与来源于HBEC的外泌体同样地，也抑制了p21的由TGF-β1导致的表达上升(图3C)。与来源于BM-MSC的外泌体相比，来源于HBEC的外泌体导致的针对p21表达上升的抑制效果更大(图3D)。
接下来，针对由外泌体导致的细胞衰老抑制的作用机制进行了研究。迄今为止，已知在肺纤维症中，抑制WNT/b-连环蛋白信号会对肌成纤维细胞分化进行抑制。
因此，调查了来源于气道上皮细胞的外泌体带来的WNT/b-连环蛋白的影响。结果，外泌体抑制TGF-β1诱导WNT/b-连环蛋白，因而提示了外泌体介由WNT/b-连环蛋白的抑制对TGF-β1诱导肌成纤维细胞分化进行抑制(图4、A：分级前、B：核、C：细胞质)。
以上结果显示，来源于气道上皮细胞的外泌体可通过抑制肌成纤维细胞的分化及/或上皮细胞的衰老来实现对肺纤维症等的治疗及/或预防效果。
(与现有治疗药的比较)
实施了与作为针对特发性肺纤维症的现有治疗药的吡非尼酮和尼达尼布的效果比较。将吡非尼酮的血中浓度10μg/ml及其50倍浓度的500μg/ml以及尼达尼布的血中浓度100nM及其50倍浓度的5000μg/ml作为比较对象。将原代肺成纤维细胞以记载的浓度的各成分刺激24小时，更换培养基，进一步培养48小时后，进行分析。
结果示于图5中。来源于气道上皮细胞株的外泌体浓度依赖性地抑制作为TGF-β1诱导肌成纤维细胞分化标志物的I型胶原蛋白、纤连蛋白(FN)、及α-SMA，其抑制效果与IPF治疗药的血中浓度为同等水平或更高。
(动物实验)
向8-12周龄的C57BL/6J小鼠经气道地施予2.5U/kg博来霉素，制作肺纤维化模型小鼠。通过向该模型小鼠经气道地施予来源于气道上皮细胞株的外泌体，降低了经由Masson三色染色认定的肺纤维化分数(图6A及B)。进而通过经气道地施予来源于气道上皮细胞株的外泌体，作为胶原蛋白积累的指标的肺组织的羟脯氨酸量降低(图7A)，作为细胞衰老标志物的p16及p21的阳性细胞的数量减少(图7B及C)。因此表明，来源于气道上皮细胞株的外泌体在体内抑制肺纤维症小鼠的纤维化及衰老。
(与来源于MSC的外泌体的比较)
向原代肺成纤维细胞添加TGF-β1及/或外泌体(来源于HBEC的外泌体或来源于源自骨髓的间充质干细胞(BM-MSC)的外泌体)，培养24小时，更换培养基，进一步培养48小时。然后，将通过Western印迹对作为肌成纤维细胞的标志物的α-SMA及作为管家蛋白的肌动蛋白的表达进行确认而得的结果示于图8中。如图8所示，对于被TGF-β1诱导的α-SMA的表达上升而言，与来源于BM-MSC的外泌体相比，添加来源于HBEC的外泌体使其显著地下降。该结果表明，较之未分化的BM-MSC，来源于已分化的HBEC的外泌体可具有在肺中的较高的肌成纤维细胞分化抑制能力。
(来源于气道上皮细胞以外的细胞的外泌体的效果)
通过将来源于气道上皮细胞(HBEC)以外的细胞的外泌体添加至原代肺成纤维细胞，研究了针对TGF-β1诱导肌成纤维细胞分化的效果。具体而言，对于来源于人气道上皮细胞(HBEC)、人气道上皮细胞株(BEAS-2B)、人胚胎肾细胞293(HEK293)、单核细胞白血病细胞株(THP1)、人小气道上皮细胞(HSAEC)的外泌体、以及来源于源自骨髓的间充质干细胞(BM-MSC)的外泌体，研究了针对TGF-β1诱导肌成纤维细胞分化的效果。
针对被TGF-β1诱导的α-SMA的表达上升，来源于BEAS-2B的外泌体及来源于HEK293的外泌体显示出与来源于HBEC的外泌体同等的抑制效果。上述外泌体的效果均较之来源于BM-MSC的外泌体更为显著(图9A及B)。另一方面，来源于THP1的外泌体未观察到效果。针对被TGF-β1诱导的α-SMA及I型胶原蛋白的表达上升，来源于BEAS-2B的外泌体及来源于HSAEC的外泌体显示出与来源于HBEC的外泌体同等的抑制效果(图10)。
上述结果表明，来源于气道上皮细胞以外的细胞(例如肾细胞、肺泡上皮细胞等)的外泌体也可具有在肺中的较高的肌成纤维细胞分化抑制能力。
(外泌体对皮肤成纤维细胞的TGF-β1诱导肌成纤维细胞分化造成的抑制效果)
研究了来源于HBEC的外泌体对皮肤成纤维细胞是否也具有抑制纤维化的效果。
向皮肤成纤维细胞(NHDF)添加TGF-β1 2ng/ml及/或外泌体10μg/ml(HBEC-EV)24小时，更换培养基，进一步培养48小时。然后，将通过Western印迹对作为肌成纤维细胞的标志物的α-SMA及I型胶原蛋白、以及肌动蛋白的表达进行确认而得的结果示于图11中。
在皮肤成纤维细胞(NHDF)中，被TGF-β1诱导的α-SMA及I型胶原蛋白的表达上升由于添加外泌体而下降，由此表明，来源于HBEC的外泌体在皮肤成纤维细胞中也对TGF-β1诱导肌成纤维细胞分化进行抑制。该结果显示了来源于肺的外泌体在不同于肺的组织中能够成为硬皮病的治疗药的可能性。
(ARDS模型中的外泌体的效果)
研究了来源于HBEC的外泌体是否具有抑制急性呼吸窘迫综合征(ARDS)模型小鼠中的炎症反应的效果。
将脂多糖(LPS)喷雾喷雾至气管4小时后，将poly I:C及/或外泌体(HBEC-EV)喷雾至气管，制作急性呼吸窘迫综合征(ARDS)模型小鼠，再过20小时后解剖小鼠(图12A)，针对肺中的炎症反应进行研究。
被LPS及poly I:C诱导的嗜中性粒细胞数量的增大被来源于HBEC的外泌体显著地抑制(图12B)。此外，用HE染色进行评价的病理图像中显示，来源于HBEC的外泌体使得气管、血管周围的炎症细胞浸润减少，肺损伤得到抑制(图12C)。进而，被LPS及poly I:C诱导的肺炎症分数的增大由于来源于HBEC的外泌体而显著下降(图12D)。以上结果显示了本发明的外泌体能够成为包括ARDS在内的炎症疾病的治疗药的可能性。
本说明书中引用的所有出版物、专利及专利申请均通过引用直接并入本说明书中。
Claims (11)
1.纤维化疾病、炎症疾病、及衰老症中的至少1种疾病的治疗及/或预防剂，所述治疗及/或预防剂包含来源于可发生所述疾病的组织或其周围组织的细胞的细胞外囊泡，所述细胞为分化细胞。
2.如权利要求1所述的治疗及/或预防剂，其中，供给所述细胞外囊泡的细胞所来源的组织与接受所述细胞外囊泡的细胞的组织不同。
3.如权利要求1所述的治疗及/或预防剂，其中，所述细胞为上皮细胞、内皮细胞、间皮细胞、肌细胞、或神经细胞。
4.如权利要求3所述的治疗及/或预防剂，其中，所述上皮细胞为气道上皮细胞、小气道上皮细胞、或肺泡上皮细胞。
5.如权利要求1所述的治疗及/或预防剂，其中，所述组织或其周围组织选自由肺或气道；眼；肾脏或肾小球；肝脏、胆囊或胆管；肠道；胰腺；心脏；血管；甲状腺；脑或神经；腹腔内；子宫；皮肤；肌肉；骨；及关节组成的组。
6.如权利要求5所述的治疗及/或预防剂，其中，所述组织或其周围组织为肺或气道。
7.如权利要求4或6所述的治疗及/或预防剂，其中，所述疾病选自由硬皮病、肺纤维症、COPD(慢性阻塞性肺病)、支气管哮喘、ARDS(急性呼吸窘迫综合征)、肺动脉高压、放射性肺炎、肺结节病、胶原病伴随性肺泡出血、间质性肺炎、支气管扩张症、囊性纤维化、或支气管肺发育不良组成的组。
8.如权利要求1～7中任一项所述的治疗及/或预防剂，其中，所述细胞来源于健康正常者。
9.如权利要求1～8中任一项所述的治疗及/或预防剂，其中，所述细胞外囊泡为外泌体。
10.医药组合物，其包含权利要求1～9中任一项所述的治疗及/或预防剂作为有效成分。
11.如权利要求10所述的医药组合物，其被制剂化为吸入、喷雾施予、注射、滴注、经口、经皮、经鼻、经局部、经阴道、经粘膜、或经直肠用途。
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| SHENGYANG HE等: "THE PROTECTIVE ROLE OF BRONCHIAL EPITHELIAL CELLS DERIVED EXOSOME IN COPD", 《RESPIROLOGY》, vol. 23, no. 2, pages 47 - 48, XP055972808, DOI: 10.1111/resp.13419_109 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114272265A (zh) * | 2022-01-21 | 2022-04-05 | 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） | 来源于正常组织间隙的胞外囊泡及其用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3954435A1 (en) | 2022-02-16 |
| EP3954435A4 (en) | 2022-11-23 |
| WO2020209304A1 (ja) | 2020-10-15 |
| US20220160786A1 (en) | 2022-05-26 |
| JPWO2020209304A1 (zh) | 2020-10-15 |
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