KR101742594B1

KR101742594B1 - 체내 유지 시간이 향상된 치과용 흡수성 차폐막의 제조 방법 및 이러한 방법으로 제조된 치과용 흡수성 차폐막

Info

Publication number: KR101742594B1
Application number: KR1020160003394A
Authority: KR
Inventors: 최다미; 송주동; 엄태관; 최규옥
Original assignee: 오스템임플란트 주식회사
Priority date: 2016-01-11
Filing date: 2016-01-11
Publication date: 2017-06-01

Abstract

본 발명은 포유류에서 유래된 순수한 type 1 콜라겐(collagen) 및/또는 type 3 콜라겐으로 이루어진 치과용 흡수성 콜라겐 멤브레인(membrane)에 관한 것으로, 체내에서 장기간 유지되면서도 치밀한 구조를 가지고, 외부 박테리아의 침투를 효과적으로 방어하여 감염에 대한 저항성이 우수한 콜라겐 멤브레인의 제조 방법 및 이러한 방법으로 제조된 콜라겐 멤브레인에 관한 것으로, 콜라겐 용해, 염처리, 가교, 유기용매 처리, 압착, 멸균보호용액 처리, 동결건조 및 멸균 단계를 거쳐 제조되며, 가교도와 분해 효소 저항성이 향상되어 환부의 골형성이 완료되는 시점까지 체내에서 장기간 유지될 수 있는 장점이 있다.

Description

체내 유지 시간이 향상된 치과용 흡수성 차폐막의 제조 방법 및 이러한 방법으로 제조된 치과용 흡수성 차폐막{Preparation Method of a Dental Collagen Membrane with Improved Durability and a Dental Collagen Membrane Prepared Thereby}

본 발명은 포유류에서 유래된 순수한 type 1 콜라겐(collagen) 및/또는 type 3 콜라겐으로 이루어진 치과용 흡수성 콜라겐 멤브레인(membrane)에 관한 것으로, 체내에서 장기간 유지되면서도 치밀한 구조를 가지고, 외부 박테리아의 침투를 효과적으로 방어하여 감염에 대한 저항성이 우수한 콜라겐 멤브레인의 제조 방법 및 이러한 방법으로 제조된 콜라겐 멤브레인에 관한 것으로, 콜라겐 용해, 염처리, 가교, 유기용매 처리, 압착, 멸균보호용액 처리, 동결건조 및 멸균 단계를 거쳐 제조되는 것을 특징으로 한다.

일반적으로, 악안면 영역에서 치주염, 치아 상실, 악골 기형 등으로 골 결손부가 발생하는 경우, 골 결손부 재건을 위해 오랫동안 골유도 재생 시술이 사용되어 왔다. 이러한 골유도 재생 시술을 위해서는 골 결손부에 골 이식재를 채운 후, 차폐막을 덮어서 연조직 개입을 막고 골조직 유입을 유도한다. 즉, 이러한 차폐막은 골 결손부에 골 이식재를 채운 후 단순히 이를 덮는 방법에 따라 연조직의 개입을 막도록 하는 기능을 수행한다.

하지만, 이러한 종래의 골 이식재는 가루 형태로 형성됨에 따라 출혈이나 흡입에 의해 골 결손부에서 흩어지기 쉽고, 연조직 판막 조작이나 봉합과정 등에서 위치를 벗어나는 경우가 발생하는 문제가 있으며, 골 이식재의 분산은 골 결손부의 재생 능력을 떨어뜨려 골 치유의 저해요인으로 작용할 수 있다.

또한, 기존의 차폐막의 적용을 위해서는 골 결손부와 골 이식재의 범위에 따라 형태와 크기에 맞도록 재단해야 하는데, 이로 인해 수술 시간이 지연되고 조작상의 어려움이 발생하는 문제가 있으며, 차폐막은 적절히 고정되지 못하는 경우에는, 치유과정 중에도 골 이식재의 변위나 움직임에 의해 골 치유가 저해되고, 원하는 양의 골 재생을 도모하지 못할 수 있는 문제가 있다.

등록특허 제1260757호에는 이러한 기존의 차폐막의 문제점을 해결하고, 이식 후 급격한 분해를 방지하면서, 차폐막 안으로 연조직이 침투하는 것을 효과적으로 차단하여, 골 형성 기간 동안 차폐막으로서의 역할을 충실히 수행할 수 있도록 생분해성 재료와 수화젤이 다중층으로 결합된 다중층 흡수성 치주조직 재생 유도막에 관한 내용이 제시되어 있다.

이러한 흡수성 멤브레인 중 콜라겐 멤브레인은 임상적으로 장기간 안전성이 확보된 재료이나, 이식 후 체내 유지 기간이 짧아 치조골이 충분히 형성되기 전에 분해되며, 빠른 분해속도로 인해 일정 시점 이후부터 박테리아 및 세균의 침투를 효과적으로 방어할 수 없는 경우가 많아 2차 감염에 취약한 문제점이 존재한다.

상기 문제점들을 해결하기 위하여 기존의 상용화된 콜라겐 멤브레인들은 화학적 가교제를 사용하여 콜레겐 멤브레인의 체내 분해기간을 연장시키는 방식을 적용하고 있으나, 화학적 가교제를 이용한 분해기간의 지연에는 한계가 있으며, 무엇보다 미반응 후 잔류되는 가교제에 의한 체내 염증 반응의 유발 가능성으로 인해 이상적인 해결 방법으로 보기 어렵다.

따라서 콜라겐 멤브레인의 체내 유지 기간을 지연시키는 방법으로서 화학적 가교제 사용에 대한 의존도를 낮추면서도 골 생성이 완료되는 시점까지 유지될 수 있는 멤브레인에 대한 개발이 필요하다.

등록특허 제1213244호 (2012년 12월 18일 등록공고) 등록특허 제1260757호 (2013년 5월 6일 등록공고)

본 발명은, 이러한 기존의 흡수성 차폐막 혹은 콜라겐 멤브레인이 갖는 문제점을 해결하기 위한 것으로, 환부의 골형성이 완료되는 시점까지 체내에서 장기간 유지되는 콜라겐 멤브레인의 제조 방법 및 이러한 방법으로 제조된 흡수성 차폐막에 관한 것으로, 외부 박테리아의 침투를 효과적으로 방어하여 감염에 대한 저항성이 강한 콜라겐 멤브레인을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 실시 형태에 따른 치과용 흡수성 차폐막의 제조 방법은, 약 0.5 ~ 3 wt%의 농도를 갖는 콜라겐 수용액을 준비하는 단계; 염화합물 수용액을 상기 콜라겐 수용액과 혼합하여 혼합용액을 제조한 후, 10 ~ 37℃의 범위에서 4 ~ 24 시간 동안 유지시킴으로써 염처리를 수행하는 단계; 상기 염처리가 수행된 혼합용액에 가교제를 혼합하여 상기 콜라겐의 가교 과정을 수행하는 가교 단계; 가교된 콜라겐 내에 포함된 수분을 제거하기 위해 상기 콜라겐에 1~10분 동안 압력을 가하는 압착 단계; 유기용매 처리 단계를 거친 콜라겐을 동결 건조하여 수분함유량이 6 wt% 이하로 유지시키는 동결 건조 단계; 및 동결 건조된 콜라겐을 멸균처리하는 단계;를 포함한다.

본 발명의 치과용 흡수성 차폐막의 제조 방법은, 상기 가교 단계와 압착 단계의 사이에, 상기 콜라겐을 유기용매와 물이 부피비로 1:1 혼합된 유기용매 혼합 수용액에 침지시키는 유기용매 처리 단계;를 더 포함할 수 있으며, 혹은 상기 압착 단계와 동결 건조 단계의 사이에, 후속되는 멸균처리 과정에서 발생되는 라디칼을 포집하고, 콜라겐의 손상을 감소시키기 위해, 정제수와 인산 완충 식염수(PBS: Phosphate Buffer Saline)가 부피비로 1:1 혼합된 수용액에 EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)과 아스코빅산(Ascobic acid) 또는 아스코빅 유도체가 혼합된 멸균보호 용액에 상기 콜라겐을 침지시키는 멸균보호 용액 처리 단계를 더 포함할 수 있다.

선택적으로 본 발명의 치과용 흡수성 차폐막의 제조 방법은, 상기 가교 단계와 압착 단계의 사이에, 상기 콜라겐을 유기용매와 물이 부피비로 1:1 혼합된 유기용매 혼합 수용액에 침지시키는 유기용매 처리 단계;를 포함하고, 상기 압착 단계와 동결 건조 단계의 사이에, 후속되는 멸균처리 과정에서 발생되는 라디칼을 포집하고, 콜라겐의 손상을 감소시키기 위해, 정제수와 인산 완충 식염수(PBS: Phosphate Buffer Saline)가 부피비로 1:1 혼합된 수용액에 EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)과 아스코빅산(Ascobic acid) 또는 아스코빅 유도체가 혼합된 멸균보호 용액에 상기 콜라겐을 침지시키는 멸균보호 용액 처리 단계;를 포함하는 것도 가능하다.

상기 염처리를 수행하는 단계에 사용되는 염화합물은, 인산염, 칼슘염, 나트륨염 또는 이들의 혼합물이고, 염화합물 수용액의 농도는 0.1 ~ 10M인 것이 바람직하고, 상기 가교 단계에서 사용되는 가교제는, 포름알데히드(formaldehyde), α-하이드록시아디프알데히드(α-hydroxyadipaldehyde), 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 또는 EDC/NHS (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide/N-hydroxy succinimide)가 1wt%의 농도로 사용되는 것이 바람직하며, 상기 가교 단계는 10 ~ 37℃의 범위에서 4 ~ 24 시간 동안 진행되는 것이 바람직하다.

상기 유기용매 처리 단계에서 사용되는 유기용매는, 에틸 알코올, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 에틸에테르, 부탄올, 이소프로필 알코올, 메탄올, 메톡시에탄올, 아세톤 또는 이들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 두개 이상의 혼합물이 사용될 수 있고, 상기 멸균보호 용액은 0.5M의 EDTA과 0.1~ 5 mM의 아스코빅산 또는 아스코빅 유도체가 혼합되는 것이 바람직하며, 상기 아스코빅 유도체는, ascorbic acid 2-glucoside(AA-2G), ascorbic acid 2-phosphate(AA-2P) 또는 ascorbic acid 2-sulfate(AA-2S))가 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 실시 형태로 상기 언급된 방법으로 제조된 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막을 포함한다.

본 발명은, 콜라겐 용해 단계, 염처리 단계, 가교 단계, 유기용매 처리 단계, 동결 건조 단계 및 멸균 단계를 거처 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막을 제조함으로써, 가교도와 분해 효소 저항성을 향상시켜 환부의 골형성이 완료되는 시점까지 체내에서 장기간 유지될 수 있는 장점이 있다.

또한, 상기 유기용매 처리 단계 이후에 콜라겐 내에 포함된 수분을 제거하기 위해 상기 콜라겐에 압력을 가하는 압착 단계; 및/또는 후속되는 멸균처리 과정에서 발생되는 라디칼을 포집하고, 콜라겐의 손상을 감소시키기 위해, 정제수와 인산 완충 식염수(PBS: Phosphate Buffer Saline)가 혼합된 수용액에 EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)과 아스코빅산(Ascobic acid) 또는 아스코빅 유도체가 혼합된 멸균보호 용액에 상기 콜라겐을 침지시키는 멸균보호 용액 처리 단계;를 추가로 더 수행함으로써, 가교도와 분해 효소 저항성을 더욱 향상시킬 수 있는 효과가 있으며, in vivo 실험을 통해 이러한 장점과 효과를 확인할 수 있었다.

이러한 본 발명의 제조 방법으로 제조된 콜라겐 멤브레인은 외부 박테리아의 침투를 효과적으로 방어하여 감염에 대한 저항성이 강한 콜라겐 멤브레인을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막의 제조 방법으로 제조된 시험군 3의 사진이다.
도 2는 본 발명의 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막의 표면과 단면을 SEM으로 관찰한 이미지이다.
도 3은 본 발명의 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막의 가교도를 제조 조건별로 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막의 분해 정도를 시간별로 관찰한 결과이다.
도 5는 본 발명의 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막의 생체 내에서의 분해 정도를 이식기간별로 측정한 결과이다.

이하에서는 본 발명의 일 실시예에 따른 콜라겐 멤브레인 제조 방법을 구체적으로 설명한다.

본 발명의 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막인 콜라겐 멤브레인은, 콜라겐 용해 단계, 염처리 단계, 가교 단계, 압착 단계, 동결 건조 단계 및 멸균 단계를 거처 제조되는데, 선택적으로 상기 가교 단계와 압착 단계의 사이에 유기용매 처리 단계를 더 포함할 수 있다.

또한 상기 압착 단계과 동결 건조 단계 사이에, 후속되는 멸균처리 과정에서 발생되는 라디칼을 포집하고, 콜라겐의 손상을 감소시키기 위해, 정제수와 인산 완충 식염수(PBS: Phosphate Buffer Saline)가 혼합된 수용액에 EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)과 아℃스코빅산(Ascobic acid) 또는 아스코빅 유도체가 혼합된 멸균보호 용액에 상기 콜라겐을 침지시키는 멸균보호 용액 처리 단계;가 추가로 더 포함될 수 있다.

콜라겐 용해 단계는 포유류 유래 콜라겐인 type 1 및/또는 type 3를 수용액 상태로 용해하는 단계로서, 바람직한 콜라겐 수용액의 농도는 약 0.5 ~ 3 wt%이다. 상기 콜라겐 수용액의 농도가 0.5 wt% 미만일 경우에는 후속되는 염처리 단계에서 콜라겐 섬유가 잘 형성되지 않고, 3 wt%를 초과하는 고농도의 경우에는 콜라겐이 수용액 형태로 잘 용해가 되지 않는 문제점이 있다.

수용액 형태로 용해된 콜라겐 수용액에, 인산염, 칼슘염, 나트륨염 또는 이들의 혼합물 등과 같이 수용액 상태에서 염 이온으로 해리 가능한 염화합물 수용액을 0.1 ~ 10 M의 농도 범위로 첨가하여 10 ~ 37 ℃의 온도 범위에서 약 4 ~ 24 시간 동안 유지시키는 염처리 단계를 수행한다.

상기 염처리 단계에서 사용되는 염화합물 수용액의 농도가 0.1M 미만일 경우에는 후속 단계인 가교 단계에서 콜라겐 분자들 사이의 가교결합이 형성되지 아니하고, 10M을 초과하는 고농도의 경우에는 고농도의 염 이온이 콜라겐 분자간의 가교결합을 오히려 방해하여 매트릭스화를 방해하게 되므로 바람직하지 아니하다.

이렇게 염처리 단계를 거친 콜라겐 수용액에 formaldehyde, α-hydroxyadipaldehyde, glutaraldehyde, 또는 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide/N-hydroxy succinimide (EDC/NHS)등의 가교제를 약 1 wt% 범위의 농도로 사용하여 가교 단계를 수행하게 된다. 이러한 가교 단계 역시 염처리 단계와 유사한 조건인 10 ~ 37 ℃의 온도 범위에서 약 4 ~ 24 시간 동안 수행하는 것이 바람직하다.

가교 단계가 수행된 콜라겐은 메트릭스 형태로 얻어지게 되며, 이렇게 수득된 콜라겐 메트릭스를 유기용매와 물이 부피비로 1:1 혼합된 유기용매 혼합 수용액에 침지시키는 유기용매 처리 단계를 거체게 된다.

이러한 유기용매 처리 단계에 사용되는 유기용매로는 에틸 알코올, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 에틸에테르, 부탄올, 이소프로필 알코올, 메탄올, 메톡시에탄올, 아세톤 등의 비할로겐족 유기용매를 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 할로겐 유기용매는 인체 피해를 주는 물질로 알려져 있으며, 약 10 ~ 100ppm의 인체 허용 한계 농도를 갖는 화합물이므로 사용하는 것이 바람직하지 않다. 유기용매 처리 단계 역시 가교 단계의 조건과 유사하게 10 ~ 37 ℃의 온도 범위에서 약 4 ~ 24 시간 동안 수행하는 것이 바람직하다.

이러한 유기용매 처리 단계를 거침으로써, 콜라겐 매트릭스 내의 분자간 가교도를 높여줄 수 있는데, 이는 콜라겐 섬유 분자들 사이에 존재하는 수분이 유기용매로 대체되는 일종의 탈수 반응을 일으킴으로써, 콜라겐 섬유 간격 사이의 치밀도 높은 가교 결합을 유도하게 된다. 즉, 본 발명의 콜라겐 멤브레인은 유기용매 처리 단계를 거침으로써, 화학적 가교제만을 단독으로 사용하였을 때에 비해 콜라겐의 가교도가 높아져 체내 유지 기간 증대 효과를 갖게된다.

상기 유기용매 처리단계를 거친 콜라겐 매트릭스는 후속 처리 과정으로 동결건조 단계 및 멸균처리 단계를 거치게 되는데, 상기 동결건조는 동결건조기를 사용하여 콜라겐 내의 수분 함유량이 6%를 넘지 않도록 18 ~ 36 시간동안 수행되는 것이 바람직하며, 멸균 단계는 5 ~ 40kGy의 방사선 멸균을 통해 수행되는 것이 바람직하다.

본 발명의 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막의 제조 방법은, 선택적으로 상기 유기용매 처리 단계 후에, 콜라겐 매트릭스에 대해 기계적인 압착 단계 및/또는 멸균보호 용액 처리단계를 추가적으로 거친 후, 상기 동결 건조 단계 및 멸균처리 단계를 거치는 것도 가능하다.

상기 압착 단계는, 유기용매 처리 단계를 거친 콜라겐 매트릭스에 대하여 높은 압력을 가하는 물리적 혹은 기계적 압착 과정을 수행함으로써 콜라겐 매트릭스 내 수분을 제거하는 과정으로, 이러한 압착 단계를 통해 콜라겐 섬유 및 섬유층 사이의 거리가 조밀해져 더욱 치밀한 구조를 갖는 콜라겐 멤브레인을 형성할 수 도록 할 수 있다. 이때 가해지는 압력은 약 1kgf/1cm²이며, 바람직하게는 기존의 상용화된 프레스 장치를 사용하여 상온에서 약 1 ~ 10 분 동안 압력을 가하여 수분을 제거하는 것이 바람직하다.

이렇게 압착 단계는 상기 유기용매 처리 단계와 동결 건조 단계의 사이에 수행될 수 있는데, 필요에 따라 상기 압착 단계를 거친 콜라겐 매트릭스에 대하여 동결 건조 단계 이전에 멸균보호 용액 처리 단계를 추가로 더 거칠 수 있다.

상기 멸균보호 용액 처리 단계는, 이후의 방사선 멸균 단계가 수행될 때, 콜라겐 매트릭스 멤브레인 내에 남아있는 수분이 방사선 조사로 인해 반응성이 큰 라디칼을 생성할 수 있는데, 이렇게 생성된 라디칼은 멸균이 진행되는 동안 콜라겐 멤브레인 내의 가교결합을 파괴하고 조직의 손상, 단백질 구조의 변형/손상을 가져올 수 있으므로, 이를 방지하기 위한 것이다.

즉, 상기 콜라겐 매트릭스를 멸균보호 용액을 처리함으로써, 이후 방사선 조사가 이루어지는 멸균 단계에서 발생할 수 있는 라디칼을 쉽게 포집하는 기능을 부여할 수 있으며, 이를 통해 추후 멸균 단계에서 발생할 수 있는 콜라겐 멤브레인의 손상을 최소화시킬 수 있다.

상기 멸균보호용액의 조성은, 정제수와 인산 완충 식염수(PBS: Phosphate Buffer Saline)를 부피비로 1:1 혼합된 수용액에 EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)과 아스코빅산(Ascobic acid) 또는 아스코빅 유도체가 혼합된 것으로, 이러한 조성을 갖는 멸균보호 용액에 상기 콜라겐 매트릭스를 침지시킨 후, 상온에서 90 ~ 150분 동안 약 60 ~ 80 rpm 정도로 교반시키는 과정을 통해 멸균보호 용액 처리 단계가 수행된다.

상기 멸균보호 용액에 EDTA는 0.5 M의 농도로 포함되고, 아스코빅산 또는 아스코빅 유도체는 0.1~ 5 mM의 범위로 포함되는 것이 바람직하며, 상기 아스코빅 유도체로는 ascorbic acid 2-glucoside(AA-2G), ascorbic acid 2-phosphate(AA-2P), 또는 ascorbic acid 2-sulfate (AA-2S)가 더욱 바람직하다.

즉, 이러한 추가적인 압착 단계를 통해 콜라겐 층간의 조밀도를 높이고, 콜라겐 층들 사이의 간격을 좁혀 치밀도가 높은 콜라겐 멤브레인 구조를 형성함으로써, 외부 박테리아 및 감염에 대한 저항력을 향상시킬 수 있고, 방사선 멸균 단계(예를 들러 전자멸균, 감마멸균 등)에 의한 콜라겐 멤브레인 내부의 가교결합의 절단 혹은 손상을 방지하기 위해 멸균보호 용액 처리 단계를 통해 콜라겐 멤브레인의 가교결합을 보존함으로써 체내 유지 기간 증대 효과를 더욱 높일 수 있게 된다.

이러한 압착 단계와 멸균보호 용액 처리 단계는, 유기용매 처리 단계와 동결 건조 단계 사이에 모두 수행되거나 이들 중 어느 하나의 단계가 수행되는 것도 가능하다.

이하에서는 구체적인 실험예를 포함하는 비교예와 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하고자 하며, 이러한 구체적인 실시예는 단지 본 발명의 기술적 특징과 기술적 사상을 설명하기 위한 예에 불과할 뿐, 본 발명의 기술적 범위를 한정하는 것이 아님은 당연한 것입니다.

[ 실시예 1]

본 발명의 일 실시예에 따른 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막을 다음의 표 1과 같은 과정을 통하여 제조하였다.

제조 단계		시험군 1	시험군 2	시험군 3	대조군1
콜라겐 용해	콜라겐 Type 1 2.0 wt% 수용액	O	O	O	O
염처리	인산염 5M, 상온 20hr	O	O	O	O
가교	glutaraldehyde 1 wt% 상온 20hr	O	O	O	O
유기용매처리	증류수 : 에탄올 = 1 : 1 (vol) 상온 20 hr	X	O	O	X
압착	1 kgf / cm ² , 5 min	O	O	O	X
멸균보호용액 처리	증류수 : PBS = 1:1 (vol) 0.5M EDTA , 0.25 mM AA-2G 상온 120 min	X	X	O	X
동결건조	24 hr	O	O	O	O
멸균 공정	15 kGy	O	O	O	O

상기 표 1의 모든 제조 단계를 거쳐 제조된 시험군 3에 해당하는 본 발명의 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막의 사진을 도 1에 제시하였으며, 이렇게 최종적으로 제조된 본 발명의 콜라겐 멤브레인은 수화된 이후에도 충분한 인장 강도 및 물리적 특성을 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 2]

앞서 실시예 1에서 제조된 각각의 콜라겐 멤브레인의 표면과 단면을 SEM으로 관찰한 결과를 도 2에 제시하였다.

도 2에 제시된 콜라겐 멤브레인은 시험군 3의 제조 방법으로 제조된 것으로, (a)는 유기용매 처리단계 만을 거치지 않은 콜라겐 멤브레인의 표면 SEM 사진이고, (c)는 압착 단계만을 거치지 않은 콜라겐 멤브레인의 단면 SEM 사진이다. 그리고 (b)와 (d)는 각각 시험군 3의 제조 방법과 같이 (유기용매 처리단계 및 압착 단계를 포함한) 모든 제조 단계를 거쳐 제조된 콜라겐 멤브레인의 표면과 단면 SEM 사진으로, 유기용매 처리단계 혹은 압착 단계를 거치지 않은 콜라겐 멤브레인에 비해 저욱 조밀한 섬유구조와 치밀한 층간 구조를 갖고 있음을 확인할 수 있다.

[ 실시예 3]

3-methyl-2- benzothiazolinone hydrochloride (MBTH) 측정법은 콜라겐 분자간의 가교 결합 정도를 측정할 수 있는 측정법으로서, 발색 정도로 콜라겐의 가교도를 정량화할 수 있는 분석법이다. 앞선 실시예 1에서 제조된 시험군 1 내지 3과 유기용매 처리, 압착 처리 및 멸균보호용액 처리를 거치지 않은 통상의 콜라겐 멤브레인을 대조군 1로 사용하여 BMTH 측정법을 수행하였으며, 콜라겐의 가교도가 높을수록 콜라겐 분해 효소에 대한 저항성이 높으므로 상대적으로 체내 장기간 유지될 수 있음을 의미한다.

이러한 BMTH 측정법을 통해 측정한 각각의 시료의 가교도를 정량적으로 환산한 결과를 도 3에 제시하였다. 상기 도 3의 결과에서 알 수 있듯이, 유기용매 처리 단계를 거치거나, 멸균보호용액 처리 단계를 거칠수록 발색 정도가 높게 관찰되었으며, 이러한 발색 정도를 표준시료를 사용하여 흡광도를 측정한 결과를 토대로 정량적으로 환산하여 보면, 본 발명의 유기용매 처리 또는 멸균보호용액 처리 단계를 거침으로써 콜라겐 멤브레인의 가교도가 증가하였음을 확인할 수 있었다.

유기용매 처리 단계를 거친 콜라겐 멤브레인의 경우 대조군에 비해 약 132% 증가된 가교도를 얻을 수 있었고, 유기용매와 멸균보호용액을 모두 처리한 경우에는 대조군 대비 약 185% 높은 가교도를 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 4]

본 발명의 제조 단계를 거친 콜라겐 멤브레인에 대하여 콜라겐분해 효소인 Collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma 社)를 사용하여 분해 저항성을 측정하였다. 다음의 표 2와 같은 단계를 거쳐 제조된, 10X10 mm²의 동일한 크기를 갖는 콜라겐 멤브레인 시편을 준비한 후, 각각의 시편별로 150U/㎠ 농도로 콜라겐 분해효소를 처리하여 시간별 분해 양상을 관찰하였으며, 그 결과를 도 4로 정리하였다.

제조 단계		시험군 4	시험군 2	시험군 3	대조군2
콜라겐 용해	콜라겐 Type 1 2.0 wt% 수용액	O	O	O	BioGide ( Geistlich )
염처리	인산염 5M, 상온 20hr	O	O	O
가교	glutaraldehyde 1 wt% 상온 20hr	O	O	O
유기용매처리	증류수 : 에탄올 = 1 : 1 (vol) 상온 20 hr	O	O	O
압착	1 kgf / cm ² , 5 min	X	O	O
멸균보호용액 처리	증류수 : PBS = 1:1 (vol) 0.5M EDTA , 0.25 mM AA-2G 상온 120 min	X	X	O
동결건조	24 hr	O	O	O
멸균 공정	15 kGy	O	O	O

상기 도 4의 실험결과에서 확인될 수 있듯이, 체내에서 약 3개월 이내에 빠르게 분해되는 상용화된 멤브레인으로 알려져 있는 Bio-Gide(Geistlich사) 제품(대조군 2)의 경우 150U/㎠ 농도의 콜라겐 분해효소에 의해 약 8시간 시점에서 모두 분해되는 것으로 확인되었다.

하지만, 본 발명을 통해 제조된 콜라겐 멤브레인 시험군 2 내지 4의 경우 대조군 2와 대비하여 볼 때, 높은 분해저항성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 특히 콜라겐 분자간의 가교결합 및 물리적 구조를 조밀하게 만드는 공정인 압착처리 단계 및 명균보호용액 처리 단계를 추가할수록 분해저항성은 더욱 높아지는 것을 확인할 수 있었다.

이러한 실험 결과를 통해, 본 발명의 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막의 제조 방법에 포함되어 있는 유기용매 처리 단계, 압착 단계 및 멸균보호용액 처리 단계가 콜라겐 멤브레인의 가교도 및 구조를 유지/보존에 기여를 하고 있으며, 콜라겐 멤브레인의 분해 현상에 대한 저항성을 향상시켜 주고 있음을 확인할 수 있다.

[ 실시예 5]

앞서 살펴본 실시예 4의 콜라겐 멤브레인 시료들 각각에 대하여 체내 이식 후 유지기간을 확인하기 위하여, 6주령 SD rat(male)의 조직을 절개하여 근막을 분리한 후 피하 주머니를 유발시켰다. 10X10 mm²로 준비된 각각의 콜라겐 멤브레인 시료를 피하주머니 내에 이식 후 봉합하고 4주 간격으로 4주부터 36주까지 이식 부위를 적출하여 멤브레인의 잔류량을 측정하였으며, 그 결과를 도 5에 정리하였다.

상기 도 5의 결과에 따르면, 대조군 2의 경우 약 4개월 시점에서 완전히 분해되는 양상을 나타내었지만, 본 발명의 콜라겐 멤브레인 시험군 2 내지 4의 경우에는, 유기용매 처리 단계, 압착 단계 및 멸균보호용액 처리 단계가 단계적으로 추가할수록 콜라겐 멤브레인의 잔류 시간이 6개월 이상으로 증가하는 것을 알 수 있었다. 즉, 본 발명의 제조 방법으로 제조된 콜라겐 멤브레인은 기존의 상용화된 콜라겐 멤브레인의 문제점인 체내 빠른 분해기간을 효과적으로 해결하고 있음을 알 수 있다.

Claims

치과용 흡수성 차폐막의 제조 방법에 있어서,
0.5 ~ 3 wt%의 농도를 갖는 콜라겐 수용액을 준비하는 단계;
염화합물 수용액을 상기 콜라겐 수용액과 혼합하여 혼합용액을 제조한 후, 10 ~ 37℃의 범위에서 4 ~ 24 시간 동안 유지시킴으로써 염처리를 수행하는 단계;
상기 염처리가 수행된 혼합용액에 가교제를 혼합하여 상기 콜라겐의 가교 과정을 수행하는 가교 단계;
가교된 콜라겐 내에 포함된 수분을 제거하기 위해 상기 콜라겐에 1~10분 동안 압력을 가하는 압착 단계;
압착 단계를 거친 콜라겐을 동결 건조하여 콜라겐의 수분함유량을 6 wt% 이하로 유지시키는 동결 건조 단계; 및
동결 건조된 콜라겐을 멸균처리하는 단계;를 포함하는 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막의 제조 방법
제1항에 있어서,
상기 가교 단계와 압착 단계의 사이에,
상기 콜라겐을 유기용매와 물이 부피비로 1:1 혼합된 유기용매 혼합 수용액에 침지시키는 유기용매 처리 단계;를 더 포함하는, 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막의 제조 방법
제1항에 있어서,
상기 압착 단계와 동결 건조 단계의 사이에,
후속되는 멸균처리 과정에서 발생되는 라디칼을 포집하고, 콜라겐의 손상을 감소시키기 위해, 정제수와 인산 완충 식염수(PBS: Phosphate Buffer Saline)가 부피비로 1:1 혼합된 수용액에 EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)과 아스코빅산(Ascobic acid) 또는 아스코빅 유도체가 혼합된 멸균보호 용액에 상기 콜라겐을 침지시키는 멸균보호 용액 처리 단계를 더 포함하는, 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막의 제조 방법
제1항에 있어서,
상기 가교 단계와 압착 단계의 사이에, 상기 콜라겐을 유기용매와 물이 부피비로 1:1 혼합된 유기용매 혼합 수용액에 침지시키는 유기용매 처리 단계;를 포함하고,
상기 압착 단계와 동결 건조 단계의 사이에, 후속되는 멸균처리 과정에서 발생되는 라디칼을 포집하고, 콜라겐의 손상을 감소시키기 위해, 정제수와 인산 완충 식염수(PBS: Phosphate Buffer Saline)가 부피비로 1:1 혼합된 수용액에 EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)과 아스코빅산(Ascobic acid) 또는 아스코빅 유도체가 혼합된 멸균보호 용액에 상기 콜라겐을 침지시키는 멸균보호 용액 처리 단계;를 포함하는, 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막의 제조 방법
제1항에 있어서,
상기 염처리를 수행하는 단계에 사용되는 염화합물은, 인산염, 칼슘염, 나트륨염 또는 이들의 혼합물이고, 염화합물 수용액의 농도는 0.1 ~ 10M인 것을 특징으로 하는, 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막의 제조 방법
제1항에 있어서,
상기 가교 단계에서 사용되는 가교제는, 포름알데히드(formaldehyde), α-하이드록시아디프알데히드(α-hydroxyadipaldehyde), 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 또는 EDC/NHS (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide/N-hydroxy succinimide)가 1wt%의 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는, 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막의 제조 방법
제6항에 있어서,
상기 가교 단계는 10 ~ 37℃의 범위에서 4 ~ 24 시간 동안 진행되는 것을 특징으로 하는, 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막의 제조 방법
제2항 또는 제4항에 있어서,
상기 유기용매 처리 단계에서 사용되는 유기용매는, 에틸 알코올, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 에틸에테르, 부탄올, 이소프로필 알코올, 메탄올, 메톡시에탄올, 아세톤 또는 이들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 두개 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는, 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막의 제조 방법
제3항 또는 제4항에 있어서,
상기 멸균보호 용액은 0.5M의 EDTA과 0.1~ 5 mM의 아스코빅산 또는 아스코빅 유도체가 혼합되는 것을 특징으로 하는, 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막의 제조 방법
제9항에 있어서,
상기 아스코빅 유도체는, ascorbic acid 2-glucoside(AA-2G), ascorbic acid 2-phosphate(AA-2P) 또는 ascorbic acid 2-sulfate(AA-2S))인 것을 특징으로 하는, 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막의 제조 방법
청구항 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막의 제조 방법으로 제조된 치과용 흡수성 콜라겐 차폐막.