CN117563048A - 一种脱细胞细胞外基质组织块的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医用材料技术领域，涉及到修复舌缺损的脱细胞细胞外基质组织块，具体来说涉及一种脱细胞细胞外基质组织块的制备方法及应用。本发明先采用使组织块发生物理形变的手段脱去组织里的大部分细胞，进一步破坏细胞膜使核酸蛋白复合物解离，最后再利用核酸酶去除核酸，具体包括反复物理冻融循环、低渗超纯水浸泡后转高渗NaCl溶液浸泡、化学试剂处理、脱氧核糖核酸酶处理等。本发明方法制备得到的舌脱细胞细胞外基质组织块免疫原性更低、安全性能更高。
Description
技术领域
本发明属于医用材料技术领域，涉及到修复舌缺损的脱细胞细胞外基质(decellularized Extracellular Matrix,dECM)组织块，具体来说涉及一种脱细胞细胞外基质组织块的制备方法及应用。
背景技术
口腔黏膜病是口腔最常见的三大疾病之一，口腔黏膜病中白斑有1％-60％会发生癌变，红斑有80％是原位癌或早期浸润癌。在世界范围内，口腔癌的发病率居全身恶性肿瘤的第六位，其中有至少80％是鳞状细胞癌(Squamous Cell Carcinoma)，其中又以舌鳞状细胞癌(简称舌癌)为最常见的口腔癌。现在比较普遍的是使用口腔修复膜或皮瓣来进行修复舌癌术中缺损的重建或再生。临床常用的口腔修复膜主要有海奥口腔修复膜和GeistlichBio-Gide生物膜。其中，海奥口腔修复膜是由牛的皮肤组织经过一系列处理后制备得到的异种脱细胞真皮基质；Geistlich Bio-Gide生物膜是由猪胶原加工纯化制成的双层可吸收胶原膜。这两种口腔修复膜均只能修复舌缺损的表层，无法修复舌肌，更无法修复舌的形态和语言、咀嚼、吞咽等功能。皮瓣包括局部组织瓣、带蒂皮瓣和游离皮瓣，但是无论是哪一种皮瓣，均需要取患者自身的组织，进而造成机体的损伤，并且无法形成舌肌纤维的三个维度(横向、纵向和垂直)的重建，也无法修复舌的语言、咀嚼、吞咽等生理功能。
申请号为CN202110211121.0，名称为“口腔鳞癌组织脱细胞基质及其制备方法和应用”的发明专利，公开了一种制备口腔鳞癌组织脱细胞基质的制备方法。该专利方法将口腔鳞癌组织清洗切块后先用1％的Triton-X100摇动处理12h得到初步脱细胞组织，进一步再依次用1％的SDS处理12h和用100U/ml的DNAseI震荡24h，最后经过清洗后置于抗生素溶液中保存。该专利方法制备的脱细胞基质材料基本能保持原有基质的生物成分(包括不同型的胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白)，因此该专利方法得到的这种脱细胞基质的用途是模拟肿瘤生长三维微环境。但该专利方法公开的制备脱细胞基质的工艺过程整体上较为粗糙，因此制得的产品DNA含量较多(50ng左右)，因此会使样品的免疫原性较高。此外该专利方法采用了较高浓度的SDS处理样品，但漂洗却不够充分，可能是考虑到过度漂洗会造成脱细胞基质三维结构损坏的风险，但漂洗不充分又会导致细胞毒性大。
申请号为CN201811433676.4，名称为“一种口腔缺损修复膜及其制备方法”，公开了用来自猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料来修复口腔缺损。然而，该专利中仅使用了化学方法，且未验证最终材料中残留的DNA含量。但本领域技术人员普遍认为仅使用单一的化学方法无法使DNA含量降低到50ng/mg的标准以下，因此该专利方法制备得到的脱细胞基质免疫原性较高。
综上所述，有必要提出一种改良的脱细胞细胞外基质组织块的制备方法，以补充现有技术的不足。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种脱细胞细胞外基质组织块的制备方法及应用，具体技术方案如下。
一种脱细胞细胞外基质组织块的制备方法，所述方法先采用使组织块发生物理形变的手段脱去组织里的大部分细胞，进一步破坏细胞膜使核酸蛋白复合物解离，最后再利用核酸酶去除核酸，具体步骤如下：
步骤1：取新鲜牛舌，清洗干净后，切成组织块；
步骤2：将切好的组织块样品进行物理冻融循环处理，共进行3-5次循环使细胞溶解(采用物理反复冻融的方式，可以使细胞溶解，同时又不会引入其他的外源物质)；将经过反复物理冻融循环处理后的组织块样品浸泡于超纯水中使细胞膨胀破裂(该过程可进一步去除细胞)，再用相对高渗(相较于超纯水)的NaCl溶液浸泡组织块使细胞膜皱缩变形(组织块从低渗的超纯水到相对高渗的NaCl溶液中可发生细胞膜的皱缩变形)；
步骤3：将经过步骤2处理后的组织块样品置于低浓度SDS溶液中处理6-12h，所述低浓度SDS溶液为0.1％-0.25％的SDS溶液(该方法步骤使部分细胞膜发生破坏，从而解离核酸蛋白复合物)；
步骤4：将经过步骤3处理后的组织块样品再置于2％-5％的Triton X-100溶液中处理6-12h(该方法步骤是在细胞膜上进一步打孔破坏)，然后用氯化镁和氯化钙的混合溶液洗涤6-12小时以除掉残余的SDS溶液和Triton X-100溶液(该方法步骤可充分去除化学试剂残留的细胞毒性)；
步骤5：将经过步骤4处理后的组织块样品与100-600U/ml的脱氧核糖核酸酶在常温下孵育6-12h(该方法步骤是用于进一步去除核酸)；
步骤6：用PBS溶液充分清洗组织块样品，然后将所述组织块样品风干后低温保存(经过上述工艺步骤得到的组织块样品是无菌的，风干保存可进一步减少细菌滋生，延长保存时间。同时低温保存，例如，4℃，还可以保留残留蛋白的完整性与活性)。
进一步，将所述新鲜牛舌先浸泡于碘伏中消毒，清洗干净后切成规格包括1×1×0.5cm、3×3×0.5cm或5×5×0.5cm的组织块。不同规格的组织块可应用于不同的舌缺损修复场景。
进一步，所述物理冻融操作为先在80℃下冷冻1小时，然后再在室温下解冻45分钟，一次完整的冻融过程为1个循环。
进一步，所述氯化镁和氯化钙的混合溶液中氯化镁浓度为5mM，氯化钙浓度为5mM。
进一步，将经过反复物理冻融循环处理后的组织块样品浸泡于超纯水中6-12h，然后将用超纯水充分浸泡后的组织块置于浓度为0.5-1.0M NaCl溶液中再浸泡6-12h。
作为一种优选，所述NaCl溶液的浓度为1.0M。
作为一种优选，所述SDS溶液的质量分数为0.25％。
作为一种优选，所述Triton X-100溶液的质量分数为2％。
作为一种优选，所述脱氧核糖核酸酶的浓度为300U/ml。
作为一种优选，所述脱氧核糖核酸酶为Dnase I。
作为一种优选，用PBS溶液洗涤3次，8小时/次。
上述方法制备得到的脱细胞细胞外基质组织块。
本发明方法得到的脱细胞细胞外基质组织块的厚度为5mm。
上述脱细胞细胞外基质组织块在制备修复舌缺损材料中的应用。
有益技术效果
本发明整体上采用了物理、化学和生物酶法相结合的工艺步骤。其中，包括先使用反复冻融、从低渗超纯水浸泡转到高渗出性氯化钠溶液浸泡使组织细胞先经历发胀破裂再经历细胞壁皱缩破裂的物理形变方式，有效脱去了大部分细胞。相较于现有技术首先采用破坏细胞膜的方式来脱除细胞，脱除细胞的效率更高且组织中残留的化学试剂更低。
本发明进一步再在已经脱除了大部分细胞的组织块样品中使用低浓度SDS溶液破坏细胞膜，再辅以Triton X-100细胞膜打孔和核酸酶去除核酸的手段，最终使舌脱细胞细胞外基质材料内DNA含量仅为25-30ng/mg，相较于现有技术免疫原性更低，且没有细胞毒性。此外本发明工艺方法能够避免舌组织中的细胞生长因子等重要蛋白的损失，确保所得舌脱细胞细胞外基质材料具有良好的舌肌三个维度的纤维结构和机械性能，能够满足修复舌缺损的需求。
本发明方法制备得到的免疫原性更低、安全性能更高的舌脱细胞细胞外基质组织块厚度为5mm，而目前市场上应用的通常是2mm厚度的脱细胞真皮基质，度上无法满足临床舌体缺损的修复重建需求。因此本发明制得的舌脱细胞细胞外基质组织块能够弥补目前市场上菲薄材料中无法实现的用途。
本发明制备得到的舌脱细胞细胞外基质组织块仅需风干后在4℃下保存即可，无需浸泡于抗生素溶液中，因此保存方法更加简便，同时避免了材料长期浸泡于抗生素溶液后带来的其他风险。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明其中一个实施例制备得到的舌脱细胞基质块扫描电镜(SEM)图；
图2为本发明其中一个实施例制备得到的舌脱细胞基质块DNA含量检测实验图；
图3为本发明其中一个实施例制备得到的舌脱细胞基质块细胞毒性检测实验图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本文中“和/或”包括任何和所有一个或多个列出的相关项的组合。
本文中“多个”意指两个或两个以上，即其包含两个、三个、四个、五个等。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。
在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
实施例1
本实施例提供一种舌脱细胞基质组织块的制备方法示例
取牛舌，碘伏浸泡消毒，盐水清洗3次。将牛舌切成1×1×0.5cm，或3×3×0.5cm，或5×5×0.5cm。在无菌条件下，4℃，边搅拌边完成脱细胞。
首先，将样品在80℃下冷冻1小时，在室温下解45分钟，共进行3～5个冻融循环，每循环1小时45分钟(发生物理形变)。然后用超纯水浸泡6-12小时，再用1.0M NaCl溶液浸泡样品6-12小时(发生物理形变)。进一步，将组织块用质量分数为0.25％的SDS处理6-12小时(破坏部分细胞膜)。进一步，将组织块在质量分数为2％的Triton X-100中处理6-12小时(细胞膜上打孔)。然后用5mM氯化镁+5mM氯化钙洗涤6-12小时(去除化学试剂残留)。进一步将样品与Dnase I(300U/ml)在37℃孵育6-12小时(去除核酸)。最后在PBS中洗涤3次，8小时/次，得到厚度约为5mm的脱细胞组织块。
进一步将组织块样品风干，储存在4℃下直到使用。
对制备得到的舌脱细胞基质组织块进行结构检测，见图1。、实验结论：按照上述脱细胞步骤制备舌脱细胞基质。舌脱细胞基质有效去除了细胞，但是保留了舌细胞外基质的三维网状结构，以及部分蛋白(纤维连接蛋白、层粘蛋白)。
实施例2
对实施例1制备得到的舌脱细胞基质组织块进行检测
1.DNA含量检测：超声波+组织剪打碎舌脱细胞基质组织块为细胞悬液，然后11,200×g离心，倒尽上清，加入200μL缓冲液GA，震荡至彻底悬浮。加入20μL Proteinase K混匀后，在56℃放置，直至组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液变清亮，简短离心去除管盖内壁水珠。加入200μL无水乙醇，充分震荡混匀15sec，简短离心以去除管盖内壁水珠。将上一步絮状沉淀加入一个吸附柱CB3中，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。将吸附柱CB3转入干净离心管中，加入100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2min，12,000rpm离心2min，收集上清液。上机检测。
舌脱细胞基质组织块中DNA含量，见图2。
实验结论：脱细胞基质组织块的DNA含量均在25ng/mg左右，表明充分脱去了DNA物质。
2.细胞毒性检测：用PBS+青霉素+链霉素清洗舌脱细胞基质组织块3次后，放入DMEM中浸泡7天。浸泡了舌脱细胞基质组织块的DMEM配成培养基，即往其中加入10％ FBS和1％青霉素+1％链霉素。用上述培养基作为实验组，常规培养基作为对照组。96孔板每孔接种104个细胞，分别在接种后第一、三、五、七天测CCK8值。
细胞毒性实验见图3。图3中从左往右为不同时间的实验组比上对照组的百分比。从左往右依次为：1.厚度为5mm左右的TEM支架浸提液相对于对照组培养后第一天的细胞增殖活性；2)厚度为5mm左右的TEM支架浸提液相对于对照组培养后第三天的细胞增殖活性；3)厚度为5mm左右的TEM支架浸提液相对于对照组培养后第五天的细胞增殖活性；4)厚度为5mm左右的TEM支架浸提液相对于对照组培养后第七天的细胞增殖活性。
实验结论：把舌脱细胞基质充分浸泡后的溶液用来培养细胞，不对细胞产生毒副作用。说明本发明制备脱细胞基质组织块的工艺方法安全，没有有毒害化学试剂的残留。
实施例3
不同方法的对比验证
1.采用实施例1的方法制备得到一种舌脱细胞基质组织块，记为组织1。
2.采用对比方法，制备另一种舌脱细胞基质组织块，记为组织2，方法步骤如下。
1)取新鲜牛舌，切成实施例1大小的组织块，在摇床上用1％的Triton X-100处理12h。
2)用1％SDS处理12h。
3)用100U/ml的DNAse I处理24h。
4)PBS清洗干净。
将不同方法制备得到的组织1和组织2按照实施例2中DNA含量检测的方法进行检测，结构如下表所示。
表1组织1和组织2DNA含量
| 对比项 | DNA含量 |
| 组织1 | 27ng/mg |
| 组织2 | 51ng/mg |
实验结论：方法2的工艺步骤更精简，但制备得到的脱细胞基质组织块的DNA含量更高，因此会带来更高的免疫原性。
实施例4
本发明工艺方法的进一步验证
表2本发明工艺方法各步骤验证
备注：每一个方案下做了两组平行试验。
实验结论：1)方案一和方案二中，任一一组仅经过一次物理形变处理的组织块样品，其DNA残留含量均较高(方案二的组织块样品DNA残留最高)。说明本发明工艺方法中采用使组织块样品发生两次物理形变的手段可以有效去除组织里的大部分细胞。2)方案三和方案四中，仅用一种化学手段破坏细胞膜的组织块样品，其DNA含量也比较高。本发明工艺方法为了使最终制得的产品安全没有细胞毒性，采用了更为温和低浓度的化学试剂来处理(例如0.25％的SDS)，由于单一化学试剂的成分质量分数低，因此对去除组织块的DNA作用有限，必须采用多种方法组合的工艺步骤来实现。3)方案五中未经过充分清洗的组织块的DNA残留量高于未在细胞膜上打孔的样品组。4)本发明完整方法步骤制得的组织块DNA含量在25-30ng/mg，远低于现有技术。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。
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Claims (10)
1.一种脱细胞细胞外基质组织块的制备方法，其特征在于，所述方法先采用使组织块发生物理形变的手段脱去组织里的大部分细胞，进一步破坏细胞膜使核酸蛋白复合物解离，最后再利用核酸酶去除核酸，具体步骤如下：
步骤1：取新鲜牛舌，清洗干净后，切成组织块；
步骤2：将切好的组织块样品进行物理冻融循环处理，共进行3-5次循环使细胞溶解；经过反复物理冻融循环处理后的组织块样品浸泡于超纯水中使细胞膨胀破裂，再用相对高渗的NaCl溶液浸泡组织块使细胞膜皱缩变形；
步骤3：将经过步骤2处理后的组织块样品置于低浓度SDS溶液中处理6-12h，所述低浓度SDS溶液为0.1％-0.25％的SDS溶液；
步骤4：将经过步骤3处理后的组织块样品再置于2％-5％的TritonX-100溶液中处理6-12h，然后用氯化镁和氯化钙的混合溶液洗涤6-12小时以除掉残余的SDS溶液和Triton X-100溶液；
步骤5：将经过步骤4处理后的组织块样品与100-600U/ml的脱氧核糖核酸酶在常温下孵育6-12h；
步骤6：用PBS溶液充分清洗组织块样品，然后将所述组织块样品风干后低温保存。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特在于，所述物理冻融操作为先在80℃下冷冻1小时，然后再在室温下解冻45分钟，一次完整的冻融过程为1个循环。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氯化镁和氯化钙的混合溶液中氯化镁浓度为5mM，氯化钙浓度为5mM。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将经过反复物理冻融循环处理后的组织块样品浸泡于超纯水中6-12h，然后将用超纯水充分浸泡后的组织块置于浓度为0.5-1.0MNaCl溶液中再浸泡6-12h。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述NaCl溶液的浓度为1.0M。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述SDS溶液的质量分数为0.25％。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Triton X-100溶液的质量分数为2％。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脱氧核糖核酸酶的浓度为300U/ml。
9.权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的脱细胞细胞外基质组织块。
10.权利要求9所述的脱细胞细胞外基质组织块在制备修复舌缺损材料中的应用。
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