KR20220118711A

KR20220118711A - 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법 및 이를 이용하여 접착력이 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막

Info

Publication number: KR20220118711A
Application number: KR1020210022468A
Authority: KR
Inventors: 정성린; 민병현
Original assignee: 한국원자력연구원; 아주대학교산학협력단
Priority date: 2021-02-19
Filing date: 2021-02-19
Publication date: 2022-08-26
Also published as: KR102549899B1

Abstract

본 발명은 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법 및 이를 이용하여 접착력이 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막에 관한 것으로, 보다 상세하게는 방사선이 조사된 동물 연골 유래 세포외기질 막의 적어도 일부에 과산화수소 수용액을 적용하는 단계를 포함하는, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법; 및 상기 본 발명의 방법에 의해 접착력이 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막에 관한 것이다.

Description

동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법 및 이를 이용하여 접착력이 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막{Method for adjusting adhesive force of animal cartilage-derived extracellular matrix membrane and animal cartilage-derived extracellular matrix membrane having adjustable adhesive force by using the same}

본 발명은 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법 및 이를 이용하여 접착력이 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막에 관한 것으로, 보다 상세하게는 장기의 형태나 위치에 제한 없이 사용이 가능하고, 접착력이 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막에 관한 것이다.

세포외기질(extracellular matrix)은 동물, 인체에서 유래한 물질로서 매우 우수한 생체적 합성과 생리적 기능을 가지고 있다. 따라서 세포외기질로 제조된 막은 생체에 이식 후 염증반응이 적을 뿐 아니라, 뛰어난 생체기능성과 생분해성 등을 제공할 수 있어 이상적인 세포치료제 혹은 약물전달 및 조직공학용 지지체의 재료로 평가 받고 있다.

연골 유래 세포외기질은 무혈관 및 무신경 조직으로서, 다른 조직의 세포외기질에 비해 조직 특이적으로 성분의 차별성이 있다. 대표적으로 연골조직에는 혈관생성을 억제하는 콘드로모듈린(chondromodulin), 트롬보스폰딘(thrombospondin), 엔도스타틴(endostatin) 등이 풍부하며, 뿐만 아니라 세포의 부착을 방지하는 루브리신(lubricin), 비글리칸(biglycan), 데코린(Decorin), 피브로모듈린(Fibromodulin) 등이 존재하고 있다. 그러나 천연소재로서의 높은 생체적합성과 기능성에도 불구하고 현재 상용화된 유착방지제의 경우 대부분이 필름 또는 젤 형태로 제조되어 장유착 모델에 대항 사용이 적합하도록 설계되어 있다. 하지만, 유착은 다양한 부위에 발생 할 수 있으므로 현재의 유착 방지제로는 그 활용이 제한적인 문제가 있다.

특히, 다양한 상처 부위 표면에 대한 유착방지 필름의 부착력이 불충분하여 유착방지제 필름이 요구되는 부위에 정확하게 고정되지 못하거나, 이러한 이유 때문에 유착방지 필름을 수술용 봉합사로 고정하는 작업이 요구되고, 이때 필름의 유연선 부족으로 필름이 찢어지는 문제 등이 발생할 수 있다. 따라서, 유착방지 필름은 예를 들어 복강경 시술 등에도 적용 가능한 수준의 충분한 유연성을 가짐과 동시에 시술부위를 충분히 보호할 수 있는 충분한 인장강도가 확보되어야 하며, 이와 동시에 목적 부위에 대하여 충분한 접착력이 발현되어 추가적인 봉합사에 의한 고정이 요구되지 않을 수 있는 물성을 보유할 것이 요구된다.

이와 관련하여 한국특허 제10-1772316호는 방사선을 이용한 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법을 개시하고 있으나, 동물의 연골 유래 세포외기질 막에 실제 상기 특허와 같이 방사선만을 가하는 경우, 낮은 선량에서는 접착력 조절 효과가 거의 획득되지 않으며, 높은 선량에서는 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 주 성분인 콜라겐 성분에 변성이 유발되어 막의 물성이 저하되는 문제가 발생한다.

따라서, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 물성을 유지하면서 접착력을 조절할 수 있는 기술이 개발되는 경우 관련 분야에서 널리 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

이에 본 발명의 한 측면은 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 측면은 본 발명의 상기 접착력 조절 방법을 이용하여 접착력이 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 견지에 의하면, 방사선이 조사된 동물 연골 유래 세포외기질 막의 적어도 일부에 과산화수소 수용액을 적용하는 단계를 포함하는, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 견지에 의하면, 상기 본 발명의 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법에 의해 접착력이 조절된, 동물의 연골 유래 세포외기질 막이 제공된다.

본 발명에 의하면, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 물성을 유지하면서 접착력을 조절할 수 있으며, 따라서 본 발명에 의해 접착력이 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막을 이용하여 체내 안정성과 유착방지 효능이 뛰어나며, 적용 범위가 확장된 유착방지제를 획득할 수 있다.

도 1은 실시예 및 비교예에서 획득되는 유착방지 필름에 대한 과산화수소 수용액의 적용의 영향을 확인한 것이다.
도 2는 실시예 및 비교예에서 획득되는 유착방지 필름에 대한 과산화수소 수용액의 적용의 영향을 확인하기 위한 SEM 이미지 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 과산화수소 수용액의 농도에 따른 실시예 및 비교예에서 획득되는 유착방지 필름의 팽윤성(%, swelling ratio)을 나타낸 것이다.
도 4는 유착방지 필름의 성분 변화 분석을 위한 FTIR 그래프를 나타낸 것이다.
도 5는 과산화수소 수용액의 농도에 따른 실시예 및 비교예에서 획득되는 유착방지 필름의 접착력을 측정한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 의하면, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 물성을 유지하면서 접착력을 조절할 수 있는 방법이 제공되며, 본 발명은 특히 과산화수소와 방사선 조사를 이용하는 것이다.

본 발명에 있어서, "연골 유래 세포외기질"은 "연골 유래 탈세포 세포외기질 막"과 상호교환적으로 사용될 수 있으며, "막"은 "필름"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 한편, 본 발명에 있어서 상기 연골 유래 세포외기질 막 또는 필름은 유착방지 필름일 수 있으므로, "유착방지 필름"으로 지칭될 수도 있다.

단백질 등의 유기물 산화력을 갖는 과산화수소는 약산으로서 수산기 라디칼(OH·)로 분해되므로 높은 반응성 자유 라디칼을 형성할 수 있다. 동물 연골 유래 세포외기질 막에 대한 과산화수소의 직접 적용은 막 자체의 분해를 가져올 수 있으나, 본 발명에 의하면, 화학적 가교 및 물리적 가교가 수행된 동물 연골 유래 세포외기질 막에 대하여 과산화수소를 적용함으로써 동물 연골 유래 세포외기질 막의 접착력을 조절할 수 있다.

보다 상세하게, 본 발명의 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법은 방사선이 조사된 동물 연골 유래 세포외기질 막의 적어도 일부에 과산화수소 수용액을 적용하는 단계를 포함하는 것이다.

상기 과산화수소 수용액을 적용하는 단계는 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 양면 또는 일면에 대하여 전체적으로 또는 부분적으로 수행되는 것일 수 있으며, 보다 상세하게는 막 전체, 양면 또는 일면에 대해 수행될 수 있으며, 또한 막 전체, 양면 또는 일면에 전체적으로 또는 이 중 필요한 일부 영역일 수 있다.

따라서, 상기 과산화수소 수용액을 적용하는 단계는 침지, 스프레이 및 도포 중 적어도 하나의 방법에 의해 수행되는 것일 수 있으며, 목적으로 하는 적용 영역에 따라 적절하게 채용할 수 있고, 예를 들어 도포 혹은 분무(스프레잉)에 의해 일면에만 과산화수소 수용액을 적용할 수 있다.

본 발명의 동물 연골 유래 세포외기질 막은 방사선이 조사된 것으로, 해당 막에 방사선을 조사하는 단계를 통해 획득될 수 있으며, 이때 방사선은 감마선, 전자선, 자외선 및 X선으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것으로, 바람직하게는 감마선이다. 또한 상기 감마선은 코발트(Co)-60, 크립톤(Kr)-85, 스트론튬(Sr)-90, 및 세슘(Cs)-137으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방사성 동위원소로부터 방출될 수 있으며, 바람직하게는 상기 감마선은 코발트(Co)-60일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방사선이 조사된 동물 연골 유래 세포외기질 막은 동물 연골 유래 세포외기질 막에 0 초과 50kGy 이하, 예를 들어 1 내지 25 kGy의 총 선량의 방사선을 조사하여 획득되는 것일 수 있다. 상기 방사선을 조사하는 단계에 있어서 총 선량이 50 kGy를 초과하는 경우에는 방사선 조사에 의해 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 주 성분인 콜라겐이 변형되어 실질적인 콜라겐 함량 및 분자량이 감소하게 되며, 그 결과 동물의 연골 유래 세포외기질 막이 물성 및 생화학적 물질이 감소하게 되는 문제가 있다.

나아가, 상기 방사선을 조사하는 단계는 시간 당 0 초과 10kGy 이하의 선량으로 수행되는 것이 바람직하며, 예를 들어 시간 당 100Gy 내지 10kGy의 선량으로 수행될 수 있다. 시간 당 방사선 조사 선량이 10kGy를 초과하는 경우에는 총 선량이 25 kGy 이하인 경우에도 콜라겐이 변형 및 이에 따른 실질적인 콜라겐 함량 감소가 발생할 수 있다.

본 발명에 사용되는 상기 과산화수소 수용액은 0.1 내지 30wt% 농도의 과산화수소 수용액일 수 있으며, 예를 들어 3wt% 초과 내지 30wt%, 바람직하게는 5 내지 30 wt% 또는 10 내지 30 wt% 농도의 과산화수소 수용액일 수 있다. 과산화수소 수용액 내 과산화수소의 농도가 0.1 wt% 미만인 경우에는 접착력 향상 효과가 불충분할 수 있으며, 30wt%을 초과하는 경우에는 단백질의 산화반응 증가로 인해 동물의 연골 유래 세포외기질의 단백질의 변성 및 기계적 물성이 떨어져 일어나는 문제가 있다.

연골의 세포외기질에는 다른 조직의 세포외기질에 비해 조직 특이적으로 세포의 부착을 방지하는 루브리신, 비글리칸, 디코린, 피브로모듈린 등이 존재하고 있어서 장기와 장기 사이의 유착방지 효과를 향상시킬 수 있다. 한편, 본 발명에 사용될 수 있는 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 재료는 바람직하게는 인간을 제외한 동물로부터 획득할 수 있고, 예를 들어 돼지, 말, 소 등의 동물로부터 획득될 수 있는 것이나, 특히 제한되는 것은 아니며, 돼지 연골 유래 세포외기질 막인 것이 보다 바람직하다.

상기 동물의 연골 유래 세포외기질 막은 화학적 가교된 동물의 연골 유래 세포외기질 막일 수 있으며, 상기 화학적 가교를 수행할 수 있는 가교제는 특히 제한되는 것은 아니며, 글루타르알데히드, EDC (1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide), 제니핀(genipin) 등일 수 있으며, 특히 글루타르알데히드(Glutaraldehyde)에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에 의하면, 상술한 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법에 의해 접착력이 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막이 제공된다.

동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절은 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 성분 및 바람직한 물성을 가능한 유지하는 것이 전제되어야 하는 것으로, 본 발명에 의하면 접착력이 조절되면서도 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 성분이 변형되지 않고 유지되며, 바람직한 물성도 유지될 수 있다.

동물의 연골 유래 세포외기질 막의 주 성분이 콜라겐이므로, 콜라겐의 변형 및 변성이 발생되는 경우 동물의 연골 유래 세포외기질 막은 접착력은 조절되지만, 물성이 저하되는 문제가 발생한다.

한편, 본 발명에 의해 접착력이 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막은 접착력 조절을 위한 과정에서 콜라겐의 변형 및 변성이 최소화될 수 있는 한편, 접착력이 1.0 내지 2.5 N 범위인 것이다.

동물 연골 유래 세포외기질 막의 일면에 과산화수소 수용액이 적용되는 경우에는, 해당 면의 부착력을 현저하게 향상시켜 추가적인 봉합을 수행하지 않고 필요로 하는 부위에 동물 연골 유래 세포외기질 막을 유착방지제로써 사용할 수 있다.

예를 들어, 상기 접착력이 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막은 일면의 부착력이 조절된 막일 수 있으며, 이 경우 내부 장기에 대한 수술 후 수술 부위에 접착력이 향상된 면이 향하도록 배치되어 추가적인 봉합이 요구되지 않으면서도, 접착력이 높지 않은 면이 외부를 향하게 되어 유착방지 역할을 효과적으로 수행할 수 있다.

이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 연골 유래 세포외기질 분말의 제조

돼지로부터 연골 유래 세포외기질 파우더를 제작하기 위해 EN 12442의 "Animal tissues and their derivatives utilized in the manufacture of medical devices, part 1; Analysis and management of risk, part 2; controls on sourcing, collection and handling"을 참조하여 기준에 부합하는 시설의 돼지 무릎 연골을 구입하여 사용하였다.

돼지 연골에서 연골을 잘라내어 연골 조각 (약 20 X 30 mm)을 만들고 여기에 생리식염수를 이용하여 10분간 3회 세척하여 -80℃에 냉동시킨 뒤 3일간 동결건조 시켰다. 건조된 연골 조각을 동결분쇄기(JAI, JFC-300, JAPAN)를 사용하여 약 10 ㎛ 사이즈로 동결 분쇄하여 -80℃에 보관하였다.

돼지연골분말에 존재하는 세포 및 유전물질을 제거하고, 순수한 세포외기질 성분만을 얻기 위해 다음과 같이 탈세포화 과정을 수행하였다.

이를 위해 상기에서 제조한 돼지연골분말을 10 g 당 저장액 (Hypotonic buffer) 500 ml을 처리하여 200 rpm으로 4℃에서 4시간 동안 교반하였다. 연골분말을 침전시켜 분리시키기 위해서 원심분리기(US-21SMT, Vision, Korea)를 사용하여 10,000 rpm에서 30분간 처리하였다. 상층액을 제거한 뒤 연골분말을 0.1% SDS (Sodium dodecyl sulfate, Bio-rad, USA) 용액에 첨가하여 200 rpm으로 4℃에서 2시간 동안 교반하였다. SDS 처리가 끝난 뒤 연골분말은 3차 증류수를 이용하여 5회 반복하여 세척하였고 세척수의 교환은 전술한 바와 같은 원심분리조건으로 진행하였다. 다음으로, 500 U/ml의 DNase (Sigma, USA) 200 ml을 처리하여 200 rpm으로 37℃배양기에서 12시간 동안 교반하였다. Dnase 처리 후 전술한 바와 같이 3차 증류수를 이용하여 5회 세척하였다. 탈세포화된 연골분말은 -80℃ 초저온 냉동장치에서 냉각한 후 3일간 동결건조하였다. 건조된 연골분말은 전술한 바와 같은 방법으로 파쇄하여 최종적으로 약 10 ㎛ 사이즈의 연골분말 파우더를 수득하고 필요 시까지 -80℃에서 보관하였다.

탈세포화된 연골분말 4 g 당 100 ml의 염산수용액에 펩신(Pepsin; sigma, USA)을 처리하여 200 rpm으로 4℃에서 24시간 교반하였다. 펩신(pepsin) 처리 후, NaOH 용액을 이용하여 pH 7.4로 중화시켰다. 수용화된 연골분말은 투석막 (MWCO 1000, Spectrolab, USA)에 넣은 뒤 3차 증류수에 200 rpm으로 4℃에서 24시간 동안 교반하였다. 그 후 수용화된 연골분말을 용기에 담아 -80℃ 초저온 냉동장치에서 냉각시킨 후 3일간 동결건조하였다. 수용화 처리된 연골분말은 전술한 바와 같은 방법으로 약 10㎛ 사이즈를 갖는 파우더로 분쇄하여 최종적으로 -80℃ 냉동장치에 필요시까지 보관하였다. 이렇게 획득된 연골 유래 세포외기질 분말은 수용성이다.

2. 돼지 연골 유래 세포외기질(PCAM) 막의 제조

실시예 1

상기 1.에 의해 획득한 수용성 돼지연골분말 1.3 g을 3차 증류수 100 ml 에 처리한 후 200 rpm 으로 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 돼지연골분말 수용액을 원심분리기 용기에 넣은 후 3000 rpm에서 10분간 처리하였다. 피펫(pipet)을 이용하여 상층액을 100 X 100 mm 사각형 실리콘 몰드에 35 ml씩 분주한 뒤 클린 벤치(clean bench)에서 48시간 동안 건조 시켰다. 건조된 막 6 mg 당 0.1% 글루타르알데히드 용액(Glutaraldehyde solution; Sigma, USA) 1 ml을 처리하여 100 rpm으로 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 가교된 막은 6 mg 당 1 ml의 PBS 용액으로 3회 반복하여 100 rpm으로 30분간 세척한 뒤 이어서 3차 증류수를 이용하여 3회 세척하였다. 세척한 막은 6 mg 당 1 ml의 4M NaCl 용액을 처리하여 100 rpm으로 상온으로 30분간 처리하였다. 세척이 완료된 막은 클린 벤치(clean bench)에서 테프론 필름 위에 펴서 건조 시켜 최종적으로 약 30 ㎛의 두께를 갖는 돼지연골 세포외기질 막을 제조하였다.

나아가 상기에서 획득된 글루타르알데히드로 화학적 가교된 돼지연골 세포외기질 막에 대하여 방사선을 조사하여 추가적인 가교를 수행하였다.

이때 상기 방사선은 감마선 (⁶⁰CO, MDS Nordion, Canada, IR 221 n wet storage type C-188, 한국원자력연구원 정읍 방사선연구소)을 사용하였고, 25 kGy (선량률; 10 kGy/hr)로 조사하였다.

비교예 1

상기 3.에 개시된 유착방지 필름 제조 공정 중 글루타르알데히드 용액 처리를 하지않고, 나아가 방사선을 조사하지 않은 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 과정에 의해 유착방지 필름을 제조하였다.

비교예 2

상기 3.에 개시된 유착방지 필름 제조 공정 중 방사선을 조사하지 않은 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 과정에 의해 과산화수소 수용액을 처리하였다.

비교예 3

상기 3.에 개시된 유착방지 필름 제조 공정 중 글루타르알데히드 용액 처리를 하지않은 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 과정에 의해 방사선을 조사하여 유착방지 필름을 제조하였다.

3. 과산화수소 용액의 제조

증류수와 50% 과산화수소(H₂O₂)를 다양한 중량비로 조합하여 과산화수소 수용액을 제조하였다. 본 실험에서는 0.3 내지 30% 과산화수소(H₂O₂)를 사용하였다. 한편, 증류수를 대조군(control)으로 사용하였다.

4. 가교 돼지연골 탈세포 세포외기질(PCAM) 막에 대한 과산화수소 수용액의 적용

상기 3.에서 제조된 다양한 농도의 과산화수소 수용액을 50 ml 유리병에 담고, 37℃에서 2시간 동안 상기 2.에서 획득된 가교 돼지연골 탈세포 세포외기질(PCAM) 막인 유착방지 필름을 각각 담침하고 그 결과를 도 1에 나타내었다.

방사선 조사에 의한 가교 및 글루타르알데히드 가교가 모두 이루어 지지 않은 비교예 1(Non-radiated CAM, GA-X)은 필름 형태가 없어지면서 입자 형태로 현탁되었으며, 방사선 조사되지 않았으나 글루타르알데히드로 가교된(Non-radiated CAM, GA-O) 비교예 2는 필름 형태를 유지하는 것으로 확인되었고, 비교예 3의 방사선 25 kGy 조사되었으나 글루타르알데히드로 가교되지 않은(Radiated CAM(25 kGy), GA-X) 필름은 형태가 유지되는 것으로 보아 방사선에 의해 물리적인 가교가 이루어지는 것을 확인하였으며, 실시예 1의 방사선 25 kGy 조사된 글루타르알데히드로 가교된(Non-radiated CAM, GA-O)은 필름 형태의 변화가 없는 것으로 확인하였다.

5. 돼지연골 세포외기질(PCAM) 막의 형태학적 분석

4.와 동일한 과정에 의해 과산화수소 수용액으로 처리된 필름의 표면을 금으로 진공코팅 처리 후, 그 표면을 주사전자현미경(SEM, Scanning Electron Microscopy)을 통해 이미지화 하여 분석하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이 비교예 1의 필름은 필름 형태가 없어지면서 입자 형태로 현탁되어 측정이 불가능했으며, 한편 비교예 2의 방사선 조사 되지 않고 글루타르알데히드로 가교된(Non-radiated CAM, GA-O) 필름은 과산화수소 농도가 증가할 수록 CAM의 콜라겐이 산화되어 콜라겐 섬유 구조가 뭉그러지는 것을 관찰할 수 있었다.

한편, 비교예 3(Radiated CAM(25 kGy), GA-X)은 필름 형태가 유지되었으며, 실시예1(Non-radiated CAM, GA-O)은 필름 형태에 변화가 없는 것을 확인하였고, 따라서 글루타르알데히드 및 방사선에 의해 이중 가교된 것을 확인 할 수 있었다.

6. 돼지연골 탈세포 세포외기질 필름의 팽윤성 분석

실시예 1에서 획득된 필름에 대하여 3.의 과산화수소 수용액의 농도를 0.3%, 3% 및30%로 조정한 후 각각의 농도의 과산화수소 수용액에 37℃에서 2시간 동안 필름을 각각 담침 한 후 증류수로 3회 세척하고 상온에서 2일 동안 건조하였고, 그 결과 각 샘플의 팽윤성을 도 3에 나타내었다.

팽윤석 분석은 페트리 디쉬에 있는 각 건조된 필름(먼저 중량이 측정됨)이 증류수에 잠기도록, 증류수를 부은 후 증류수를 120분 후 제거하였다. 그 다음, 팽윤된 필름과 함께 측량되는 페트리 디쉬를 분석 저울에 놓고 가장 근사치의 중량값을 기록하였다. 팽윤성의 값은 다음과 같은 식에 의해 계산되었다.

팽윤성(%)=[(W_s-W_d)/(W_d)]*100

(여기서, W_s는 팽윤된 필름을 나타내고,W_d는 건조된 필름을 나타냄)

그 결과, 도 3(a)에서 보이는 바와 같이 실시예 1의 필름은 비교예 2의 필름에 비하여 과산화수소 농도가 증가할수록 필름의 함수율의 현저한 증가를 확인 하였으며, 도 3(b)에서 보이는 바와 같이 비교예 3의 방사선 25 kGy 조사되었으나 글루타르알데히드로 가교되지 않은(Radiated CAM(25 kGy), GA-X) 필름은 30% 과산화수소에 담침된 경우, 높은 산화력에 의해 CAM의 콜라겐 섬유 구조가 파괴 되어 필름의 형태를 파괴되는 문제가 있음을 확인할 수 있었다. 다만 0.3 ~ 3% 과산화수소에 담친된 필름인 경우, 방사선 가교 반응이 과산화수소의 산화반응보다 크게 작용하여 팽윤성이 증가 되는 것을 확인하였다.

7. 돼지연골 탈세포 세포외기질 필름의 화학결합도 분석

방사선 조사 및 과산화수소 수용액 적용에 따른 필름에서의 화학적 변화를 측정하기 위해 실시예 1 및 비교예 2 및 3으로부터 획득한 필름을 상온 건조하여 성분 분석 및 결합도를 확인 하기 위해 FT-IR (Tensor 37, Bruker, Germany)로 분석을 실시하였으며, 그 결과 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 성분 분석 및 화학구조를 분석해 본 결과 필름의 표면 변화는 없는 것을 확인하였다.

특히, 돼지연골 세포외기질의 단백질의 아마이드 피크인 3700~3000 cm^-1과 1600~1700 cm^-1의 위치가 변화 되지 않는 것으로 보아 성분 및 화학구조 변화가 없어 원래의 물성이 유지되는 것으로 해석될 수 있다. 한편, 과산화수소에 의해 단백질이 산화되면서 OH 라디칼이 형성으로 인해 3000 cm^-1 피크가 증가 되는 것을 확인하였다. 본 실험 결과에 의해 방사선 선량과 산화제에 대한 화학구조 및 성분 변화가 없는 것을 알 수 있다.

8. 돼지연골 탈세포 세포외기질(PCAM) 필름의 접착력 측정

과산화수소 수용액의 농도에 따른 돼지연골 탈세포 세포외기질 필름의 접착력 변화를 측정하기 위해, 건조된 필름을 1 cm x 1 cm 동일 크기로 자른 후 텍스쳐 분석기(Texture analyser, TX-XT2i, sable microsystem Co. Ltd. Surrey England) 압력 로드 바닦에 부착하고 쥐 피부에 고정 하고 10분 후에 로드가 위로 올라 갈 때 걸리는 압력을 측정하였다.

그 결과, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 실시예 1의 필름은 과산화수소의 농도가 증가 할수록 가교구조가 분해되어 수분 함수량이 증가되고, 이와 같은 이유로 피부의 수분을 흡수하면서 생기는 진공에 의해 접착력이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

반면, 비교예 2의 필름은 과산화수소의 농도 증가에 따른 접착력의 증가가 현저하지 않음을 확인할 수 있었다.

이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims

방사선이 조사된 동물 연골 유래 세포외기질 막의 적어도 일부에 과산화수소 수용액을 적용하는 단계를 포함하는, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법.
제1항에 있어서, 상기 방사선이 조사된 동물 연골 유래 세포외기질 막은 동물 연골 유래 세포외기질 막에 0 초과 50kGy 이하의 총 선량의 방사선을 조사하여 획득되는, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법.
제1항에 있어서, 상기 과산화수소 용액은 0.1 내지 30wt% 농도의 과산화수소 수용액인, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법.
제1항에 있어서, 상기 과산화수소 용액은 3 초과 내지 30wt% 농도의 과산화수소 수용액인, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법.
제1항에 있어서, 상기 방사선은 감마선, 전자선, 자외선 및 X선으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법.
제1항에 있어서, 상기 과산화수소 수용액을 적용하는 단계는 침지, 스프레이 및 도포 중 적어도 하나의 방법에 의해 수행되는, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법.
제1항에 있어서, 상기 과산화수소 수용액을 적용하는 단계는 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 양면 또는 일면에 대하여 전체적으로 또는 부분적으로 수행되는, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법.
제1항에 있어서, 상기 동물의 연골 유래 세포외기질 막은 돼지 연골 유래 세포외기질 막인, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법.
제1항에 있어서, 상기 동물의 연골 유래 세포외기질 막은 화학적 가교된 동물의 연골 유래 세포외기질 막인, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법.
제9항에 있어서, 상기 화학적 가교는 글루타르알데히드(Glutaraldehyde)에 의해 수행되는, 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 동물의 연골 유래 세포외기질 막의 접착력 조절 방법에 의해 접착력이 조절된, 동물의 연골 유래 세포외기질 막.
제11항에 있어서, 상기 접착력이 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막은 접착력이 1.0 내지 2.5 N 범위인, 접착력이 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막.
제11항에 있어서, 상기 접착력이 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막은 일면의부착력이 조절된, 접착력이 조절된 동물의 연골 유래 세포외기질 막.