WO2024004696A1 - 三次元造形物の製造方法および三次元造形物作製用インクセット - Google Patents

三次元造形物の製造方法および三次元造形物作製用インクセット Download PDF

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WO2024004696A1
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WO
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hydrogen peroxide
support material
material ink
model
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慎司 境
聖 粉谷
豊浩 永野
大輔 中村
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国立大学法人大阪大学
ナガセケムテックス株式会社
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    • B29C64/00—Additive manufacturing, i.e. manufacturing of three-dimensional [3D] objects by additive deposition, additive agglomeration or additive layering, e.g. by 3D printing, stereolithography or selective laser sintering
    • B29C64/10—Processes of additive manufacturing
    • B29C64/106—Processes of additive manufacturing using only liquids or viscous materials, e.g. depositing a continuous bead of viscous material
    • B29C64/112—Processes of additive manufacturing using only liquids or viscous materials, e.g. depositing a continuous bead of viscous material using individual droplets, e.g. from jetting heads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
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    • B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
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    • B29C64/40—Structures for supporting 3D objects during manufacture and intended to be sacrificed after completion thereof
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    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y10/00—Processes of additive manufacturing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y70/00—Materials specially adapted for additive manufacturing

Definitions

  • the present invention relates to a method for manufacturing a three-dimensional object and an ink set for manufacturing a three-dimensional object, and is particularly suitable for manufacturing a three-dimensional object with a complex shape made of soft materials in the field of regenerative medicine.
  • This invention relates to a method for manufacturing a three-dimensional structure.
  • Patent Document 1 aims to apply it to fields such as regenerative medicine, and by adding silk nanofibers to ink for 3D printing systems containing natural and/or synthetic polymers, it is possible to reduce the viscosity when ejected from a nozzle. It is disclosed that the pressure at the time of discharge can be lowered, and the viscosity is high on the substrate after printing, so that deformation of the shaped object can be sufficiently prevented. On the other hand, it is desired to further expand the range of materials and develop new methods for manufacturing three-dimensional objects.
  • the present invention provides a method for manufacturing a three-dimensional model, which can manufacture a three-dimensional model with good modeling accuracy, even when manufacturing a complex-shaped three-dimensional model made of soft materials, and a three-dimensional model.
  • the purpose is to provide an ink set for production.
  • the present inventors found that an ink for model materials containing a crosslinkable polymer and a hydrogen peroxide decomposer, and an ink for supporting materials containing a support material and hydrogen peroxide or a hydrogen peroxide donor were discharged. Then, the discharged hydrogen peroxide decomposer decomposes the discharged hydrogen peroxide and crosslinks the crosslinkable polymer, and then removes the support material ink model to form a three-dimensional model. As a result, it has been found that even when producing a three-dimensional structure made of soft material and having a complex shape, for example, the three-dimensional structure can be manufactured with good modeling accuracy.
  • the hydrogen peroxide decomposer may be contained in the ink for the support material, and the hydrogen peroxide or the hydrogen peroxide donor may be contained in the ink for the model material, and have completed the present invention. .
  • the present invention (1) includes a step of discharging (a) a model material ink containing a crosslinkable polymer, and (b) a support material ink containing a support material, and a step of discharging the crosslinkable polymer.
  • the model material ink (a) and the support material ink (b) further include a hydrogen peroxide decomposer.
  • the other further contains hydrogen peroxide or a hydrogen peroxide donor, and the discharged hydrogen peroxide decomposing agent decomposes the discharged hydrogen peroxide and crosslinks the crosslinkable polymer, thereby producing three-dimensional modeling.
  • the present invention relates to a method for manufacturing a three-dimensional object.
  • the present invention (2) is the method for producing a three-dimensional structure according to the present invention (1), wherein the hydrogen peroxide decomposing agent is a crosslinking enzyme.
  • the present invention (3) is the method for producing a three-dimensional structure according to the present invention (1) or (2), wherein the hydrogen peroxide donor is a hydrogen peroxide-producing enzyme.
  • the present invention (4) is a method for producing a three-dimensional structure in any combination with any of the present inventions (1) to (3), in which the crosslinkable polymer has a phenolic hydroxyl group.
  • the present invention (5) is a method for producing a three-dimensional structure in any combination with any of the present inventions (1) to (4), wherein the support material is a water-soluble polymer or a water-dispersible polymer. .
  • the water-soluble polymer or water-dispersible polymer is a water-soluble polymer or water-dispersible polymer that forms an aqueous gel that aggregates or reduces viscosity by interacting with an ionic compound, Any combination with any one of the present invention (1) to (5), in which in the step of removing the shaped objects of the support material ink, an ionic compound is applied to remove the shaped objects of the support material ink (b). This is a method for manufacturing a three-dimensional object.
  • the present invention (7) provides (a) an ink for a model material containing a crosslinkable polymer, and (b) consisting of an ink for a support material containing a support material;
  • One of the model material ink (a) and the support material ink (b) further contains a hydrogen peroxide decomposer, and the other further contains a tertiary ink containing hydrogen peroxide or a hydrogen peroxide donor. This is an ink set for creating original objects.
  • the present invention (8) is the ink set for producing a three-dimensional structure according to the present invention (7), wherein the hydrogen peroxide decomposing agent is a crosslinking enzyme.
  • the present invention (9) is the ink set for producing a three-dimensional structure according to the present invention (7) or (8), wherein the hydrogen peroxide donor is a hydrogen peroxide producing enzyme.
  • the present invention (10) is an ink set for producing a three-dimensional structure, in which the crosslinkable polymer has a phenolic hydroxyl group in any combination with any of the present inventions (7) to (9).
  • the present invention (11) is the present invention (7) in which the support material ink (b) contains a water-soluble polymer or a water-dispersible polymer that forms an aqueous gel that aggregates or reduces viscosity by acting with an ionic compound. ) to (10) in any combination for producing a three-dimensional object.
  • a method for manufacturing a three-dimensional model that can manufacture a three-dimensional model with good modeling accuracy even when manufacturing a complex-shaped three-dimensional model made of soft material, for example. be able to.
  • FIG. 3 is a graph showing the viscosity versus shear rate of the support material ink produced in Production Example 2. This is a photograph showing the formation of white precipitate when the projelly used in Production Example 2 is reacted with an ionic compound. This is a photograph in which the projelly used in Production Example 2 was blended into a DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle medium) to proliferate cells, and the growth of the cells was observed.
  • 1 is a photograph taken of three-dimensional structures produced in Example 1 and Comparative Example 1. This is a photograph taken of the three-dimensional structure produced in Examples 1 to 3.
  • the method for manufacturing a three-dimensional structure of the present invention includes the steps of discharging (a) an ink for a model material containing a crosslinkable polymer, and (b) an ink for a support material containing a support material, respectively; After crosslinking the crosslinkable polymer, the model material ink (a) and the support material ink (b) further contain hydrogen peroxide.
  • the other further contains hydrogen peroxide or a hydrogen peroxide donor, and the discharged hydrogen peroxide decomposition agent decomposes the discharged hydrogen peroxide and crosslinks the crosslinkable polymer. , is characterized by modeling three-dimensional objects.
  • FIG. 1 is a schematic diagram for explaining the process of producing a three-dimensional structure having a bridge portion by the method for producing a three-dimensional structure of the present invention.
  • FIG. 1A schematically shows how ink 1 for support material is ejected from a nozzle 3a of a three-dimensional printer.
  • FIG. 1(b) schematically shows how the model material ink 2 is ejected from the nozzle 3b of the three-dimensional printer.
  • the nozzle 3a and the nozzle 3b may be the same nozzle, it is preferable that they are different.
  • one layer can be formed by discharging ink 1 for support material, and then discharging ink 2 for model material at a position surrounded by ink 1 for support material, and this can be repeated to form a laminated structure. do.
  • the ejected support material ink 1 and the ejected model material ink 2 are in contact with each other.
  • the support material ink 1 contains hydrogen peroxide or a hydrogen peroxide donor together with the support material
  • the model material ink 2 contains a hydrogen peroxide decomposer together with the crosslinkable polymer
  • the ejected support material ink Hydrogen peroxide is supplied to the model material ink 2 discharged from 1, and the hydrogen peroxide decomposer in the model material ink 2 discharged decomposes the hydrogen peroxide and crosslinks the crosslinkable polymer.
  • the model material ink 2 is gelled.
  • model material ink 1(c) after the gelation of the model material ink 2 is completed, the obtained model is immersed in a model removal solution 5 of the support material ink 1, and the model material ink 1 is removed. It shows the process of removing objects.
  • removing the modeled object of the support material ink 1 it is also possible to produce a three-dimensional modeled object 2A (model material ink modeled object) having a complex shape including a bridge portion 2a and a hole 2b.
  • ink for model materials and ink for support materials are discharged into cylindrical containers such as beakers and petri dishes, prismatic containers, and containers of various other shapes to create a three-dimensional structure. You may also create a shaped object. Since the inner wall of the container serves as a support for the model material ink and/or the support material ink, it is possible to produce a model with a higher height.
  • the material of the container is not particularly limited as long as it serves as a support for the model material ink and/or the support material ink, and materials such as glass and resin can be used. Moreover, the container may be manufactured by three-dimensional modeling.
  • a model material ink (a) and a support material ink (b) containing a support material are discharged from a nozzle of a three-dimensional printer onto a target location such as on a substrate.
  • the three-dimensional printer is not particularly limited, and may be any of an inkjet type, laser beam type, extrusion type, etc., but an extrusion type three-dimensional printer is more preferable. preferable. It is preferable that the nozzle for ejecting the model material ink (a) is different from the nozzle for ejecting the support material ink (b).
  • the ink (a) for model materials contains a crosslinkable polymer, and becomes gel-like due to the crosslinking of the crosslinkable polymer as hydrogen peroxide decomposes.
  • crosslinkable polymers include, but are not particularly limited to, polymers obtained by bonding a polymer base material and a compound having a phenolic hydroxyl group, amino group-containing polysaccharides, polyphenols, and the like.
  • the polymer base material is not particularly limited and includes, for example, polysaccharides, nucleic acids, carbohydrates, proteins, polypeptides, poly( ⁇ -hydroxy acids), polylactones, polyamino acids, polyanhydrides, polyorthoesters, poly(anhydrous (co-imide), polyorthocarbonate, poly( ⁇ -hydroxyalkanoate), polydioxanone, polyphosphoester, polylactic acid, poly(L-lactide) (PLLA), poly(D,L-lactide) (PDLLA) , polyglycolic acid, polyglycolide (PGA), poly(lactide-co-glycolide) (PLGA), poly(L-lactide-co-D,L-lactide), poly(D,L-lactide-co-trimethylene) carbonate), polyhydroxybutyrate (PHB), poly( ⁇ -caprolactone), poly( ⁇ -valerolactone), poly( ⁇ -butyrolactone), polycaprolactone, poly(
  • Examples include polyalkylene oxide, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, polyethyloxazoline, poly(ethylene oxide)-co-poly(propylene oxide) block copolymer, poly(ethylene terephthalate) polyamide, and salts of these polymer base materials.
  • polysaccharides examples include cellulose, hemicellulose, dextran, hyaluronic acid, chitin, chitosan, alginic acid, chondroitin sulfate, starch, pullulan, carrageenan, curdlan, fucoidan, amylose, amylopectin, pectin, and salts such as alkali metal salts thereof. , derivatives, etc.
  • examples of polysaccharide derivatives include carboxymethylcellulose, methylcellulose, deacetylated chitins, and deacetylated chitosans.
  • proteins include simple proteins such as albumin, globulin, prolamin, glutelin, histone, protamine, and hard protein; complex proteins such as nuclear protein, glycoprotein, chromoprotein, and phosphoprotein; and induced proteins such as gelatin, proteose, and peptone. Can be mentioned.
  • the salt of the polymer base material is not particularly limited, and includes acid addition salts, metal salts, ammonium salts, organic amine salts, and the like.
  • acid addition salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate, and phosphate; organic acid salts such as acetate, maleate, fumarate, tartrate, and citrate.
  • metal salts include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts, alkaline earth metal salts such as calcium salts, magnesium salts, aluminum salts, zinc salts, and the like.
  • organic amine salts include salts of morpholine, piperidine, and the like.
  • polysaccharides and proteins are preferred because they are easily supplied and the properties of the three-dimensional structure obtained are good, and polysaccharides are more preferred.
  • polymer base material only one of the above-mentioned materials may be used, or two or more kinds thereof may be used in combination.
  • Compounds having a phenolic hydroxyl group include, but are not particularly limited to, the following general formula (1):
  • X 1 represents a hydroxyl group, an amino group, or a carboxylic acid (salt) group.
  • One or two of X 2 to X 6 represent a hydroxyl group, and the rest are hydrogen atoms or have 1 carbon number.
  • ⁇ 6 represents an alkoxy group.
  • the two hydroxyl groups are preferably in the ortho or para positional relationship.
  • Compounds represented by are preferred.
  • a crosslinkable polymer in which a phenolic hydroxyl group is introduced into a polymer base material is easily crosslinked by a hydrogen peroxide decomposing agent such as a crosslinking enzyme.
  • X 1 is preferably a carboxylic acid (salt) group or an amino group, more preferably an amino group, since it is easy to introduce a phenolic hydroxyl group into the polymer base material.
  • the said amino group is preferably a primary amino group or a secondary amino group.
  • the carboxylic acid (salt) group is preferably a carboxylic acid group, an alkali metal salt of a carboxylic acid group, or an alkaline earth metal salt.
  • the number of carbon atoms in the divalent hydrocarbon group represented by R is preferably 1 to 8, more preferably 1 to 6.
  • the divalent hydrocarbon group represented by R includes, but is not particularly limited to, an alkylene group, an alkylalkylene group, and the like. Further, examples of the substituent that R may have include an amide group, an ester group, and an ether group.
  • X 1 is a hydroxyl group, it is an alcoholic hydroxyl group.
  • Examples of compounds having a phenolic hydroxyl group include compounds having one phenolic hydroxyl group such as tyramine, homovanillic acid, and derivatives thereof, and compounds having two phenolic hydroxyl groups such as catecholamines such as dopamine, noradrenaline, and adrenaline. Can be mentioned. Among these, from the viewpoint of crosslinking reactivity of the resulting crosslinkable polymer, compounds having one phenolic hydroxyl group are preferred, and tyramine and tyramine derivatives are more preferred.
  • tyramine hydrochloride (4-(2-aminoethyl)phenol hydrochloride, product number: T2879, manufactured by Sigma-Aldrich).
  • the method of bonding the polymer base material and the compound having a phenolic hydroxyl group is not particularly limited, but the compound having a phenolic hydroxyl group may have a functional group such as a carboxyl group, an amino group, or an alcoholic hydroxyl group, Examples include a method of condensing a functional group such as an amino group, a carboxyl group, or a thiol group that the polymer base material may have using a condensing agent, and a method of condensing using glutamyl transferase.
  • the condensing agent is not particularly limited, but includes, for example, 1,1-carbonyldiimidazole, dicyclohexylcarbodiimide, 3-(3-dimethylaminopropyl)-1-ethylcarbodiimide hydrochloride (water-soluble carbodiimide: WSCD/HCl), etc. can be mentioned.
  • the polymeric base material used the compound having a phenolic hydroxyl group, the condensing agent and
  • the pH, concentration of polymer base material, reaction temperature, solvent, etc. can be selected as appropriate depending on the properties of glutamyl transferase.
  • the introduction rate (modification rate) of a compound having a phenolic hydroxyl group into a polymer base material is the ratio of condensation-reactive groups that have undergone a condensation reaction (modified) to the total number of condensation-reactive groups that the polymer base material has. From the viewpoint of achieving both gelation rate and hardness (not too hard) in a well-balanced manner, it is preferably 0.3 to 20 mol%, more preferably 1 to 10 mol%, based on 100 mol% of the condensation reaction group possessed by the polymer base material. .
  • amino group-containing polysaccharides and polyphenols can also be used.
  • amino group-containing polysaccharides include acetylated chitin and chitosan.
  • polyphenols include catechin compounds, anthocyanin compounds, rutin, and natural pigments.
  • the concentration of the crosslinkable polymer in the model material ink (a) is usually 0.1 to 30% by weight, preferably 0.5 to 20% by weight, and more preferably 0.75 to 10% by weight. If the concentration of the crosslinkable polymer is less than 0.1% by weight, the strength of the three-dimensional structure may not be sufficient, and if it exceeds 30% by weight, the viscosity of the ink for model materials will become too high. , the pressure at the time of ejection from the nozzle becomes high, which may affect the quality of the material of the model material ink (a).
  • the concentration of the crosslinkable polymer in the ink (a) for model materials is usually 0.1 to 30 w/v% (g/100 mL), and 0.5 to 20 w/v% (g/100 mL). Preferably, 0.75 to 10 w/v% (g/100 mL) is more preferable.
  • the ink for model material (a) further contains a hydrogen peroxide decomposer, hydrogen peroxide, or a hydrogen peroxide donor.
  • a hydrogen peroxide decomposer for model material (a) further includes a hydrogen peroxide decomposer.
  • the hydrogen peroxide decomposer may be any agent as long as it decomposes hydrogen peroxide and crosslinks the crosslinkable polymer in the model material ink (a), and crosslinking enzymes, complexes, proteins, etc. are preferably used.
  • the crosslinking enzyme is not particularly limited, but preferable examples include peroxidase, laccase, tyrosinase, and catalase because the reaction proceeds at room temperature and atmospheric pressure and is highly safe.
  • the origin of the crosslinking enzyme is not particularly limited, but as the peroxidase, peroxidase derived from horseradish is preferred.
  • the complex include iron porphyrin complexes because the reaction proceeds at room temperature and atmospheric pressure and is highly safe.
  • proteins include hemoglobin.
  • the concentration of the crosslink-forming enzyme in the ink for model materials (a) is not particularly limited, but from the viewpoint of faster gelation, the concentration is 0.1 U/ mL or more is preferable, and 1 U/mL or more is more preferable. Further, the concentration of the crosslinking enzyme is usually 10,000 U/mL or less, preferably 2,000 U/mL or less, more preferably 1,000 U/mL or less, and even more preferably 500 U/mL or less.
  • the concentration of the hydrogen peroxide decomposing agent other than the crosslinking enzyme in the ink for model materials (a) may further increase gelation.
  • the amount is preferably 0.1% by weight or more, and more preferably 1% by weight or more.
  • the concentration of the hydrogen peroxide decomposer other than the crosslinking enzyme is usually 20% by weight or less, preferably 10% by weight or less.
  • the ink for model materials contains hydrogen peroxide or a hydrogen peroxide donor, specific examples of the hydrogen peroxide donor, preferred examples of hydrogen peroxide or hydrogen peroxide donors in the ink for model materials (a)
  • concentration is the same as the specific example of the hydrogen peroxide donor contained in the support material ink (b) and the preferred concentration of hydrogen peroxide or hydrogen peroxide donor in the support material ink (b), which will be described later.
  • the model material ink (a) may contain other components in addition to the crosslinkable polymer, the hydrogen peroxide decomposer, or the hydrogen peroxide or hydrogen peroxide donor.
  • Other components include various cells, solvents, polymerization initiators, chain transfer agents, plasticizers, pH adjusters, buffers, preservatives, solvents, ultraviolet absorbers, colorants, surfactants, and the like.
  • the solvent include water, phosphate buffered saline (PBS), and a mixture of water and an organic solvent.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the organic solvent is not particularly limited, and examples thereof include ethanol, glycerin, dimethyl sulfoxide, and the like.
  • Examples of animals from which cells are derived include mammals, birds, and reptiles, with mammals being preferred.
  • Examples of mammals include humans, pigs, cows, sheep, goats, rabbits, mice, rats, dogs, cats, and chickens, with humans being preferred.
  • Examples of cell types include epithelial cells, fibroblasts, chondrocytes, osteoblasts, smooth muscle cells, nerve cells, and stem cells.
  • the concentration of cells in the model material ink is not particularly limited, but is preferably 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 9 cells/mL, more preferably 1 ⁇ 10 4 to ⁇ 10 7 cells/mL.
  • the model material ink (a) is preferably liquid at room temperature. Since it is liquid at room temperature, it can be easily discharged using a 3D printer or the like.
  • the viscosity of the model material ink (a) at 20° C. is not particularly limited, but is preferably 10 mPa ⁇ s or more, more preferably 20 mPa ⁇ s or more, and even more preferably 50 mPa ⁇ s or more. Further, the viscosity is preferably 100,000 mPa ⁇ s or less, more preferably 10,000 mPa ⁇ s or less, and even more preferably 2,000 mPa ⁇ s or less.
  • the production method of the present invention can sufficiently prevent the model material ink (a) before gelling from flowing out (dripping), so that a low-viscosity model material ink (a) can be suitably used.
  • a low-viscosity model material ink (a) can be suitably used.
  • the above viscosity is measured using a cone-plate type E-type viscometer at a rotation speed of 20 rpm.
  • Ink (a) for model materials can be manufactured by mixing the above-mentioned crosslinkable polymer, hydrogen peroxide decomposer, hydrogen peroxide or hydrogen peroxide donor, and other components as necessary. Can be done.
  • the mixing conditions are not particularly limited, but from the viewpoint of enzyme activity, the temperature is preferably 4 to 45°C, more preferably 10 to 40°C. Further, during mixing, the pH is usually 2 to 11, preferably 5 to 9, from the viewpoint of enzyme activity.
  • the obtained ink for model materials is usually preferably stored at -80 to 20°C.
  • the ink for model material may be freeze-dried after being produced. A known method can be used for freeze-drying.
  • the support material ink (b) may be one that maintains its shape through crosslinking and becomes a modeled object, but it is more convenient to use an ink that can maintain its shape by itself and directly becomes a modeled object. preferable.
  • the modeled object made of the support material ink (b) retains the shape of the model material ink (a) until the model material ink (a) is sufficiently gelled, and prevents the model material ink (a) from flowing out (liquid). This prevents dripping) and deformation of the model material ink (a) due to gravity. After the model material ink (a) is gelled, the model material ink (b) is removed by the method described below.
  • the support material included in the support material ink (b) is a polymer such as a natural polymer or a synthetic polymer.
  • the polymer include polysaccharides, nucleic acids, carbohydrates, proteins, polypeptides, polyamino acids, and polyesters.
  • Lactic acid polyalkylene oxides such as polyethylene oxide, polyalkylene imines such as polyethyleneimine, polyalkylene glycols such as polyvinylpyrrolidone and polyethylene glycol, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyglutamic acid, carboxyvinyl polymer, carboxymethylcellulose, methylcellulose, Examples include hydroxyethyl cellulose, albumin, gelatin, collagen, silk fibroin, polyvinyl alcohol, and salts of these polymers.
  • the above-mentioned polymers include polysaccharides, nucleic acids, carbohydrates, proteins, polypeptides, polyamino acids, polylactic acid, polyethylene oxide, polyethyleneimine, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol, polyacrylic acid, polyglutamic acid, albumin, gelatin, collagen, polyvinyl Alcohols and salts of these polymers are preferred.
  • the salts of polysaccharides, proteins, and polymers are the same as the salts of polysaccharides, proteins, and polymers described above for the polymer base material.
  • the support material may be made by crosslinking the above-mentioned polymer with a crosslinking agent.
  • polysaccharides include cellulose, hemicellulose, dextran, hyaluronic acid, chitin, chitosan, alginic acid, chondroitin sulfate, starch, pullulan, carrageenan, curdlan, fucoidan, amylose, amylopectin, pectin, and salts such as alkali metal salts thereof. , derivatives, etc.
  • the support material is preferably a water-soluble polymer or a water-dispersible polymer.
  • the solubility of the water-soluble polymer in 100 g of water at 20° C. is not particularly limited, but is preferably 1 g or more, more preferably 5 g or more.
  • the water-soluble polymer or the water-dispersible polymer forms an aqueous polymer gel, and the formed aqueous polymer gel aggregates or reduces its viscosity by interacting with an ionic compound.
  • the water-soluble polymer or water-dispersible polymer that forms a polymer aqueous gel that aggregates or reduces viscosity by interacting with an ionic compound is a hydrocarbon chain having an acid group such as a carboxylic acid group (e.g., polyacrylic acid).
  • the main chain is crosslinked with a crosslinking agent.
  • the crosslinking agent include, but are not limited to, allylsucrose, pentaerythritol, and the like. The ionic compound will be described later.
  • the concentration of the polymer in the support material ink (b) is preferably 0.1% by weight or more, and 0.3% by weight or more from the viewpoint of further improving the pseudoplasticity of the support material ink (b). It is more preferably 0.5% by weight or more, even more preferably 1.0% by weight or more. Further, the concentration of the polymer is preferably 30.0% by weight or less, more preferably 15.0% by weight or less, and even more preferably 10.0% by weight or less. In addition, when two or more kinds of polymers are contained in the support material ink (b), the above concentration means the total concentration of all the polymers contained in the support material ink.
  • the support material ink (b) further contains hydrogen peroxide, a hydrogen peroxide donor, or a hydrogen peroxide decomposer.
  • hydrogen peroxide a hydrogen peroxide donor
  • hydrogen peroxide decomposer a hydrogen peroxide decomposer
  • the concentration of hydrogen peroxide in the support material ink (b) is not particularly limited, but is preferably 0.01 mM or more and 1M or less.
  • the concentration is more preferably 0.1mM or more, even more preferably 1mM or more, and particularly preferably 5mM or more.
  • the concentration of hydrogen peroxide is more preferably 100 mM or less, further preferably 30 mM or less, and particularly preferably 10 mM or less from the viewpoint of further improving the modeling accuracy of the three-dimensional structure.
  • the hydrogen peroxide donor is not particularly limited as long as it can generate hydrogen peroxide, and examples include hydrogen peroxide-generating enzymes and photocatalysts, with hydrogen peroxide-generating enzymes being preferred.
  • hydrogen peroxide-producing enzymes include choline oxidase, amino acid oxidase, alcohol oxidase, pyruvate oxidase, cholesterol oxidase, and glucose oxidase.
  • the concentration of the hydrogen peroxide-generating enzyme in the support material ink (b) is preferably 0.1 mU/mL or more from the viewpoint of reactivity, and 1 mU /mL or more is more preferable, and 2.5 mU/mL or more is even more preferable. Further, the concentration of the hydrogen peroxide generating enzyme is preferably 20,000 mU/mL or less, more preferably 10,000 mU/mL or less, even more preferably 1,000 mU/mL or less, and particularly preferably 200 mU/mL or less.
  • the concentration of the hydrogen peroxide donor other than the hydrogen peroxide-generating enzyme in the support material ink (b) is determined by the reaction From the viewpoint of properties, the content is preferably 0.1% by weight or more, and more preferably 1% by weight or more. Further, the concentration of hydrogen peroxide donors other than the hydrogen peroxide-producing enzyme is usually 20% by weight or less, preferably 10% by weight or less.
  • the support material ink (b) contains a hydrogen peroxide decomposition agent
  • specific examples of the hydrogen peroxide decomposition agent and preferred concentrations of the hydrogen peroxide decomposition agent in the support material ink (b) are as follows: Specific examples of the hydrogen peroxide decomposer contained in the ink (a) for model materials are the same as the preferred concentration of the hydrogen peroxide decomposer in the ink (a) for model materials.
  • the support material ink (b) may contain other components in addition to the polymer as the support material, hydrogen peroxide, a hydrogen peroxide donor, or a hydrogen peroxide decomposer.
  • Other components include humectants such as glycerol, pH adjusters such as alkali metal hydroxides and organic amines, preservatives, colorants, solvents, plasticizers, ultraviolet absorbers, and surfactants.
  • the solvent include water, phosphate buffered saline (PBS), and a mixture of water and an organic solvent.
  • the organic solvent is not particularly limited, and examples thereof include ethanol, glycerin, and the like.
  • the support material ink (b) is preferably liquid or gel-like at room temperature, and more preferably gel-like. Since it is gel-like at room temperature, it can be easily modeled using a 3D printer or the like.
  • the viscosity of the support material ink (b) at 20° C. at a shear rate of 0.01 (1/s) is preferably 10,000 mPa ⁇ s or more, and from the viewpoint of being able to maintain its shape by itself, the viscosity is 100,000 mPa. ⁇ s or more is more preferable, and 500000 mPa ⁇ s or more is even more preferable. Further, the upper limit of the viscosity is not particularly limited, but is usually 10,000,000 mPa ⁇ s or less.
  • the viscosity of the support material ink (b) at 20° C. at a shear rate of 10 (1/s) is preferably 10 mPa ⁇ s or more, more preferably 100 mPa ⁇ s or more, and even more preferably 1000 mPa ⁇ s or more. Further, the upper limit of the viscosity is not particularly limited, but is usually less than 10,000 mPa ⁇ s.
  • the above viscosity is a value measured using a viscosity/viscoelasticity measuring device manufactured by Thermo Fisher Scientific.
  • the ratio of the viscosity at a shear rate of 0.01 (1/s) to the viscosity at a shear rate of 10 (1/s) at 20°C of the support material ink (b) is preferably 5 or more, more preferably 10 or more. It is preferably 20 or more, more preferably 50 or more. As a result, the support material ink (b) has better pseudoplasticity.
  • the support material ink (b) can be produced by mixing a polymer, hydrogen peroxide, a hydrogen peroxide donor, or a hydrogen peroxide decomposer, and other components as necessary. .
  • the conditions during mixing are not particularly limited.
  • a three-dimensional printer is usually used to eject the model material ink (a) and the support material ink (b), respectively, to form a layer, and this process is repeated.
  • Stack When the ejected model material ink (a) and the ejected support material ink (b) come into contact, the ejected hydrogen peroxide decomposer decomposes the ejected hydrogen peroxide, resulting in highly crosslinkable The molecules are cross-linked to form a model material ink (a).
  • hydrogen peroxide, a hydrogen peroxide donor, or a hydrogen peroxide decomposer contained in the ejected support material ink (b) is supplied to the ejected model material ink (a).
  • ionic crosslinking, photocrosslinking, enzymatic crosslinking, temperature change, etc. may contribute to the crosslinking of the crosslinkable polymer. .
  • the model material ink and the first support material ink are used.
  • the support material may be manufactured by discharging a second support material ink.
  • the ink for the second support material may be ejected in advance to create a three-dimensional object (container or outer frame), or only one part of the three-dimensional object (container or outer frame) may be created and the remaining part , the model material ink and the first support material ink may be ejected together. Alternatively, all may be produced at the same time.
  • the three-dimensional structure (container or outer frame) produced using the second support material ink serves as a support for the model material ink and the first support material ink. It is possible to more fully prevent the support material ink from collapsing, and it is also possible to produce a three-dimensional structure with a higher height, if desired. Further, such a second support material ink may not contain a hydrogen peroxide decomposing agent, hydrogen peroxide or a hydrogen peroxide donor, and a second support material ink may be added to such a second support material ink.
  • the hydrogen peroxide decomposing agent, hydrogen peroxide, or hydrogen peroxide donor contained in the first support material ink can be reduced. You can also save on the amount your body uses.
  • the second support material included in the second support material ink is not particularly limited as long as it serves as a support for the model material ink and/or the support material ink, and the second support material ink contained in the support material ink (b ), glass, resin, etc. can be used.
  • the objects formed from the second support material ink can be removed in the same way as the objects formed from the first support material ink.
  • the ink for the model material may be in contact with a shaped object, a part or all of which is made up of the second support material.
  • FIG. 10 is a schematic diagram for explaining the step of producing a three-dimensional structure by further using the second support material ink in the method for producing a three-dimensional structure of the present invention.
  • FIG. 10A schematically shows how the second support material ink 11s is ejected from the nozzle 13a of the three-dimensional printer.
  • FIG. 10(b) schematically shows how the first support material ink 11 is ejected from the nozzle 13b of the three-dimensional printer.
  • FIG. 10C schematically shows how the model material ink 12 is ejected from the nozzle 13c of the three-dimensional printer.
  • the nozzle 13a, the nozzle 13b, and the nozzle 13c may be the same nozzle, but are preferably different from each other.
  • the second support material ink 11s is discharged, the first support material ink 11 is discharged at a position surrounded by the second support material ink 11s, and the first support material ink 11 is One layer is formed by discharging the model material ink 12 at the surrounded position, and this is repeated to form a laminated structure.
  • the ejected second support material ink 11s has a thin wall shape with flat inner and outer peripheral parts, and The support material ink 11 is contacted and supported, and the ejected model material ink 12 is also indirectly supported.
  • an ink that can form a hard model as the second support material ink 11s, it is possible to more fully prevent the model material ink 12 and the first support material ink 11 from collapsing during gelation. can. Further, if desired, a three-dimensional structure with a higher height can be produced.
  • FIG. 10(d) similarly to FIG. 1(c), after gelation of the model material ink 12 is completed, the obtained model is immersed in the removal solution 15, and the first support material ink is removed.
  • 11 shows a step of removing the molded object of No. 11 and the molded object of the second support material ink 11s. This step will be described later.
  • FIG. 11 is the same as the schematic diagram shown in FIG. 10, except that the ejection ranges of the first support material ink 21 and the second support material ink 21s are changed as shown in FIG. Below, only the parts different from FIG. 10 will be explained.
  • the ink for the second support material is ejected in a stepped manner with the inner circumference expanding downward, and a part of the ink for the first support material is ejected into the second ink in contrast to the case of FIG. It is being replaced with ink for support materials.
  • the model material ink 22 and the first By using an ink that can form a hard model and does not contain a hydrogen peroxide decomposing agent, hydrogen peroxide, or a hydrogen peroxide donor as the second support material ink 21s, the model material ink 22 and the first
  • the ejection amount of the first support material ink 21 can be reduced while more fully preventing the support material ink 21 from collapsing during gelation, etc., and hydrogen peroxide or a hydrogen peroxide donor, Alternatively, the amount of hydrogen peroxide decomposer used can be saved.
  • the second support material ink is shaped so that the outer periphery thereof has a stepped shape that expands upward in accordance with the shapes of the ejected model material ink 32 and the ejected first support material ink 31.
  • the amount of ink for the second support material to be ejected can also be reduced compared to FIG. 10.
  • the removing step is not particularly limited as long as a model material ink (a) is obtained by removing the model material ink (b), but for example, the model material ink (b) model material is removed. This is preferably carried out by immersing and/or washing in a solution for removing the modeled object of the support material ink (b).
  • the removing step is preferably carried out under mild conditions, for example, at a temperature of 10 to 40°C, from the viewpoint of reducing the influence of the ink for model materials (a) on the modeled object (three-dimensional model). It is preferable to do so. Further, the pH of the removal solution at 20° C.
  • the modeled object of support material ink consists of remaining components such as support material (polymer) after hydrogen peroxide or hydrogen peroxide decomposer is supplied from support material ink to model material ink. It is something.
  • the modeled object of the support material ink (b) and the modeled object of the second support material ink are prepared using different methods. However, it is preferable to remove the shaped objects of the second support material ink together with the shaped objects of the support material ink (b) in the above-mentioned removing step.
  • the support material is a water-soluble polymer or a water-dispersible polymer
  • water or an aqueous solution can be used as the removal solution.
  • a removal solution may be used.
  • an aqueous solution of an ionic compound can be particularly preferably used.
  • a water-soluble polymer or water-dispersible polymer interacts with an ionic compound, it means that the aqueous polymer gel aggregates or its viscosity decreases as a result of the contact between the water-soluble polymer or water-dispersible polymer and the ionic compound.
  • examples thereof include those that react (chemically react) with ionic compounds.
  • a degrading enzyme can be used, and by using culture medium, buffer, physiological saline, water, etc. after enzymatic treatment, support material ink can be Modeled objects can be removed. If the support material undergoes a phase transition depending on the temperature, the phase transition can be caused by heating or cooling, and after the phase transition, the shaped objects of the support material ink can be removed by using water or an aqueous solution. .
  • Ionic compounds include polyvalent metal salts such as calcium, zinc, magnesium, barium, strontium, copper, iron, aluminum, cobalt, and the like. Among them, calcium chloride, calcium hydroxide, calcium carbonate, and calcium lactate are preferred, and calcium chloride is more preferred.
  • the concentration of the ionic compound in the removal solution is preferably 1 mM or more, more preferably 10 mM or more.
  • the concentration is preferably 2M or less, more preferably 0.2M or less.
  • Degradative enzymes include, but are not limited to, cellulase, amylase, dextranase, carraginase, alginate lyase, hyaluronidase, chitinase, and chitosanase.
  • the concentration of the degrading enzyme in the removal solution is preferably 0.1 to 5% by weight, more preferably 0.1 to 1% by weight.
  • the model material is sufficiently gelled.
  • the method may include a step of allowing the discharged model material ink and support material ink to stand still.
  • the three-dimensional model obtained using the manufacturing method of the present invention can be made of, for example, a complex-shaped three-dimensional model made of soft material, and is particularly suitable as an artificial organ in the field of regenerative medicine. It can be used for Note that the shape of the three-dimensional structure is not particularly limited, but it is also suitable for a three-dimensional structure having a bridge portion and/or a hole. The dimensions of the three-dimensional structure can be set as appropriate.
  • the present invention comprises (a) an ink for a model material containing a crosslinkable polymer, and (b) an ink for a support material containing a support material, wherein either the ink for the model material or the ink for the support material is
  • the ink set further includes a hydrogen peroxide decomposing agent, and the other further includes hydrogen peroxide or a hydrogen peroxide donor.
  • the crosslinkable polymer, support material, hydrogen peroxide decomposer, hydrogen peroxide, hydrogen peroxide donor, and other components contained in the model material ink (a) and the support material ink (b) are as described above. It is.
  • the method for producing a three-dimensional structure of the present invention can be suitably carried out.
  • Production example 1 preparation of ink for model material 10 g of sodium hyaluronate (manufactured by Fuji Medici Co., Ltd.) was dissolved in 1 L of 0.1 M 2-morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate (MES) buffer (pH 5.8). Further, a solution of 0.56 g of tyramine hydrochloride, 1.43 g of water-soluble carbodiimide (WSCD/HCl), and 0.43 g of N-hydroxysuccinimide (NHS) dissolved in 10 mL of purified water was added, and the mixture was heated to room temperature for 22 hours. Stir for hours.
  • MES 2-morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate
  • WSCD/HCl water-soluble carbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • HYA-Ph modified phenolic hydroxyl group: 4.8 mol%.
  • the prepared HYA-Ph was added to a concentration of 1.0 w/v% (g/100 mL), and the hydrogen peroxide decomposer (HRP [peroxidase derived from horseradish]) was added to a solvent (calcium/magnesium deficient) to a concentration of 10 U/mL. (Phosphate-buffered saline) to prepare an ink for model materials.
  • HRP hydrogen peroxide decomposer
  • Production example 2 preparation of ink for support material
  • Ink for support material was prepared by dissolving hydrogen peroxide in Projelly (high viscosity type, manufactured by Gex Co., Ltd.) at concentrations of 0.1 mM, 1.0 mM, 10 mM, and 100 mM.
  • the viscosity of the projelly used in the support material ink with respect to the shear rate is as shown in FIG. 2, and it was found that the viscosity did not change even when hydrogen peroxide, which is a crosslinking agent, was added.
  • the support material ink obtained in Production Example 2 containing Projelly as a main component can maintain its shape by itself after being ejected. I was able to construct a sculpture.
  • projelly reacted with calcium ions Ca 2+ in a 100 mM calcium chloride aqueous solution to produce a white precipitate, resulting in a significant decrease in viscosity.
  • projelly acts with an ionic compound to aggregate or reduce its viscosity, so the ionic compound can be suitably used when removing a shaped object of a support material ink containing projelly.
  • FIG. 4 shows that cells proliferated and spread normally in the DMEM medium containing Projelly (Dulbecco's modified Eagle medium), as well as in the DMEM medium not containing Projelly.
  • the cells used were mouse fetal-derived fibroblasts (10T1/2 cells). Therefore, Projelly was virtually free of cytotoxicity. From the above, projelly is suitable as a raw material for ink for support materials.
  • Production example 3 (preparation of ink for model material) Modified polyvinyl alcohol (3.3 (w/v)%) was added to 0.1M 2-morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate (MES) buffer (pH 6.0). A solution in which AF-17 (manufactured by Nippon Ace Vine & Poval Co., Ltd.) was dissolved was heated at 120° C. for 15 minutes. After cooling to room temperature, tyramine hydrochloride, water-soluble carbodiimide (WSCD HCl) and N-hydroxysuccinimide (NHS) were added to 3.3, 3.3, and 1.0 (w/v)%, respectively. The mixture was stirred at 40°C for 20 hours.
  • MES 2-morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate
  • Production example 4 preparation of ink for model material 10 g of gelatin (manufactured by Gelice Co., Ltd.) was dissolved in 500 mL of 0.05 M 2-morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate (MES) buffer (pH 6.0). Further, a solution of 1.84 g of tyramine hydrochloride, 1.85 g of water-soluble carbodiimide (WSCD/HCl), and 0.57 g of N-hydroxysuccinimide (NHS) dissolved in 5 mL of purified water was added, and the mixture was heated to room temperature for 20 min. Stir for hours.
  • MES 2-morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate
  • WSCD/HCl water-soluble carbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • Example 1 As three-dimensional objects, two types of hexagonal tubes with the sizes shown below were produced using the following procedure: Fabricated in Production Example 2 using a three-dimensional printer (product name: BIO X, manufacturer name: Celllink) The support material ink having a hydrogen peroxide concentration of 10 mM and the model material ink produced in Production Example 1 were each discharged onto a substrate to form a layer, and this process was repeated to stack the layers. After the ejection was completed, the ink for the model material was sufficiently gelled by standing at 25° C. for 10 minutes. Thereafter, the modeled object was immersed in a calcium chloride solution (concentration 100 mM), and the modeled object of the support material ink was removed. Modeled object 1 (thickness: 1mm, height: 5mm, length of one side: 6mm) Modeled object 2 (thickness: 2mm, height: 5mm, length of one side: 6mm)
  • Comparative example 1 A three-dimensional structure was produced in the same manner as in Example 1, except that no support material ink was used and the conditions were exposed to hydrogen peroxide vapor.
  • Example 1 As shown in FIG. 5, in Example 1, by using ink for support materials and gelling the ink for model materials while holding the support material ink by the molded object, the model material had very good modeling accuracy. was able to be created. On the other hand, in Comparative Example 1, when the supporting material ink was not used and the product was exposed to hydrogen peroxide vapor, only a modeled product that was deformed and had low modeling accuracy could be obtained.
  • Example 2 A three-dimensional structure was produced in the same manner as in Example 1 except that the hydrogen peroxide concentration of the support material ink was 1 mM.
  • Example 3 A three-dimensional structure was produced in the same manner as in Example 1 except that the hydrogen peroxide concentration of the support material ink was 100 mM.
  • Example 2 three-dimensional structures with good modeling accuracy were obtained.
  • Example 3 a three-dimensional model with good modeling accuracy was obtained, but there were many bubbles due to the high concentration of hydrogen peroxide, and the three-dimensional model with good modeling accuracy was lower than the three-dimensional model obtained in Examples 1 and 2.
  • the modeling accuracy was somewhat low compared to the modeling accuracy of the modeled object.
  • Example 4 A three-dimensional structure was produced in the same manner as in Example 1, except that the ink produced in Production Example 3 was used as the ink for the model material.
  • Example 5 A three-dimensional structure was produced in the same manner as in Example 1, except that the ink produced in Production Example 4 was used as the ink for the model material.
  • Example 4 which used an ink for model materials containing modified polyvinyl alcohol
  • Example 5 which used an ink for model materials containing gelatin
  • an ink for model materials containing hyaluronic acid was used.
  • a modeled article with very good modeling accuracy was able to be produced.
  • Example 6 Mouse fibroblasts 10T1/2 were dispersed in the model material ink prepared in Production Example 1 at 1 ⁇ 10 5 cells/mL, and the resulting cell-containing model material ink and support material ink prepared in Production Example 2 were obtained. A three-dimensional structure was produced in the same manner as in Example 1 using the following.
  • the obtained three-dimensional structure was cultured in a DMEM medium containing 10 vol% fetal bovine serum. Before the start of culture, on the 7th day, and 14th day after the start of culture, the structures containing cells were washed with phosphate buffered saline (pH 7.4) containing 1 ⁇ g/mL each of the living cell staining reagent Calcein-AM and the dead cell staining reagent PI. ) for 10 minutes for staining. A photograph taken of the results is shown in FIG. Many survived even after 14 days of culture.
  • Example 7 Human liver cancer-derived cells HepG2 were dispersed in the model material ink prepared in Production Example 1 at 1 x 10 5 cells/mL, and the resulting cell-containing model material ink and support material ink prepared in Production Example 2 were used. A three-dimensional structure was produced in the same manner as in Example 1.
  • the obtained three-dimensional structure was cultured in a DMEM medium containing 10 vol% fetal bovine serum. Before the start of culture, on the 7th day, and 14th day after the start of culture, the structures containing cells were washed with phosphate buffered saline (pH 7.4) containing 1 ⁇ g/mL each of the living cell staining reagent Calcein-AM and the dead cell staining reagent PI. ) for 10 minutes for staining. A photograph taken of the results is shown in FIG. Many of the HepG2 cells remained alive after 14 days of culture, and the area of the green area representing living cells in the structure increased, confirming the proliferation of HepG2 cells.
  • Example 8 Immediately after the three-dimensional structure produced in Example 6 was produced, it was immersed in a DMEM medium containing 1 mg/mL hyaluronidase for 60 minutes for decomposition, and the cells were collected. The collected cells were seeded in a culture dish (manufactured by Corning, diameter 60 mm dish) at 1 ⁇ 10 4 cells/cm 2 and cultured. A photograph taken of the results is shown in FIG. They maintained the same shape, adhesive ability, and proliferation ability as untreated cells. From the results of Examples 6 to 8, it is inferred that the production method of the present invention has little adverse effect on cells.
  • Support material ink 2 12, 22, 32: Model material ink 2A, 12A, 22A, 32A: Three-dimensional structure 2a, 12a, 22a, 32a: Bridge portion 2b, 12b, 22b, 32b: Hole 3a , 3b, 13a, 13b, 13c, 23a, 23b, 23c, 33a, 33b, 33c: Nozzle 4, 14, 24, 34: Substrate 5, 15, 25, 35: Removal solution 11, 21, 31: First Support material ink 11s, 21s, 31s: second support material ink

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Abstract

本発明は、例えばソフトマテリアルからなる複雑な形状の三次元造形物を製造する場合であっても、良好な造形精度で三次元造形物を製造できる三次元造形物の製造方法および三次元造形物作製用インクセットを提供する。本発明は、（ａ）架橋性高分子を含むモデル材用インク、および、（ｂ）サポート材を含むサポート材用インクを、それぞれ吐出する工程、ならびに、前記架橋性高分子の架橋後に、サポート材用インクの造形物を除去する工程を含み、前記モデル材用インク（ａ）および前記サポート材用インク（ｂ）のいずれか一方は、さらに、過酸化水素分解剤を含み、他方は、さらに、過酸化水素または過酸化水素供与体を含み、吐出された過酸化水素分解剤が、吐出された過酸化水素を分解して、架橋性高分子を架橋し、三次元造形物を造形する三次元造形物の製造方法に関する。

Description

三次元造形物の製造方法および三次元造形物作製用インクセット
本発明は、三次元造形物の製造方法および三次元造形物作製用インクセットに関し、特に、再生医療の分野などで、ソフトマテリアルからなる複雑な形状の三次元造形物を製造する場合に適した三次元造形物の製造方法に関する。
三次元プリンタと呼ばれる造形装置を使用して三次元造形物を製造する技術が、種々の分野で実用化を目指して研究されている。例えば再生医療の分野では、人工臓器などとして使用するために、ソフトマテリアルからなる、ブリッジ部位や穴がある複雑な形状の三次元造形物を製造することが求められている。三次元プリンタを用いて、バイオインクからこのような三次元造形物を製造しようとすると、バイオインクが流出（液だれ）してゲル化前に崩壊したり、重力による変形が起こったりするため、造形精度の向上が求められている。
特許文献１には、再生医療などの分野への応用を目指し、天然高分子および／または合成高分子を含む３Ｄプリンティングシステム用インクにシルクナノファイバーを添加することで、ノズルからの吐出時には粘度が低く、吐出時の圧力を低くすることができ、且つ、プリント後の基板上では粘度が高く、造形物の変形を充分に防止できることが開示されている。一方、材料範囲の更なる拡大、新たな三次元造形物の製法の開発が望まれるところである。
特開２０２０－１５６３５７号公報
本発明は、例えばソフトマテリアルからなる複雑な形状の三次元造形物を製造する場合であっても、良好な造形精度で三次元造形物を製造できる三次元造形物の製造方法および三次元造形物作製用インクセットを提供することを目的とする。
本発明者らは、種々検討したところ、架橋性高分子と過酸化水素分解剤を含むモデル材用インク、および、サポート材と過酸化水素または過酸化水素供与体を含むサポート材用インクを吐出し、吐出された過酸化水素分解剤が、吐出された過酸化水素を分解して、架橋性高分子を架橋し、その後、サポート材用インクの造形物を除去して三次元造形物を造形すると、例えばソフトマテリアルからなる複雑な形状の三次元造形物を作製する場合であっても、良好な造形精度で三次元造形物を製造できることを見出した。さらに、本発明者らは、過酸化水素分解剤がサポート材用インクに、過酸化水素または過酸化水素供与体がモデル材用インクに含まれていてもよいことも見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明（１）は、（ａ）架橋性高分子を含むモデル材用インク、および、（ｂ）サポート材を含むサポート材用インクを、それぞれ吐出する工程、ならびに、前記架橋性高分子の架橋後に、サポート材用インクの造形物を除去する工程を含み、前記モデル材用インク（ａ）および前記サポート材用インク（ｂ）のいずれか一方は、さらに、過酸化水素分解剤を含み、他方は、さらに、過酸化水素または過酸化水素供与体を含み、吐出された過酸化水素分解剤が、吐出された過酸化水素を分解して、架橋性高分子を架橋し、三次元造形物を造形する三次元造形物の製造方法に関する。
本発明（２）は、前記過酸化水素分解剤が、架橋形成酵素である本発明（１）記載の三次元造形物の製造方法である。
本発明（３）は、前記過酸化水素供与体が、過酸化水素生成酵素である本発明（１）または（２）記載の三次元造形物の製造方法である。
本発明（４）は、前記架橋性高分子が、フェノール性水酸基を有する本発明（１）～（３）のいずれかとの任意の組合せの三次元造形物の製造方法である。
本発明（５）は、前記サポート材は、水溶性高分子又は水分散性高分子である本発明（１）～（４）のいずれかとの任意の組合せの三次元造形物の製造方法である。
本発明（６）は、前記水溶性高分子又は水分散性高分子が、イオン性化合物と作用して凝集または粘度低下する水性ゲルを形成する水溶性高分子又は水分散性高分子であり、サポート材用インクの造形物を除去する工程において、イオン性化合物を作用させて前記サポート材用インク（ｂ）の造形物を除去する本発明（１）～（５）のいずれかとの任意の組合せの三次元造形物の製造方法である。
本発明（７）は、（ａ）架橋性高分子を含むモデル材用インク、および、
（ｂ）サポート材を含むサポート材用インク
からなり、
前記モデル材用インク（ａ）および前記サポート材用インク（ｂ）のいずれか一方は、さらに、過酸化水素分解剤を含み、他方は、さらに、過酸化水素または過酸化水素供与体を含む三次元造形物作製用インクセットである。
本発明（８）は、前記過酸化水素分解剤が、架橋形成酵素である本発明（７）記載の三次元造形物作製用インクセットである。
本発明（９）は、前記過酸化水素供与体が、過酸化水素生成酵素である本発明（７）または（８）記載の三次元造形物作製用インクセットである。
本発明（１０）は、前記架橋性高分子が、フェノール性水酸基を有する本発明（７）～（９）のいずれかとの任意の組合せの三次元造形物作製用インクセットである。
本発明（１１）は、前記サポート材用インク（ｂ）が、イオン性化合物と作用して凝集または粘度低下する水性ゲルを形成する水溶性高分子又は水分散性高分子を含む本発明（７）～（１０）のいずれかとの任意の組合せの三次元造形物作製用インクセットである。
本発明によれば、例えばソフトマテリアルからなる複雑な形状の三次元造形物を製造する場合であっても、良好な造形精度で三次元造形物を製造できる三次元造形物の製造方法を提供することができる。
本発明の三次元造形物の製造方法によって、ブリッジ部位を有する三次元造形物を作製する工程を説明するための模式図である。 製造例２で作製したサポート材用インクのせん断速度に対する粘度を示すグラフである。 製造例２で使用したプロゼリーに、イオン性化合物と作用させた際に、白色沈殿が生じる様子を示す写真である。 製造例２で使用したプロゼリーをＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）に配合して細胞を増殖させ、細胞の成長を観察した写真である。 実施例１と比較例１で作製した三次元造形物を撮影した写真である。 実施例１～３で作製した三次元造形物を撮影した写真である。 実施例４～５で作製した三次元造形物を撮影した写真である。 実施例６～７で作製し、培養した三次元造形物を撮影した写真である。 実施例８で行った三次元造形物から回収し、培養した細胞を撮影した写真である。 本発明の三次元造形物の製造方法において、第二のサポート材用インクをさらに用いて三次元造形物を作製する工程を説明するための模式図である。 図１０に示した工程の別の一例を説明するための模式図である。 図１０に示した工程のさらに別の一例を説明するための模式図である。
＜＜三次元造形物の製造方法＞＞
本発明の、三次元造形物の製造方法は、（ａ）架橋性高分子を含むモデル材用インク、および、（ｂ）サポート材を含むサポート材用インクを、それぞれ吐出する工程、ならびに、前記架橋性高分子の架橋後に、サポート材用インクの造形物を除去する工程を含み、前記モデル材用インク（ａ）および前記サポート材用インク（ｂ）のいずれか一方は、さらに、過酸化水素分解剤を含み、他方は、さらに、過酸化水素または過酸化水素供与体を含み、吐出された過酸化水素分解剤が、吐出された過酸化水素を分解して、架橋性高分子を架橋し、三次元造形物を造形することを特徴とする。
以下に、図１を参照しながら、本発明の三次元造形物の製造方法を簡単に説明する。図１は、本発明の三次元造形物の製造方法によって、ブリッジ部位を有する三次元造形物を作製する工程を説明するための模式図である。図１（ａ）は、三次元プリンタのノズル３ａからサポート材用インク１を吐出する様子を模式的に示す。図１（ｂ）は、三次元プリンタのノズル３ｂからモデル材用インク２を吐出する様子を模式的に示す。なお、ノズル３ａとノズル３ｂは、同一のノズルであってもよいが、異なるものであることが好ましい。ここで、サポート材用インク１を吐出し、次いで、サポート材用インク１で囲まれる位置にモデル材用インク２を吐出して１つの層を形成することができ、これを繰り返して積層構造とする。
図１（ａ）および図１（ｂ）に示すように、吐出されたサポート材用インク１と吐出されたモデル材用インク２は接している。例えば、サポート材用インク１がサポート材とともに過酸化水素または過酸化水素供与体を含み、モデル材用インク２が架橋性高分子とともに過酸化水素分解剤を含む場合、吐出されたサポート材用インク１から吐出されたモデル材用インク２に過酸化水素が供給され、吐出されたモデル材用インク２中の過酸化水素分解剤が、当該過酸化水素を分解して架橋性高分子を架橋し、モデル材用インク２をゲル化する。図１（ｃ）では、モデル材用インク２のゲル化が完了した後、得られた造形物を、サポート材用インク１の造形物の除去溶液５に浸漬し、サポート材用インク１の造形物を除去する工程を示している。サポート材用インク１の造形物を除去することで、ブリッジ部位２ａや穴２ｂがある複雑な形状の三次元造形物２Ａ（モデル材用インクの造形物）の作製も可能となる。
本発明の三次元造形物の製造方法ではビーカー、シャーレ等の円筒形状の容器、角筒形状の容器、その他の各種形状の容器中にモデル材用インク及びサポート材用インクを吐出して三次元造形物を作製してもよい。容器の内壁がモデル材用インク及び／又はサポート材用インクの支持体となるため、より高さの高い造形物を作製することができる。なお、容器の材質は、モデル材用インク及び／又はサポート材用インクの支持体となるものである限り特に限定されず、ガラス、樹脂等からなるものを使用できる。また、容器は三次元造形により製造されたものでもよい。
＜（ａ）架橋性高分子を含むモデル材用インク、および、（ｂ）サポート材を含むサポート材用インクを、それぞれ吐出する工程＞
吐出する工程では、例えば、三次元プリンタのノズルから、基板上などの目的箇所に、モデル材用インク（ａ）およびサポート材を含むサポート材用インク（ｂ）を吐出する。インクを吐出する工程で三次元プリンタを用いる場合、三次元プリンタは、特に限定されず、インクジェット式、レーザー光式、押し出し式などのいずれであってもよいが、押し出し式の三次元プリンタがより好ましい。モデル材用インク（ａ）を吐出するノズルは、サポート材用インク（ｂ）を吐出するノズルと異なることが好ましい。
（（ａ）架橋性高分子を含むモデル材用インク）
モデル材用インク（ａ）は、架橋性高分子を含み、過酸化水素の分解に伴って架橋性高分子が架橋することで、ゲル状となるものである。架橋性高分子としては、特に限定されないが、例えば、高分子基材と、フェノール性水酸基を有する化合物とを結合させて得られる高分子、アミノ基含有多糖類、ポリフェノール類などが挙げられる。
高分子基材としては、特に限定されず、例えば、多糖類、核酸、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ポリ（α－ヒドロキシ酸）、ポリラクトン、ポリアミノ酸、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（無水物－ｃｏ－イミド）、ポリオルトカーボネート、ポリ（α－ヒドロキシアルカノエート）、ポリジオキサノン、ポリホスホエステル、ポリ乳酸、ポリ（Ｌ－ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコール酸、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－トリメチレンカーボネート）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ（ε－カプロラクトン）、ポリ（δ－バレロラクトン）、ポリ（γ－ブチロラクトン）、ポリカプロラクトン、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリカルボン酸、ポリアリルアミン塩酸塩、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド、ポリエチレンイミンなどのポリアルキレンイミン、ポリプロピレンフマレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンなどのポリアルキレン、ポリメチルメタクリレート、炭素繊維、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、ポリエチレンオキシドなどのポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチルオキサゾリン、ポリ（エチレンオキシド）－ｃｏ－ポリ（プロピレンオキシド）ブロック共重合体、ポリ（エチレンテレフタレート）ポリアミド、これら高分子基材の塩などが挙げられる。
多糖類としては、例えば、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、澱粉、プルラン、カラギーナン、カードラン、フコイダン、アミロース、アミロペクチン、ペクチン、これらのアルカリ金属塩等の塩、誘導体などが挙げられる。なお、多糖類の誘導体としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、脱アセチル化キチン類、脱アセチル化キトサン類などが挙げられる。
タンパク質としては、アルブミン、グロブリン、プロラミン、グルテリン、ヒストン、プロタミン、硬タンパク質などの単純タンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質などの複合タンパク質、ゼラチン、プロテオース、ペプトンなどの誘導タンパク質などが挙げられる。
高分子基材の塩における塩は、特に限定されず、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン塩などが挙げられる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩；酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩などの有機酸塩が挙げられる。金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、マグネシウム塩、アルミニウム塩、亜鉛塩などが挙げられる。有機アミン塩としては、例えば、モルホリン、ピペリジンなどの塩が挙げられる。
高分子基材としては、中でも、多糖類、タンパク質が、容易に供給されること、得られる三次元造形物の特性が良好なことから好ましく、多糖類がより好ましい。上記高分子基材は、上述したものの１種のみを用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
フェノール性水酸基を有する化合物としては、特に限定されないが、下記一般式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 （式中、Ｘ１は、水酸基、アミノ基、または、カルボン酸（塩）基を表す。Ｘ２～Ｘ６のうち１つまたは２つは、水酸基を表し、残りは水素原子または炭素数１～６のアルコキシ基を表す。Ｘ２～Ｘ６のうち２つが水酸基を表す場合、２つの水酸基はオルトまたはパラ位の位置関係にあることが好ましい。Ｒは、置換基を有していてもよい炭素数１～１０の二価の炭化水素基を表す。）
で表される化合物が好ましい。高分子基材にフェノール性水酸基を導入した架橋性高分子は、架橋形成酵素などの過酸化水素分解剤により容易に架橋する。Ｘ１は、フェノール性水酸基を高分子基材へ導入しやすいことから、カルボン酸（塩）基またはアミノ基が好ましく、アミノ基がより好ましい。なお、上記アミノ基は、第１級アミノ基又は第２級アミノ基が好ましい。上記カルボン酸（塩）基としては、カルボン酸基、カルボン酸基のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が好ましい。また、Ｒが表す二価の炭化水素基の炭素数は、１～８が好ましく、１～６がより好ましい。Ｒが表す二価の炭化水素基としては、特に限定されないが、アルキレン基、アルキルアルキレン基などが挙げられる。また、Ｒが有してもよい置換基としては、例えばアミド基、エステル基、エーテル基などが挙げられる。なお、Ｘ１は、水酸基である場合、アルコール性水酸基である。
フェノール性水酸基を有する化合物として、例えば、チラミン、ホモバニリン酸、これらの誘導体類などのフェノール性水酸基を１つ有する化合物、ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリンなどのカテコールアミン類などのフェノール性水酸基を２つ有する化合物が挙げられる。これらの中でも、得られる架橋性高分子の架橋反応性の観点から、フェノール性水酸基を１つ有する化合物が好ましく、チラミン、チラミン誘導体類がより好ましい。
フェノール性水酸基を有する化合物としては、市販品を使用してもよい。市販品としては、例えば、チラミン塩酸塩（４－（２－アミノエチル）フェノール・塩酸塩、製品番号：Ｔ２８７９、シグマアルドリッチ社製）などが挙げられる。
高分子基材とフェノール性水酸基を有する化合物との結合方法は、特に限定されないが、フェノール性水酸基を有する化合物が有していてもよいカルボキシル基、アミノ基またはアルコール性水酸基などの官能基と、高分子基材が有していてもよいアミノ基、カルボキシル基またはチオール基などの官能基とを縮合剤を用いて縮合する方法、グルタミルトランスフェラーゼを用いて縮合する方法などが挙げられる。
縮合剤としては、特に限定されないが、例えば、１，１－カルボニルジイミダゾール、ジシクロヘキシルカルボジイミド、３－（３－ジメチルアミノプロピル）－１－エチルカルボジイミド・塩酸塩（水溶性カルボジイミド：ＷＳＣＤ・ＨＣｌ）などが挙げられる。高分子基材およびフェノール性水酸基を有する化合物を、縮合剤を用いて縮合する方法、グルタミルトランスフェラーゼを用いて縮合する方法においては、使用する高分子基材、フェノール性水酸基を有する化合物、縮合剤やグルタミルトランスフェラーゼの性質に合わせて適宜、ｐＨ、高分子基材の濃度、反応温度、溶媒などを選択できる。
高分子基材に対するフェノール性水酸基を有する化合物の導入率（修飾率）は、高分子基材が有する縮合反応基の全体における、縮合反応した（修飾された）縮合反応基の割合である。ゲル化速度と硬度（硬すぎないこと）をバランス良く両立する観点からは、高分子基材が有する縮合反応基１００ｍｏｌ％に対して０．３～２０ｍｏｌ％が好ましく、１～１０ｍｏｌ％がより好ましい。
架橋性高分子としては、アミノ基含有多糖類、ポリフェノール類も使用できる。アミノ基含有多糖類としては、例えば、アセチル化キチン、キトサンなどが挙げられる。また、ポリフェノール類としては、例えば、カテキン類化合物、アントシアニン類化合物、ルチン、天然色素などが挙げられる。
モデル材用インク（ａ）中の架橋性高分子の濃度は、通常０．１～３０重量％であり、０．５～２０重量％が好ましく、０．７５～１０重量％がより好ましい。架橋性高分子の濃度が０．１重量％未満であると、三次元造形物の強度が充分なものでなくなるおそれがあり、３０重量％を超えると、モデル材用インクの粘度が高くなり過ぎ、ノズルからの吐出時の圧力が高くなり、モデル材用インク（ａ）の材質に影響を及ぼすおそれがある。また、モデル材用インク（ａ）中の架橋性高分子の濃度は、通常０．１～３０ｗ／ｖ％（ｇ／１００ｍＬ）であり、０．５～２０ｗ／ｖ％（ｇ／１００ｍＬ）が好ましく、０．７５～１０ｗ／ｖ％（ｇ／１００ｍＬ）がより好ましい。
本発明の製造方法では、モデル材用インク（ａ）は、さらに、過酸化水素分解剤、または、過酸化水素もしくは過酸化水素供与体を含む。以下では、モデル材用インク（ａ）が、さらに、過酸化水素分解剤を含む場合について詳しく説明する。
過酸化水素分解剤は、過酸化水素を分解してモデル材用インク（ａ）中の架橋性高分子を架橋させるものであればよく、架橋形成酵素、錯体、タンパク質などが好ましく用いられる。架橋形成酵素としては、特に限定されないが、反応が室温、大気圧下で進行し、安全性も高い点から、例えば、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、チロシナーゼ、カタラーゼなどが好ましいものとして挙げられる。架橋形成酵素の起源については、特に限定されないが、ペルオキシダーゼとしては、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼが好ましい。錯体としては、例えば、反応が室温、大気圧下で進行し、安全性も高い点から、鉄ポルフィリン錯体などが挙げられる。タンパク質としては、ヘモグロビンなどが挙げられる。
モデル材用インク（ａ）が架橋形成酵素を含む場合、モデル材用インク（ａ）中の架橋形成酵素の濃度は、特に限定されないが、ゲル化がより一層速くなる点から、０．１Ｕ／ｍＬ以上が好ましく、１Ｕ／ｍＬ以上がより好ましい。また、架橋形成酵素の濃度は、通常１００００Ｕ／ｍＬ以下であり、２０００Ｕ／ｍＬ以下が好ましく、１０００Ｕ／ｍＬ以下がより好ましく、５００Ｕ／ｍＬ以下がさらに好ましい。モデル材用インク（ａ）が架橋形成酵素以外の過酸化水素分解剤を含む場合、モデル材用インク（ａ）中の架橋形成酵素以外の過酸化水素分解剤の濃度は、ゲル化がより一層速くなる点から、０．１重量％以上が好ましく、１重量％以上がより好ましい。また、架橋形成酵素以外の過酸化水素分解剤の濃度は、通常２０重量％以下であり、１０重量％以下が好ましい。
モデル材用インク（ａ）が過酸化水素もしくは過酸化水素供与体を含む場合、過酸化水素供与体の具体例、モデル材用インク（ａ）中の過酸化水素もしくは過酸化水素供与体の好ましい濃度は、後述する、サポート材用インク（ｂ）が含む過酸化水素供与体の具体例、サポート材用インク（ｂ）中の過酸化水素もしくは過酸化水素供与体の好ましい濃度と同様である。
モデル材用インク（ａ）は、架橋性高分子、過酸化水素分解剤、または、過酸化水素もしくは過酸化水素供与体の他に、その他の成分を含有していてもよい。その他の成分としては、各種細胞、溶媒、重合開始剤、連鎖移動剤、可塑剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、保存料、溶媒、紫外線吸収剤、色材、界面活性剤などが挙げられる。溶媒としては、例えば、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、水と有機溶剤との混合物などが挙げられる。有機溶剤としては特に限定されず、例えば、エタノール、グリセリン、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。
細胞の由来動物としては、哺乳類、鳥類、爬虫類などが挙げられ、哺乳類が好ましい。哺乳類としては、人間、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ニワトリなどが挙げられ、人間が好ましい。細胞種としては、上皮細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、平滑筋細胞、神経細胞、幹細胞などが挙げられる。
モデル材用インクにおける細胞の濃度は特に限定されないが、１×１０３～１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬが好ましく、１×１０４～×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬがより好ましい。
モデル材用インク（ａ）は、室温で液状であることが好ましい。室温で液状であることで、３Ｄプリンタなどを用いて容易に吐出することができる。モデル材用インク（ａ）の２０℃における粘度は、特に限定されないが、１０ｍＰａ・ｓ以上が好ましく、２０ｍＰａ・ｓ以上がより好ましく、５０ｍＰａ・ｓ以上がさらに好ましい。また、上記粘度は、１０００００ｍＰａ・ｓ以下が好ましく、１００００ｍＰａ・ｓ以下がより好ましく、２０００ｍＰａ・ｓ以下がさらに好ましい。本発明の製造方法により、ゲル化前のモデル材用インク（ａ）の流出（液だれ）を充分に防止できるため、低粘度のモデル材用インク（ａ）を好適に使用できる。なお、上記粘度は、コーン・プレート型のＥ型粘度計を用いて、２０ｒｐｍの回転速度で測定されるものである。
モデル材用インク（ａ）は、上述した架橋性高分子、過酸化水素分解剤、または、過酸化水素もしくは過酸化水素供与体、必要に応じてその他の成分を混合することによって、製造することができる。混合時の条件は、特に限定されないが、酵素活性の点から、４～４５℃であることが好ましく、１０～４０℃がより好ましい。また、混合時には、ｐＨは、酵素活性の点から、通常、２～１１であり、５～９が好ましい。得られるモデル材用インクは、通常、－８０～２０℃で保存しておくことが好ましい。また、モデル材用インクは、作製された後、凍結乾燥されたものであってもよい。凍結乾燥の方法は、公知の方法を採用できる。
（（ｂ）サポート材を含むサポート材用インク）
サポート材用インク（ｂ）は、吐出された後、架橋により形態を保持し、造形物となるものであってもよいが、それ自体で形態を保持でき、そのまま造形物となるものが簡便で好ましい。サポート材用インク（ｂ）の造形物は、モデル材用インク（ａ）が充分にゲル化するまでモデル材用インク（ａ）の形状を保持し、モデル材用インク（ａ）の流出（液だれ）や、重力によるモデル材用インク（ａ）の変形を防ぐ。モデル材用インク（ａ）がゲル化した後は、サポート材用インク（ｂ）の造形物は、後述する方法で除去される。
サポート材用インク（ｂ）が含むサポート材は、天然高分子や合成高分子などの高分子であり、高分子としては、例えば、多糖類、核酸、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ポリアミノ酸、ポリ乳酸、ポリエチレンオキシドなどのポリアルキレンオキシド、ポリエチレンイミンなどのポリアルキレンイミン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリグルタミン酸、カルボキシビニルポリマ―、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、シルクフィブロイン、ポリビニルアルコール、これら高分子の塩などが挙げられる。上記高分子としては、多糖類、核酸、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ポリアミノ酸、ポリ乳酸、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、ポリグルタミン酸、アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、ポリビニルアルコール、これら高分子の塩が好ましい。多糖類、タンパク質、高分子の塩における塩は、高分子基材において前述した多糖類、タンパク質、高分子基材の塩における塩と同様である。また上記サポート材は、前述した高分子を架橋剤で架橋したものであってもよい。
多糖類としては、例えば、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、澱粉、プルラン、カラギーナン、カードラン、フコイダン、アミロース、アミロペクチン、ペクチン、これらのアルカリ金属塩等の塩、誘導体などが挙げられる。
中でも、サポート材は、水溶性高分子又は水分散性高分子であることが好ましい。これにより、後述するように、サポート材用インク（ｂ）の造形物を除去する工程において、水又は水溶液を用いて温和な条件で簡便に造形物を除去できる。ここで、本明細書中、水溶性高分子の、２０℃の水１００ｇに対する溶解度は特に限定されないが、１ｇ以上が好ましく、５ｇ以上がより好ましい。
水溶性高分子又は水分散性高分子は、高分子水性ゲルを形成し、形成された高分子水性ゲルは、イオン性化合物と作用して凝集または粘度低下するものであることが好ましい。イオン性化合物と作用して凝集または粘度低下する高分子水性ゲルを形成する水溶性高分子又は水分散性高分子は、カルボン酸基などの酸基を有する炭化水素鎖（例えば、ポリアクリル酸）を主鎖として、架橋剤で架橋したものが挙げられる。架橋剤としては、特に限定されないが、アリルショ糖、ペンタエリスリトールなどが挙げられる。イオン性化合物については、後述する。
サポート材用インク（ｂ）中の高分子の濃度は、サポート材用インク（ｂ）の擬塑性をより一層向上する観点からは、０．１重量％以上が好ましく、０．３重量％以上がより好ましく、０．５重量％以上がさらに好ましく、１．０重量％以上が特に好ましい。また、高分子の濃度は、３０．０重量％以下が好ましく、１５．０重量％以下がより好ましく、１０．０重量％以下がさらに好ましい。なお、サポート材用インク（ｂ）中に高分子が２種以上含まれる場合、上記の濃度は、サポート材用インク中に含まれる全ての高分子の合計の濃度を意味する。
サポート材用インク（ｂ）は、さらに、過酸化水素もしくは過酸化水素供与体、または、過酸化水素分解剤を含む。以下では、サポート材用インク（ｂ）が、さらに、過酸化水素もしくは過酸化水素供与体を含む場合について詳しく説明する。
サポート材用インク（ｂ）が過酸化水素を含む場合、サポート材用インク（ｂ）中の過酸化水素の濃度は、特に限定されないが、０．０１ｍＭ以上、１Ｍ以下であることが好ましい。該濃度は、０．１ｍＭ以上であることがより好ましく、１ｍＭ以上であることがさらに好ましく、５ｍＭ以上であることが特に好ましい。また、過酸化水素の濃度は、１００ｍＭ以下であることがより好ましく、三次元造形物の造形精度をより一層優れたものとする観点からは、３０ｍＭ以下がさらに好ましく、１０ｍＭ以下が特に好ましい。
過酸化水素供与体は、過酸化水素を生成できるものである限り特に限定されず、過酸化水素生成酵素、光触媒などが挙げられるが、過酸化水素生成酵素が好ましい。過酸化水素生成酵素としては、例えば、コリンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられる。
サポート材用インク（ｂ）が過酸化水素生成酵素を含む場合、サポート材用インク（ｂ）中の過酸化水素生成酵素の濃度は、反応性の点から０．１ｍＵ／ｍＬ以上が好ましく、１ｍＵ／ｍＬ以上がより好ましく、２．５ｍＵ／ｍＬ以上がさらに好ましい。また、過酸化水素生成酵素の濃度は、２００００ｍＵ／ｍＬ以下が好ましく、１００００ｍＵ／ｍＬ以下がより好ましく、１０００ｍＵ／ｍＬ以下がさらに好ましく、２００ｍＵ／ｍＬ以下が特に好ましい。サポート材用インク（ｂ）が過酸化水素生成酵素以外の過酸化水素供与体を含む場合、サポート材用インク（ｂ）中の過酸化水素生成酵素以外の過酸化水素供与体の濃度は、反応性の点から０．１重量％以上が好ましく、１重量％以上がより好ましい。また、過酸化水素生成酵素以外の過酸化水素供与体の濃度は、通常２０重量％以下であり、１０重量％以下が好ましい。
サポート材用インク（ｂ）が過酸化水素分解剤を含む場合、過酸化水素分解剤の具体例、サポート材用インク（ｂ）中の過酸化水素分解剤の好ましい濃度は、上述した、モデル材用インク（ａ）が含む過酸化水素分解剤の具体例、モデル材用インク（ａ）中の過酸化水素分解剤の好ましい濃度と同様である。
サポート材用インク（ｂ）は、サポート材としての高分子と、過酸化水素もしくは過酸化水素供与体、または、過酸化水素分解剤の他に、その他の成分を含有していてもよい。その他の成分としては、グリセロールなどの保湿剤、アルカリ金属水酸化物、有機アミンなどのｐＨ調整剤、保存料、色材、溶媒、可塑剤、紫外線吸収剤、界面活性剤などが挙げられる。溶媒としては、例えば、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、水と有機溶剤との混合物などが挙げられる。有機溶剤としては特に限定されず、例えば、エタノール、グリセリンなどが挙げられる。
サポート材用インク（ｂ）は、室温で液状またはゲル状であることが好ましく、ゲル状であることがより好ましい。室温でゲル状であることで、３Ｄプリンタなどを用いて容易に造形することができる。サポート材用インク（ｂ）の、２０℃での、せん断速度０．０１（１／ｓ）における粘度は、１００００ｍＰａ・ｓ以上が好ましく、それ自体で形態を保持できるようにする観点からは、１０００００ｍＰａ・ｓ以上がより好ましく、５０００００ｍＰａ・ｓ以上がさらに好ましい。また、該粘度は、その上限は特に限定されないが、通常は１０００００００ｍＰａ・ｓ以下である。
サポート材用インク（ｂ）の、２０℃での、せん断速度１０（１／ｓ）における粘度は、１０ｍＰａ・ｓ以上が好ましく、１００ｍＰａ・ｓ以上がより好ましく、１０００ｍＰａ・ｓ以上がさらに好ましい。また、該粘度は、その上限は特に限定されないが、通常は１００００ｍＰａ・ｓ未満である。なお、上記粘度は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、粘度・粘弾性測定装置を用いて測定される値である。
サポート材用インク（ｂ）の、２０℃での、せん断速度１０（１／ｓ）における粘度に対するせん断速度０．０１（１／ｓ）における粘度の比は、５以上が好ましく、１０以上がより好ましく、２０以上がさらに好ましく、５０以上が特に好ましい。これにより、サポート材用インク（ｂ）の擬塑性がより優れるものとなる。
サポート材用インク（ｂ）は、高分子と、過酸化水素もしくは過酸化水素供与体、または、過酸化水素分解剤と、必要に応じてその他の成分を混合することによって、製造することができる。混合時の条件は、特に限定されない。
上述したように、本発明の製造方法では、通常、三次元プリンタを用いて、モデル材用インク（ａ）とサポート材用インク（ｂ）をそれぞれ吐出し、層を形成し、これを繰り返して積層する。吐出されたモデル材用インク（ａ）と吐出されたサポート材用インク（ｂ）が接することにより、吐出された過酸化水素分解剤が、吐出された過酸化水素を分解して、架橋性高分子を架橋し、モデル材用インク（ａ）の造形物を造形する。ここで、吐出されたサポート材用インク（ｂ）が含む過酸化水素もしくは過酸化水素供与体、または、過酸化水素分解剤は、吐出されたモデル材用インク（ａ）に供給される。なお、本発明の製造方法では、過酸化水素の分解による架橋性高分子の架橋とともに、イオン架橋、光架橋、酵素架橋、温度変化などが架橋性高分子の架橋に寄与していても構わない。
（第二のサポート材を含む第二のサポート材用インク）
本発明の製造方法ではモデル材用インク（ａ）とサポート材用インク（ｂ）（以下では、第一のサポート材用インクともいう）とともに、モデル材用インク及び第一のサポート材用インクの支持材として第二のサポート材用インクを吐出して製造してもよい。第二のサポート材用インクはあらかじめ吐出して三次元造形物（容器または外枠）を作製してもよいし、三次元造形物（容器または外枠）を一部分だけ作製して残りの部分を、モデル材用インク及び第一のサポート材用インクとともに吐出して作製してもよい。また全てを同時に作製してもよい。第二のサポート材用インクで作製される三次元造形物（容器または外枠）が、モデル材用インク及び第一のサポート材用インクの支持体となるため、モデル材用インク及び第一のサポート材用インクの崩壊をより充分に防止でき、また、所望により、より高さの高い三次元造形物を作製することができる。また、このような第二のサポート材用インクは、過酸化水素分解剤、または、過酸化水素もしくは過酸化水素供与体を含まなくてもよく、このような第二のサポート材用インクに第一のサポート材用インクを置き換えて第一のサポート材用インクの吐出量を減らすことで、第一のサポート材用インクに含まれる過酸化水素分解剤、または、過酸化水素もしくは過酸化水素供与体の使用量を節約することもできる。なお、第二のサポート材用インクが含む第二のサポート材は、モデル材用インク及び／又はサポート材用インクの支持体となるものである限り特に限定されず、上記サポート材用インク（ｂ）に使用するサポート材やガラス、樹脂等を使用できる。また、後述するように、第二のサポート材用インクの造形物は適当な材料を選択することにより、第一のサポート材用インクの造形物と同様に取り除くことができる。モデル材用インクはその一部または全部が第二のサポート材で構成される造形物と接してもよい。
図１０は、本発明の三次元造形物の製造方法において、第二のサポート材用インクをさらに用いて三次元造形物を作製する工程を説明するための模式図である。以下に、図１と異なる部分のみ説明する。図１０（ａ）は、三次元プリンタのノズル１３ａから第二のサポート材用インク１１ｓを吐出する様子を模式的に示す。図１０（ｂ）は、三次元プリンタのノズル１３ｂから第一のサポート材用インク１１を吐出する様子を模式的に示す。図１０（ｃ）は、三次元プリンタのノズル１３ｃからモデル材用インク１２を吐出する様子を模式的に示す。なお、ノズル１３ａ、ノズル１３ｂ、および、ノズル１３ｃは、同一のノズルであってもよいが、それぞれ異なるものであることが好ましい。図１０では、第二のサポート材用インク１１ｓを吐出し、第二のサポート材用インク１１ｓで囲まれる位置に第一のサポート材用インク１１を吐出し、第一のサポート材用インク１１で囲まれる位置にモデル材用インク１２を吐出することで１つの層を形成し、これを繰り返して積層構造とする。
図１０（ａ）～図１０（ｃ）に示すように、吐出された第二のサポート材用インク１１ｓは、内周部および外周部がともに平らな薄い壁状であり、吐出された第一のサポート材用インク１１と接してこれを支持し、吐出されたモデル材用インク１２も間接的に支持する。第二のサポート材用インク１１ｓとして硬質な造形物を形成できるものを用いることで、モデル材用インク１２および第一のサポート材用インク１１がゲル化の途中などで崩れることをより充分に防止できる。また、所望により、より高さの高い三次元造形物を作製することができる。
図１０（ｄ）は、図１（ｃ）と同様に、モデル材用インク１２のゲル化が完了した後、得られた造形物を、除去溶液１５に浸漬し、第一のサポート材用インク１１の造形物及び第二のサポート材用インク１１ｓの造形物を除去する工程を示している。この工程については、後述する。
図１１は、第一のサポート材用インク２１及び第二のサポート材用インク２１ｓの吐出範囲を図１１に示したように変更した以外は、図１０に示した模式図と同様である。以下に、図１０と異なる部分のみ説明する。図１１では、第二のサポート材用インクを、内周部が下方へ拡がる段状となるように吐出し、図１０の場合に対して、第一のサポート材用インクの一部を第二のサポート材用インクに置き換えている。第二のサポート材用インク２１ｓとして、硬質な造形物を形成でき、過酸化水素分解剤、過酸化水素、過酸化水素供与体を含まないものを用いることで、モデル材用インク２２および第一のサポート材用インク２１がゲル化の途中などで崩れることをより充分に防止しながら、第一のサポート材用インク２１の吐出量を減らすことができ、過酸化水素もしくは過酸化水素供与体、または、過酸化水素分解剤の使用量を節約することができる。
図１２は、第二のサポート材用インク３１ｓの吐出範囲を図１２に示したように変更した以外は、図１０に示した模式図と同様である。以下に、図１０と異なる部分のみ説明する。図１２では、第二のサポート材用インクを、吐出されたモデル材用インク３２および吐出された第一のサポート材用インク３１の形状に合わせて、外周部が上方へ拡がる段状となるように吐出し、図１０と比べて、第二のサポート材用インクの吐出量をも減らすことができる。
＜架橋性高分子の架橋後に、サポート材用インクの造形物を除去する工程＞
除去する工程は、サポート材用インク（ｂ）の造形物を除去し、モデル材用インク（ａ）の造形物が得られる限り特に限定されないが、例えば、サポート材用インク（ｂ）の造形物を、サポート材用インク（ｂ）の造形物の除去溶液に浸漬および／または洗浄することでおこなうことが好ましい。除去する工程は、モデル材用インク（ａ）の造形物（三次元造形物）に及ぼす影響を小さくする観点から、温和な条件下でおこなうことが好ましく、例えば、１０～４０℃の温度条件下でおこなうことが好ましい。また、除去溶液の２０℃でのｐＨは、酵素活性の点から、２～１０が好ましく、５～９がより好ましい。なお、サポート材用インクの造形物は、サポート材用インクからモデル材用インクに過酸化水素または過酸化水素分解剤が供給された後の、サポート材（高分子）などの残りの成分からなるものである。
サポート材用インク（ｂ）とともに上述した第二のサポート材用インクをさらに用いる場合は、サポート材用インク（ｂ）の造形物と第二のサポート材用インクの造形物とを、それぞれ異なる方法で除去してもよいが、上記除去する工程によりサポート材用インク（ｂ）の造形物とともに第二のサポート材用インクの造形物も除去することが好ましい。
サポート材が、水溶性高分子又は水分散性高分子である場合、除去溶液として、水や水溶液を使用できる。また水溶性高分子又は水分散性高分子が、高分子水性ゲルを形成し、形成された高分子水性ゲルは、イオン性化合物と作用して凝集または粘度低下するものである場合は、除去溶液として、イオン性化合物の水溶液を特に好適に使用できる。水溶性高分子又は水分散性高分子が、イオン性化合物と作用するとは、水溶性高分子又は水分散性高分子とイオン性化合物とが接触した結果、高分子水性ゲルが凝集または粘度低下する限り特に限定されないが、例えば、イオン性化合物と反応（化学反応）するものが挙げられる。高分子水性ゲルが、酵素処理によって分解されるものである場合は、分解酵素を使用でき、酵素処理後に培養液、緩衝液、生理食塩水および水などを使用することで、サポート材用インクの造形物を除去できる。サポート材が、温度によって相転移するものである場合、加熱や冷却を行うことで相転移させることができ、相転移後に水や水溶液を使用することで、サポート材用インクの造形物を除去できる。
イオン性化合物としては、カルシウム、亜鉛、マグネシウム、バリウム、ストロンチウム、銅、鉄、アルミニウム、コバルト、等の多価金属塩が挙げられる。それらの内、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、乳酸カルシウムが好ましく、塩化カルシウムがより好ましい。
除去溶液中のイオン性化合物の濃度は、１ｍＭ以上であることが好ましく、１０ｍＭ以上であることがより好ましい。該濃度は、２Ｍ以下が好ましく、０．２Ｍ以下がより好ましい。
分解酵素としては、セルラーゼ、アミラーゼ、デキストラナーゼ、カラギナーゼ、アルギン酸リアーゼ、ヒアルロニダーゼ、キチナーゼ及びキトサナーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。
除去溶液中の分解酵素の濃度は、０．１～５重量％が好ましく、０．１～１重量％がより好ましい。
＜その他の工程＞
本発明の製造方法は、上述したモデル材用インクおよびサポート材用インクをそれぞれ吐出する工程の後、サポート材用インクの造形物を除去する工程の前に、モデル材を充分にゲル化させるために、吐出したモデル材用インクおよびサポート材用インクを静置する工程を含んでいてもよい。
本発明の製造方法を用いて得られる三次元造形物は、例えばソフトマテリアルからなる複雑な形状の三次元造形物とすることが可能であり、特に、再生医療の分野で、人工臓器などとして好適に使用できるものである。なお、三次元造形物の形状は、特に限定されないが、ブリッジ部位および／または穴があるものにも適している。三次元造形物の寸法は、適宜設定できる。
＜＜三次元造形物作製用インクセット＞＞
本発明は、（ａ）架橋性高分子を含むモデル材用インク、および、（ｂ）サポート材を含むサポート材用インクからなり、前記モデル材用インクおよび前記サポート材用インクのいずれか一方は、さらに、過酸化水素分解剤を含み、他方は、さらに、過酸化水素または過酸化水素供与体を含む三次元造形物作製用インクセットでもある。架橋性高分子、サポート材、過酸化水素分解剤、過酸化水素、過酸化水素供与体、モデル材用インク（ａ）やサポート材用インク（ｂ）が含むその他の成分については、上述した通りである。本発明の三次元造形物作製用インクセットを用いて、本発明の三次元造形物の製造方法を好適に実施することができる。
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。以下、「部」または「％」は特記ない限り、それぞれ「重量部」または「重量％」を意味する。
製造例１（モデル材用インクの作製）
０．１Ｍの２－モルフォリノエタンスルホン酸一水和物（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｌｉｃ　ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ５．８）１Ｌにヒアルロン酸ナトリウム（株式会社富士メディシエ製）１０ｇを溶解させた。さらにチラミン塩酸塩０．５６ｇ、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＤ・ＨＣｌ）１．４３ｇおよびＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）０．４３ｇを１０ｍＬの精製水に溶解させた溶液を加えた後、室温で２２時間攪拌した。得られた反応混合物を限外ろ過にてろ過し、凍結真空乾燥を行うことによってＨＹＡ－Ｐｈ（フェノール性水酸基の修飾率：４．８ｍｏｌ％）を作製した。作製したＨＹＡ－Ｐｈを濃度１．０ｗ／ｖ％（ｇ／１００ｍＬ）に、過酸化水素分解剤（ＨＲＰ〔西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ〕）を濃度１０Ｕ／ｍＬとなるように、溶媒（カルシウム・マグネシウム不含リン酸緩衝生理食塩水）に溶解し、モデル材用インクを作製した。
製造例２（サポート材用インクの作製）
プロゼリー（ジェクス株式会社製　高粘度タイプ）に、過酸化水素を濃度０．１ｍＭ、１．０ｍＭ、１０ｍＭ、１００ｍＭとなるように溶解し、サポート材用インクを作製した。
サポート材用インクに使用したプロゼリーのせん断速度に対する粘度は、図２に示す通りであり、架橋剤である過酸化水素を添加しても粘度が変化しないことが分かった。また、プロゼリーは、低せん断速度での粘度が非常に高いため、これを主成分として含む製造例２で得られたサポート材用インクは、吐出された後、単体で形態を保持することができる造形物を構成できた。
プロゼリーは、図３に示すように、１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液中で、カルシウムイオンＣａ２＋と反応して白色沈殿を生じ、粘度が大幅に低下した。このように、プロゼリーは、イオン性化合物と作用して凝集または粘度低下するため、プロゼリーを含むサポート材用インクの造形物を除去する際に、イオン性化合物を好適に使用できる。
図４では、プロゼリーを含有したＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中で、プロゼリーを含有しないＤＭＥＭ培地中と同様に、通常通り細胞が増殖、伸展したことが示されている。用いた細胞は、マウス胎児由来繊維芽細胞（１０Ｔ１／２細胞）である。したがって、プロゼリーは、細胞毒性が実質的に無かった。以上より、プロゼリーは、サポート材用インクの原料として適する。
製造例３（モデル材用インクの作製）
０．１Ｍの２－モルフォリノエタンスルホン酸一水和物（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｌｉｃ　ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．０）に３．３（ｗ／ｖ）％となるように変性ポリビニルアルコール（日本酢ビ・ポバール株式会社製ＡＦ－１７）を溶解させた溶液を１２０℃で１５分加温した。室温に冷却した後、チラミン塩酸塩、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＤ・ＨＣｌ）およびＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）をそれぞれ３．３、３．３、１．０（ｗ／ｖ）％となるように加えた後、４０℃で２０時間攪拌した。得られた反応溶液をエタノール中に加えて沈殿させた後、沈殿生成物を９０％エタノール水溶液およびエタノールで洗浄し、減圧乾燥を行うことによりＰＶＡ－Ｐｈ（フェノール性水酸基の修飾率：２．４×１０－４ｍｏｌ／ｇ）を作製した。作製したＰＶＡ－Ｐｈが濃度１．０ｗ／ｖ％（ｇ／１００ｍＬ）となるように、製造例１と同様にしてモデル材用インクを作製した。
製造例４（モデル材用インクの作製）
０．０５Ｍの２－モルフォリノエタンスルホン酸一水和物（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｌｉｃ　ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．０）５００ｍＬにゼラチン（ゼライス株式会社製）１０ｇを溶解させた。さらにチラミン塩酸塩１．８４ｇ、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＤ・ＨＣｌ）１．８５ｇおよびＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）０．５７ｇを５ｍＬの精製水に溶解させた溶液を加えた後、室温で２０時間攪拌した。得られた反応混合物を限外ろ過にてろ過し、凍結真空乾燥を行うことによってＧｅｌａ－Ｐｈ（フェノール性水酸基の修飾率：２．７×１０－４ｍｏｌ／ｇ）を作製した。作製したＧｅｌａ－Ｐｈが濃度３．０ｗ／ｖ％（ｇ／１００ｍＬ）となるように、製造例１と同様にしてモデル材用インクを作製した。
実施例１
三次元造形物として、以下に示す大きさの２種類の六角筒を、次の手順で作製した：三次元プリンタ（製品名：ＢＩＯ　Ｘ、製造社名：Ｃｅｌｌｉｎｋ）を用いて、製造例２で作製した過酸化水素濃度１０ｍＭのサポート材用インクと、製造例１で作製したモデル材用インクを基板上にそれぞれ吐出して層を形成し、これを繰り返して積層した。吐出終了後、２５℃で１０分間静置し、モデル材用インクを充分にゲル化した。その後、造形物を塩化カルシウム溶液（濃度１００ｍＭ）中に浸漬し、サポート材用インクの造形物を除去した。
造形物１（厚み：１ｍｍ、高さ：５ｍｍ、１辺の長さ：６ｍｍ）
造形物２（厚み：２ｍｍ、高さ：５ｍｍ、１辺の長さ：６ｍｍ）
比較例１
サポート材用インクを用いず、過酸化水素の蒸気暴露条件下としたこと以外は実施例１と同様にして三次元造形物を作製した。
図５に示すように、実施例１では、サポート材用インクを用い、サポート材用インクの造形物により保持しながらモデル材用インクをゲル化したことで、造形精度が非常に良好な造形物を作製することができた。一方、比較例１では、サポート材用インクを用いず、過酸化水素の蒸気暴露条件下としたところ、変形し、造形精度が低い造形物しか得ることができなかった。
実施例２
サポート材用インクの過酸化水素濃度を１ｍＭとした以外は実施例１と同様にして三次元造形物を作製した。
実施例３
サポート材用インクの過酸化水素濃度を１００ｍＭとした以外は実施例１と同様にして三次元造形物を作製した。
図６に示すように、実施例２では、いずれも造形精度が良好な三次元造形物が得られた。一方、実施例３では、造形精度が良好な三次元造形物が得られたが、過酸化水素の濃度が高いために気泡が多く、その造形精度は実施例１～２で得られた三次元造形物の造形精度と比べるとやや低いものであった。
上記の結果から、材料が柔らかいもの（ソフトマテリアル）からなる複雑な形状の造形物を製造する場合に、本発明の製造方法を適用することで、良好な造形精度で三次元造形物を得ることができることが分かった。
実施例４
モデル材用インクとして製造例３で作製したインクを使用したこと以外は、実施例１と同様にして三次元造形物を作製した。
実施例５
モデル材用インクとして製造例４で作製したインクを使用したこと以外は、実施例１と同様にして三次元造形物を作製した。
図７に示すように、変性ポリビニルアルコールを含むモデル材用インクを使用した実施例４や、ゼラチンを含むモデル材用インクを使用した実施例５でも、ヒアルロン酸を含むモデル材用インクを使用した実施例１と同様に、造形精度が非常に良好な造形物を作製することができた。
実施例６
マウス線維芽細胞１０Ｔ１／２を製造例１で作製したモデル材用インクに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで分散させ、得られた細胞含有モデル材用インクと製造例２で作製したサポート材用インクを用いて実施例１と同様にして三次元造形物を作製した。
得られた三次元造形物を、ウシ胎児血清を１０ｖｏｌ％含有するＤＭＥＭ培地中で培養を行った。培養開始前、培養開始７日目、１４日目に細胞を含む造形物を生細胞染色試薬Ｃａｌｃｅｉｎ―ＡＭと死細胞染色試薬ＰＩをそれぞれ１μｇ／ｍＬで含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に１０分間浸して染色を行った。その結果を撮影した写真を図８に示す。１４日間の培養を経た後も多くが生存していた。
実施例７
ヒト肝癌由来細胞ＨｅｐＧ２を製造例１で作製したモデル材用インクに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで分散させ、得られた細胞含有モデル材用インクと製造例２で作製したサポート材用インクを用いて実施例１と同様にして三次元造形物を作製した。
得られた三次元造形物を、ウシ胎児血清を１０ｖｏｌ％含有するＤＭＥＭ培地中で培養を行った。培養開始前、培養開始７日目、１４日目に細胞を含む造形物を生細胞染色試薬Ｃａｌｃｅｉｎ―ＡＭと死細胞染色試薬ＰＩをそれぞれ１μｇ／ｍＬで含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に１０分間浸して染色を行った。その結果を撮影した写真を図８に示す。１４日間の培養を経た後も多くが生存しており、さらに、構造物中の生細胞を表す緑の領域の面積が増大したことから、ＨｅｐＧ２細胞の増殖が確認された。
実施例８
実施例６で作製した三次元造形物を、作製直後に１ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼを含むＤＭＥＭ培地に６０分間浸漬して分解し、細胞を回収した。回収した細胞を、培養皿（コーニング製、直径６０ｍｍディッシュ）に、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種して培養した。その結果を撮影した写真を図９に示す。未処理の細胞と同様の形状、接着能、増殖能を維持していた。実施例６～８の結果から、本発明の製造方法は細胞への悪影響が小さいことが推測される。
１：サポート材用インク
２、１２、２２、３２：モデル材用インク
２Ａ、１２Ａ、２２Ａ、３２Ａ：三次元造形物
２ａ、１２ａ、２２ａ、３２ａ：ブリッジ部位
２ｂ、１２ｂ、２２ｂ、３２ｂ：穴
３ａ、３ｂ、１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、３３ａ、３３ｂ、３３ｃ：ノズル
４、１４、２４、３４：基板
５、１５、２５、３５：除去溶液
１１、２１、３１：第一のサポート材用インク
１１ｓ、２１ｓ、３１ｓ：第二のサポート材用インク　

Claims (11)

  1. （ａ）架橋性高分子を含むモデル材用インク、および、（ｂ）サポート材を含むサポート材用インクを、それぞれ吐出する工程、ならびに、
    前記架橋性高分子の架橋後に、サポート材用インクの造形物を除去する工程
    を含み、
    前記モデル材用インク（ａ）および前記サポート材用インク（ｂ）のいずれか一方は、さらに、過酸化水素分解剤を含み、他方は、さらに、過酸化水素または過酸化水素供与体を含み、
    吐出された前記過酸化水素分解剤が、吐出された前記過酸化水素を分解して、架橋性高分子を架橋し、三次元造形物を造形する三次元造形物の製造方法。
  2. 前記過酸化水素分解剤が、架橋形成酵素である請求項１に記載の三次元造形物の製造方法。
  3. 前記過酸化水素供与体が、過酸化水素生成酵素である請求項１または２に記載の三次元造形物の製造方法。
  4. 前記架橋性高分子が、フェノール性水酸基を有する請求項１～３のいずれか１項に記載の三次元造形物の製造方法。
  5. 前記サポート材が、水溶性高分子又は水分散性高分子である請求項１～４のいずれか１項に記載の三次元造形物の製造方法。
  6. 前記水溶性高分子又は水分散性高分子が、イオン性化合物と作用して凝集または粘度低下する水性ゲルを形成する水溶性高分子又は水分散性高分子であり、サポート材用インクの造形物を除去する工程において、イオン性化合物を作用させて前記サポート材用インク（ｂ）の造形物を除去する請求項５に記載の三次元造形物の製造方法。
  7. （ａ）架橋性高分子を含むモデル材用インク、および、
    （ｂ）サポート材を含むサポート材用インク
    からなり、
    前記モデル材用インク（ａ）および前記サポート材用インク（ｂ）のいずれか一方は、さらに、過酸化水素分解剤を含み、他方は、さらに、過酸化水素または過酸化水素供与体を含む三次元造形物作製用インクセット。
  8. 前記過酸化水素分解剤が、架橋形成酵素である請求項７に記載の三次元造形物作製用インクセット。
  9. 前記過酸化水素供与体が、過酸化水素生成酵素である請求項７または８に記載の三次元造形物作製用インクセット。
  10. 前記架橋性高分子が、フェノール性水酸基を有する請求項７～９のいずれか１項に記載の三次元造形物作製用インクセット。
  11. 前記サポート材用インク（ｂ）が、イオン性化合物と作用して凝集または粘度低下する水性ゲルを形成する水溶性高分子又は水分散性高分子を含む請求項７～１０のいずれか１項に記載の三次元造形物作製用インクセット。
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