CN110450401A - 一种液体支撑介质内生物三维打印人工关节的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种液体支撑介质内生物三维打印人工关节的方法，该液体支撑介质内生物三维打印人工关节的液体支撑介质由以下质量份数的原料制成：壳聚糖5‑50、海藻酸5‑50、环糊精5‑50、淀粉5‑50、白蛋白5‑50、明胶5‑50、溶剂5‑50。有益效果：该方法使用液体支撑介质内生物三维打印技术，极大地提高打印结构稳定性；而使用含种子细胞的打印液，可使产物含有大量细胞，根据需要，设计打印路径参数，打印获得人工关节生物支架，该方法所获得的人工关节生物支架精度高，同时携带大量细胞进行增殖修复，利于快速恢复关节腔内环境，重建关节结构与功能。
Description
技术领域
本发明涉及三维打印技术领域，具体来说，涉及一种液体支撑介质内生物三维打印人工关节的方法。
背景技术
关节由关节面、关节囊和关节腔三部分构成，它是骨与骨之间的连接。关节由关节面至深层通常分为三层：软骨层，钙化软骨层，骨层。在运动中起到减少摩擦，减缓运动时的震动和冲击的作用。骨关节炎是一类较为常见的运动系统损伤，常见的骨关节炎包括髋关节炎、膝关节炎等，由炎症、感染、退化、创伤等因素引起，导致关节软骨变性或骨质结构改变，从而产生多关节肿胀、疼痛，远期甚至会引起关节畸形，残废等。
目前对骨关节炎的治疗分为非手术治疗和手术治疗两大类，非手术治疗主要包括抗炎、润滑药物治疗，效果主要为缓解症状，改善关节功能，但疗效持续时间较短，无法根治。手术治疗中最有效的为人工关节置换术。目前临床使用的人工关节材料包括金属材料、高分子材料和陶瓷材料。但上述材料均有各自不足，金属材料可能存在应力屏蔽、金属假体松动、锈蚀等不利因素；高分子材料硬度偏低，易磨损并产生碎屑与巨噬细胞反应引起骨吸收；陶瓷材料则弹性模量远高于人体骨，匹配性差。组织工程技术为人工关节的制备提供了一种理想、符合生理需求的方法。用组织工程技术，即在体外培养少量的种子细胞，在扩增后和生物支架结合成复合物，将其植入病变部位后，细胞增殖、分化、分泌基质，修复损伤组织，同时生物材料逐渐降解，最终达到生物学意义上的完全修复。该复合物在组织工程中起到支撑作用，同时提供大量种子细胞并为之提供成长、分化和增殖的空间。支架与细胞共同引导受损组织的再生进行和控制再生组织的结构。
针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
发明内容
针对相关技术中的问题，本发明提出一种液体支撑介质内生物三维打印人工关节的方法，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题。
为此，本发明采用的具体技术方案如下：
一种液体支撑介质内生物三维打印人工关节的方法，该液体支撑介质内生物三维打印人工关节的液体支撑介质由以下质量份数的原料制成：
壳聚糖5-50、海藻酸5-50、环糊精5-50、淀粉5-50、白蛋白5-50、明胶5-50、溶剂5-50。
该液体支撑介质内生物三维打印人工关节的方法，包括以下步骤：
种子细胞的培养：以含10％胎牛血清的F12培养基培养于37℃、5％CO2孵箱中，以含10％胎牛血清、结缔组织生长因子CTGF 25ng/ml、抗坏血酸25uM的α-MEM培养基培养于37℃、5％CO2孵箱中。
人工关节模型的建立：利用CT或MRI扫描获取损伤部位数据，通过生物三维打印机软件进行分割以及编辑处理，获取该部位三维模型，并进行局部修正及曲面化处理，保存该数据，格式为stl数据文件。
三维打印路径的建立：将所得三维模型数据进行切片分层处理，从而形成每个层面的，打印高分子材料以及打印含细胞水凝胶材料的打印路径，将两个路径分别保存，等待下一步骤。
液体支撑介质的制备：量取适量的壳聚糖、海藻酸、环糊精、淀粉、白蛋白和明胶，溶解于溶剂中并调整至所需密度。
人工关节生物支架三维打印材料的制备：量取适量的生物高分子材料A1、A2并灭菌；量取适量的天然材料B1、B2并灭菌，与种子细胞混合，得到含细胞凝胶。
人工关节生物支架三维打印设备的准备：调校生物三维打印设备的工艺参数：打印头直径为150-400μm，打印温度根据材料的热属性进行调整，打印过程中料筒气压为600-1000KPa，打印结构由S2步骤相对应的打印路径控制。
人工关节生物支架的打印：将高分子材料A1和含细胞凝胶B1分别置入两料筒，启动设备，于S3支撑溶剂中进行三维打印，交替打印高分子材料与细胞凝胶，支撑溶剂中含交联剂，或打印完毕后使用适当方法对含细胞凝胶B1进行交联；当骨区制备完毕后，将料筒内的材料更换为A2、B2，对软骨区域进行打印，支撑溶剂中含交联剂，或打印完毕后使用适当方法对含细胞凝胶B2进行交联。
三维打印人工关节的培养：量取适量的培养基，浸没S4所得的人工关节生物支架后放入二氧化碳培养箱中持续培养。
进一步的，生物高分子材料A1、A2是由聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物、聚对二氧环己酮中的一种或几种构成。
进一步的，天然材料B1、B2是由明胶、透明质酸、海藻酸钠、壳聚糖、胶原蛋白中的一种或几种构成。
进一步的，种子细胞是由骨髓干细胞、软骨细胞中的一种或几种构成。
进一步的，交联剂为紫外光、氯化钙溶液中的一种或几种。
进一步的，在人工关节生物支架打印完成后，随后使用含海藻酸裂解酶的溶液去除海藻酸盐支撑介质。
本发明的有益效果为：该方法使用液体支撑介质内生物三维打印技术，极大地提高打印结构稳定性；而使用含种子细胞的打印液，可使产物含有大量细胞，根据需要，设计打印路径参数，打印获得人工关节生物支架，该方法所获得的人工关节生物支架精度高，同时携带大量细胞进行增殖修复，利于快速恢复关节腔内环境，重建关节结构与功能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是根据本发明实施例的一种液体支撑介质内生物三维打印人工关节的方法的流程图；
图2是根据本发明实施例的一种液体支撑介质内生物三维打印人工关节的方法的骨区和软骨区吸光值对照图；
图3是根据本发明实施例的一种液体支撑介质内生物三维打印人工关节的方法的骨区和软骨区软骨相关产物变化图；
图4是根据本发明实施例的一种液体支撑介质内生物三维打印人工关节的方法的骨软骨恢复状况图。
具体实施方式
为进一步说明各实施例，本发明提供有附图，这些附图为本发明揭露内容的一部分，其主要用以说明实施例，并可配合说明书的相关描述来解释实施例的运作原理，配合参考这些内容，本领域普通技术人员应能理解其他可能的实施方式以及本发明的优点，图中的组件并未按比例绘制，而类似的组件符号通常用来表示类似的组件。
根据本发明的实施例，提供了一种液体支撑介质内生物三维打印人工关节的方法。
该液体支撑介质内生物三维打印人工关节的液体支撑介质由以下质量份数的原料制成：
壳聚糖5-50、海藻酸5-50、环糊精5-50、淀粉5-50、白蛋白5-50、明胶5-50、溶剂5-50。
实施例一：
该液体支撑介质内生物三维打印人工关节的方法，包括以下步骤：
步骤S101，种子细胞的培养：以含10％胎牛血清的F12培养基培养于37℃、5％CO2孵箱中，以含10％胎牛血清、结缔组织生长因子CTGF25ng/ml、抗坏血酸25uM的α-MEM培养基培养于37℃、5％CO2孵箱中。
步骤S103，人工关节模型的建立：利用CT或MRI扫描获取损伤部位数据，通过生物三维打印机软件进行分割以及编辑处理，获取该部位三维模型，并进行局部修正及曲面化处理，保存该数据，格式为stl数据文件。
步骤S105，三维打印路径的建立：将所得三维模型数据进行切片分层处理，从而形成每个层面的，打印高分子材料以及打印含细胞水凝胶材料的打印路径，将两个路径分别保存，等待下一步骤。
步骤S107，液体支撑介质的制备：量取适量的壳聚糖、海藻酸、环糊精、淀粉、白蛋白和明胶，溶解于溶剂中并调整至所需密度。
步骤S109，人工关节生物支架三维打印材料的制备：量取适量的生物高分子材料A1、A2并灭菌；量取适量的天然材料B1、B2并灭菌，与种子细胞混合，得到含细胞凝胶。
步骤S111，人工关节生物支架三维打印设备的准备：调校生物三维打印设备的工艺参数：打印头直径为150-400μm，打印温度根据材料的热属性进行调整，打印过程中料筒气压为600-1000KPa，打印结构由S2步骤相对应的打印路径控制。
步骤S113，人工关节生物支架的打印：将高分子材料A1和含细胞凝胶B1分别置入两料筒，启动设备，于S3支撑溶剂中进行三维打印，交替打印高分子材料与细胞凝胶，支撑溶剂中含交联剂，或打印完毕后使用适当方法对含细胞凝胶B1进行交联；当骨区制备完毕后，将料筒内的材料更换为A2、B2，对软骨区域进行打印，支撑溶剂中含交联剂，或打印完毕后使用适当方法对含细胞凝胶B2进行交联。
步骤S115，三维打印人工关节的培养：量取适量的培养基，浸没S4所得的人工关节生物支架后放入二氧化碳培养箱中持续培养。
实施例二：
生物高分子材料A1、A2是由聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物、聚对二氧环己酮中的一种或几种构成，天然材料B1、B2是由明胶、透明质酸、海藻酸钠、壳聚糖、胶原蛋白中的一种或几种构成，种子细胞是由骨髓干细胞、软骨细胞中的一种或几种构成，交联剂为紫外光、氯化钙溶液中的一种或几种，在人工关节生物支架打印完成后，随后使用含海藻酸裂解酶的溶液去除海藻酸盐支撑介质。
实施例三：
(1)以膝关节炎为例，利用MRI扫描获取患者患侧膝关节，得到退变区域为内侧髁的一部分。通过生物三维打印机软件进行分割以及编辑处理，获取该区域三维模型，并进行局部修正，对该三维模型数据进行切片分层处理，形成每个层面的打印路径。
(2)量取适量的海藻酸盐、黄原胶、碳酸钙，溶解于D-(+)葡萄糖酸δ内酯与双蒸水中，并调整至所需密度。
(3)量取适量的聚己内酯并灭菌，量取适量的明胶并灭菌，与骨髓干细胞混合均匀，得到含骨髓干细胞明胶凝胶；量取适量的明胶并灭菌，与软骨细胞混合均匀，得到含软骨细胞明胶凝胶。
(4)设备的准备：调校生物三维打印设备的工艺参数：打印头直径为100μm，聚己内酯打印温度为120℃，含细胞凝胶打印温度18-37℃打印过程中料筒气压为600-1000KPa，打印结构由打印路径控制。将高分子材料聚己内酯和含细胞凝胶分别置入两料筒，启动设备，于支撑溶剂中进行三维打印，交替打印高分子材料与细胞凝胶，支撑溶剂中已含交联剂钙离子，可在打印同时对含细胞凝胶进行交联。当骨区制备完毕后，将含细胞凝胶更换为含软骨细胞凝胶，继续对软骨区进行打印，得到人工关节生物支架。随后使用含海藻酸裂解酶的溶液去除海藻酸盐支撑介质。
实施例四：
将上述实施例3中得到的人工关节生物支架进行生物相容性表征。将步骤(4)所得人工关节生物支架放入培养箱中培养。以不含细胞凝胶打印得到的关节支架，于骨区、软骨区分别种植骨髓干细胞、软骨细胞为对照组。分别培养1，3，7，14天后，利用MTT法检测关节的细胞活力。结果图如2所示，显示带有细胞的人工关节生物支架上的细胞具有良好的增殖行为，细胞活力较好，且较对照组增殖行为更加显著。
实施例五：
将上述实施例3中利用液体支撑介质内生物三维打印得到的人工关节生物支架进行qRT-PCR检测。以不含细胞凝胶打印得到的关节支架，于骨区、软骨区分别种植骨髓干细胞、软骨细胞为对照组作对比。分别培养14、28天后，进行qRT-PCR检测。结果图如3所示，显示实验组骨区(BMP4、OCN、RUNX2)、软骨区软骨相关产物(SOX9、Aggrecan、COL II)表达明显较多。
实施例六：
将上述实施例3中得到的人工关节生物支架于含10％胎牛血清的F12培养基，37℃、5％CO2孵箱中进行持续培养后，予HE、Masson、天狼星红染色。结果如图4所示，结果显示经培养后，骨软骨恢复状况良好。
综上所述，借助于本发明的上述技术方案，该方法使用液体支撑介质内生物三维打印技术，极大地提高打印结构稳定性；而使用含种子细胞的打印液，可使产物含有大量细胞，根据需要，设计打印路径参数，打印获得人工关节生物支架，该方法所获得的人工关节生物支架精度高，同时携带大量细胞进行增殖修复，利于快速恢复关节腔内环境，重建关节结构与功能。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种液体支撑介质内生物三维打印人工关节的方法，其特征在于，该液体支撑介质内生物三维打印人工关节的液体支撑介质由以下质量份数的原料制成：
壳聚糖5-50、海藻酸5-50、环糊精5-50、淀粉5-50、白蛋白5-50、明胶5-50、溶剂5-50。
2.一种液体支撑介质内生物三维打印人工关节的方法，其特征在于，该液体支撑介质内生物三维打印人工关节的方法，包括以下步骤：
种子细胞的培养：以含10％胎牛血清的F12培养基培养于37℃、5％CO2孵箱中，以含10％胎牛血清、结缔组织生长因子CTGF 25ng/ml、抗坏血酸25uM的α-MEM培养基培养于37℃、5％CO2孵箱中。
人工关节模型的建立：利用CT或MRI扫描获取损伤部位数据，通过生物三维打印机软件进行分割以及编辑处理，获取该部位三维模型，并进行局部修正及曲面化处理，保存该数据，格式为stl数据文件。
三维打印路径的建立：将所得三维模型数据进行切片分层处理，从而形成每个层面的，打印高分子材料以及打印含细胞水凝胶材料的打印路径，将两个路径分别保存，等待下一步骤。
液体支撑介质的制备：量取适量的壳聚糖、海藻酸、环糊精、淀粉、白蛋白和明胶，溶解于溶剂中并调整至所需密度。
人工关节生物支架三维打印材料的制备：量取适量的生物高分子材料A1、A2并灭菌；量取适量的天然材料B1、B2并灭菌，与种子细胞混合，得到含细胞凝胶。
人工关节生物支架三维打印设备的准备：调校生物三维打印设备的工艺参数：打印头直径为150-400μm，打印温度根据材料的热属性进行调整，打印过程中料筒气压为600-1000KPa，打印结构由S2步骤相对应的打印路径控制。
人工关节生物支架的打印：将高分子材料A1和含细胞凝胶B1分别置入两料筒，启动设备，于S3支撑溶剂中进行三维打印，交替打印高分子材料与细胞凝胶，支撑溶剂中含交联剂，或打印完毕后使用适当方法对含细胞凝胶B1进行交联；当骨区制备完毕后，将料筒内的材料更换为A2、B2，对软骨区域进行打印，支撑溶剂中含交联剂，或打印完毕后使用适当方法对含细胞凝胶B2进行交联。
三维打印人工关节的培养：量取适量的培养基，浸没S4所得的人工关节生物支架后放入二氧化碳培养箱中持续培养。
3.根据权利要求2所述的一种液体支撑介质内生物三维打印人工关节的方法，其特征在于，生物高分子材料A1、A2是由聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物、聚对二氧环己酮中的一种或几种构成。
4.根据权利要求2所述的一种液体支撑介质内生物三维打印人工关节的方法，其特征在于，天然材料B1、B2是由明胶、透明质酸、海藻酸钠、壳聚糖、胶原蛋白中的一种或几种构成。
5.根据权利要求1所述的一种液体支撑介质内生物三维打印人工关节的方法，其特征在于，种子细胞是由骨髓干细胞、软骨细胞中的一种或几种构成。
6.根据权利要求2所述的一种液体支撑介质内生物三维打印人工关节的方法，其特征在于，交联剂为紫外光、氯化钙溶液中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的一种液体支撑介质内生物三维打印人工关节的方法，其特征在于，在人工关节生物支架打印完成后，随后使用含海藻酸裂解酶的溶液去除海藻酸盐支撑介质。
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