CN114632020B - 一种具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯及其制备方法，包括以下重量百分比的原料：胰岛素样生长因子(IGF‑Ⅰ)25‑35ppm，纤维细胞生长因子(KGF‑Ⅱ)25‑35ppm，血小板衍生生长因子(PDGF)25‑35ppm，血管内皮生长因子(VEGF)25‑35ppm，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)25‑35ppm，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)25‑35ppm，肥大细胞生长因子(SCF)25‑35ppm，转录激活因子(Krox‑20)25‑35ppm，冻干保护液余量为水；其为生物功效性产品，具有促进毛发生长功效，且制备时不添加防腐剂、人工化学成分，对皮肤无刺激，能快速修复皮肤屏障，生发养发。

Description

一种具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯及其制备 方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯及其制备方法。

背景技术

头发，指生长在头部的毛发。头发主要用于保护头部，还可以起到提升个人形象的作用。然而随着人们的生活作息、压力水平和饮食习惯都发生了巨大变化，脱发人群数量大量上升，并且越来越多的年轻人出现此类问题。有关报道显示，中国男性脱发率高20％，30岁前脱发占比更是高达84％。女性异常脱发的问题也不容忽视。同时有关调查表明，脱发带来的个人形象的负面作用，直接影响其心理健康状况，抑郁程度较正常人更高。这些都表明脱发问题目前尚得不到有效的控制，预防和治疗脱发已成为全社会的一大难题。

市售的生发功效产品中，非那雄胺、度他雄胺和依立雄胺等育发成分，会引起激素分泌失常等生理性不良反应；米诺地尔类生发剂，副作用同样明显，并且对皮肤的刺激性较高；侧柏、绿茶等植物提取物的效果不理想，作用机制等也并不清晰。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯及其制备方法，所述冻干微芯为生物功效性产品，其对人源真皮乳头细胞(hDPC)具有促细胞增殖活性和促细胞迁移活性，且在毛发促进生长功效测试中显示具有促进毛发生长功效，且制备时不添加防腐剂、人工化学成分，对皮肤无刺激，能快速修复皮肤屏障，生发养发。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯，所述冻干微芯包括以下重量百分比的原料：胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)25-35ppm，纤维细胞生长因子(KGF-Ⅱ)25-35ppm，血小板衍生生长因子(PDGF)25-35ppm，血管内皮生长因子(VEGF)25-35ppm，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)25-35ppm，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)25-35ppm，肥大细胞生长因子(SCF)25-35ppm，转录激活因子(Krox-20)25-35ppm，冻干保护液，余量为水。

所述冻干保护液的重量百分比为10-15％。

所述冻干保护液中各原料的重量比如下：甘露醇：甘氨酸：海藻糖＝4-8：4-8：1。

所述具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯优选为包括以下重量百分比的原料：胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)30ppm，纤维细胞生长因子(KGF-Ⅱ)30ppm，血小板衍生生长因子(PDGF)30ppm，血管内皮生长因子(VEGF)30ppm，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)30ppm，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)30ppm，肥大细胞生长因子(SCF)30ppm，转录激活因子(Krox-20)30ppm，甘露醇6％，甘氨酸6％，海藻糖1％，余量为水。

本发明还提供了所述具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将配方量的各原料混合得到混合液；

(2)利用高精度流体分装系统，将混合溶液逐滴滴入存于杜瓦瓶的液氮中冷冻成微芯；

(3)将微芯取出装入西林瓶中，进行冷冻干燥。

步骤(2)中，每滴混合溶液的体积为5-60μL，优选为5-15μL，更优选为10μL。

步骤(3)中，每个西林瓶中装入2-20粒冷冻后的微芯。

(3)将微芯取出装入西林瓶中，每瓶装入10滴，进行冷冻干燥。

所述冷冻干燥具体为：35～45Kpa的真空度下-35-45℃预冻170-190min，并在同样的条件下冻结220～260min，随后在5～15Pa的真空度下进行一期升华干燥及二期升华干燥。

所述一期升华干燥的程序设计为：-34～-38℃保持55～65min，-31～-33℃保持150～200min，-28～-30℃保持400～450min，-20～-27℃保持220～260min，-10～-18℃保持220～260min，-5～-5℃保持100～140min；所述二期升华干燥的程序设计为：20～25℃保持280-320min，28～-30℃保持280-320min。

本发明提供的具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯的使用方法为：将适量纯化水加入到含有冻干微芯的西林瓶中，混合待微芯完全溶解后，即可使用。

本发明提供的具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯，同时含有多种重组类人蛋白，其中胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)可以活化细胞，改善头部血液循环，调节影响毛囊真皮细胞和毛囊角质细胞的增殖、迁徙及分化，在毛发生长周期中促进生长初期毛发的生长，延缓毛发衰退期及休止期的时间；纤维细胞生长因子(KGF-Ⅱ)可培育改善生发细胞活性和毛囊环境，通过提高促毛囊生长因子的活性和含量，激活毛母细胞、毛乳头细胞再生，从而达到促进毛发再生的作用；血小板衍生生长因子(PDGF)可促进毛囊发育、促进皮下血管生成、修复皮下血液微循环系统、促进胶原蛋白合成；血管内皮生长因子(VEGF)可以与血管内皮细胞表面受体结合促进内皮细胞增殖，在头皮真皮层诱导形成新的血管，并通过改善毛囊的营养供应来刺激毛囊直径增加，刺激毛发生长，为毛发再生及代谢提供有利微环境；酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)可以影响真皮细胞分裂，促进毛乳头细胞增殖，刺激血管形成，促进角质细胞生长；转录激活因子(Krox-20)能促进毛发生长相关基因的表达；肥大细胞生长因子(SCF)可促进黑素细胞前体的扩散和存活，该配方中转录激活因子(Krox-20)和肥大细胞生长因子(SCF)两种重组蛋白的加入进一步提升了促进毛发生长的效果。

本发明提供的具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯为生物功效性产品，其原料中的各生长因子均与人体同源，易吸收，对皮肤无任何副作用，其对人源真皮乳头细胞(hDPC)具有促细胞增殖活性和促细胞迁移活性，且在毛发促进生长功效测试中显示具有促进毛发生长功效，且制备时不添加防腐剂、人工化学成分，对皮肤无刺激，能快速修复皮肤屏障，生发养发。其制备形式相较于普通的冻干粉，更有效的降低了冻干过程对于重组蛋白的活性损失。

具体实施方式

本发明所涉及的酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)生长因子的制备方法如下：

(1)通过GenBank查询获得aFGF基因，将aFGF基因序列插入到pMD19-TSimpleVector中，其5’端接Not Ⅰ酶切位点(GCGGCCGC)，3’端接Xba Ⅰ酶切位点(TCTAGA)，由此得到质粒pMD19-T-aFGF；

(2)用内切酶Not I和内切酶Xba I分别对质粒pYES2/CT-MFα及质粒pMD19-T-aFGF进行双酶切，酶切反应体系为：

双酶切体系	体积(μL)
		QuickCut Not I	2.0
QuickCut Xba I	2.0
		10xQuickCut Green Buffer	5
pYES2/CT-MFa或aFGF片段	15
		ddH2O	26
Total Volume	50

在37℃金属浴酶切反应3h，酶切产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并分别切胶回收aFGF基因片段和pYES2/CT-MFα载体，然后用T4 DNA连接酶进行连接，连接反应体系为：

连接体系	体积(μL)
		aFGF基因片段	5
pYES2/CT-MFα	3
		T4 DNA连接酶	1
10×ligase buffer	1
		Total Volume	10

反应条件为16℃、14h，将重组质粒转化至大肠杆菌(DH5ɑ)，在含氨苄青霉素的LB平板培养基上挑取阳性克隆，经菌液PCR及双酶切鉴定，选取阳性克隆pYES2/CT-MFα-aFGF；

(3)将10μL pYES2/CT-MFα-aFGF质粒加到80μl酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，然后转移到预冷的电击杯中，冰浴5min，擦干电击杯外壁；将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，PIC选项，电击杯置于Bio-Rad电转化仪上电击，迅速向电击杯中加入500μl预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，涂SC-U板；30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆。在SC-U选择培养基(含氨苄)生长的为含有pYES2/CT-MFα-aFGF的酿酒酵母转化子，菌液PCR筛选出INVSc1/pYES2/CT-MFα-aFGF阳性克隆子。

(4)挑取INVSc1/pYES2/CT-MFα-aFGF单菌落接种于20ml SC-U选择培养基，经30℃、220rpm震荡培养过夜，测定其OD_600nm吸光值，计算好相应体积的菌液转接至于100ml SC-U诱导培养基中，使得初始OD_600nm达到0.4；然后在4℃、1500g离心5min，收集菌体，用1～2ml的SC-U诱导培养基悬浮菌体，重新接种100ml的SC-U诱导培养基中，置于30℃震荡培养96h，4℃、15000g离心5min，收集菌体和上清，诱导表达的上清液经离心并通过0.22μm滤膜过滤，收集过滤液。

(5)取离心并经0.22μm滤膜过滤后的过滤液，使用GE Healthcare公司ChelatingSepharose TM Fast Flow镍离子螯合亲和层析填料自行装柱，用3个柱体积的纯化水清洗Ni²⁺螯合亲和层析柱，再用PBS平衡2-3个柱体积；在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速5-6ml/min；再用PBS过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到OD_280nm稳定，再以含500mM咪唑PBS缓冲液过层析柱，洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，即得到经过金属离子亲和层析后的重组人aFGF蛋白原液。

(6)将金属离子亲和层析纯化后收集的蛋白原液置换到Binding Buffer Ⅱ中后，上样通过用Binding Buffer Ⅱ平衡好的DEAE阴离子交换层析柱，收集aFGF融合蛋白峰；再用Elution Buffer Ⅱ(50mM三羟甲基氨基甲烷，1M Na Cl，pH8.5)洗脱，洗去杂蛋白并收集洗脱峰对应的蛋白。即可制备得到酸性成纤维细胞生长因子的蛋白原液，此原液直接作为冻干微芯的原料进行使用。

按照上述酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)制备方法在同样的制备步骤下分别制备出胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)、纤维细胞生长因子(KGF-Ⅱ)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转录激活因子(Krox-20)、肥大细胞生长因子(SCF)的蛋白原液，各原液直接作为冻干微芯的原料进行使用。

各个生长因子的基因序列参考的基因库编号如下所示：

胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)：CR541861.1；

纤维细胞生长因子(KGF-Ⅱ)：DI088921.1；

血小板衍生生长因子(PDGF)：U41745.1；

血管内皮生长因子(VEGF)：AY047581.1；

酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)：S67291.1；

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)：L31408.1；

转录激活因子(Krox-20)：AK312813.1；

肥大细胞生长因子(SCF)：M59964.1。

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例

一种具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯，其是由下述重量百分比的原料制得：胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)30ppm，纤维细胞生长因子(KGF-Ⅱ)30ppm，血小板衍生生长因子(PDGF)30ppm，血管内皮生长因子(VEGF)30ppm，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)30ppm，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)30ppm，肥大细胞生长因子(SCF)30ppm，转录激活因子(Krox-20)30ppm，甘露醇6％，甘氨酸6％，海藻糖1％，余量为水。

所述冻干微芯的制备方法，包括以下步骤：

(1)将配方量的各原料混合得到混合液；

(2)利用高精度流体分装系统，将混合溶液按照10μL每滴逐滴滴入存于杜瓦瓶的液氮中冷冻成微芯；

(3)将微芯取出装入西林瓶中，每个西林瓶中装入10粒冷冻后的微芯，进行冷冻干燥，冷冻干燥的程序控制如表1所示。

表1冻干程序参数表

对比例1

本对比例与实施例相比，区别仅在于，在配方中，将转录激活因子(Krox-20)替换为等量的血管内皮生长因子(VEGF)，除此之外的方法步骤均相同。

对比例2

本对比例与实施例相比，区别仅在于，在制备过程中省去了其中的步骤(2)，即将100μL步骤(1)中的混合液装入西林瓶中后进行冷冻干燥，冷冻干燥的程序控制同实施例1。

对比例3

一种具有生发固发功效的生物蛋白组合物混合液，混合液中的原料组成为：胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)30ppm，纤维细胞生长因子(KGF-Ⅱ)30ppm，血小板衍生生长因子(PDGF)30ppm，血管内皮生长因子(VEGF)30ppm，成纤维细胞生长因子(aFGF)30ppm，成纤维细胞生长因子(bFGF)30ppm，肥大细胞生长因子(SCF)30ppm，转录激活因子(Krox-20)30ppm，甘露醇6％，甘氨酸6％，海藻糖1％，余量为水。

一、促细胞增殖活性检验

试剂配制

完全培养液 量取小牛血清100ml，加培养液定容至1000ml。

维持培养液 量取小牛血清4ml，加培养液定容至1000ml。

消化液：称取乙二胺四乙酸二钠0.2g、氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.152g、磷酸二氢钾0.2g、胰蛋白酶2.5g，加纯化水溶解并定容至1000ml，过滤除菌。

噻唑蓝(MTT)溶液：称取MTT粉末0.10g，加PBS 20ml使溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。

PBS：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加纯化水溶解并定容至1000ml，经121℃15分钟灭菌。

细胞株：人源真皮乳头细胞(hDPC)。

试验操作

供试品制备：将实施例、对比例1和对比例2中加入适量且等量的纯化水，至蛋白含量与对比例3相同。取100μL供试品于900μL完全培养液中进行10倍稀释。取1000倍稀释液在96孔细胞培养板中，从1︰2开始依次做2倍递增梯度稀释(具体操作步骤为首先于96孔细胞培养板中加入100μL完全培养液，取50μL 10倍稀释的供试品溶液加入96孔板中第1列，吹打稀释。充分稀释后于第1列孔中抽取50μL于第2列孔，吹打稀释。充分稀释后于第2列孔中抽取50μL于第3列孔，吹打稀释。重复上述操作，直至第10列)，共做10个稀释度(1～10孔)，每个稀释度同时设置一个复孔。

测定方法

①hDPC细胞株用完全培养液于37℃、5％二氧化碳培养，控制细胞浓度为每1ml含3.0×10⁴-5.0×10⁴个细胞，传代后24～36小时用于生物学活性测定。

②弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞用完全培养液配成每1ml含5.0×10⁴～8.0×10⁴个细胞的细胞悬液，接种于96孔板中，接种过程中不停摇匀，保持每孔接种数相同，每孔100μL,于37℃、5％二氧化碳条件下培养。

③24小时后换成维持培养液。置37℃、5％二氧化碳培养24小时。

④制备的细胞培养板弃去维持液，加入供试品溶液，每孔100μL。置37℃、5％二氧化碳培养24～48小时。

⑤MTT比色法：每孔加入MTT溶液20μL,于37℃、5％二氧化碳培养5小时。以上操作在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入DMSO 100μL,混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，570nm为试验波长测定吸光度，记录测定结果。

数据处理

将各个样品及标准品的OD值数据进行四参数拟合。

结果计算

试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。

供试品工作效价计算公式：U＝预稀释倍数*2^C(C为四参数方程中C值)

表2促细胞增殖活性结果汇总表

样品配方	实施例	对比例1	对比例2	对比例3
					工作效价(U/ml)	3510	3150	3310	3680

表2中的结果表明，本发明提供的具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯具有促细胞增殖活性，对比例3工作效价最高，实施例工作效价略低于对比例3，对比例1和对比例2工作效价均低于实施例。结果表明，冻干过程会导致配方原液的活性略微降低，但是冻干微芯的活性显著优于普通冻干粉。综上，本发明所涉及的组合物具有促细胞增殖的效果。

二、促细胞迁移速率实验

实验原理：本法系依据当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。在细胞迁移过程中在开始和试验结束时定期捕获图像，通过比较图像以确定细胞迁移速率。

试验材料

细胞株：hDPC细胞；

其他材料与设备：新生牛血清和DMEM培养基；

96孔细胞培养板；200μL、1ml无菌枪头；青霉素-链霉素溶液；

200μL、1ml移液器，直尺等。

二氧化碳培养箱、超净工作台、冰箱等。

试验方法

①先用marker笔在6孔板背后，用直尺对齐，均匀得划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。

②向6孔板孔中加入浓度为5×10⁴个/ml的hDPC细胞悬液2ml。

③第二天观察到6孔板内细胞均长满单层，用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，每孔内划2道。

④用PBS洗细胞3次，洗掉划下的悬浮细胞。

⑤将实施例、对比例1和对比例2中加入适量且等量的纯化水，至蛋白含量与对比例3相同。根据分组往孔中加入1.8ml的无血清培养液，之后加入200μL的供试品，细胞对照孔加入等量的PBS。12孔板中供试品孔与细胞对照孔如下表所示。

⑥放入37度5％CO₂培养箱，培养。0时拍照，记录每孔内拍照位置。后续观察时对固定位置进行观察、拍照。

通过对比不同时间同一划痕处细胞迁移数，算出细胞迁移速率，得出结论。

表2促细胞迁移速率结果汇总表

样品配方	实施例	对比例1	对比例2	对比例3
					促细胞迁移速率	56％	50％	47％	61％

表2中的结果表明，本发明提供的具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯具有促细胞迁移活性，对比例3迁移活性最高，实施例迁移活性略低于对比例3，对比例1和对比例2迁移活性均低于实施例。结果表明，冻干过程会导致配方原液的活性略微降低，但是冻干微芯的活性显著优于普通冻干粉。综上，本发明所涉及的组合物具有促细胞迁移的效果。

三、动物毛发促进生长功效测试实验

模型建立

取昆明种小鼠100值，背部毛剪短，将脱毛剂(6％Na₂S)涂于毛兔背部约2-3分钟后，用温水洗净，以小鼠背部光滑，无伤无残毛为净，脱毛面积约3×4cm²。

试验分组

将实施例、对比例1和对比例2中加入适量且等量的纯化水，至蛋白含量与对比例3相同。脱毛次日，将小鼠随机分未5组，每组20只，分别为：1，空白组：涂抹生理盐水；2，实施例：涂抹对应的冻干微芯复溶液；对比例1：涂抹对应的冻干微芯复溶液；对比例2：涂抹对应的冻干微芯复溶液；对比例3：涂抹对比例3中的混合液。

试验方法

局部皮肤使用移液枪定量涂抹给药，每天2次，每次给药量为0.1ml/12cm²。上午和下午给动物喂食前给药，连续给药10天。

观察指标

新生毛生长状况：10天后对每鼠脱毛区新生长毛状况评分，3名实验人员同时评分，取平均值。评分标准见下表3，试验测试结果见表4。

表3评分标准表

评分值	小鼠新生毛生长状况
		0	无毛生长
1	浅毛长满脱毛区
		2	新生毛长度及密度约为未脱毛区的一半
3	新生毛长度及密度超过未脱毛区的一半，与未脱毛区仍有差别
		4	新生毛长与未脱毛区无差别
注	出现不规则毛生长的小鼠按面积比率计算

表4试验测试结果汇总表

分组	小鼠新生毛生长状况评分值
		实施例	3.51
对比例1	3.14
		对比例2	3.21
对比例3	3.59

表4中的结果表明，本发明提供的具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯具有促进毛发生长功效。对比例3活性最高，实施例活性略低于对比例3，对比例1和对比例2活性均低于实施例。结果表明，冻干过程会导致配方原液的活性略微降低，但是冻干微芯的活性显著优于普通冻干粉。综上，本发明所涉及的组合物具有促进毛发生长的效果。

四、人体生发实验

志愿者A：女，28岁，属产后激素性脱发，每次洗头平均掉发150根左右，前额左右部位明显有秃块出现，脱发程度严重。

试用过程中，该志愿者每天洗发一次后，将适量纯化水加入到实施例冻干微芯的西林瓶中，混合待微芯完全溶解后，均匀涂抹在头皮并轻轻按摩至吸收，持续观察掉发量的变化。

该志愿者试用后，掉发量在3周后明显减少，7周后发现秃块部位长出新发，使用至20周时，生发效果一直持续，没有明显不良反应出现，秃块逐渐被新发覆盖。

志愿者B：男，35岁，雄性激素源性脱发。患者头皮油脂过量溢出，常伴有头屑增多，头皮油腻，瘙痒明显，头发在稍有外力作用下便会脱落，尤其是两侧额角还会发生慢性弥漫性脱发。

志愿者B在试用过程中，每日早晚两次、每次将适量纯化水加入到实施例冻干微芯的西林瓶中，混合待微芯完全溶解后，均匀涂抹在头皮并轻轻按摩至吸收。20周后，开始稀疏的微绒毛逐渐健壮，密度也逐渐提升，24周后毛发明显比使用前浓密。

志愿者C：女，34岁，属压力性脱发。前额部位脱发明显，发际线明显后移。

该志愿者在试用过程中，每日早晚两次、每次将适量纯化水加入到实施例冻干微芯的西林瓶中，混合待微芯完全溶解后，均匀涂抹在头皮并轻轻按摩至吸收。8周后，明显脱发的前额部位逐渐长出新发，且至20周时，生发效果一直持续。

综上所述，本发明提供的冻干微芯对人源真皮乳头细胞(hDPC)具有促细胞增殖活性和促细胞迁移活性，且在动物毛发促进生长功效测试中显示具有促进毛发生长功效，人体生发实验表明本发明的冻干微芯具有促进人体毛发生长的功效。并且，该配方中转录激活因子(Krox-20)重组蛋白的加入明显提升了促进毛发生长的效果。另外，冻干微芯的制备形式相较于普通的冻干粉，更有效的降低了冻干过程对于重组蛋白的活性损失。

上述参照实施例对一种具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯及其制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯，其特征在于，所述冻干微芯包括以下重量百分比的原料：胰岛素样生长因子IGF-Ⅰ 25-35ppm，纤维细胞生长因子KGF-Ⅱ25-35ppm，血小板衍生生长因子PDGF 25-35ppm，血管内皮生长因子VEGF 25-35ppm，酸性成纤维细胞生长因子aFGF 25-35ppm，碱性成纤维细胞生长因子bFGF 25-35ppm，肥大细胞生长因子SCF 25-35ppm，转录激活因子Krox-20 25-35ppm，冻干保护液，余量为水；

所述具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯的制备方法包括以下步骤：

（1）将配方量的各原料混合得到混合液；

（2）利用高精度流体分装系统，将混合溶液逐滴滴入存于杜瓦瓶的液氮中冷冻成微芯；

（3）将微芯取出装入西林瓶中，进行冷冻干燥。

2.根据权利要求1所述的具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯，其特征在于，所述冻干保护液的重量百分比为10-15%。

3.根据权利要求1所述的具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯，其特征在于，所述冻干保护液中各原料的重量比如下：甘露醇：甘氨酸：海藻糖=4-8：4-8：1。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯，其特征在于，所述冻干微芯包括以下重量百分比的原料：胰岛素样生长因子IGF-Ⅰ 30ppm，纤维细胞生长因子KGF-Ⅱ 30ppm，血小板衍生生长因子PDGF 30ppm，血管内皮生长因子VEGF 30ppm，酸性成纤维细胞生长因子aFGF 30ppm，碱性成纤维细胞生长因子bFGF 30ppm，肥大细胞生长因子SCF 30ppm，转录激活因子Krox-20 30ppm，甘露醇6%，甘氨酸6%，海藻糖1%，余量为水。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的具有生发固发功效的生物蛋白组合物冻干微芯的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（1）将配方量的各原料混合得到混合液；

（2）利用高精度流体分装系统，将混合溶液逐滴滴入存于杜瓦瓶的液氮中冷冻成微芯；

（3）将微芯取出装入西林瓶中，进行冷冻干燥。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，每滴混合溶液的体积为5-60μL。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，每个西林瓶中装入2-20粒冷冻后的微芯。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥具体为：35~45Kpa的真空度下-35~-45℃预冻170-190min，并在同样的条件下冻结220~260min，随后在5~15Pa的真空度下进行一期升华干燥及二期升华干燥。