CN114990059A - 一种脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法，涉及冻干粉技术领域。本发明是在脐带间充质干细胞培养液中加入维生素C和钠盐，混合均匀后再将混合物料进行冻干操作，从而降低冻干操作的难度，避免了脐带间充质干细胞在冻干过程中产生损伤。
Description
技术领域
本发明属于冻干粉加工技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法。
背景技术
脐带间充质干细胞是存在于新生儿脐带华通氏胶和血管周围组织中的一种间充质干细胞。脐带间充质干细胞是具有高度自我更新能力和多项分化潜能的多能干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪、羊膜液、胎盘、脐带血及脐带组织中。
为了使得脐带间充质干细胞便于保存和使用，现有技术是将脐带间充质干细胞制成冻干粉。但是传统的冻干技术容易损伤细胞因子的活性，如果冻干不彻底，脐带间充质干细胞冻干粉极易在保存过程中失去活性。在一些冻干技术中，为了使得脐带间充质干细胞能够充分被冻干，往往是采用极低的冻干温度(低于-80℃)，这使得冻干工艺成本高昂且超低的冻干温度也会对干细胞活性造成损害。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法，该方法能够有效提高脐带间充质干细胞的生物活性。
本发明脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法包括以下步骤：
S1、将脐带间充质原代干细胞进行传代培养，收集第12～15代的细胞培养上清液；
S2、在所述上清液中加入维生素C混合均匀后，再加入占上清液质量0.01％～0.5％的钠盐，室温搅拌混合5-20min；
S3、将混合后的物料进行冷冻干燥制成冻干粉。
优选的，步骤S1是将脐带间充质原代干细胞接种至培养基中，在低氧条件下进行传代培养，所述培养基是在DMEM/F12培养基中添加L-谷氨酰胺5-10μg/mL、胰岛素10-15μg/mL、右旋糖苷7.5-12μg/mL、L-抗坏血酸20-30ng/mL制成。
优选的，步骤S2中维生素C的加入量占所述上清液质量的1.5～3.5％。
优选的，步骤S2中钠盐为氯化钠。
优选的，步骤S3所述冷冻干燥是将物料先按15-20℃/h的速率降温至-20℃～-25℃,然后在以5～10℃/h的速率降温至-30℃～-35℃，最后再以1-3℃/h的速率降温至-50～-60℃，保持该温度10-24h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明是在脐带间充质干细胞培养液中加入维生素C和钠盐，混合均匀后再将混合物料进行冻干操作，从而降低冻干操作的难度，避免了脐带间充质干细胞在冻干过程中产生损伤。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法，具体操作如下：
S1、将脐带间充质原代干细胞接种至培养基中，在低氧条件下进行传代培养，所述培养基是在DMEM/F12培养基中添加L-谷氨酰胺10μg/mL、胰岛素15μg/mL、右旋糖苷12μg/mL、L-抗坏血酸25ng/mL制成，收集第13代的细胞培养上清液；
S2、在所述上清液中加入占所述上清液质量的2.5％维生素C，混合均匀后再加入占上清液质量0.09％的氯化钠，室温搅拌混合15min；
S3、将混合后的物料先按15℃/h的速率降温至-25℃,然后在以10℃/h的速率降温至-35℃，最后再以2℃/h的速率降温至-55℃，保持该温度20h，制成冻干粉。
实施例2
一种脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法，具体操作如下：
S1、将脐带间充质原代干细胞接种至培养基中，在低氧条件下进行传代培养，所述培养基是在DMEM/F12培养基中添加L-谷氨酰胺10μg/mL、胰岛素15μg/mL、右旋糖苷12μg/mL、L-抗坏血酸25ng/mL制成，收集第15代的细胞培养上清液；
S2、在所述上清液中加入占所述上清液质量的2.5％维生素C，混合均匀后再加入占上清液质量0.2％的氯化钠，室温搅拌混合15min；
S3、将混合后的物料先按15℃/h的速率降温至-25℃,然后在以10℃/h的速率降温至-35℃，最后再以2℃/h的速率降温至-55℃，保持该温度20h，制成冻干粉。
实施例3
一种脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法，具体操作如下：
S1、将脐带间充质原代干细胞接种至培养基中，在低氧条件下进行传代培养，所述培养基是在DMEM/F12培养基中添加L-谷氨酰胺10μg/mL、胰岛素15μg/mL、右旋糖苷12μg/mL、L-抗坏血酸25ng/mL制成，收集第14代的细胞培养上清液；
S2、在所述上清液中加入占所述上清液质量的3.5％维生素C，混合均匀后再加入占上清液质量0.09％的氯化钠，室温搅拌混合15min；
S3、将混合后的物料先按15℃/h的速率降温至-25℃,然后在以10℃/h的速率降温至-35℃，最后再以2℃/h的速率降温至-55℃，保持该温度20h，制成冻干粉。
实施例4
一种脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法，具体操作如下：
S1、将脐带间充质原代干细胞接种至培养基中，在低氧条件下进行传代培养，所述培养基是在DMEM/F12培养基中添加L-谷氨酰胺10μg/mL、胰岛素15μg/mL、右旋糖苷12μg/mL、L-抗坏血酸25ng/mL制成，收集第14代的细胞培养上清液；
S2、在所述上清液中加入占所述上清液质量的2.0％维生素C，混合均匀后再加入占上清液质量0.3％的氯化钠，室温搅拌混合15min；
S3、将混合后的物料先按15℃/h的速率降温至-25℃,然后在以10℃/h的速率降温至-35℃，最后再以2℃/h的速率降温至-55℃，保持该温度20h，制成冻干粉。
实施例5
一种脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法，具体操作如下：
S1、将脐带间充质原代干细胞接种至培养基中，在低氧条件下进行传代培养，所述培养基是在DMEM/F12培养基中添加L-谷氨酰胺10μg/mL、胰岛素15μg/mL、右旋糖苷12μg/mL、L-抗坏血酸25ng/mL制成，收集第13代的细胞培养上清液；
S2、在所述上清液中加入占所述上清液质量的3.5％维生素C，混合均匀后再加入占上清液质量0.5％的氯化钠，室温搅拌混合15min；
S3、将混合后的物料先按15℃/h的速率降温至-25℃,然后在以10℃/h的速率降温至-35℃，最后再以2℃/h的速率降温至-55℃，保持该温度20h，制成冻干粉。
对比例1
一种脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法，具体操作如下：
S1、将脐带间充质原代干细胞接种至培养基中，在低氧条件下进行传代培养，所述培养基是在DMEM/F12培养基中添加L-谷氨酰胺10μg/mL、胰岛素15μg/mL、右旋糖苷12μg/mL、L-抗坏血酸25ng/mL制成，收集第13代的细胞培养上清液；
S2、在所述上清液中加入占所述上清液质量的2.5％维生素C，室温搅拌混合15min；
S3、将混合后的物料先按15℃/h的速率降温至-25℃,然后在以10℃/h的速率降温至-35℃，最后再以2℃/h的速率降温至-55℃，保持该温度20h，制成冻干粉。
对比例2
一种脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法，具体操作如下：
S1、将脐带间充质原代干细胞接种至培养基中，在低氧条件下进行传代培养，所述培养基是在DMEM/F12培养基中添加L-谷氨酰胺10μg/mL、胰岛素15μg/mL、右旋糖苷12μg/mL、L-抗坏血酸25ng/mL制成，收集第13代的细胞培养上清液；
S2、在所述上清液中加入占所述上清液质量的2.5％维生素C，室温搅拌混合15min；
S3、将混合后的物料先按15℃/h的速率降温至-55℃，保持该温度20h，制成冻干粉。
将实施例1以及对比例1-2的冻干粉在4℃条件下保存12个月后，分别检测冻干粉对人皮肤成纤维细胞活力的影响，具体方法参照中国专利CN201610529860.3一种人脐带间充质干细胞提取物冻干粉及制备方法。具体街结果如表1所示：
表1
| OD值 | 活力(％) | SOD(U/mg.prot) | |
| 实施例1 | 0.85 | 83.9％ | 46.2 |
| 对比例1 | 0.55 | 67.4％ | 32.1 |
| 对比例2 | 0.50 | 58.3％ | 28.5 |
从表1中可以看出，利用本发明的处理方法能够显著提高冻干粉的活力。
需要说明的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例，显然本发明不仅仅限于以上实施例，还可以有其他变形。本领域的技术人员从本发明公开内容直接导出或间接引申的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将脐带间充质原代干细胞进行传代培养，收集第12～15代的细胞培养上清液；
S2、在所述上清液中加入维生素C混合均匀后，再加入占上清液质量0.01％～0.5％的钠盐，室温搅拌混合5-20min；
S3、将混合后的物料进行冷冻干燥制成冻干粉。
2.根据权利要求1所述脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤S1是将脐带间充质原代干细胞接种至培养基中，在低氧条件下进行传代培养，所述培养基是在DMEM/F12培养基中添加L-谷氨酰胺5-10μg/mL、胰岛素10-15μg/mL、右旋糖苷7.5-12μg/mL、L-抗坏血酸20-30ng/mL制成。
3.根据权利要求1所述脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤S2中维生素C的加入量占所述上清液质量的1.5～3.5％。
4.根据权利要求1所述脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤S2中钠盐为氯化钠。
5.根据权利要求1所述脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤S3所述冷冻干燥是将物料先按15-20℃/h的速率降温至-20℃～-25℃,然后在以5～10℃/h的速率降温至-30℃～-35℃，最后再以1-3℃/h的速率降温至-50～-60℃，保持该温度10-24h。
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