JPH10304874A - 新規細胞株および本細胞株を用いたスクリーニング法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 正常な成熟動物から軟骨細胞および脂肪細胞
に分化することができる未分化間葉系細胞のクローン化
細胞株を樹立し、細胞の分化調節物質のスクリ−ニング
方法を確立すること。 【解決手段】 正常成熟動物に由来することを特徴とす
る軟骨細胞および脂肪細胞に分化する能力を有する細胞
株、当該細胞株を使用する細胞の分化調節物質のスクリ
ーニング法、当該細胞株を含むスクリーニング用キッ
ト、上記スクリーニング法に得られる細胞の分化調節物
質、並びに上記分化調節物質を含有する医薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、正常成熟動物に由
来することを特徴とする軟骨細胞および脂肪細胞に分化
する能力を有する新規な細胞株、並びに、当該細胞株を
用いる未分化間葉系細胞から軟骨細胞および脂肪細胞へ
の分化を調節する物質などを簡便に探索することを可能
とする新しいｉｎ ｖｉｔｒｏのスクリーニング方法に
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来から軟骨細胞は、軟骨内骨化による
骨格の形成や関節の形成による運動の円滑化など、脊椎
動物が生存する上で重要な機能を果たしていることが知
られている。一方で、軟骨細胞が形成している関節軟骨
の損傷は、変形性関節症などの疾患においてその病態の
進展を促す重要な因子であると考えられている。こうし
た軟骨細胞が生体内で果たす役割の重要性にもかかわら
ず、未分化間葉系細胞から軟骨細胞への分化調節機構は
全く解明されていない。

【０００３】一方、軟骨細胞と同様に未分化間葉系細胞
に起源を有する脂肪細胞は、細胞質内に脂肪滴を蓄積す
ることで生体内のエネルギー供給の調節に重要な働きを
有することが知られている。言うまでもなく脂肪細胞に
おける過剰な脂肪の蓄積は肥満を生じ、多くの成人病に
対する危険因子として捉えられている。脂肪細胞の分化
機構は、プロスタグランジンＪ₂を生理的リガンドとす
る核内受容体であるＰＰＡＲ−γ２や、転写因子である
Ｃ／ＥＢＰ−α等によって調節されることが報告されて
いるが、全容が解明されているとは言えない。ここで、
未分化間葉系細胞とは、一般的に複数の分化能を有する
未分化な間葉系細胞を指すが、中でも特に多分化能を有
する中胚葉由来の細胞を意味する。具体的な例として
は、マウス胎児由来のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２（Cell, 17:7
71-779,1979）や、ラット胎仔由来のＲＣＪ３．１（J.
Cell. Bio., 106:2139-2151、 1988）や、ラット新生仔
由来のＲＯＢ（Calcif. Tissue Int. 49 (3): 221-225,
1991）などが知られている。

【０００４】このような未分化間葉系細胞からの軟骨細
胞および脂肪細胞への分化調節機構の研究に有用と考え
られる、軟骨および脂肪細胞への分化能を有する細胞株
は、胎児（Cell, 17, 771 (1979)）や腫瘍（J. Cell Bi
ol. 130,1461 (1995)）、新生動物（J.Cell Biol. 106,
2139 (1988)）などに由来するものが知られているが、
正常な成熟動物に由来するものは現在のところ知られて
いない。こうした状況において、正常な成熟マウスなど
の正常成熟動物から、軟骨細胞および脂肪細胞に分化す
ることができる未分化間葉系細胞のクローン化細胞株を
樹立することができれば、成熟した個体におけるこれら
の細胞の分化調節機構の研究に極めて有用な研究手段を
提供できると考えられる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的の一つ
は、正常な成熟動物から軟骨細胞および脂肪細胞に分化
することができる未分化間葉系細胞のクローン化細胞株
を樹立することである。本発明の別の目的は、上記の細
胞株を用いることを特徴とする、細胞の分化調節物質
（例えば、軟骨細胞または脂肪細胞への分化を調節する
物質、軟骨組織の破壊を調節する物質または軟骨細胞の
石灰化を調節する物質）をスクリーニングするための方
法を確立することである。

【０００６】本発明のさらに別の目的は、上記の細胞株
を含む、細胞の分化調節物質（例えば、軟骨細胞または
脂肪細胞への分化を調節する物質、軟骨組織の破壊を調
節する物質または軟骨細胞の石灰化を調節する物質）を
スクリーニングするためのキットを提供することであ
る。本発明のさらに別の目的は、上記のような細胞株を
用いるスクリーニング法により得られることのできる、
細胞の分化調節物質（例えば、軟骨細胞または脂肪細胞
への分化を調節する物質、軟骨組織の破壊を調節する物
質または軟骨細胞の石灰化を調節する物質）、並びに上
記の分化調節物質を含有する医薬を提供することであ
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の課題
を解決するために鋭意研究した結果、正常な成熟マウス
の下腿骨よりクローン化細胞株を樹立することに成功し
た。そして、このクローン化細胞株の性状を詳細に解析
した結果、この細胞株は軟骨細胞および脂肪細胞に分化
する能力を有することが明らかになり、本発明を完成す
るに至った。

【０００８】そして、ヒトＴＧＦ−β₁などの軟骨誘導
物質に対するこの細胞株の反応性を検討した結果、この
細胞株を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで簡便に軟骨誘導物質
をスクリーニングすることができることが判明した。同
時に、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃によってこ
の細胞株の石灰化が抑制されることが明らかになり、こ
の細胞株が軟骨の石灰化を抑制する物質をｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで簡便にスクリーニングできることも判明した。

【０００９】また、ヒトＴＧＦ−β₁によってＣＬ−１
細胞が形成する軟骨様組織が炎症性サイトカインである
ＩＬ−１やＴＮＦ−αによって破壊されることも判明
し、この細胞株を用いて、こうした軟骨破壊を抑制する
物質をｉｎ ｖｉｔｒｏで簡便にスクリーニングできる
ことも明らかとなった。さらに、１，２５−ジヒドロキ
シビタミンＤ₃はこの細胞株の脂肪細胞への分化を顕著
に抑制することが判明し、この細胞株を用いてｉｎ ｖ
ｉｔｒｏで簡便に脂肪化抑制物質をスクリーニングする
ことができることが判明した。

【００１０】即ち、本発明の第１の側面によれば、正常
成熟動物に由来することを特徴とする軟骨細胞および脂
肪細胞に分化する能力を有する細胞株が提供される。上
記細胞株の一つの実施態様においては、正常成熟マウス
に由来する細胞株が提供される。

【００１１】上記細胞株の一つの実施態様においては、
未分化間葉系細胞に由来する細胞株が提供される。上記
細胞株の一例としては、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５８
２３を有する細胞株が挙げられる。

【００１２】本発明の第２の側面によれば、上記の本発
明の細胞株を用いることを特徴とする、細胞の分化調節
物質（例えば、軟骨細胞または脂肪細胞への分化を調節
する物質、軟骨組織の破壊を調節する物質または軟骨細
胞の石灰化を調節する物質）をスクリーニングするため
の方法が提供される。上記スクリーニング法の一つの実
施態様においては、スクリーニングされる物質は遺伝子
である。

【００１３】本発明の第３の側面によれば、上記の本発
明の細胞株を含む、細胞の分化調節物質（例えば、軟骨
細胞または脂肪細胞への分化を調節する物質、軟骨組織
の破壊を調節する物質または軟骨細胞の石灰化を調節す
る物質）をスクリーニングするためのキットが提供され
る。

【００１４】本発明の第４の側面によれば、上記した本
発明の細胞株を用いるスクリーニング法により得られる
ことのできる細胞の分化調節物質（例えば、軟骨細胞ま
たは脂肪細胞への分化を調節する物質、軟骨組織の破壊
を調節する物質または軟骨細胞の石灰化を調節する物
質）、並びに上記分化調節物質を含有する医薬が提供さ
れる。本願発明による分化調節物質を含有する医薬の具
体的用途の例としては、変形性関節症治療薬、軟骨を含
む組織の修復剤、リュウマチ治療薬、椎間板ヘルニア治
療薬、抗肥満薬などが挙げられる。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明の細胞株の一つの特徴は、
正常成熟動物に由来することである。本明細書中におい
て「正常成熟」という用語は、胎児由来の細胞、腫瘍細
胞または新生動物由来の細胞などを排除するために用い
られるものであり、広い意味に解釈されるものである。
本明細書中において「動物」という用語は、任意の動物
の意味をし、例えば、哺乳類、ハ虫類、両生類、魚類、
特には哺乳動物をさし、哺乳動物の具体例としては、マ
ウス、ラット、ヒト、サル、ハムスターなどが挙げら
れ、好ましくはマウスである。

【００１６】本発明の細胞株は、上記の動物の多様な部
位、例えば、下腿骨、大腿骨、頭蓋骨、気管、耳介、
鼻、椎間板、心臓などから樹立することができる。より
具体的には、生体試料を切り出し、血清および抗生物質
などを適宜補充した適当な培地中で適当な期間（例え
ば、９〜１５日間）、培養する。その後、クローン性に
増殖してくる細胞集落を単離し、培養を継続する。さら
に細胞が増殖した後、継代を適当な回数（例えば１０〜
１２回）繰り返す。最後に、限界希釈法などのような細
胞のクローニングのために当業者に既知の適当な技術を
用いて細胞のクローニングを行うことにより、クローン
化した細胞株を樹立することができる。

【００１７】本発明の細胞株のもう一つの特徴は、軟骨
細胞および脂肪細胞に分化する能力を有するということ
である。細胞が軟骨細胞に分化したかどうかは、幾つか
の試験により判断することができる。例えば、Ｌ−アス
コルビン酸を含む培地中で培養した細胞をアルシアンブ
ルー（ｐＨ１．０）で染色した場合に染色される結節を
形成するか否かにより、軟骨細胞への分化の有無を判断
することができる。ここで使用されるアルシアンブルー
は銅フタロシアニンの誘導体である色素であり、カルボ
キシル基を有する酸性多糖（ポリアニオン）を染色でき
るので、組織化学において広く酸性ムコ多糖（グリコサ
ミノグリカン）の検出およびシアル酸含有糖タンパク質
の組織内分布の検出に用いられている。あるいは、成熟
動物より分離した初代培養軟骨細胞の軟骨基質とくにプ
ロテオグリカンの合成能を評価する際に汎用されてい
る、³⁵Ｓ標識硫酸を含む培地中で培養した後の³⁵Ｓ標識
硫酸の細胞層への取り込み量（Calcif.Tissue Int.19,
179-187, 1975）を指標に、細胞が軟骨細胞に分化した
かどうかを判断することができる。

【００１８】あるいはまた、細胞におけるＩＩ型コラー
ゲン、Ｘ型コラーゲンおよびアグリカンコア蛋白の発現
の有無により、軟骨細胞への分化の有無を判断すること
ができるし、細胞の結節の内部の超微細構造を、例えば
透過型電子顕微鏡などを用いて詳細に観察することなど
によっても、軟骨細胞への分化の有無を判断することが
できる。

【００１９】一般的には、軟骨細胞への分化の有無の判
断は、上記したような試験を複数組み合わせて行い、そ
の結果を総合的に考慮して判断される。しかしながら、
軟骨細胞への分化の有無を判断するために、上記以外の
試験を行うことも可能であるものと理解されるべきであ
る。例えば、トルイジンブルー染色によって結節の異染
性の観察などである。

【００２０】細胞が脂肪細胞に分化したかどうかも、幾
つかの試験により判断することができる。例えば、オイ
ルレッドＯに染色される細胞質内脂肪滴の蓄積が認めら
れるか否かにより脂肪細胞への分化の有無を判断するこ
とができる。あるいは、ＰＰＡＲ−γ₂の発現の有無に
より、脂肪細胞への分化の有無を判断することができ
る。

【００２１】軟骨細胞への分化の有無の判断と同様に、
脂肪細胞への分化の有無の判断も、上記したような試験
を組み合わせて行い、その結果を総合的に考慮して判断
することができる。しかしながら、脂肪細胞への分化の
有無を判断するためには、上記以外の試験を行うことも
可能であるものと理解されるべきである。例えば、スダ
ンＩＩＩ染色に染色される細胞質内脂肪滴の蓄積の有無
や、ａＰ２およびアジプシンの発現の有無の検討などで
ある。

【００２２】本発明の細胞株の培養条件は、特に限定さ
れず、細胞が死滅せずに生存または増殖できるような任
意の条件下で培養することができる。例えば、培養温度
は、一般的には３３〜３９℃で、好ましくは３７℃であ
る。培養培地は、ウシ胎児血清、好ましくは非働化ウシ
胎児血清（熱処理することにより、補体を不活化したウ
シ胎児血清）を３〜１０％（好ましくは１０％）含むα
−ＭＥＭ培地を用いる。通気は、５％ＣＯ₂を含む空気
とし、湿度は８０〜１２０％（好ましくは１００％）に
保って培養を行う。

【００２３】本細胞株の保存条件も特には限定されない
が、例えば、１０％グリセリンあるいは１０％ジメチル
スルホキシドおよび１０％血清を含む培地中に１０²〜
１０¹⁰、好ましくは１０⁴〜１０⁸、さらに好ましくは１
０⁶個／ｍｌの細胞濃度で浮遊させた状態で、−８０℃
あるいは液体窒素中で凍結保存することができる。好ま
しくは、１０％グリセリンおよび１０％血清を含む培地
中で１０⁶個／ｍｌの細胞濃度で浮遊させた状態で、液
体窒素中で凍結保存する。上記のように保存された細胞
株は、例えば、３７℃の水浴で急速に溶解した後、１０
倍量の１０％血清を含む培地を添加して攪拌し、遠心分
離して回収した細胞を１０％血清を含む培地で培養する
ことにより再び増殖させることができる。

【００２４】本発明の第２の側面によれば、本発明の細
胞株を用いることを特徴とする、細胞の分化調節物質
（例えば、軟骨細胞または脂肪細胞への分化を調節する
物質、軟骨組織の破壊を調節する物質または軟骨細胞の
石灰化を調節する物質）をスクリーニングするための方
法が提供される。本明細書中において、「細胞の分化調
節物質」とは、細胞の分化の調節に関与する任意の物質
を意味し、その例としてはヒト骨髄性白血病細胞株ＨＬ
−６０に対して、それぞれマクロファージまたは顆粒球
に分化させることが知られている１，２５−ジヒドロキ
シビタミンＤ₃や全トランスレチノイン酸などが挙げら
れる。本発明の細胞株においては、軟骨細胞または脂肪
細胞への分化を調節する物質、軟骨組織の破壊を調節す
る物質または軟骨細胞の石灰化を調節する物質などが含
まれる。これらの例としては、軟骨細胞への分化の促進
因子としてのヒトＴＧＦ−β₁およびヒトインシュリン
様増殖因子−Ｉ、脂肪細胞分化の促進物質としてのヒト
インシュリン様増殖因子−Ｉ、脂肪細胞分化の抑制物質
としてのヒトＴＧＦ−β₁および１，２５−ジヒドロキ
シビタミンＤ₃、軟骨組織の破壊を促進する物質として
のＩＬ−１およびＴＮＦ−α、軟骨細胞の石灰化を抑制
する因子としての１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃
がそれぞれ挙げられる。

【００２５】本明細書中において、「軟骨細胞または脂
肪細胞への分化を調節する物質」とは、未分化細胞、例
えば未分化間葉系細胞から、軟骨細胞または脂肪細胞へ
の分化を誘導または抑制する物質を意味する。軟骨細胞
への分化を調節する物質の例としては、軟骨誘導能を有
することが知られているヒトトランスフォーミング成長
因子β₁および軟骨細胞に対する細胞外基質産生促進作
用を有することが知られているヒトインシュリン様増殖
因子−Ｉなどが挙げられる。脂肪細胞への分化を調節す
る物質の例としては、脂肪前駆細胞株３Ｔ３−Ｌ１細胞
に対してその脂肪化を抑制することが知られている１，
２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃および脂肪細胞に対す
る脂肪合成促作用を有することが知られているヒトイン
シュリン様増殖因子−Ｉなどが挙げられる。

【００２６】本明細書中において、「軟骨組織の破壊を
調節する物質」とは、軟骨組織、例えば軟骨形成能を有
する細胞を一定条件下で培養した場合に形成される軟骨
組織に対して、当該組織の破壊を調節する物質、特には
当該組織の破壊を促進または抑制する物質を意味する。
軟骨組織の破壊を促進する物質の具体例としては、炎症
性のサイトカインであるＩＬ−１またはＴＮＦ−αなど
が挙げられる。

【００２７】本明細書中において、「軟骨細胞の石灰化
を調節する物質」とは、軟骨細胞の石灰化を促進または
抑制する物質を意味し、特には石灰化を抑制する物質を
意味する。細胞の石灰化は、例えば、細胞中のＣａ含量
を測定することにより評価することができる。軟骨細胞
の石灰化を抑制する物質の例としては、１，２５−ジヒ
ドロキシビタミンＤ₃などが挙げられる。

【００２８】後記の実施例で実証されるように、本発明
の細胞株は、上記に挙げた物質を用いた場合、軟骨細胞
および脂肪細胞への分化の有無、軟骨組織の破壊の程度
および軟骨細胞の石灰化の程度を評価できる細胞株であ
ると言えることから、本発明の細胞株を用いて、軟骨細
胞または脂肪細胞への分化を調節する物質、軟骨組織の
破壊を調節する物質または軟骨細胞の石灰化を調節する
物質をスクリーニングすることができることは明らかで
ある。

【００２９】また、スクリーニングされる物質の対象と
しては、それ自体で分化調節能力を有する生理活性物質
のみならず、分化調節に何らかの形式で関与する遺伝子
も含まれる。例えば、本明細書中上記した通り、本発明
の細胞株は軟骨細胞への分化に伴って、ＩＩ型コラーゲ
ン、Ｘ型コラーゲンおよびアグリカンコア蛋白のｍＲＮ
Ａを発現しており、これらのｍＲＮＡは、以下の実施例
に記載されているＲＴ−ＰＣＲ法や公知のＴＭＡ法（Tr
anscription Mediated Amplification, 特表平４−５０
０７５９号）などのようなｍＲＮＡの検出のために当業
者に慣用される技術により検出することができる。ＲＴ
−ＰＣＲ法を使用する場合には、軟骨細胞への分化に関
与することが推定される遺伝子の配列に特異的なＰＣＲ
用プライマーを設計し、このプライマーを用いてＲＴ−
ＰＣＲ法を実施することにより、軟骨細胞への分化に関
与する遺伝子を単離することが可能である。

【００３０】これら遺伝子の単離には、他にも発現クロ
ーニング法などを用いることもできる。例えば、本発明
の細胞から抽出したｍＲＮＡから２本鎖ｃＤＮＡライブ
ラリーを作成し、これらのｃＤＮＡを適当なベクターに
組み込み、適当な動物細胞に遺伝子導入し、ｃＤＮＡを
発現させる。これらの細胞を軟骨細胞分化の適当な指
標、例えばアルシアンブルー染色性などでスクリーニン
グすることにより、軟骨細胞の分化に関わる遺伝子を単
離することができる。また、軟骨細胞の分化との関連の
有無にかかわらず、既知の遺伝子の塩基配列をもとにＰ
ＣＲ法を用いて遺伝子を単離することもできる。例え
ば、既知の遺伝子と類似の遺伝子の塩基配列から、適当
なプライマーを設計し、本発明の細胞から抽出したｍＲ
ＮＡから作成したｃＤＮＡライブラリーを用いて適当な
条件下でＰＣＲを行うことで既知の遺伝子と類似性の塩
基配列を有する遺伝子を増幅、単離することができる。

【００３１】同様に、本発明の細胞株は脂肪細胞への分
化に関与することが知られているＰＰＡＲ−γ₂のｍＲ
ＮＡを発現しており、このｍＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲ法や
公知のＴＭＡ法などのようなｍＲＮＡの検出のために当
業者に慣用される技術により検出することができる。Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ法を使用する場合には、脂肪細胞への分化に
関与することが推定される遺伝子の配列に特異的なＰＣ
Ｒ用プライマーを設計し、このプライマーを用いてＲＴ
−ＰＣＲ法を実施することにより、脂肪細胞への分化に
関与する遺伝子を単離することが可能である。

【００３２】これら遺伝子の単離には、他にも発現クロ
ーニング法などを用いることもできる。例えば、本発明
の細胞から抽出したｍＲＮＡから２本鎖ｃＤＮＡライブ
ラリーを作成し、これらのｃＤＮＡを適当なベクターに
組み込み、適当な動物細胞に遺伝子導入し、ｃＤＮＡを
発現させる。これらの細胞を脂肪細胞分化の適当な指
標、例えば細胞内脂肪滴の蓄積などでスクリーニングす
ることにより、脂肪細胞の分化に関わる遺伝子を単離す
ることができる。また、脂肪細胞の分化との関連の有無
にかかわらず、既知の遺伝子の塩基配列をもとにＰＣＲ
法を用いて遺伝子を単離することもできる。例えば、既
知の遺伝子と類似の遺伝子の塩基配列から、適当なプラ
イマーを設計し、本発明の細胞から抽出したｍＲＮＡか
ら作成したｃＤＮＡライブラリーを用いて適当な条件下
でＰＣＲを行うことで既知の遺伝子と類似性の塩基配列
を有する遺伝子を増幅、単離することができる。

【００３３】さらに本発明によれば、本発明の細胞株を
含む、軟骨細胞または脂肪細胞への分化を調節する物
質、軟骨組織の破壊を調節する物質または軟骨細胞の石
灰化を調節する物質をスクリーニングするためのキット
が提供される。本キット中において、本発明の細胞株
は、好ましくは、容易に培養増殖可能な状態に回復でき
るような形態で保持されている。例えば、１０％グリセ
リンおよび１０％血清を含む培地中で凍結保存した状態
や、培養用のフラスコで培養してある状態などである。

【００３４】本キットには通常、本発明の細胞株に加え
て、スクリーニングの目的とされる物質の作用によって
生じるであろう当該細胞株の性質の変化を検出するため
の試薬、および場合によっては、細胞株の培養の際に培
地に添加すべき特定の試薬などが含まれる。

【００３５】例えば、軟骨誘導物質をスクリーニングす
るためのキットまたは軟骨破壊抑制物質をスクリーニン
グするためのキットの場合には、検出試薬としてはアル
シアンブルー（ｐＨ１．０）、³Ｈ標識グルコサミンあ
るいは³⁵Ｓ標識硫酸などを使用することができる。ま
た、脂肪細胞分化調節物質をスクリーニングするための
キットの場合には、検出試薬としてはオイルレッドＯ、
スダンＩＩＩ、トリグリセリド定量のための試薬などを
使用することができる。

【００３６】さらにまた、本発明によれば、本発明の細
胞株を用いるスクリーニング法により得られることがで
きる細胞の分化調節物質（例えば、軟骨細胞または脂肪
細胞への分化を調節する物質、軟骨組織の破壊を調節す
る物質または軟骨細胞の石灰化を調節する物質）が提供
される。これらの物質の種類は特には限定されず、本発
明のスクリーニング法においてスクリーニングされた任
意の物質（遺伝子などを含む）が含まれる。これらの物
質の中には、関節や耳、鼻の軟骨の修復、再建や、関節
軟骨の石灰化抑制による関節機能の維持や、関節の炎症
における関節軟骨破壊の抑制、あるいは肥満の治療など
の分野において有用な治療薬剤として使用できるものが
含まれる。

【００３７】

【実施例】本発明を以下の実施例によって例示的に説明
するが、本発明は実施例によって限定されるものではな
い。実施例１：クローン化細胞株の樹立 正常成熟マウス下腿骨由来細胞株は、５週齢のＣ５７Ｂ
Ｌ／６マウスの下腿骨近位端から樹立された。すなわ
ち、マウス下腿骨を無菌的に摘出後近位端を切り出し、
６穴プレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）中で１０％非働化
血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１０
０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したαＭＥＭ培
地（ＧＩＢＣＯ社製）で９日間培養した。培地交換後さ
らに４日間培養した。

【００３８】その後、クローン性に増殖している細胞集
落を０．０５％トリプシン＋０．０２％ＥＤＴＡ（Ｓｉ
ｇｍａ社製）に浸した濾紙片で単離し、濾紙片ごと２４
穴プレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）で培養した。培地交
換は３日ごとに行った。濾紙片の培養開始から７日目に
細胞がコンフルエントに達したのを確認後、Ｃａ−Ｍｇ
を含まないＰＢＳと０．０５％トリプシン＋０．０２％
ＥＤＴＡを用いて細胞を剥離し、６０ｍｍ皿（ＣＯＲＮ
ＩＮＧ社製）に継代した。３日ごとに培地を交換し、継
代後６日で４倍の希釈倍率で細胞を継代した。以後同様
にして１６回まで細胞を継代し、１６回目の細胞を限界
希釈法を用いて細胞のクローニングを行い、クローン化
細胞株であるＣＬ−１細胞を樹立した。上記で得られた
ＣＬ−１細胞は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３
号の工業技術院生命工学工業研究所に、１９９７年２月
１８日に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２３の下、寄託
された。

【００３９】実施例２：ＣＬ−１細胞の特性 前記の如くして樹立されたＣＬ−１細胞について、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでの結節形成能を検索すると共に、ＲＴ−
ＰＣＲ法を用いてＩＩ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン、
アグリカンコア蛋白およびＰＰＡＲ−γ₂のｍＲＮＡ発
現の有無の検討を行い、また透過型電子顕微鏡を用いた
超微細構造の観察を行った。ＣＬ−１細胞を５０μｇ／
ｍｌのＬ−アスコルビン酸（和光純薬社製）を添加した
培地で１カ月間培養した。その後、４％パラホルムアル
デヒド（ｐＨ７．４）で固定し、０．１Ｎ塩酸で洗浄
後、１％アルシアンブルー（EM Science社製）溶液（ｐ
Ｈ１．０）で１時間染色し、０．１Ｎ塩酸で分別後、光
学顕微鏡下で観察した。その結果、アルシアンブルー
（ｐＨ１．０）に染色される結節が形成された（図１を
参照）。

【００４０】また、培地に１０ｍＭのβグリセロリン酸
を添加してＣＬ−１細胞を同様に培養した。その後、４
％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）で固定し、蒸留
水で洗浄後、１％アリザリンレッドＳ（Merck社製）溶
液で５分間染色し、水洗後、肉眼的および光学顕微鏡的
に観察した。その結果、結節はアリザリンレッドＳに陽
性を示すようになった（図２を参照）。また、結節を形
成しない部位では、オイルレッドＯ（プロピレングリコ
ール中の濃度０．５％）に染色される細胞質内脂肪滴の
蓄積が認められた（図１を参照）。

【００４１】また、ＣＬ−１細胞の結節形成の過程にお
けるＩＩ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲンおよびアグリカ
ンコア蛋白のｍＲＮＡ発現を、ＲＮＡ ＰＣＲキット
（宝酒造社製）およびこれらに特異的な塩基配列を有す
るプライマー（図６および配列表を参照）を用いてＲＴ
−ＰＣＲ法で解析した。なお、図６中のＩＩ型コラーゲ
ンの検出用のプライマーの配列は配列番号１および２
に；図６中のＸ型コラーゲンの検出用のプライマーの配
列は配列番号３および４に；図６中のアグリカンコア蛋
白の検出用のプライマーの配列は配列番号５および６に
それぞれ記載されている。ＲＴ−ＰＣＲは、ＣＬ−１か
ら抽出した総ＲＮＡをＤＮＡｓｅＩ（宝酒造社製）処理
後、キットの説明書に従って試薬を添加し、逆転写反応
を行い、それに引き続いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、
９４℃での１分間の処理を１回行い、９４℃で１分間、
５７℃で２分間そして７２℃で３分間のサイクルを４０
回行い、最後に７２℃で７分間の処理を１回行い、４℃
に冷却する条件で行った。その結果、上記全てのｍＲＮ
Ａについてその発現が認められた（図３から図５を参
照）。一方、ＰＰＡＲ−γ₂のｍＲＮＡの発現も同様に
プライマー（図６および配列表を参照）を用いてＲＴ−
ＰＣＲ法で解析した。図６中のＰＰＡＲ−γ₂の検出用
のプライマーの配列は配列番号７および８に記載されて
いる。その結果、ＰＰＡＲ−γ₂の発現も認められた
（図７を参照）。

【００４２】さらに、ＣＬ−１細胞の結節を透過型電子
顕微鏡を用いて結節内部の超微細構造を観察したとこ
ろ、軟骨細胞に類似した細胞形態と細胞間基質の構造が
認められた（図８を参照）。これらの結果から、ＣＬ−
１細胞は軟骨および脂肪細胞への分化能を有する間葉系
細胞であることが明らかとなった。

【００４３】さらに、ＣＬ−１細胞をβグリセロリン酸
存在下で１カ月間培養すると、ＣＬ−１細胞によって形
成された結節がアリザリンレッドＳに陽性であることに
より、ＣＬ−１細胞より生じた軟骨様細胞は、軟骨の最
終分化段階である石灰化軟骨にまで分化できることも判
明した。

【００４４】実施例３：ＣＬ−１細胞を用いたｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでの軟骨誘導能の評価 ＣＬ−１細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏの軟骨誘導物質のスク
リーニング系として利用できるかどうかを検討するため
に、軟骨誘導能が知られているｈＴＧＦ−β₁（J.Biol.
Chem. 261, 5693 (1986)）に関して、ＣＬ−１細胞のア
ルシアンブルー（ｐＨ１．０）に対する染色性への作用
を検討した。すなわち、ＣＬ−１細胞を２５００細胞／
ｃｍ²の細胞密度で２４穴プレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社
製）で培養し、コンフルエントに達した時点でヒトトラ
ンスフォーミング成長因子−β₁（ｈＴＧＦ−β₁；ＡＵ
ＳＴＲＡＬ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）を０．１、
１．０、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、２ないし３日
ごとに培地交換して、添加開始後３週間培養した。ｈＴ
ＧＦ−β₁の添加は、培地交換ごとに実施した。培養終
了後、細胞を４％パラホルムアルデヒド（和光純薬社
製）で固定し、水洗後０．１Ｎ塩酸（和光純薬社製）で
３分処理後、アルシアンブルー（ｐＨ１．０）溶液（濃
度：１％）で一晩染色した。染色終了後、サンプルを蒸
留水で３回洗浄し、風乾した。乾燥したサンプルを３０
０μｌの６Ｍグアニジン塩酸溶液（和光純薬社製）に３
時間浸漬し、撹拌後グアニジン塩酸溶液の６２０ｎｍに
おける吸光度を測定した。その結果、ｈＴＧＦ−β₁の
用量依存的にアルシアンブルー（ｐＨ１．０）に対する
染色性は増加した（図９を参照）。

【００４５】軟骨細胞に対する細胞外基質産生促進作用
が知られている（Ann. Rev. Physiol. 47, 443 (198
5)）ヒトインシュリン様増殖因子−Ｉ（ｈＩＧＦ−Ｉ；
ＣＨＥＭＩＣＯＮ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ社製）
についても同様の検討を行ったところ、１００ｎｇ／ｍ
ｌでアルシアンブルー（ｐＨ１．０）に対する染色性の
増加が認められた（図１０を参照）。また、ＣＬ−１細
胞がコンフルエントに達した後にｈＴＧＦ−β₁（図１
１を参照）あるいはｈＩＧＦ−Ｉ（図１２を参照）を５
ないし７日間連日添加した場合にも同様の結果が得られ
た。形態学的にもｈＴＧＦ−β₁およびｈＩＧＦ−Ｉの
存在下で培養した場合、培地のみで培養した場合と比較
して、アルシアンブルー（ｐＨ１．０）陽性の結節は明
らかに増加していた（図１３を参照）。

【００４６】また、インシュリン存在下で軟骨細胞に分
化することが知られているＡＴＤＣ−５細胞（Cell Dif
f. Dev. 30, 109 (1990)；理化学研究所細胞銀行から入
手可能）についても、１０μｇ／ｍｌのインシュリンお
よび０．１ないし１０ｎｇ／ｍｌのｈＴＧＦ−β₁の存
在下で同様の方法でコンフルエント後７日間培養して、
アルシアンブルー（ｐＨ１．０）に対する染色性を検討
した。その結果、ｈＴＧＦ−β₁処理によって、ＡＴＤ
Ｃ−５細胞ではアルシアンブルー（ｐＨ１．０）に対す
る染色性は用量依存的に低下した（図１４を参照）。こ
れらの結果から、ＣＬ−１細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで軟
骨形成を評価できる有用な細胞株であることが明らかに
なった。

【００４７】実施例４：ＣＬ−１細胞を用いたｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでの軟骨破壊評価系の構築 ＣＬ−１細胞にｈＴＧＦ−β₁の存在下で培養すること
で形成される軟骨様結節が、炎症性のサイトカインであ
るＩＬ−１やＴＮＦ−αによって破壊されるかどうかを
検討した。ＣＬ−１細胞を２５００細胞／ｃｍ²の細胞
密度で２４穴プレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）で培養
し、コンフルエントに達した時点でｈＴＧＦ−β
₁（１．０ｎｇ／ｍｌ）の最終濃度になるよう連日５日
間培地に添加した。その後、マウスインターロイキン１
α（ｍＩＬ−１α；Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社製）および
マウス腫瘍壊死因子−α（ｍＴＮＦ−α；Ｒ＆Ｄｓｙｓ
ｔｅｍｓ社製）を最終濃度０．１、１．０、１０ｎｇ／
ｍｌとなるよう培地に連日５日間添加し培養した。その
後に、上記と同様の方法でＣＬ−１細胞のアルシアンブ
ルー（ｐＨ１．０）に対する染色性を測定した。その結
果、ｍＩＬ−１αは０．１ｎｇ／ｍｌ以上（図１５を参
照）、ｍＴＮＦ−αは１．０ｎｇ／ｍｌ以上（図１６を
参照）でアルシアンブルー（ｐＨ１．０）に対する染色
性が低下した。また、ｈＴＧＦ−β₁の添加とｍＩＬ−
１α（図１７を参照）あるいはｍＴＮＦ−α（図１８を
参照）を同時に添加しても同様の成績が得られた。

【００４８】これらの結果から、ＣＬ−１細胞は炎症性
サイトカインによる軟骨組織の破壊をｉｎ ｖｉｔｒｏ
で評価できる細胞株であることが明らかになった。ま
た、このことから、本実験系を利用して軟骨破壊抑制物
質の探索も可能であることが示された。

【００４９】実施例５：ＣＬ−１細胞を用いたｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでの脂肪細胞分化調節物質のスクリーニング 脂肪前駆細胞株３Ｔ３−Ｌ１細胞に対してその脂肪化を
抑制することが知られている１，２５−ジヒドロキシビ
タミンＤ₃（Comp. Biochem. Physiol. 96A, (1990)）の
ＣＬ−１細胞の脂肪細胞への分化への影響を検討した。
ＣＬ−１細胞を２５００細胞／ｃｍ²の細胞密度で４穴
チャンバースライド（Ｎｕｎｃ社製）で培養し、コンフ
ルエントに達した時点で１，２５−ジヒドロキシビタミ
ンＤ₃を最終濃度１０^-7Ｍになるように培地交換ごとに
添加した。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃添加開
始後３週間でオイルレッドＯ陽性細胞内脂肪滴の蓄積を
顕微鏡下で観察した。その結果、１，２５−ジヒドロキ
シビタミンＤ₃はオイルレッドＯ陽性の細胞質内脂肪滴
の蓄積を顕著に抑制していた（図１９を参照）。

【００５０】一方、脂肪細胞に対して脂肪合成促進作用
が知られているｈＩＧＦ−Ｉ（Ann.Rev. Physiol. 47,
443 (1985)）についても同様の検討を行ったところ、Ｃ
Ｌ−１細胞のオイルレッドＯ陽性脂肪滴の蓄積は培地の
みのものに比較して促進されていた（図１３ｃを参
照）。これらのことから、ＣＬ−１細胞は未分化な間葉
系細胞から脂肪細胞への分化を抑制あるいは促進する物
質のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価系として有用であることが明
らかになった。

【００５１】実施例６：ＣＬ−１細胞を用いた軟骨石灰
化抑制物質のスクリーニング １，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃は軟骨の石灰化過
程において抑制的に働くことが知られているが（Proc.
Natl. Acad. Sci. 87, 6522 (1990)）、そのＣＬ−１細
胞の石灰化に対する作用を検討した。ＣＬ−１細胞を２
０００細胞／ｃｍ²の細胞密度で６０ｍｍ皿（ＣＯＲＮ
ＩＮＧ社製）で培養した。コンフルエントに達した時点
で１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃を最終濃度１０
^-9、１０^-8および１０^-7Ｍになるように添加し、コンフ
ルエント後４週間まで毎週サンプリングして経時的にＣ
ａ含量を測定した。すなわち、細胞層をＣａ−Ｍｇを含
まないＰＢＳにて３回洗浄後セルスクレイパー（Ｎｕｎ
ｃ社製）でるつぼに回収後、６０度の孵卵器中で乾燥
後、オーブンで８００℃で一晩燃焼し、残った灰を６Ｎ
塩酸（和光純薬社製）５００μｌに溶解した。この溶液
中のＣａ量を０−ＣＰＣ法（Ｃａテストワコー、和光純
薬）にて定量し、皿あたりのＣａ沈着量を算出した。そ
の結果、コンフルエント後２週間以降で１，２５−ジヒ
ドロキシビタミンＤ₃は溶媒対照群に対して有意なＣａ
沈着量の抑制が認められた（図２０を参照）。この結果
から、ＣＬ−１細胞が軟骨の石灰化を抑制する物質をｉ
ｎ ｖｉｔｒｏで評価できる細胞株であることが明らか
になった。

【００５２】実施例７：ＣＬ−１細胞を用いたｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでの軟骨への分化促進活性の評価 実施例３では、アルシアンブルーに対する染色性を指標
にして軟骨誘導能を評価したが、この実施例では³⁵Ｓ標
識硫酸の取り込み量を指標にして軟骨への分化促進活性
を評価した。ＣＬ−１細胞を２０００個／ウエルの細胞
数でポリスチレン製９６ウエルプレート（Wallac社製）
にまき、１０％非働化血清（Intergen社製）および１０
０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプ
トマイシンを含むα−ＭＥＭ（GIBCO社製）で３７℃、
５％ＣＯ₂のインキュベーター内で培養し、コンフルエ
ントに達するまで週３回新鮮培地に交換した。コンフル
エントを顕微鏡下で確認後、ヒトＴＧＦ−β₁（AUSTRAL
BIOLOGICALS社製）を０．１、１．０、１０ｎｇ／ｍｌ
含む新鮮培地に交換し、培養を続けた。その２４時間
後、³⁵Ｓ標識硫酸（Amersham社製）を０．５μＣｉ／ウ
エル添加し、さらに２４時間培養した。その後、５％パ
ラホルムアルデヒド（和光純薬社製）および０．４％セ
チルピリジニウムクロリド（和光純薬社製）を含む０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２００μｌと交換し、
室温で２時間固定した。同液で１回ＣＬ−１細胞層を洗
浄後、液体シンチレータ（Optiphase supermix, Wallac
社製）１００μｌを各ウエルに添加後攪拌し、ＣＬ−１
細胞層が取り込んだ³⁵Ｓ標識硫酸の放射活性を、液体シ
ンチレータ（Microbeta 1450, Wallac社製）で測定し
た。その結果、ヒトＴＧＦ−β₁は０．１ｎｇ／ｍｌ以
上で培地のみの対照と比較して統計学的に有意に³⁵Ｓ標
識硫酸の取り込み量を増大させた。

【００５３】ＴＧＦ−β₁について得られた結果を図２
１に示す。図２１から分かるように、³⁵Ｓ標識硫酸の取
り込み量は、ＴＧＦ−β₁の添加により約２倍まで増加
した。なお、この³⁵Ｓ標識硫酸の取り込み量を指標とし
たこのスクリーニング法は、コンフルエント到達後２日
間で結果が得られるという点で、 アルシアンブルーに
対する染色性を指標にする方法よりも時間と労力を低減
できる。また、コンフルエント到達後に添加した物質の
軟骨細胞への分化促進作用を、２日間で評価できる系は
これまで報告されていないため、ＣＬ−１細胞を使用す
るスクリーニング法はこれまでにない有用性を提供する
ことになる。

【００５４】

【発明の効果】本発明の細胞株は、正常成熟動物に由来
した、軟骨細胞および脂肪細胞に分化することができる
新規な細胞株である。そして、本発明の細胞株を利用す
ることにより、細胞の分化調節物質、例えば、軟骨細胞
および脂肪細胞の分化を調節する物質、軟骨組織の破壊
を抑制する物質、または軟骨細胞の石灰化を調節する物
質などをスクリーニングすることができる。さらにま
た、本発明の細胞株を用いたスクリーニング法により得
られる物質は、その特性を利用して、例えば、関節や
耳、鼻の軟骨の修復・再建や、関節軟骨の石灰化抑制に
よる関節機能の維持や、関節の炎症における関節軟骨破
壊の抑制、あるいは肥満の治療などの分野において有用
な治療薬剤などとして利用しうるものである。

【００５５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．１９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ACACAATCCA TTGCGAACC 19

【００５６】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．２０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AGATAGTTCC TGTCTCCGCC 20

【００５７】配列番号：３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．２１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CAGCTGGCAT AGCAACTAAG G 21

【００５８】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．２０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GTGGTTAGCA CTGACAAGCG 20

【００５９】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．２０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TGTTCAGTGG AACAGCAACC 20

【００６０】配列番号：６ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．２２ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AGATTGTTCA CTGACGTCCA CC 22

【００６１】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．２０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CTGATGCACT GCCTATGAGC 20

【００６２】配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．２０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CATGAGGCCT GTTGTAGAGC 20

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＣＬ−１細胞を４週間培養したときの
アルシアンブルー（ｐＨ１．０）とオイルレッドＯの２
重染色標本を示す写真である。

【図２】図２は、ＣＬ−１細胞をβグリセロリン酸で４
週間培養したときのアリザリンレッドＳ染色標本を示す
写真である。図２中、ａは培地のみでコンフルエント後
３週間培養したＣＬ−１細胞を示し、ｂは１０ｍＭのβ
グリセロリン酸存在下でコンフルエント後３週間培養し
たＣＬ−１細胞を示す。

【図３】図３は、ＩＩ型コラーゲン特異的プライマーを
用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。図３中、
レーンａはサブコンフルエント培養から抽出した全ＲＮ
Ａ；レーンｂはコンフルエント後１週間培養から抽出し
た全ＲＮＡ；レーンｃはコンフルエント後２週間培養か
ら抽出した全ＲＮＡ；およびレーンｄはコンフルエント
後４週間培養から抽出した全ＲＮＡを示す。

【図４】図４は、Ｘ型コラーゲン特異的プライマーを用
いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。図４中、レ
ーンａはサブコンフルエント培養から抽出した全ＲＮ
Ａ；レーンｂはコンフルエント後１週間培養から抽出し
た全ＲＮＡ；レーンｃはコンフルエント後２週間培養か
ら抽出した全ＲＮＡ；およびレーンｄはコンフルエント
後４週間培養から抽出した全ＲＮＡを示す。

【図５】図５は、アグリカンコア蛋白特異的プライマー
を用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。図５
中、レーンａはサブコンフルエント培養から抽出した全
ＲＮＡ；レーンｂはコンフルエント後１週間培養から抽
出した全ＲＮＡ；レーンｃはコンフルエント後２週間培
養から抽出した全ＲＮＡ；およびレーンｄはコンフルエ
ント後４週間培養から抽出した全ＲＮＡを示す。

【図６】図６は、ＲＴ−ＰＣＲに用いた特異的プライマ
ーの塩基配列を示す。

【図７】図７は、ＰＰＡＲ−γ２特異的プライマーを用
いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。図７中、レ
ーンａはサブコンフルエント培養から抽出した全ＲＮ
Ａ；レーンｂはコンフルエント後１週間培養から抽出し
た全ＲＮＡ；レーンｃはコンフルエント後２週間培養か
ら抽出した全ＲＮＡ；およびレーンｄはコンフルエント
後４週間培養から抽出した全ＲＮＡを示す。

【図８】図８は、ＣＬ−１細胞により形成された結節内
部のＣＬ−１細胞の透過型電子顕微鏡像（拡大倍率４０
００倍）を示す写真である。

【図９】図９は、ｈＴＧＦ−β₁によるＣＬ−１細胞の
アルシアンブルー（ｐＨ１．０）に対する染色性の変化
を示すグラフである。

【図１０】図１０は、ｈＩＧＦ−ＩによるＣＬ−１細胞
のアルシアンブルー（ｐＨ１．０）に対する染色性の変
化を示すグラフである。

【図１１】図１１は、ｈＴＧＦ−β₁の連日添加による
ＣＬ−１細胞のアルシアンブルー（ｐＨ１．０）に対す
る染色性の変化を示すグラフである。

【図１２】図１２は、ｈＩＧＦ−Ｉの連日添加によるＣ
Ｌ−１細胞のアルシアンブルー（ｐＨ１．０）に対する
染色性の変化を示すグラフである。

【図１３】図１３は、ｈＴＧＦ−β₁またはｈＩＧＦ−
ＩによるＣＬ−１細胞のアルシアンブルー陽性結節形成
の変化を示す写真である。図１３中、ａは培地のみでコ
ンフルエント後３週間培養したＣＬ−１細胞を示し、ｂ
はｈＴＧＦ−β₁（１．０ｎｇ／ｍｌ）でコンフルエン
ト後３週間培養したＣＬ−１細胞を示し、ｃはｈＩＧＦ
−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ）でコンフルエント後３週間培
養したＣＬ−１細胞を示す。

【図１４】図１４は、ｈＴＧＦ−β₁連日添加によるＡ
ＴＤＣ−５細胞層のアルシアンブルー（ｐＨ１．０）に
対する染色性の変化を示すグラフである。

【図１５】図１５は、ｈＴＧＦ−β₁によって増加した
ＣＬ−１細胞層のアルシアンブルー（ｐＨ１．０）に対
する染色性のｍＩＬ−１αによる変化を示すグラフであ
る。

【図１６】図１６は、ｈＴＧＦ−β₁によって増加した
ＣＬ−１細胞層のアルシアンブルー（ｐＨ１．０）に対
する染色性のｍＴＮＦ−αによる変化を示すグラフであ
る。

【図１７】図１７は、ｈＴＧＦ−β₁とｍＩＬ−１αを
同時に添加したときのＣＬ−１細胞層のアルシアンブル
ー（ｐＨ１．０）に対する染色性の変化を示すグラフで
ある。

【図１８】図１８は、ｈＴＧＦ−β₁とｍＴＮＦ−αを
同時に添加したときのＣＬ−１細胞層のアルシアンブル
ー（ｐＨ１．０）に対する染色性の変化を示すグラフで
ある。

【図１９】図１９は、１，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ₃によるＣＬ−１細胞の脂肪細胞への分化抑制を示す
写真である。図１９中、ａは培地のみでコンフルエント
後３週間培養したＣＬ−１細胞を示し、ｂは１，２５−
ジヒドロキシビタミンＤ₃（１０^-7Ｍ）存在下でコンフ
ルエント後３週間培養したＣＬ−１細胞を示す。

【図２０】図２０は、１，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ₃によるＣＬ−１細胞層へのＣａ沈着量の変化を示す
グラフである。

【図２１】図２１は、ＴＧＦ−β₁添加による、ＣＬ−
１細胞の³⁵Ｓ標識硫酸の取り込み量の変化を示すグラフ
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 正常成熟動物に由来することを特徴とす
   る軟骨細胞および脂肪細胞に分化する能力を有する細胞
   株。
2. 【請求項２】 正常成熟動物が正常成熟マウスである、
   請求項１に記載の細胞株。
3. 【請求項３】 未分化間葉系細胞に由来する、請求項１
   または２に記載の細胞株。
4. 【請求項４】 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２３を有
   する請求項１から３の何れかに記載の細胞株。
5. 【請求項５】 請求項１から４の何れかに記載の細胞株
   を用いることを特徴とする、細胞の分化調節物質をスク
   リーニングするための方法。
6. 【請求項６】 細胞の分化調節物質が、軟骨細胞または
   脂肪細胞への分化を調節する物質、軟骨組織の破壊を調
   節する物質または軟骨細胞の石灰化を調節する物質であ
   る、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 スクリーニングされる物質が遺伝子であ
   ることを特徴とする、請求項５または６に記載のスクリ
   ーニング方法。
8. 【請求項８】 請求項１から４の何れか１項に記載の細
   胞株を含む、細胞の分化調節物質をスクリーニングする
   ためのキット。
9. 【請求項９】 細胞の分化調節物質が、軟骨細胞または
   脂肪細胞への分化を調節する物質、軟骨組織の破壊を調
   節する物質または軟骨細胞の石灰化を調節する物質であ
   る、請求項８に記載のキット。
10. 【請求項１０】 請求項１から４の何れかに記載の細胞
    株を用いるスクリーニング法により得られることのでき
    る細胞の分化調節物質。
11. 【請求項１１】 軟骨細胞または脂肪細胞への分化を調
    節する物質、軟骨組織の破壊を調節する物質または軟骨
    細胞の石灰化を調節する物質である、請求項１０に記載
    の細胞の分化調節物質。
12. 【請求項１２】 請求項１０または１１に記載の分化調
    節物質を含有する医薬。
13. 【請求項１３】 変形性関節症治療薬、軟骨を含む組織
    の修復剤、リュウマチ治療薬、椎間板ヘルニア治療薬お
    よび抗肥満薬から成る群から選択されることを特徴とす
    る、請求項１２に記載の医薬。