WO2005123905A1 - 生体力学的刺激負荷による細胞培養方法及びその装置 - Google Patents

生体力学的刺激負荷による細胞培養方法及びその装置 Download PDF

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Ken Nakata
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/50—Means for positioning or orientating the apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
    • C12M41/14—Incubators; Climatic chambers

Definitions

  • the present invention provides a method for in vitro culturing of cultured cells, cultured tissues or cultured cells by applying a stimulus similar to a vertical load applied stimulus or a lateral shear stress stimulus generated in a tissue in a living body on the ground.
  • the present invention relates to a cell culture method by biomechanical stimulus loading for repeatedly applying biomechanical stimuli to a structure containing the same (in this specification, these are collectively referred to as a “culture body”) and an apparatus therefor.
  • Tissues and cells in a living body are subjected to mechanical stimulation by gravity, contraction force of muscles, and external force, which can be overcome only by biochemical stimulation, and cultured cells and cultured tissues are static or dynamic. It is known that functions such as proliferation, differentiation and metabolism are changed by receiving a mechanical stimulus.
  • a culture system by stress stimulation a method of culturing chondrocytes or vascular smooth muscle cells by expanding or contracting or vibrating a membrane member to which cells are attached, or a method of culturing chondrocytes held on a support in a column.
  • a culture system using hydrostatic pressure stimulation there is a method of loading chondrocytes with a gas cylinder type pressure load, and a pressure of 5 MPa corresponding to the intra-articular pressure is applied to a column by a hydraulic cylinder type pump. A method is used to stimulate the chondrocytes.
  • a cell culture device in which a culture medium is sent to a column (device in the column) by a pump and a flow rate of the culture medium is changed by operating a valve or the like so that a pressure load pattern or cycle can be arbitrarily created. It has been proposed.
  • a state close to the inside of a living body can be reproduced through a culture solution, such as a change in pressure level or pressure exerted on cells in the living body, a pattern of pressure rise and fall, and the like. It is a stimulus to the cultured cells through the elongation of the cultured cells, the flow of the culture solution, and the culture solution, and the vertical biomechanical stimulation due to the gravity exerted on the supporting tissues such as bone and cartilage. It was something that was reproducible.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-265164
  • the above-described conventional technique reproduces a vertical load-load stimulus caused by gravity on cultured cells and a force exerted on cells in a state surrounded by a matrix that is an extracellular tissue. Not something.
  • the present invention relates to a structure containing cultured cells, cultured tissue, or cultured cells in vitro by stimulating the same stimuli as vertical load-bearing stimuli or lateral shear stress stimuli generated in the body in vivo on the ground. It is an object of the present invention to provide a cell culture method by biomechanical stimulus load for repeatedly applying biomechanical stimulus to a subject and a device therefor.
  • the cell culture method using biomechanical stimulus loading comprises the steps of: providing a biomechanical stimulus to a culture in a culture vessel installed in a carbon dioxide incubator; Wherein the weight of the load-applying piston is applied to the culture in the culture vessel at a predetermined cycle to apply a vertical load-loading stimulus to the culture in the culture vessel. It is characterized by.
  • the culture container on which the culture is placed is moved or vibrated in a horizontal plane, so that the lateral shearing is performed.
  • a stress stimulus can be applied.
  • the biomechanical stimulus loading device for carrying out the cell culture method using the biomechanical stimulus load of the present invention includes a mechanical stimulus loading device and a culture vessel installed in a carbon dioxide incubator, A biomechanical stimulus load device comprising a load computer, wherein the mechanical stimulus load device supports the load-loading piston and the load-loading piston so as to be vertically movable within a predetermined range.
  • an additional load weight can be attached to the upper end of the load-loading piston.
  • a pressure body having a shape corresponding to the culture body can be mounted on the lower end of the load-applying piston.
  • a plurality of load-loading pistons can be supported on the piston vertical movement stage.
  • the load-loading piston can be supported via a piston mounting stage mounted on the piston vertical movement stage.
  • a piston mounting stage that supports a plurality of load-loading pistons is provided.
  • piston vertical movement stage can be configured to be movable in a horizontal plane.
  • the piston force for load application prevents the piston from rotating. It can be supported on a vertical movement stage or a piston mounting stage.
  • a shear stress loading mechanism for moving or vibrating the culture vessel in a horizontal plane can be provided.
  • a receiving group having a predetermined shape can be fixed in the culture vessel, and the culture-body load-load stimulating unit composed of the pressurizing body at the lower end of the load-loading piston and the receiving group is used as a knee joint or the like. A structure similar to the predetermined shape can be obtained.
  • a member made of a biocompatible synthetic resin material may be attached to the culture-body load-load stimulating unit constituted by the pressurizing body and the receiving group at the lower end of the load-loading piston. Can be done.
  • the weight of the load-applying piston is applied to the culture in the culture vessel in a predetermined cycle, so that the culture in the culture vessel is vertically oriented.
  • the culture in the culture vessel is vertically oriented.
  • the culture vessel in which the culture is placed is moved or vibrated in a horizontal plane while applying a vertical load stimulus to the culture in the culture vessel, so that a lateral shear stress stimulus is applied.
  • a stimulus similar to the lateral shear stress stimulus generated in the tissue in the living body on the ground can be applied to the culture, and the culture can be approximated to the tissue environment in the living body. Since the cells can be cultured in a state, a differentiated and mature culture that can withstand the mechanical load after transplantation can be prepared, and the repair and maturation of living tissue can be performed more efficiently.
  • the mechanical stimulus loading device includes a load-applying piston, A stage for vertically moving the piston for vertically moving the load-loading piston within a predetermined range; and a stage elevating mechanism for vertically moving the stage for vertically moving the piston.
  • the stage elevating mechanism By driving the stage elevating mechanism in a predetermined cycle by a computer, the stage for moving the piston up and down is moved up and down.
  • the stage for moving the piston up and down moves, the weight of the load-applying piston is transferred to the culture in the culture vessel. Therefore, a device that accurately applies a stimulus similar to a vertical load-bearing stimulus generated in a tissue in a living body on the ground to the culture body can be simply and easily provided. It can be obtained at low cost.
  • the magnitude of the vertical load-load stimulus applied to the culture can be adjusted accurately and easily.
  • a plurality of cultures can be given a vertical load-load stimulus and the same magnitude of load-load stimulus. , Or differently, and can be applied at the same time, and the culture can be cultured efficiently.
  • the piston mounting stage supporting a plurality of load-loading pistons is configured to be movable in a horizontal plane with respect to the piston vertical movement stage, so that one Different vertical load stimuli can be applied to the culture.
  • the lower end portion of the load-loading piston is supported by a piston vertical-movement stage or a piston-mounting stage so as not to rotate when the load-loading piston force moves in the vertical direction. Even if a pressurized body with a shape corresponding to the culture is mounted on the ground, the vertical A similar stimulus can be accurately applied to the culture.
  • various types of culture containers can be easily mounted by detachably mounting the culture container on the culture container fixing stage of the mechanical stimulation loading device.
  • a receiving group having a predetermined shape can be fixed in the culture vessel, and the culture-body load-load stimulating unit composed of the pressurizing body at the lower end of the load-loading piston and the receiving group is used as a knee joint or the like.
  • a member made of a biocompatible synthetic resin material is attached to the culture-body load-load stimulating unit constituted by the pressurizing body and the receiving group at the lower end of the load-loading piston. Since the culture can be cultured in a state similar to the tissue environment in the living body, the compatibility of the culture with the living body after transplantation can be improved.
  • FIG. 1 is an overall explanatory view showing a first embodiment of a biomechanical stimulus load device of the present invention.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram of the main part.
  • FIG. 3 is an exploded explanatory view showing a load-applying piston.
  • FIG. 4 is an explanatory view showing an internal culture vessel and a receiving group.
  • FIG. 5 is an overall explanatory view showing a second embodiment of the biomechanical stimulus load device of the present invention.
  • FIG. 6 is an explanatory diagram of the main part.
  • FIG. 7 shows a third embodiment of the biomechanical stimulus load device of the present invention, and is an explanatory view of the osteochondral structure of the knee joint in a meniscus tissue culture example.
  • C culture (cultured cells, cultured tissues or structures containing cultured cells)
  • FIGS. 1 and 2 show a first embodiment of a biomechanical stimulus loading device for carrying out the cell culture method using a biomechanical stimulus load of the present invention.
  • This biomechanical stimulus load device is composed of a mechanical stimulus load device 2 and a culture vessel 3 installed in a carbon dioxide gas incubator 1, and a control computer 4. All operations of the biomechanical stimulus load device should be performed by the external force of the carbon dioxide incubator 2, thereby enabling the cultivation for a long time while maintaining the sterilized state in the carbon dioxide incubator 2. it can.
  • the inside of the carbon dioxide gas incubator 2 is sterilized, and is used in an environment where the temperature, humidity, oxygen, carbon dioxide, nitrogen partial pressure and the like are controlled.
  • the mechanical stimulation loading device 2 installed in the carbon dioxide gas incubator 1 includes a piston 5 for loading, and a piston vertical movement for supporting the piston 5 for loading so as to be movable in a vertical direction within a predetermined range.
  • the control computer 4 drives the stage elevating mechanism 22 in a predetermined cycle, thereby When the stage 21 for vertical movement is moved in the vertical direction, Further, the weight of the load-applying piston 5 is applied to the culture C in the culture vessel 3.
  • the stage elevating mechanism 22 for moving the piston up-down movement stage 21 in the up-down direction is connected to, for example, an electric actuator 22a and the electric actuator 22a, and suspends the piston up-down movement stage 21.
  • Lowering wire 22b is also powerful.
  • the piston up-down movement stage 21 can be moved up and down along the guide member 20 via the wire 22b.
  • a plurality of (for example, 5 ⁇ 5 pieces in total, 25) load-loading pins are provided via the piston mounting stage 23 mounted on the piston vertical movement stage 21. Try to support Ston 5.
  • the piston vertical movement stage 21 is for mounting the piston mounting stage 23, so that the load-applying piston 5 can be freely moved in the center in the vertical direction. Hole 21a is formed.
  • the piston mounting stage 23 may be omitted, and the load loading piston 5 may be directly supported on the piston vertical movement stage 21.
  • the load-applying piston 5 has, at its lower end, a pressurizing section 51 having a shape corresponding to the culture C, and a guide shaft section 52 that is inserted into a hole 23 a formed in the piston mounting stage 23 at an intermediate section.
  • a large-diameter portion 53 is formed on the upper portion, and a heavy weight mounting portion 54 for mounting the additional load heavy weight 55 is formed on the upper end portion.
  • the stage 21 for vertically moving the piston is moved downward from the state where the load-applying piston 5 is supported by the stage 23 for placing the piston, and as shown in FIG. 2 (b).
  • the support of the large-diameter portion 53 of the load-loading piston 5 on the piston-mounting stage 23 is released so that the weight of the load-loading piston 5 is reduced.
  • the state is returned to the state in which the piston 5 for load application is supported by the stage 23 for mounting a piston.
  • the vertical load application stimulation by the load application piston 5 can freely operate the load cycle and the load time by operating the control computer 14.
  • the additional load weight 55 can be attached to the weight mounting portion 54 as necessary, and its weight can be freely set. Therefore, the magnitude of the vertical load load stimulation applied to the culture C is large. Can be easily adjusted.
  • the shape of the pressurizing portion 51 of the load-applying piston 5 can be any shape corresponding to the culture C. Further, as shown in a modified example of the load-applying piston 5 shown in FIG. Next, a pressurized body 51A having a shape corresponding to the culture C is formed as a separate member, and the lower end 51B of the load-applying piston 5 is mounted on the pressurized body.
  • the load-applying piston 5 moves in the up-down direction, it can be supported by the piston-mounting stage 23 (or the piston up-down movement stage 21) so as not to rotate.
  • the hole 23a formed in the piston mounting stage 23 is formed in a polygonal shape, and the guide shaft 52 is formed so as to have a polygonal cross-sectional shape adapted to the polygonal hole 23a. To achieve.
  • the culture vessel 3 is detachably mounted on the culture vessel fixing stage 24 of the mechanical stimulus load device 2.
  • the culture vessel 3 contains a culture tank (for injection) 32 and a culture tank (for discharge) 33 as necessary. And control of the injection and discharge of the culture medium by the control computer 4.
  • a shear stress loading mechanism 26 for moving or vibrating the culture vessel 3 in a horizontal plane is provided.
  • a shear stress stage 25 is provided on the culture vessel fixing stage 24 so as to be movable in a horizontal plane with respect to the culture vessel fixing stage 24, and the culture vessel 3 is mounted on the shear stress stage 25. At the same time, the shear stress stage 25 is moved or vibrated in a horizontal plane by the shear stress loading mechanism 26.
  • direction of movement or vibration in the horizontal plane is not limited to one direction, but may be any direction such as two directions in the X and Y directions and a circular motion.
  • the shear stress loading mechanism 26 for example, an electric actuator, a moving mechanism or a vibration mechanism combining a permanent magnet and an electromagnetic stone can be used, and the driving of the shear stress loading mechanism 26 is performed by the control computer 4. Take control.
  • a transverse shear stress stimulus generated in the tissue in the living body on the ground for example, a stimulus similar to the stimulus applied to the knee joint at the time of flexion or extension movement.
  • the culture vessel 3 is moved or vibrated in the horizontal plane by the shear stress loading mechanism 26 while adjusting the method of applying the vertical load stimulus to the culture C in the culture vessel 3 by the load-applying piston 5.
  • the shear stress loading mechanism 26 By doing so, it is advantageous to apply an oblique shear stress stimulus.
  • an internal culture vessel 30 having an arbitrary shape suitable for the culture C is installed in the culture vessel 3, and the internal culture vessel 30 is loaded with a load.
  • Cells 31 of a cultured cell, a cultured tissue or a structure containing a cultured cell are mounted on the piston 5 at a position opposed to the pressurizing portion 51, and the cultured cells, cultured tissue or Place the structure containing the culture cells.
  • the pressurized body 51A of the load-applying piston 5 shown in FIG. 3 and the flat receiving group 31 of the internal culture vessel 30 shown in FIG. Apply a vertical load stimulus and a lateral shear stress stimulus to the tissue, respectively. You can do it.
  • FIGS. 5 and 6 show a second embodiment of the biomechanical stimulus loading device for performing the cell culture method using the biomechanical stimulus load of the present invention.
  • This biomechanical stimulus load device supports a plurality (a plurality of types) of load-loading pistons 5a and 5b (pressurized bodies 51Aa and 51Ab) on the biomechanical stimulus load device of the first embodiment.
  • the configured piston mounting stage 23 may be configured to be movable in a horizontal plane with respect to the piston vertical movement stage 21, and a plurality of (multiple types) additional load may be applied.
  • the additional load heavy weight mounting stage 28 supporting the heavy weights 55a and 55b is configured to be movable in the horizontal plane with respect to the additional car load heavy weight vertical movement stage 27, and the load loading piston 5a. , 5b and the additional load weights 55a, 55b are added to the function that allows the user to arbitrarily select the combination.
  • a piston mounting stage 23 is provided on the piston vertical movement stage 21 so as to be movable (for example, rotatable) in a horizontal plane with respect to the piston vertical movement stage 21.
  • the additional load heavy lifting stage 28 is disposed on the additional load heavy lifting vertical movement stage 27 so as to be movable (for example, rotatable) with respect to the additional load heavy lifting vertical movement stage 27, and the piston
  • the mounting stage 23 and the additional load heavy mounting stage 28 are independently moved in a horizontal plane by the piston mounting stage drive mechanism 23b and the additional load heavy mounting stage drive mechanism 28b (for example, (Rotate).
  • piston mounting stage drive mechanism 23b and the additional load heavy load mounting stage drive mechanism 28b for example, a drive mechanism that combines an electric motor and a gear can be used, and this piston mounting stage drive mechanism 23b and the additional The drive of the load driving stage driving mechanism 28b is controlled by the control computer 4.
  • load-loading pistons 5 a and 5 b are mounted on the piston mounting stage 23, and additional load weights 55 a and 55 b are mounted on the additional-load heavy-loading stage 28. From the supported state, the piston vertical movement stage 21 and the additional load heavy mounting stage 28 are moved downward, and the piston vertical movement stage 21 and the additional load are moved.
  • the large-diameter portion 53 of the load-loading piston 5 supports the piston mounting stage 23, and similarly, the additional load weights 55a and 55b additional load weight mounting stages
  • the weight of the load-applying pistons 5a and 5b and the additional load weights 55a and 55b is applied directly to the culture C in the culture vessel 3 by sequentially releasing the supporting force to the load 28.
  • the combination of the load-applying pistons 5a, 5b and the additional load-applying weights 55a, 55b can be arbitrarily selected, and different load-applying pistons 5a, 5b (pressurized bodies 51Aa, 51Ab ) Makes it possible to easily apply different-sized vertical load stimuli.
  • biomechanical stimulus load device The other configuration and operation of the biomechanical stimulus load device are the same as those of the biomechanical stimulus load device of the first embodiment.
  • FIG. 7 shows a third embodiment of the biomechanical stimulus loading device for performing the cell culture method using the biomechanical stimulus load of the present invention.
  • This biomechanical stimulus load device is suitably used for culturing meniscus, labrum, articular disc, and the like.
  • an internal culture container 30 suitable for the culture C is installed in the culture container 3.
  • the receiving group 31 of the culture cell, the cultured tissue or the structure containing the cultured cell is attached to the inner culture vessel 30 at a position opposite to the pressurized body 51C of the load-applying piston 5 and the culture medium is placed on the receiving group 31.
  • a cultured cell, a cultured tissue or a structure containing a cultured cell as C should be mounted.
  • Meniscus, labrum, articular disc, etc. are subjected to load stimulus in osteochondral rather than to the load stimulus in vivo with hardness similar to bone, so their culture (here, meniscus Culture), artificial femoral osteochondral 51D made of synthetic resin of biocompatible material similar to femoral osteochondral was attached to pressurized body 51C of load-applying piston 5, and receiving group 31
  • the artificial tibial osteochondral 31A made of a synthetic resin of a biocompatible material similar to tibia osteochondral is placed on the tibia.
  • a culture C here, a specially shaped culture dish for meniscus
  • osteochondral here, The load stimulation by the osteochondral of the knee joint
  • the culture C comprising the cultured tissue or the structure containing the cultured cells can be formed in advance into a shape suitable for transplantation.
  • the matrix of the structure including the cultured cells is Using a biocompatible material-based three-dimensional cell support, for example, using a collagen-based cell support, etc., to form a structure containing cultured cells to which chondrocytes and meniscal cells have been seeded and adhered Can be.
  • the present invention provides a structure containing cultured cells, cultured tissues or cultured cells in an in vitro culture in an environment in which the inside of a carbon dioxide gas incubator is sterilized and the temperature, humidity, oxygen, carbon dioxide, nitrogen partial pressure and the like are controlled.
  • a biomechanical stimulus load is applied to the culture medium consisting of the in-vivo environment and the structure similar to the structure, vertical load-load stimulus is applied using gravity, and lateral shear stress stimulus is applied to the culture vessel in a horizontal plane. It can be applied directly by moving or vibrating inside.
  • the biomechanical stimulus loading device of the present invention can perform the operation with the external force of the carbon dioxide incubator 2 and can perform continuous culture for a long time because the replacement of the culture medium is also performed with the operation with the external force.
  • the biomechanical stimulus loading device does not require a large amount of power, and the weight of the applied load is accurate, and a compact biomechanical stimulus loading device can be manufactured.
  • Can be cultured in similar conditions Therefore, a differentiated and mature culture that can withstand the mechanical load after transplantation can be prepared, and the tissue of the living body can be repaired and matured efficiently.
  • the culture is cultured in a form suitable for transplantation, thereby affecting the growth and differentiation of the culture, thereby affecting transplantation.
  • a suitable organization can be created.
  • a tissue that has been subjected to a biomechanical load stimulus outside of the body can withstand the mechanical load after transplantation. This makes it possible to create a cultured tissue, which contributes to tissue regeneration of living organisms and medical treatment for transplantation.
  • the present invention can apply a stimulus very similar to standing, walking, running, jumping, and torsion of a living body, thereby contributing to elucidation of the mechanism of destruction and damage of bone, cartilage, skin, etc. Can also be expected.
  • the weight of the vertical load-loading piston can be changed to the damage load weight, the descent speed can be increased, and a vertical impact stimulus can be applied.
  • a directional shear stress can be applied to stimulate the knee.
  • the biomechanical stimulus load device of the present invention can be applied as a tissue culture device under various conditions and can be miniaturized with a relatively simple device. Applying a shear stress stimulus through an extracellular matrix can apply a load similar to the in vivo environment! It can be spread as a standard culture device product in many medical biology tissue regeneration laboratories and has the potential for new industries, and this device can be used to grow bone and cartilage cultured cells. It is recognized that the device is useful for culturing structures containing cultured tissues or cells, and if it is a device for manufacturing cartilage, the need for regenerative treatment of meniscus alone is equal to or greater than the need for bone. In Japan alone, 10,000 cases can be targeted annually.

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Abstract

　地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激や横方向の剪断応力刺激と同様の刺激を、体外培養にて培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体に繰り返し生体力学刺激として付与するための生体力学的刺激負荷による細胞培養方法及びその装置を提供する。 　炭酸ガスインキュベーター１内に設置される力学刺激負荷装置２及び培養容器３と、制御用コンピューター４とからなり、力学刺激負荷装置２を、荷重負荷用ピストン５と、この荷重負荷用ピストン５を所定の範囲内で上下方向に移動可能に支持するピストン上下移動用ステージ２１と、このピストン上下移動用ステージ２１を上下方向に移動させるためのステージ昇降機構２２とを備え、制御用コンピューター４によってステージ昇降機構２２を所定のサイクルで駆動することにより、ピストン上下移動用ステージ２１を上下方向に移動させ、ピストン上下移動用ステージ２１の降下時に、荷重負荷用ピストン５の重量が培養容器３内の培養体Ｃにかかるように構成する。

Description

明 細 書
生体力学的刺激負荷による細胞培養方法及びその装置
技術分野
[0001] 本発明は、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激や 横方向の剪断応力刺激と同様の刺激を、体外培養にて培養細胞、培養組織又は培 養細胞を含む構造体 (本明細書において、これらを包括して「培養体」という。）に繰り 返し生体力学刺激として付与するための生体力学的刺激負荷による細胞培養方法 及びその装置に関するものである。
背景技術
[0002] 近年、軟骨病変をもつ患者の治療として、患者本人の残された健常軟骨組織を採 取し、体外に取り出し、軟骨細胞を分離し、体外培養にて増殖し、この自家培養軟骨 細胞をもとの患者に移植する細胞移植治療方法が、欧米等で行われるようになった し力しながら、この方法は、軟骨細胞の培養、増殖を体外で行うものである力 軟骨 組織の再生を体外で行うものでなぐ治療効果も不安定で、軟骨組織の修復、成熟 に長期間を要するという問題があった。
[0003] 生体内の組織や細胞は、生化学的刺激だけでなぐ重力や筋肉の収縮力、外力に よる力学的刺激を受けており、培養細胞及び培養組織は、静的あるいは動的な生体 力学的刺激を受けることにより、増殖、分化、代謝等の機能が変化することが知られ ている。
[0004] ところで、このような知見に基づき、最近、生体力学的刺激を利用した細胞培養、組 織培養を行う細胞培養装置が国内外の幾つかの研究グループにより検討、実施され てきた (例えば、特許文献 1参照)。
[0005] 応力刺激による培養システムとしては、細胞を付着させた膜部材を伸縮又は振動さ せて軟骨細胞や血管平滑筋細胞を培養する方法や、カラム内に支持体に保持され た軟骨細胞を入れ、ポンプで培地を循環させ支持体中の軟骨へ培養液の流れによ る応力刺激を行いながら軟骨細胞を培養する方法がある。 [0006] また、静水圧刺激による培養システムとしては、ガスシリンダ式の圧力負荷による軟 骨細胞の刺激負荷方法があり、油圧シリンダ式ポンプでカラムに関節内圧に相当す る 5MPaの圧力を負荷する方法で軟骨細胞への刺激負荷を行うようにして 、る。
[0007] また、カラム (カラム内デバイス）にポンプで培地を送液し、バルブ等の操作で培地 の流量を変化させることにより圧力負荷のパターンやサイクルを任意に作り出すよう にした細胞培養装置も提案されて 、る。
[0008] これらの方法や装置は、生体で細胞に力かる圧力レベルや圧力の変ィ匕、圧力の上 昇と下降のパターン等を培養液を介して生体内に近い状態が再現がされるものであ る力 あくまでも、培養細胞の伸張や培養液の流れ、培養液を介した培養細胞への 刺激であり、骨、軟骨等の支持組織に力かる重力による鉛直方向の生体力学的刺激 が再現されて 、るとは ヽえな 、ものであった。
[0009] ここで、重力による鉛直方向の繰り返し刺激が生体にとって重要であることは、健常 な宇宙飛行士が微小重力宇宙空間で生活し重力による刺激が減少したり、疾病や 高齢により臥床を余儀なくされると、脊椎、上下肢に骨粗鬆症をきたすことが知られて いることからも明らかである。
特許文献 1：特開 2003 - 265164
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] このように、上記従来の技術は、培養細胞に対する重力による鉛直方向の荷重負 荷刺激や、細胞外組織であるマトリックスに囲まれた状態での細胞に力かる力を再現 しているものではない。
本発明は、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激や 横方向の剪断応力刺激と同様の刺激を、体外培養にて培養細胞、培養組織又は培 養細胞を含む構造体に繰り返し生体力学刺激として付与するための生体力学的刺 激負荷による細胞培養方法及びその装置を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0011] 上記目的を達成するため、本発明の生体力学的刺激負荷による細胞培養方法は、 炭酸ガスインキュベーター内に設置された培養容器内の培養体に生体力学的刺激 を付与する方法であって、荷重負荷用ピストンの重量を所定のサイクルで培養容器 内の培養体にかけることにより、培養容器内の培養体に鉛直方向の荷重負荷刺激を 付与するようにしたことを特徴とする。
[0012] この場合において、培養容器内の培養体に鉛直方向の荷重負荷刺激を付与しな がら、培養体を載置した培養容器を水平面内で移動又は振動させることにより、横方 向の剪断応力刺激を付与するようにすることができる。
[0013] また、上記本発明の生体力学的刺激負荷による細胞培養方法を実施するための 生体力学的刺激負荷装置は、炭酸ガスインキュベーター内に設置される力学刺激負 荷装置及び培養容器と、制御用コンピュータ一とで構成した生体力学的刺激負荷装 置であって、前記力学刺激負荷装置が、荷重負荷用ピストンと、該荷重負荷用ピスト ンを所定の範囲内で上下方向に移動可能に支持するピストン上下移動用ステージと 、該ピストン上下移動用ステージを上下方向に移動させるためのステージ昇降機構と を備え、制御用コンピューターによってステージ昇降機構を所定のサイクルで駆動す ることにより、ピストン上下移動用ステージを上下方向に移動させ、ピストン上下移動 用ステージの降下時に、荷重負荷用ピストンの重量が培養容器内の培養体に力かる ようにしたことを特徴とする。
[0014] この場合において、荷重負荷用ピストンの上端部に追加荷重重鎮を装着するように することができる。
[0015] また、荷重負荷用ピストンの下端部に培養体に対応した形状の加圧体を装着する ようにすることができる。
[0016] また、ピストン上下移動用ステージに複数個の荷重負荷用ピストンを支持するように することができる。
[0017] また、ピストン上下移動用ステージに載置したピストン載置用ステージを介して、荷 重負荷用ピストンを支持するようにすることができる。
[0018] また、複数個の荷重負荷用ピストンを支持するようにしたピストン載置用ステージを
、ピストン上下移動用ステージに対して、水平面内で移動可能に構成するようにする ことができる。
[0019] また、荷重負荷用ピストン力 上下方向に移動する際に、回転しないようにピストン 上下移動用ステージ又はピストン載置用ステージに支持するようにすることができる。
[0020] また、培養容器を力学刺激負荷装置の培養容器固定ステージに着脱可能に装着 するよう〖こすることがでさる。
[0021] また、培養容器を水平面内で移動又は振動させる剪断応力負荷機構を設けること ができる。
[0022] また、培養容器内に所定の形状の受容基を固定可能にし、荷重負荷用ピストンの 下端部の加圧体と受容基とで構成される培養体荷重負荷刺激部が、膝関節等の所 定の形状に類似した構造となるようにすることができる。
[0023] また、荷重負荷用ピストンの下端部の加圧体と受容基とで構成される培養体荷重負 荷刺激部に、生体適合合成樹脂材料で製作された部材を装着するようにすることが できる。
発明の効果
[0024] 本発明の生体力学的刺激負荷による細胞培養方法によれば、荷重負荷用ピストン の重量を所定のサイクルで培養容器内の培養体にかけることにより、培養容器内の 培養体に鉛直方向の荷重負荷刺激を付与するようにしているので、地上における生 体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体に付与す ることができ、培養体を生体内の組織の環境に近似した状態で培養することができる ため、移植後の力学負荷に耐え得る分化、成熟した培養体が作成可能となり、生体 の組織の修復、成熟を効率的に行うことができる。
[0025] また、培養容器内の培養体に鉛直方向の荷重負荷刺激を付与しながら、培養体を 載置した培養容器を水平面内で移動又は振動させることにより、横方向の剪断応力 刺激を付与するようにすることにより、地上における生体内で組織に生じている横方 向の剪断応力刺激と同様の刺激を培養体に付与することができ、培養体を生体内の 組織の環境に近似した状態で培養することができるため、移植後の力学負荷に耐え 得る分化、成熟した培養体が作成可能となり、生体の組織の修復、成熟を一層効率 的に行うことができる。
[0026] また、上記本発明の生体力学的刺激負荷による細胞培養方法を実施するための 生体力学的刺激負荷装置によれば、力学刺激負荷装置が、荷重負荷用ピストンと、 該荷重負荷用ピストンを所定の範囲内で上下方向に移動可能に支持するピストン上 下移動用ステージと、該ピストン上下移動用ステージを上下方向に移動させるための ステージ昇降機構とを備え、制御用コンピューターによってステージ昇降機構を所定 のサイクルで駆動することにより、ピストン上下移動用ステージを上下方向に移動させ 、ピストン上下移動用ステージの降下時に、荷重負荷用ピストンの重量が培養容器 内の培養体に力かるように構成するようにして 、るので、地上における生体内で組織 に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体に正確に付与する装 置を、簡易に、かつ、低コストで得ることができる。
[0027] また、荷重負荷用ピストンの上端部に追加荷重重鎮を装着するようにすることにより 、培養体に付与する鉛直方向の荷重負荷刺激の大きさを正確かつ簡易に調節する ことができる。
[0028] また、荷重負荷用ピストンの下端部に培養体に対応した形状の加圧体を装着する ようにすることにより、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷 刺激と同様の刺激を培養体に正確に付与することができる。
[0029] また、ピストン上下移動用ステージに複数個の荷重負荷用ピストンを支持するように することにより、複数個の培養体に鉛直方向の荷重負荷刺激を、荷重負荷刺激の大 きさを同じにしたり、異なるようにして、同時に付与することができ、培養体の培養を効 率的に行うことができる。
[0030] また、ピストン上下移動用ステージに載置したピストン載置用ステージを介して、荷 重負荷用ピストンを支持することにより、種々の荷重負荷用ピストンの支持を簡易に 行うことができる。
[0031] また、複数個の荷重負荷用ピストンを支持するようにしたピストン載置用ステージを 、ピストン上下移動用ステージに対して、水平面内で移動可能に構成するようにする ことにより、 1つの培養体に異なる鉛直方向の荷重負荷刺激を付与することができる。
[0032] また、荷重負荷用ピストン力 上下方向に移動する際に、回転しないようにピストン 上下移動用ステージ又はピストン載置用ステージに支持するようにすることにより、荷 重負荷用ピストンの下端部に培養体に対応した形状の加圧体を装着するようにした 場合等でも、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と 同様の刺激を培養体に正確に付与することができる。
[0033] また、培養容器を力学刺激負荷装置の培養容器固定ステージに着脱可能に装着 することにより、種々の培養容器の装着を簡易に行うことができる。
[0034] また、培養容器を水平面内で移動又は振動させる剪断応力負荷機構を設けること により、地上における生体内で組織に生じている横方向の剪断応力刺激と同様の刺 激を培養体に正確に付与する装置を、簡易に、かつ、低コストで得ることができる。
[0035] また、培養容器内に所定の形状の受容基を固定可能にし、荷重負荷用ピストンの 下端部の加圧体と受容基とで構成される培養体荷重負荷刺激部が、膝関節等の所 定の形状に類似した構造となるようにすることにより、細胞外組織であるマトリックスに 囲まれた状態での細胞に力かる力を容易に再現することができる。
[0036] また、荷重負荷用ピストンの下端部の加圧体と受容基とで構成される培養体荷重負 荷刺激部に、生体適合合成樹脂材料で製作された部材を装着するようにすること〖こ より、培養体を生体内の組織の環境に近似した状態で培養することができるため、培 養体の移植後の生体に対する適合性を向上することができる。
図面の簡単な説明
[0037] [図 1]本発明の生体力学的刺激負荷装置の第 1実施例を示す全体説明図である。
[図 2]同要部説明図である。
[図 3]荷重負荷用ピストンを示す分解した説明図である。
圆 4]内部培養容器と受容基を示す説明図である。
[図 5]本発明の生体力学的刺激負荷装置の第 2実施例を示す全体説明図である。
[図 6]同要部説明図である。
[図 7]本発明の生体力学的刺激負荷装置の第 3実施例を示し、半月板の組織培養例 の膝関節の骨軟骨構造の説明図である。
符号の説明
[0038] 1 炭酸ガスインキュベーター
2 力学的刺激負荷装置
20 ガイド部材
21 ピストン上下移動用ステージ 1a 孔部
2 ステージ昇降機構
2a 電動ァクチユエ一ター
2b ワイヤー
3 ピストン載置用ステージ
3a 孔部
3b ピストン載置用ステージ駆動機構4 培養容器固定ステージ
5 剪断応力ステージ
6 剪断応力負荷機構
7 追加荷重重鎮上下移動用ステージ8 追加荷重重鎮載置用ステージ8b 追加荷重重鎮載置用ステージ 培養容器
0 内部培養容器
1 受容基
1A 人工脛骨骨軟骨
2 培地槽 (注入用）
3 培地槽 (排出用）
制御用コンピューター
荷重負荷用ピストン
a 荷重負荷用ピストン
b 荷重負荷用ピストン
1 加圧体
1A 加圧体
1Aa 加圧体
1Ab 加圧体
1C 加圧体 5 ID 人工大腿骨骨軟骨
52 ガイド軸部
53 大径部
54 重鎮装着部
55 追加荷重重鎮
55a 追加荷重重鎮
55b 追加荷重重鎮
C 培養体 (培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体）
X 培養体荷重負荷刺激部
発明を実施するための最良の形態
[0039] 以下、本発明の生体力学的刺激負荷による細胞培養方法及びその装置の実施の 形態を図面に基づいて説明する。
実施例 1
[0040] 図 1〜図 2に、本発明の生体力学的刺激負荷による細胞培養方法を実施するため の生体力学的刺激負荷装置の第 1実施例を示す。
[0041] この生体力学的刺激負荷装置は、炭酸ガスインキュベーター 1内に設置される力学 刺激負荷装置 2及び培養容器 3と、制御用コンピューター 4とで構成されている。 なお、生体力学的刺激負荷装置の操作は、すべて炭酸ガスインキュベーター 2の 外力 行えるようにし、これにより、炭酸ガスインキュベーター 2内の滅菌状態を保つ て長時間に亘つての培養を可能にすることができる。
[0042] 炭酸ガスインキュベーター 2は、その内部を滅菌し、温度、湿度、酸素、二酸化炭素 、窒素分圧等を制御した環境で使用するようにする。
[0043] この炭酸ガスインキュベーター 1内に設置される力学刺激負荷装置 2は、荷重負荷 用ピストン 5と、この荷重負荷用ピストン 5を所定の範囲内で上下方向に移動可能に 支持するピストン上下移動用ステージ 21と、このピストン上下移動用ステージ 21を上 下方向に移動させるためのステージ昇降機構 22とを備え、制御用コンピューター 4に よってステージ昇降機構 22を所定のサイクルで駆動することにより、ピストン上下移 動用ステージ 21を上下方向に移動させ、ピストン上下移動用ステージ 21の降下時 に、荷重負荷用ピストン 5の重量が培養容器 3内の培養体 Cにかかるように構成して いる。
これにより、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と 同様の刺激を培養体 Cに付与することができるようにして 、る。
[0044] ピストン上下移動用ステージ 21を上下方向に移動させるためのステージ昇降機構 22は、例えば、電動ァクチユエ一ター 22aと、この電動ァクチユエ一ター 22aに接続 され、ピストン上下移動用ステージ 21を吊り下げるワイヤー 22bと力もなる。
そして、制御用コンピューター 4の指令で電動ァクチユエ一ター 22aを操作すること により、ピストン上下移動用ステージ 21をワイヤー 22bを介して、ガイド部材 20に沿つ て上下方向に移動できるようにして 、る。
[0045] ところで、本実施例においては、ピストン上下移動用ステージ 21に載置したピストン 載置用ステージ 23を介して、複数 (例えば、 5個 X 5個の合計 25個）の荷重負荷用ピ ストン 5を支持するようにして ヽる。
この場合、ピストン上下移動用ステージ 21は、ピストン載置用ステージ 23を載置す るためのものであるので、中央部に荷重負荷用ピストン 5が自由に上下方向に移動で きるようにするための孔部 21aを形成するようにする。
これにより、種々の荷重負荷用ピストン 5の支持を簡易に行うことができる。 なお、ピストン載置用ステージ 23を省略して、ピストン上下移動用ステージ 21に荷 重負荷用ピストン 5を直接支持するようにすることもできる。
[0046] 荷重負荷用ピストン 5は、下端部に培養体 Cに対応した形状の加圧部 51を、中間 部にピストン載置用ステージ 23に形成した孔部 23aに嵌挿されるガイド軸部 52を、そ の上部に大径部 53を、上端部に追加荷重重鎮 55を装着するための重鎮装着部 54 を形成するようにする。
これにより、図 2 (a)に示すように、ピストン載置用ステージ 23に荷重負荷用ピストン 5を支持した状態から、ピストン上下移動用ステージ 21を下方向に移動させ、図 2 (b) に示すように、ピストン上下移動用ステージ 21の降下時に、荷重負荷用ピストン 5の 大径部 53によるピストン載置用ステージ 23への支持が解除されるようにして、荷重負 荷用ピストン 5の重量が培養容器 3内の培養体 Cに直接カゝかるようにする。 その後、ピストン上下移動用ステージ 21を上方向に移動させることによって、図 2 (a )に示すように、ピストン載置用ステージ 23に荷重負荷用ピストン 5を支持した状態に 復帰させる。
この荷重負荷用ピストン 5による鉛直方向の荷重負荷刺激は、制御用コンピュータ 一 4の操作で荷重サイクル、荷重時間を自由に操作できる。
また、追加荷重重鎮 55は、必要に応じて、重鎮装着部 54に装着することができ、ま た、その重さも自由に設定できることから、培養体 Cに付与する鉛直方向の荷重負荷 刺激の大きさを簡易に調節することができる。
[0047] また、荷重負荷用ピストン 5の加圧部 51の形状は、培養体 Cに対応した任意の形状 とすることができ、さらに、図 3に示す荷重負荷用ピストン 5の変形例のように、培養体 Cに対応した形状の加圧体 51 Aを別部材で形成し、荷重負荷用ピストン 5の下端部 5 1B〖こ装着するよう〖こすることちでさる。
これにより、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と 同様の刺激を培養体 Cに正確に付与することができる。
[0048] また、荷重負荷用ピストン 5が、上下方向に移動する際に、回転しないようにピストン 載置用ステージ 23 (又はピストン上下移動用ステージ 21)に支持するようにすること ができる。
具体的には、ピストン載置用ステージ 23に形成した孔部 23aを多角形に形成し、ガ イド軸部 52をこの多角形の孔部 23aに適合した多角形の断面形状を有するように形 成する。
これにより、荷重負荷用ピストン 5の下端部 51Bに培養体 Cに対応した形状（円形以 外)の加圧体 51 Aを装着するようにした場合等でも、地上における生体内で組織に 生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体 Cに正確に付与すること ができる。
[0049] 培養容器 3は、力学刺激負荷装置 2の培養容器固定ステージ 24に着脱可能に装 着するようにする。
これにより、種々の培養容器 3の装着を簡易に行うことができる。
また、培養容器 3には、必要に応じて、培地槽 (注入用） 32と、培地槽 (排出用） 33 とを接続し、培地の注入及び排出を制御用コンピューター 4によって制御するように することちでさる。
[0050] また、培養容器 3を水平面内で移動又は振動させる剪断応力負荷機構 26を設ける ようにしている。
具体的には、培養容器固定ステージ 24上に、培養容器固定ステージ 24に対して 水平面内で移動可能に剪断応力ステージ 25を配設し、この剪断応力ステージ 25上 に培養容器 3を装着するようにするとともに、剪断応力ステージ 25を、剪断応力負荷 機構 26により水平面内で移動又は振動させるようにする。
なお、水平面内で移動又は振動の方向は、 1方向に限定されず、 X、 Y方向の 2方 向や円運動等、任意の方向とすることができる。
剪断応力負荷機構 26としては、例えば、電動ァクチユエ一ターや永久磁石と電磁 石を組み合わせた移動機構又は振動機構を用いることができ、この剪断応力負荷機 構 26の駆動は、制御用コンピューター 4によって制御するようにする。
これにより、地上における生体内で組織に生じている横方向の剪断応力刺激、例え ば、膝関節に屈曲、伸展の運動時に加わる刺激と同様の刺激を培養体 Cに付与する ことができる。
この場合、荷重負荷用ピストン 5による培養容器 3内の培養体 Cへの鉛直方向の荷 重負荷刺激の付与方法を調整しながら、剪断応力負荷機構 26によって培養容器 3 を水平面内で移動又は振動させることにより、斜め方向の剪断応力刺激を付与する ようにすることちでさる。
[0051] 培養容器 3内には、図 2 (b)及び図 4に示すように、培養体 Cに適合した任意の形 状の内部培養容器 30を設置し、この内部培養容器 30の荷重負荷用ピストン 5の加 圧部 51と相対する位置に培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体の受容 基 31を装着し、受容基 31の上に培養体 Cとしての培養細胞、培養組織又は培養細 胞を含む構造体を載置するようにする。
図 3に示す荷重負荷用ピストン 5の加圧体 51A及び図 4に示す内部培養容器 30の 平坦形状の受容基 31は、培養体 Cとして皮膚の培養組織に適したもので、皮膚の培 養組織に鉛直方向の荷重負荷刺激と、横方向の剪断応力刺激を、それぞれ付与す ることがでさる。
実施例 2
[0052] 図 5〜図 6に、本発明の生体力学的刺激負荷による細胞培養方法を実施するため の生体力学的刺激負荷装置の第 2実施例を示す。
[0053] この生体力学的刺激負荷装置は、上記第 1実施例の生体力学的刺激負荷装置に 、複数個 (複数種類)の荷重負荷用ピストン 5a、 5b (加圧体 51Aa、 51Ab)を支持す るようにしたピストン載置用ステージ 23を、ピストン上下移動用ステージ 21に対して、 水平面内で移動可能に構成するようにしたり、さら〖こは、複数個 (複数種類)の追カロ 荷重重鎮 55a、 55bを支持するようにした追加荷重重鎮載置用ステージ 28を、追カロ 荷重重鎮上下移動用ステージ 27に対して、水平面内で移動可能に構成するように し、荷重負荷用ピストン 5a、 5bと追加荷重重鎮 55a、 55bとの組み合わせを任意に選 択できるようにする機能に付加したものである。
[0054] 具体的には、ピストン上下移動用ステージ 21上に、ピストン上下移動用ステージ 21 に対して水平面内で移動可能 (例えば、回転可能）にピストン載置用ステージ 23を配 設し、同様に、追加荷重重鎮上下移動用ステージ 27上に、追加荷重重鎮上下移動 用ステージ 27に対して水平面内で移動可能 (例えば、回転可能）に追加荷重重鎮載 置用ステージ 28を配設し、ピストン載置用ステージ 23及び追加荷重重鎮載置用ステ ージ 28を、ピストン載置用ステージ駆動機構 23b及び追加荷重重鎮載置用ステージ 駆動機構 28bにより、それぞれ独立して水平面内で移動 (例えば、回転)させるように する。
ピストン載置用ステージ駆動機構 23b及び追加荷重重鎮載置用ステージ駆動機構 28bとしては、例えば、電動モーターとギヤを組み合わせた駆動機構を用いることが でき、このピストン載置用ステージ駆動機構 23b及び追加荷重重鎮載置用ステージ 駆動機構 28bの駆動は、制御用コンピューター 4によって制御するようにする。
[0055] そして、図 5及び図 6に示すように、ピストン載置用ステージ 23に荷重負荷用ピスト ン 5a、 5bを、また、追加荷重重鎮載置用ステージ 28に追加荷重重鎮 55a、 55bを、 それぞれ支持した状態から、ピストン上下移動用ステージ 21及び追加荷重重鎮載置 用ステージ 28を下方向に移動させ、ピストン上下移動用ステージ 21及び追加荷重 重鎮載置用ステージ 28の降下時に、荷重負荷用ピストン 5の大径部 53によるピスト ン載置用ステージ 23への支持、及び同様に追加荷重重鎮 55a、 55bの追加荷重重 鎮載置用ステージ 28への支持力、順次解除されるようにして、荷重負荷用ピストン 5a 、 5b及び追加荷重重鎮 55a、 55bの重量が培養容器 3内の培養体 Cに直接力かるよ うにする。
その後、ピストン上下移動用ステージ 21及び追加荷重重鎮載置用ステージ 28を上 方向に移動させることによって、図 2及び図 6に示すように、ピストン載置用ステージ 2 3に荷重負荷用ピストン 5a、 5bを、また、追加荷重重鎮載置用ステージ 28に追加荷 重重鎮 55a、 55bを、それぞれ支持した状態に復帰させる。
これにより、荷重負荷用ピストン 5a、 5bと追加荷重重鎮 55a、 55bとの組み合わせ を任意に選択して、 1つの培養体 Cに、異なる荷重負荷用ピストン 5a、 5b (加圧体 51 Aa、 51Ab)によって、異なる大きさの鉛直方向の荷重負荷刺激を簡易に付与するこ とがでさる。
[0056] なお、この生体力学的刺激負荷装置のその他の構成及び作用は、上記第 1実施例 の生体力学的刺激負荷装置と同様である。
実施例 3
[0057] 図 7に、本発明の生体力学的刺激負荷による細胞培養方法を実施するための生体 力学的刺激負荷装置の第 3実施例を示す。
[0058] この生体力学的刺激負荷装置は、半月板、関節唇、関節円盤等の培養に好適に 用いられるもので、培養容器 3内に、培養体 Cに適合した内部培養容器 30を設置し 、この内部培養容器 30の荷重負荷用ピストン 5の加圧体 51Cと相対する位置に培養 細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体の受容基 31を装着し、受容基 31の上 に培養体 Cとしての培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体を載置するよう にする。
半月板、関節唇、関節円盤等は、骨に類似した硬度で生体内で負荷刺激を受けて いるのではなぐ骨軟骨で荷重負荷刺激を受けているため、その培養 (ここでは、半 月板の培養）には、荷重負荷用ピストン 5の加圧体 51Cに大腿骨骨軟骨に類似した 生体適合材料の合成樹脂で製作した人工大腿骨骨軟骨 51Dを装着し、受容基 31 に脛骨骨軟骨に類似した生体適合材料の合成樹脂で製作した人工脛骨骨軟骨 31 Aを載置することにより、その間に形成された培養体荷重負荷刺激部 Xが、生体の所 定の形状 (ここでは、膝関節）に類似した構造となるようにし、この培養体荷重負荷刺 激部 Xに培養体 C (ここでは、半月板用特殊形状培養ディッシュ)を入れて、骨軟骨（ ここでは、膝関節の骨軟骨）による荷重負荷刺激を再現するようにする。
これにより、細胞外組織であるマトリックスに囲まれた状態での細胞に力かるカを容 易に再現することができるとともに、培養体 Cを生体内の組織の環境に近似した状態 で培養することができるため、培養体の移植後の生体に対する適合性を向上すること ができる。
この場合、培養組織又は培養細胞を含む構造体カゝらなる培養体 Cは、予め移植に 適した形状に形成することができ、具体的には、培養細胞を含む構造体のマトリック スを、生体適合材料をベースにした 3次元の細胞支持体とし、例えば、コラーゲンを 主体にした細胞支持体等を用い、軟骨細胞や半月板細胞を播種、接着させた培養 細胞を含む構造体とすることができる。
[0059] なお、この生体力学的刺激負荷装置のその他の構成及び作用は、上記第 1実施例 及び第 2実施例の生体力学的刺激負荷装置と同様である。
[0060] 本発明は、炭酸ガスインキュベーター内を滅菌し、温度、湿度、酸素、二酸化炭素 、窒素分圧等を制御した環境で、体外培養にて培養細胞、培養組織又は培養細胞 を含む構造体からなる培養体に、生体力学的刺激負荷を生体内環境、構造と類似し た環境で、鉛直方向の荷重負荷刺激を重力を利用して、さらに、横方向の剪断応力 刺激を培養容器を水平面内で移動又は振動させることにより、直接付与することがで きる。
また、本発明の生体力学的刺激負荷装置は、炭酸ガスインキュベーター 2の外部 力もの操作を行うことができ、培地の入れ替えも外部力もの操作で行うために、長時 間の連続培養ができる。またこの生体力学的刺激負荷装置は大きな動力も必要とせ ず、荷重負荷重量は正確でコンパクトな生体力学的刺激負荷装置も製造可能である これによつて、培養体を生体内の組織の環境に近似した状態で培養することができ るため、移植後の力学負荷に耐え得る分化、成熟した培養体が作成可能となり、生 体の組織の修復、成熟を効率的に行うことができる。
そして、従来の組織培養技術では得られなカゝつた生体力学負荷刺激を体外で行う とともに、培養体を移植に適する形態で培養することにより、培養体の増殖、分化〖こ 影響を与え、移植に適した組織を作成することができる。
また、本発明の生体力学的刺激負荷による細胞培養方法及びその装置を用いた 基礎医学研究により、体外で生体力学負荷刺激を受けた組織は、移植後の力学負 荷に耐え得る分ィ匕成熟した培養組織の作成が可能となり、生体の組織再生、移植医 療に貢献することができる。
さらに、本発明は、生体の起立、歩行、走行、飛び跳ね、膝の捻りに極めて類似し た刺激を加えることができることから、骨、軟骨、皮膚等の破壊、損傷のメカニズムの 解明に寄与することも期待できる。具体的には、鉛直方向の荷重負荷用ピストンの重 量を損傷荷重重量に変え、下降スピードを速め鉛直方向の衝撃的刺激も加えること ができ、また、損傷荷重重量を加えた状態で強い横方向の剪断応力を加え膝を捻つ た状態の刺激を加えることもできる。また横方向の移動を繰り返し剪断応力を長時間 加え骨の摩耗等の研究も行うことができる。
産業上の利用可能性
本発明の生体力学的刺激負荷装置は組織培養装置として力学的刺激負荷をいろ いろな条件でかけられ、かつ比較的簡便な装置で小型化も可能であり、力学的刺激 を重力鉛直方向や横方向の剪断応力刺激を細胞外マトリックスを介して負荷すると V、う、生体内での環境に類似した負荷をかけ得ると!、う点で従来にな 、利点を有して いる。多くの医学生物学の組織再生分野の研究室での標準的な培養装置の製品と して普及可能であり、新たな産業ィヒの可能性があり、またこの装置が骨、軟骨の培養 細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体培養に有益な装置であることが認めら れ、軟骨等の製造装置となれば、半月板だけの再生治療のニーズも、骨のニーズと 同等かそれ以上のニーズがあり、日本国内だけでも年間 1万症例がその対象例とな り得る。

Claims

請求の範囲
[1] 炭酸ガスインキュベーター内に設置された培養容器内の培養体に生体力学的刺 激を付与する方法であって、荷重負荷用ピストンの重量を所定のサイクルで培養容 器内の培養体にかけることにより、培養容器内の培養体に鉛直方向の荷重負荷刺激 を付与するようにしたことを特徴とする生体力学的刺激負荷による細胞培養方法。
[2] 培養容器内の培養体に鉛直方向の荷重負荷刺激を付与しながら、培養体を載置 した培養容器を水平面内で移動又は振動させることにより、横方向の剪断応力刺激 を付与するようにしたことを特徴とする請求項 1記載の生体力学的刺激負荷による細 胞培養方法。
[3] 炭酸ガスインキュベーター内に設置される力学刺激負荷装置及び培養容器と、制 御用コンピュータ一とで構成した生体力学的刺激負荷装置であって、前記力学刺激 負荷装置が、荷重負荷用ピストンと、該荷重負荷用ピストンを所定の範囲内で上下方 向に移動可能に支持するピストン上下移動用ステージと、該ピストン上下移動用ステ ージを上下方向に移動させるためのステージ昇降機構とを備え、制御用コンピュータ 一によつてステージ昇降機構を所定のサイクルで駆動することにより、ピストン上下移 動用ステージを上下方向に移動させ、ピストン上下移動用ステージの降下時に、荷 重負荷用ピストンの重量が培養容器内の培養体に力かるようにしたことを特徴とする 生体力学的刺激負荷装置。
[4] 荷重負荷用ピストンの上端部に追加荷重重鎮を装着するようにしたことを特徴とす る請求項 3記載の生体力学的刺激負荷装置。
[5] 荷重負荷用ピストンの下端部に培養体に対応した形状の加圧体を装着するように したことを特徴とする請求項 3又は 4記載の生体力学的刺激負荷装置。
[6] ピストン上下移動用ステージに複数個の荷重負荷用ピストンを支持するようにしたこ とを特徴とする請求項 3、 4又は 5記載の生体力学的刺激負荷装置。
[7] ピストン上下移動用ステージに載置したピストン載置用ステージを介して、荷重負 荷用ピストンを支持するようにしたことを特徴とする請求項 3、 4、 5又は 6記載の生体 力学的刺激負荷装置。
[8] 複数個の荷重負荷用ピストンを支持するようにしたピストン載置用ステージを、ピスト ン上下移動用ステージに対して、水平面内で移動可能に構成するようにしたことを特 徴とする請求項 7記載の生体力学的刺激負荷装置。
[9] 荷重負荷用ピストンが、上下方向に移動する際に、回転しないようにピストン上下移 動用ステージ又はピストン載置用ステージに支持するようにしたことを特徴とする請求 項 3、 4、 5、 6、 7又は 8記載の生体力学的刺激負荷装置。
[10] 培養容器を力学刺激負荷装置の培養容器固定ステージに着脱可能に装着するよ うにしたことを特徴とする請求項 3、 4、 5、 6、 7、 8又は 9記載の生体力学的刺激負荷 装置。
[11] 培養容器を水平面内で移動又は振動させる剪断応力負荷機構を設けたことを特徴 とする請求項 10記載の生体力学的刺激負荷装置。
[12] 培養容器内に所定の形状の受容基を固定可能にし、荷重負荷用ピストンの下端部 の加圧体と受容基とで構成される培養体荷重負荷刺激部が、膝関節等の所定の形 状に類似した構造となるようにしたことを特徴とする請求項 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 又は 11記載の生体力学的刺激負荷装置。
[13] 荷重負荷用ピストンの下端部の加圧体と受容基とで構成される培養体荷重負荷刺 激部に、生体適合合成樹脂材料で製作された部材を装着するようにしたことを特徴と する請求項 12記載の生体力学的刺激負荷装置。
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