JPWO2005123905A1 - 生体力学的刺激負荷装置 - Google Patents
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Abstract
地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激や横方向の剪断応力刺激と同様の刺激を、体外培養にて培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体に繰り返し生体力学刺激として付与するための生体力学的刺激負荷による細胞培養方法及びその装置を提供する。炭酸ガスインキュベーター１内に設置される力学刺激負荷装置２及び培養容器３と、制御用コンピューター４とからなり、力学刺激負荷装置２を、荷重負荷用ピストン５と、この荷重負荷用ピストン５を所定の範囲内で上下方向に移動可能に支持するピストン上下移動用ステージ２１と、このピストン上下移動用ステージ２１を上下方向に移動させるためのステージ昇降機構２２とを備え、制御用コンピューター４によってステージ昇降機構２２を所定のサイクルで駆動することにより、ピストン上下移動用ステージ２１を上下方向に移動させ、ピストン上下移動用ステージ２１の降下時に、荷重負荷用ピストン５の重量が培養容器３内の培養体Ｃにかかるように構成する。
Description
本発明は、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激や横方向の剪断応力刺激と同様の刺激を、体外培養にて培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体（本明細書において、これらを包括して「培養体」という。）に繰り返し生体力学刺激として付与するための生体力学的刺激負荷による細胞培養方法及びその装置に関するものである。
近年、軟骨病変をもつ患者の治療として、患者本人の残された健常軟骨組織を採取し、体外に取り出し、軟骨細胞を分離し、体外培養にて増殖し、この自家培養軟骨細胞をもとの患者に移植する細胞移植治療方法が、欧米等で行われるようになった。
しかしながら、この方法は、軟骨細胞の培養、増殖を体外で行うものであるが、軟骨組織の再生を体外で行うものでなく、治療効果も不安定で、軟骨組織の修復、成熟に長期間を要するという問題があった。
しかしながら、この方法は、軟骨細胞の培養、増殖を体外で行うものであるが、軟骨組織の再生を体外で行うものでなく、治療効果も不安定で、軟骨組織の修復、成熟に長期間を要するという問題があった。
生体内の組織や細胞は、生化学的刺激だけでなく、重力や筋肉の収縮力、外力による力学的刺激を受けており、培養細胞及び培養組織は、静的あるいは動的な生体力学的刺激を受けることにより、増殖、分化、代謝等の機能が変化することが知られている。
ところで、このような知見に基づき、最近、生体力学的刺激を利用した細胞培養、組織培養を行う細胞培養装置が国内外の幾つかの研究グループにより検討、実施されてきた（例えば、特許文献１参照）。
応力刺激による培養システムとしては、細胞を付着させた膜部材を伸縮又は振動させて軟骨細胞や血管平滑筋細胞を培養する方法や、カラム内に支持体に保持された軟骨細胞を入れ、ポンプで培地を循環させ支持体中の軟骨へ培養液の流れによる応力刺激を行いながら軟骨細胞を培養する方法がある。
また、静水圧刺激による培養システムとしては、ガスシリンダ式の圧力負荷による軟骨細胞の刺激負荷方法があり、油圧シリンダ式ポンプでカラムに関節内圧に相当する５ＭＰａの圧力を負荷する方法で軟骨細胞への刺激負荷を行うようにしている。
また、カラム（カラム内デバイス）にポンプで培地を送液し、バルブ等の操作で培地の流量を変化させることにより圧力負荷のパターンやサイクルを任意に作り出すようにした細胞培養装置も提案されている。
これらの方法や装置は、生体で細胞にかかる圧力レベルや圧力の変化、圧力の上昇と下降のパターン等を培養液を介して生体内に近い状態が再現がされるものであるが、あくまでも、培養細胞の伸張や培養液の流れ、培養液を介した培養細胞への刺激であり、骨、軟骨等の支持組織にかかる重力による鉛直方向の生体力学的刺激が再現されているとはいえないものであった。
ここで、重力による鉛直方向の繰り返し刺激が生体にとって重要であることは、健常な宇宙飛行士が微小重力宇宙空間で生活し重力による刺激が減少したり、疾病や高齢により臥床を余儀なくされると、脊椎、上下肢に骨粗鬆症をきたすことが知られていることからも明らかである。
特開２００３−２６５１６４
このように、上記従来の技術は、培養細胞に対する重力による鉛直方向の荷重負荷刺激や、細胞外組織であるマトリックスに囲まれた状態での細胞にかかる力を再現しているものではない。
本発明は、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激や横方向の剪断応力刺激と同様の刺激を、体外培養にて培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体に繰り返し生体力学刺激として付与するための生体力学的刺激負荷による細胞培養方法及びその装置を提供することを目的とする。
本発明は、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激や横方向の剪断応力刺激と同様の刺激を、体外培養にて培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体に繰り返し生体力学刺激として付与するための生体力学的刺激負荷による細胞培養方法及びその装置を提供することを目的とする。
上記目的を達成するため、本発明の生体力学的刺激負荷による細胞培養方法は、炭酸ガスインキュベーター内に設置された培養容器内の培養体に生体力学的刺激を付与する方法であって、荷重負荷用ピストンの重量を所定のサイクルで培養容器内の培養体にかけることにより、培養容器内の培養体に鉛直方向の荷重負荷刺激を付与するようにしたことを特徴とする。
この場合において、培養容器内の培養体に鉛直方向の荷重負荷刺激を付与しながら、培養体を載置した培養容器を水平面内で移動又は振動させることにより、横方向の剪断応力刺激を付与するようにすることができる。
また、上記本発明の生体力学的刺激負荷による細胞培養方法を実施するための生体力学的刺激負荷装置は、炭酸ガスインキュベーター内に設置される力学刺激負荷装置及び培養容器と、制御用コンピューターとで構成した生体力学的刺激負荷装置であって、前記力学刺激負荷装置が、荷重負荷用ピストンと、該荷重負荷用ピストンを所定の範囲内で上下方向に移動可能に支持するピストン上下移動用ステージと、該ピストン上下移動用ステージを上下方向に移動させるためのステージ昇降機構とを備え、制御用コンピューターによってステージ昇降機構を所定のサイクルで駆動することにより、ピストン上下移動用ステージを上下方向に移動させ、ピストン上下移動用ステージの降下時に、荷重負荷用ピストンの重量が培養容器内の培養体にかかるようにしたことを特徴とする。
この場合において、荷重負荷用ピストンの上端部に追加荷重重鎮を装着するようにすることができる。
また、荷重負荷用ピストンの下端部に培養体に対応した形状の加圧体を装着するようにすることができる。
また、ピストン上下移動用ステージに複数個の荷重負荷用ピストンを支持するようにすることができる。
また、ピストン上下移動用ステージに載置したピストン載置用ステージを介して、荷重負荷用ピストンを支持するようにすることができる。
また、複数個の荷重負荷用ピストンを支持するようにしたピストン載置用ステージを、ピストン上下移動用ステージに対して、水平面内で移動可能に構成するようにすることができる。
また、荷重負荷用ピストンが、上下方向に移動する際に、回転しないようにピストン上下移動用ステージ又はピストン載置用ステージに支持するようにすることができる。
また、培養容器を力学刺激負荷装置の培養容器固定ステージに着脱可能に装着するようにすることができる。
また、培養容器を水平面内で移動又は振動させる剪断応力負荷機構を設けることができる。
また、培養容器内に所定の形状の受容基を固定可能にし、荷重負荷用ピストンの下端部の加圧体と受容基とで構成される培養体荷重負荷刺激部が、膝関節等の所定の形状に類似した構造となるようにすることができる。
また、荷重負荷用ピストンの下端部の加圧体と受容基とで構成される培養体荷重負荷刺激部に、生体適合合成樹脂材料で製作された部材を装着するようにすることができる。
本発明の生体力学的刺激負荷による細胞培養方法によれば、荷重負荷用ピストンの重量を所定のサイクルで培養容器内の培養体にかけることにより、培養容器内の培養体に鉛直方向の荷重負荷刺激を付与するようにしているので、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体に付与することができ、培養体を生体内の組織の環境に近似した状態で培養することができるため、移植後の力学負荷に耐え得る分化、成熟した培養体が作成可能となり、生体の組織の修復、成熟を効率的に行うことができる。
また、培養容器内の培養体に鉛直方向の荷重負荷刺激を付与しながら、培養体を載置した培養容器を水平面内で移動又は振動させることにより、横方向の剪断応力刺激を付与するようにすることにより、地上における生体内で組織に生じている横方向の剪断応力刺激と同様の刺激を培養体に付与することができ、培養体を生体内の組織の環境に近似した状態で培養することができるため、移植後の力学負荷に耐え得る分化、成熟した培養体が作成可能となり、生体の組織の修復、成熟を一層効率的に行うことができる。
また、上記本発明の生体力学的刺激負荷による細胞培養方法を実施するための生体力学的刺激負荷装置によれば、力学刺激負荷装置が、荷重負荷用ピストンと、該荷重負荷用ピストンを所定の範囲内で上下方向に移動可能に支持するピストン上下移動用ステージと、該ピストン上下移動用ステージを上下方向に移動させるためのステージ昇降機構とを備え、制御用コンピューターによってステージ昇降機構を所定のサイクルで駆動することにより、ピストン上下移動用ステージを上下方向に移動させ、ピストン上下移動用ステージの降下時に、荷重負荷用ピストンの重量が培養容器内の培養体にかかるように構成するようにしているので、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体に正確に付与する装置を、簡易に、かつ、低コストで得ることができる。
また、荷重負荷用ピストンの上端部に追加荷重重鎮を装着するようにすることにより、培養体に付与する鉛直方向の荷重負荷刺激の大きさを正確かつ簡易に調節することができる。
また、荷重負荷用ピストンの下端部に培養体に対応した形状の加圧体を装着するようにすることにより、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体に正確に付与することができる。
また、ピストン上下移動用ステージに複数個の荷重負荷用ピストンを支持するようにすることにより、複数個の培養体に鉛直方向の荷重負荷刺激を、荷重負荷刺激の大きさを同じにしたり、異なるようにして、同時に付与することができ、培養体の培養を効率的に行うことができる。
また、ピストン上下移動用ステージに載置したピストン載置用ステージを介して、荷重負荷用ピストンを支持することにより、種々の荷重負荷用ピストンの支持を簡易に行うことができる。
また、複数個の荷重負荷用ピストンを支持するようにしたピストン載置用ステージを、ピストン上下移動用ステージに対して、水平面内で移動可能に構成するようにすることにより、１つの培養体に異なる鉛直方向の荷重負荷刺激を付与することができる。
また、荷重負荷用ピストンが、上下方向に移動する際に、回転しないようにピストン上下移動用ステージ又はピストン載置用ステージに支持するようにすることにより、荷重負荷用ピストンの下端部に培養体に対応した形状の加圧体を装着するようにした場合等でも、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体に正確に付与することができる。
また、培養容器を力学刺激負荷装置の培養容器固定ステージに着脱可能に装着することにより、種々の培養容器の装着を簡易に行うことができる。
また、培養容器を水平面内で移動又は振動させる剪断応力負荷機構を設けることにより、地上における生体内で組織に生じている横方向の剪断応力刺激と同様の刺激を培養体に正確に付与する装置を、簡易に、かつ、低コストで得ることができる。
また、培養容器内に所定の形状の受容基を固定可能にし、荷重負荷用ピストンの下端部の加圧体と受容基とで構成される培養体荷重負荷刺激部が、膝関節等の所定の形状に類似した構造となるようにすることにより、細胞外組織であるマトリックスに囲まれた状態での細胞にかかる力を容易に再現することができる。
また、荷重負荷用ピストンの下端部の加圧体と受容基とで構成される培養体荷重負荷刺激部に、生体適合合成樹脂材料で製作された部材を装着するようにすることにより、培養体を生体内の組織の環境に近似した状態で培養することができるため、培養体の移植後の生体に対する適合性を向上することができる。
１ 炭酸ガスインキュベーター
２ 力学的刺激負荷装置
２０ ガイド部材
２１ ピストン上下移動用ステージ
２１ａ 孔部
２２ ステージ昇降機構
２２ａ 電動アクチュエーター
２２ｂ ワイヤー
２３ ピストン載置用ステージ
２３ａ 孔部
２３ｂ ピストン載置用ステージ駆動機構
２４ 培養容器固定ステージ
２５ 剪断応力ステージ
２６ 剪断応力負荷機構
２７ 追加荷重重鎮上下移動用ステージ
２８ 追加荷重重鎮載置用ステージ
２８ｂ 追加荷重重鎮載置用ステージ
３ 培養容器
３０ 内部培養容器
３１ 受容基
３１Ａ 人工脛骨骨軟骨
３２ 培地槽（注入用）
３３ 培地槽（排出用）
４ 制御用コンピューター
５ 荷重負荷用ピストン
５ａ 荷重負荷用ピストン
５ｂ 荷重負荷用ピストン
５１ 加圧体
５１Ａ 加圧体
５１Ａａ 加圧体
５１Ａｂ 加圧体
５１Ｃ 加圧体
５１Ｄ 人工大腿骨骨軟骨
５２ ガイド軸部
５３ 大径部
５４ 重鎮装着部
５５ 追加荷重重鎮
５５ａ 追加荷重重鎮
５５ｂ 追加荷重重鎮
Ｃ 培養体（培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体）
Ｘ 培養体荷重負荷刺激部
２ 力学的刺激負荷装置
２０ ガイド部材
２１ ピストン上下移動用ステージ
２１ａ 孔部
２２ ステージ昇降機構
２２ａ 電動アクチュエーター
２２ｂ ワイヤー
２３ ピストン載置用ステージ
２３ａ 孔部
２３ｂ ピストン載置用ステージ駆動機構
２４ 培養容器固定ステージ
２５ 剪断応力ステージ
２６ 剪断応力負荷機構
２７ 追加荷重重鎮上下移動用ステージ
２８ 追加荷重重鎮載置用ステージ
２８ｂ 追加荷重重鎮載置用ステージ
３ 培養容器
３０ 内部培養容器
３１ 受容基
３１Ａ 人工脛骨骨軟骨
３２ 培地槽（注入用）
３３ 培地槽（排出用）
４ 制御用コンピューター
５ 荷重負荷用ピストン
５ａ 荷重負荷用ピストン
５ｂ 荷重負荷用ピストン
５１ 加圧体
５１Ａ 加圧体
５１Ａａ 加圧体
５１Ａｂ 加圧体
５１Ｃ 加圧体
５１Ｄ 人工大腿骨骨軟骨
５２ ガイド軸部
５３ 大径部
５４ 重鎮装着部
５５ 追加荷重重鎮
５５ａ 追加荷重重鎮
５５ｂ 追加荷重重鎮
Ｃ 培養体（培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体）
Ｘ 培養体荷重負荷刺激部
以下、本発明の生体力学的刺激負荷による細胞培養方法及びその装置の実施の形態を図面に基づいて説明する。
図１〜図２に、本発明の生体力学的刺激負荷による細胞培養方法を実施するための生体力学的刺激負荷装置の第１実施例を示す。
この生体力学的刺激負荷装置は、炭酸ガスインキュベーター１内に設置される力学刺激負荷装置２及び培養容器３と、制御用コンピューター４とで構成されている。
なお、生体力学的刺激負荷装置の操作は、すべて炭酸ガスインキュベーター２の外から行えるようにし、これにより、炭酸ガスインキュベーター２内の滅菌状態を保って長時間に亘っての培養を可能にすることができる。
なお、生体力学的刺激負荷装置の操作は、すべて炭酸ガスインキュベーター２の外から行えるようにし、これにより、炭酸ガスインキュベーター２内の滅菌状態を保って長時間に亘っての培養を可能にすることができる。
炭酸ガスインキュベーター２は、その内部を滅菌し、温度、湿度、酸素、二酸化炭素、窒素分圧等を制御した環境で使用するようにする。
この炭酸ガスインキュベーター１内に設置される力学刺激負荷装置２は、荷重負荷用ピストン５と、この荷重負荷用ピストン５を所定の範囲内で上下方向に移動可能に支持するピストン上下移動用ステージ２１と、このピストン上下移動用ステージ２１を上下方向に移動させるためのステージ昇降機構２２とを備え、制御用コンピューター４によってステージ昇降機構２２を所定のサイクルで駆動することにより、ピストン上下移動用ステージ２１を上下方向に移動させ、ピストン上下移動用ステージ２１の降下時に、荷重負荷用ピストン５の重量が培養容器３内の培養体Ｃにかかるように構成している。
これにより、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体Ｃに付与することができるようにしている。
これにより、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体Ｃに付与することができるようにしている。
ピストン上下移動用ステージ２１を上下方向に移動させるためのステージ昇降機構２２は、例えば、電動アクチュエーター２２ａと、この電動アクチュエーター２２ａに接続され、ピストン上下移動用ステージ２１を吊り下げるワイヤー２２ｂとからなる。
そして、制御用コンピューター４の指令で電動アクチュエーター２２ａを操作することにより、ピストン上下移動用ステージ２１をワイヤー２２ｂを介して、ガイド部材２０に沿って上下方向に移動できるようにしている。
そして、制御用コンピューター４の指令で電動アクチュエーター２２ａを操作することにより、ピストン上下移動用ステージ２１をワイヤー２２ｂを介して、ガイド部材２０に沿って上下方向に移動できるようにしている。
ところで、本実施例においては、ピストン上下移動用ステージ２１に載置したピストン載置用ステージ２３を介して、複数（例えば、５個×５個の合計２５個）の荷重負荷用ピストン５を支持するようにしている。
この場合、ピストン上下移動用ステージ２１は、ピストン載置用ステージ２３を載置するためのものであるので、中央部に荷重負荷用ピストン５が自由に上下方向に移動できるようにするための孔部２１ａを形成するようにする。
これにより、種々の荷重負荷用ピストン５の支持を簡易に行うことができる。
なお、ピストン載置用ステージ２３を省略して、ピストン上下移動用ステージ２１に荷重負荷用ピストン５を直接支持するようにすることもできる。
この場合、ピストン上下移動用ステージ２１は、ピストン載置用ステージ２３を載置するためのものであるので、中央部に荷重負荷用ピストン５が自由に上下方向に移動できるようにするための孔部２１ａを形成するようにする。
これにより、種々の荷重負荷用ピストン５の支持を簡易に行うことができる。
なお、ピストン載置用ステージ２３を省略して、ピストン上下移動用ステージ２１に荷重負荷用ピストン５を直接支持するようにすることもできる。
荷重負荷用ピストン５は、下端部に培養体Ｃに対応した形状の加圧部５１を、中間部にピストン載置用ステージ２３に形成した孔部２３ａに嵌挿されるガイド軸部５２を、その上部に大径部５３を、上端部に追加荷重重鎮５５を装着するための重鎮装着部５４を形成するようにする。
これにより、図２（ａ）に示すように、ピストン載置用ステージ２３に荷重負荷用ピストン５を支持した状態から、ピストン上下移動用ステージ２１を下方向に移動させ、図２（ｂ）に示すように、ピストン上下移動用ステージ２１の降下時に、荷重負荷用ピストン５の大径部５３によるピストン載置用ステージ２３への支持が解除されるようにして、荷重負荷用ピストン５の重量が培養容器３内の培養体Ｃに直接かかるようにする。
その後、ピストン上下移動用ステージ２１を上方向に移動させることによって、図２（ａ）に示すように、ピストン載置用ステージ２３に荷重負荷用ピストン５を支持した状態に復帰させる。
この荷重負荷用ピストン５による鉛直方向の荷重負荷刺激は、制御用コンピューター４の操作で荷重サイクル、荷重時間を自由に操作できる。
また、追加荷重重鎮５５は、必要に応じて、重鎮装着部５４に装着することができ、また、その重さも自由に設定できることから、培養体Ｃに付与する鉛直方向の荷重負荷刺激の大きさを簡易に調節することができる。
これにより、図２（ａ）に示すように、ピストン載置用ステージ２３に荷重負荷用ピストン５を支持した状態から、ピストン上下移動用ステージ２１を下方向に移動させ、図２（ｂ）に示すように、ピストン上下移動用ステージ２１の降下時に、荷重負荷用ピストン５の大径部５３によるピストン載置用ステージ２３への支持が解除されるようにして、荷重負荷用ピストン５の重量が培養容器３内の培養体Ｃに直接かかるようにする。
その後、ピストン上下移動用ステージ２１を上方向に移動させることによって、図２（ａ）に示すように、ピストン載置用ステージ２３に荷重負荷用ピストン５を支持した状態に復帰させる。
この荷重負荷用ピストン５による鉛直方向の荷重負荷刺激は、制御用コンピューター４の操作で荷重サイクル、荷重時間を自由に操作できる。
また、追加荷重重鎮５５は、必要に応じて、重鎮装着部５４に装着することができ、また、その重さも自由に設定できることから、培養体Ｃに付与する鉛直方向の荷重負荷刺激の大きさを簡易に調節することができる。
また、荷重負荷用ピストン５の加圧部５１の形状は、培養体Ｃに対応した任意の形状とすることができ、さらに、図３に示す荷重負荷用ピストン５の変形例のように、培養体Ｃに対応した形状の加圧体５１Ａを別部材で形成し、荷重負荷用ピストン５の下端部５１Ｂに装着するようにすることもできる。
これにより、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体Ｃに正確に付与することができる。
これにより、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体Ｃに正確に付与することができる。
また、荷重負荷用ピストン５が、上下方向に移動する際に、回転しないようにピストン載置用ステージ２３（又はピストン上下移動用ステージ２１）に支持するようにすることができる。
具体的には、ピストン載置用ステージ２３に形成した孔部２３ａを多角形に形成し、ガイド軸部５２をこの多角形の孔部２３ａに適合した多角形の断面形状を有するように形成する。
これにより、荷重負荷用ピストン５の下端部５１Ｂに培養体Ｃに対応した形状（円形以外）の加圧体５１Ａを装着するようにした場合等でも、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体Ｃに正確に付与することができる。
具体的には、ピストン載置用ステージ２３に形成した孔部２３ａを多角形に形成し、ガイド軸部５２をこの多角形の孔部２３ａに適合した多角形の断面形状を有するように形成する。
これにより、荷重負荷用ピストン５の下端部５１Ｂに培養体Ｃに対応した形状（円形以外）の加圧体５１Ａを装着するようにした場合等でも、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体Ｃに正確に付与することができる。
培養容器３は、力学刺激負荷装置２の培養容器固定ステージ２４に着脱可能に装着するようにする。
これにより、種々の培養容器３の装着を簡易に行うことができる。
また、培養容器３には、必要に応じて、培地槽（注入用）３２と、培地槽（排出用）３３とを接続し、培地の注入及び排出を制御用コンピューター４によって制御するようにすることもできる。
これにより、種々の培養容器３の装着を簡易に行うことができる。
また、培養容器３には、必要に応じて、培地槽（注入用）３２と、培地槽（排出用）３３とを接続し、培地の注入及び排出を制御用コンピューター４によって制御するようにすることもできる。
また、培養容器３を水平面内で移動又は振動させる剪断応力負荷機構２６を設けるようにしている。
具体的には、培養容器固定ステージ２４上に、培養容器固定ステージ２４に対して水平面内で移動可能に剪断応力ステージ２５を配設し、この剪断応力ステージ２５上に培養容器３を装着するようにするとともに、剪断応力ステージ２５を、剪断応力負荷機構２６により水平面内で移動又は振動させるようにする。
なお、水平面内で移動又は振動の方向は、１方向に限定されず、Ｘ、Ｙ方向の２方向や円運動等、任意の方向とすることができる。
剪断応力負荷機構２６としては、例えば、電動アクチュエーターや永久磁石と電磁石を組み合わせた移動機構又は振動機構を用いることができ、この剪断応力負荷機構２６の駆動は、制御用コンピューター４によって制御するようにする。
これにより、地上における生体内で組織に生じている横方向の剪断応力刺激、例えば、膝関節に屈曲、伸展の運動時に加わる刺激と同様の刺激を培養体Ｃに付与することができる。
この場合、荷重負荷用ピストン５による培養容器３内の培養体Ｃへの鉛直方向の荷重負荷刺激の付与方法を調整しながら、剪断応力負荷機構２６によって培養容器３を水平面内で移動又は振動させることにより、斜め方向の剪断応力刺激を付与するようにすることもできる。
具体的には、培養容器固定ステージ２４上に、培養容器固定ステージ２４に対して水平面内で移動可能に剪断応力ステージ２５を配設し、この剪断応力ステージ２５上に培養容器３を装着するようにするとともに、剪断応力ステージ２５を、剪断応力負荷機構２６により水平面内で移動又は振動させるようにする。
なお、水平面内で移動又は振動の方向は、１方向に限定されず、Ｘ、Ｙ方向の２方向や円運動等、任意の方向とすることができる。
剪断応力負荷機構２６としては、例えば、電動アクチュエーターや永久磁石と電磁石を組み合わせた移動機構又は振動機構を用いることができ、この剪断応力負荷機構２６の駆動は、制御用コンピューター４によって制御するようにする。
これにより、地上における生体内で組織に生じている横方向の剪断応力刺激、例えば、膝関節に屈曲、伸展の運動時に加わる刺激と同様の刺激を培養体Ｃに付与することができる。
この場合、荷重負荷用ピストン５による培養容器３内の培養体Ｃへの鉛直方向の荷重負荷刺激の付与方法を調整しながら、剪断応力負荷機構２６によって培養容器３を水平面内で移動又は振動させることにより、斜め方向の剪断応力刺激を付与するようにすることもできる。
培養容器３内には、図２（ｂ）及び図４に示すように、培養体Ｃに適合した任意の形状の内部培養容器３０を設置し、この内部培養容器３０の荷重負荷用ピストン５の加圧部５１と相対する位置に培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体の受容基３１を装着し、受容基３１の上に培養体Ｃとしての培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体を載置するようにする。
図３に示す荷重負荷用ピストン５の加圧体５１Ａ及び図４に示す内部培養容器３０の平坦形状の受容基３１は、培養体Ｃとして皮膚の培養組織に適したもので、皮膚の培養組織に鉛直方向の荷重負荷刺激と、横方向の剪断応力刺激を、それぞれ付与することができる。
図３に示す荷重負荷用ピストン５の加圧体５１Ａ及び図４に示す内部培養容器３０の平坦形状の受容基３１は、培養体Ｃとして皮膚の培養組織に適したもので、皮膚の培養組織に鉛直方向の荷重負荷刺激と、横方向の剪断応力刺激を、それぞれ付与することができる。
図５〜図６に、本発明の生体力学的刺激負荷による細胞培養方法を実施するための生体力学的刺激負荷装置の第２実施例を示す。
この生体力学的刺激負荷装置は、上記第１実施例の生体力学的刺激負荷装置に、複数個（複数種類）の荷重負荷用ピストン５ａ、５ｂ（加圧体５１Ａａ、５１Ａｂ）を支持するようにしたピストン載置用ステージ２３を、ピストン上下移動用ステージ２１に対して、水平面内で移動可能に構成するようにしたり、さらには、複数個（複数種類）の追加荷重重鎮５５ａ、５５ｂを支持するようにした追加荷重重鎮載置用ステージ２８を、追加荷重重鎮上下移動用ステージ２７に対して、水平面内で移動可能に構成するようにし、荷重負荷用ピストン５ａ、５ｂと追加荷重重鎮５５ａ、５５ｂとの組み合わせを任意に選択できるようにする機能に付加したものである。
具体的には、ピストン上下移動用ステージ２１上に、ピストン上下移動用ステージ２１に対して水平面内で移動可能（例えば、回転可能）にピストン載置用ステージ２３を配設し、同様に、追加荷重重鎮上下移動用ステージ２７上に、追加荷重重鎮上下移動用ステージ２７に対して水平面内で移動可能（例えば、回転可能）に追加荷重重鎮載置用ステージ２８を配設し、ピストン載置用ステージ２３及び追加荷重重鎮載置用ステージ２８を、ピストン載置用ステージ駆動機構２３ｂ及び追加荷重重鎮載置用ステージ駆動機構２８ｂにより、それぞれ独立して水平面内で移動（例えば、回転）させるようにする。
ピストン載置用ステージ駆動機構２３ｂ及び追加荷重重鎮載置用ステージ駆動機構２８ｂとしては、例えば、電動モーターとギヤを組み合わせた駆動機構を用いることができ、このピストン載置用ステージ駆動機構２３ｂ及び追加荷重重鎮載置用ステージ駆動機構２８ｂの駆動は、制御用コンピューター４によって制御するようにする。
ピストン載置用ステージ駆動機構２３ｂ及び追加荷重重鎮載置用ステージ駆動機構２８ｂとしては、例えば、電動モーターとギヤを組み合わせた駆動機構を用いることができ、このピストン載置用ステージ駆動機構２３ｂ及び追加荷重重鎮載置用ステージ駆動機構２８ｂの駆動は、制御用コンピューター４によって制御するようにする。
そして、図５及び図６に示すように、ピストン載置用ステージ２３に荷重負荷用ピストン５ａ、５ｂを、また、追加荷重重鎮載置用ステージ２８に追加荷重重鎮５５ａ、５５ｂを、それぞれ支持した状態から、ピストン上下移動用ステージ２１及び追加荷重重鎮載置用ステージ２８を下方向に移動させ、ピストン上下移動用ステージ２１及び追加荷重重鎮載置用ステージ２８の降下時に、荷重負荷用ピストン５の大径部５３によるピストン載置用ステージ２３への支持、及び同様に追加荷重重鎮５５ａ、５５ｂの追加荷重重鎮載置用ステージ２８への支持が、順次解除されるようにして、荷重負荷用ピストン５ａ、５ｂ及び追加荷重重鎮５５ａ、５５ｂの重量が培養容器３内の培養体Ｃに直接かかるようにする。
その後、ピストン上下移動用ステージ２１及び追加荷重重鎮載置用ステージ２８を上方向に移動させることによって、図２及び図６に示すように、ピストン載置用ステージ２３に荷重負荷用ピストン５ａ、５ｂを、また、追加荷重重鎮載置用ステージ２８に追加荷重重鎮５５ａ、５５ｂを、それぞれ支持した状態に復帰させる。
これにより、荷重負荷用ピストン５ａ、５ｂと追加荷重重鎮５５ａ、５５ｂとの組み合わせを任意に選択して、１つの培養体Ｃに、異なる荷重負荷用ピストン５ａ、５ｂ（加圧体５１Ａａ、５１Ａｂ）によって、異なる大きさの鉛直方向の荷重負荷刺激を簡易に付与することができる。
その後、ピストン上下移動用ステージ２１及び追加荷重重鎮載置用ステージ２８を上方向に移動させることによって、図２及び図６に示すように、ピストン載置用ステージ２３に荷重負荷用ピストン５ａ、５ｂを、また、追加荷重重鎮載置用ステージ２８に追加荷重重鎮５５ａ、５５ｂを、それぞれ支持した状態に復帰させる。
これにより、荷重負荷用ピストン５ａ、５ｂと追加荷重重鎮５５ａ、５５ｂとの組み合わせを任意に選択して、１つの培養体Ｃに、異なる荷重負荷用ピストン５ａ、５ｂ（加圧体５１Ａａ、５１Ａｂ）によって、異なる大きさの鉛直方向の荷重負荷刺激を簡易に付与することができる。
なお、この生体力学的刺激負荷装置のその他の構成及び作用は、上記第１実施例の生体力学的刺激負荷装置と同様である。
図７に、本発明の生体力学的刺激負荷による細胞培養方法を実施するための生体力学的刺激負荷装置の第３実施例を示す。
この生体力学的刺激負荷装置は、半月板、関節唇、関節円盤等の培養に好適に用いられるもので、培養容器３内に、培養体Ｃに適合した内部培養容器３０を設置し、この内部培養容器３０の荷重負荷用ピストン５の加圧体５１Ｃと相対する位置に培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体の受容基３１を装着し、受容基３１の上に培養体Ｃとしての培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体を載置するようにする。
半月板、関節唇、関節円盤等は、骨に類似した硬度で生体内で負荷刺激を受けているのではなく、骨軟骨で荷重負荷刺激を受けているため、その培養（ここでは、半月板の培養）には、荷重負荷用ピストン５の加圧体５１Ｃに大腿骨骨軟骨に類似した生体適合材料の合成樹脂で製作した人工大腿骨骨軟骨５１Ｄを装着し、受容基３１に脛骨骨軟骨に類似した生体適合材料の合成樹脂で製作した人工脛骨骨軟骨３１Ａを載置することにより、その間に形成された培養体荷重負荷刺激部Ｘが、生体の所定の形状（ここでは、膝関節）に類似した構造となるようにし、この培養体荷重負荷刺激部Ｘに培養体Ｃ（ここでは、半月板用特殊形状培養ディッシュ）を入れて、骨軟骨（ここでは、膝関節の骨軟骨）による荷重負荷刺激を再現するようにする。
これにより、細胞外組織であるマトリックスに囲まれた状態での細胞にかかる力を容易に再現することができるとともに、培養体Ｃを生体内の組織の環境に近似した状態で培養することができるため、培養体の移植後の生体に対する適合性を向上することができる。
この場合、培養組織又は培養細胞を含む構造体からなる培養体Ｃは、予め移植に適した形状に形成することができ、具体的には、培養細胞を含む構造体のマトリックスを、生体適合材料をベースにした３次元の細胞支持体とし、例えば、コラーゲンを主体にした細胞支持体等を用い、軟骨細胞や半月板細胞を播種、接着させた培養細胞を含む構造体とすることができる。
半月板、関節唇、関節円盤等は、骨に類似した硬度で生体内で負荷刺激を受けているのではなく、骨軟骨で荷重負荷刺激を受けているため、その培養（ここでは、半月板の培養）には、荷重負荷用ピストン５の加圧体５１Ｃに大腿骨骨軟骨に類似した生体適合材料の合成樹脂で製作した人工大腿骨骨軟骨５１Ｄを装着し、受容基３１に脛骨骨軟骨に類似した生体適合材料の合成樹脂で製作した人工脛骨骨軟骨３１Ａを載置することにより、その間に形成された培養体荷重負荷刺激部Ｘが、生体の所定の形状（ここでは、膝関節）に類似した構造となるようにし、この培養体荷重負荷刺激部Ｘに培養体Ｃ（ここでは、半月板用特殊形状培養ディッシュ）を入れて、骨軟骨（ここでは、膝関節の骨軟骨）による荷重負荷刺激を再現するようにする。
これにより、細胞外組織であるマトリックスに囲まれた状態での細胞にかかる力を容易に再現することができるとともに、培養体Ｃを生体内の組織の環境に近似した状態で培養することができるため、培養体の移植後の生体に対する適合性を向上することができる。
この場合、培養組織又は培養細胞を含む構造体からなる培養体Ｃは、予め移植に適した形状に形成することができ、具体的には、培養細胞を含む構造体のマトリックスを、生体適合材料をベースにした３次元の細胞支持体とし、例えば、コラーゲンを主体にした細胞支持体等を用い、軟骨細胞や半月板細胞を播種、接着させた培養細胞を含む構造体とすることができる。
なお、この生体力学的刺激負荷装置のその他の構成及び作用は、上記第１実施例及び第２実施例の生体力学的刺激負荷装置と同様である。
本発明は、炭酸ガスインキュベーター内を滅菌し、温度、湿度、酸素、二酸化炭素、窒素分圧等を制御した環境で、体外培養にて培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体からなる培養体に、生体力学的刺激負荷を生体内環境、構造と類似した環境で、鉛直方向の荷重負荷刺激を重力を利用して、さらに、横方向の剪断応力刺激を培養容器を水平面内で移動又は振動させることにより、直接付与することができる。
また、本発明の生体力学的刺激負荷装置は、炭酸ガスインキュべーター２の外部からの操作を行うことができ、培地の入れ替えも外部からの操作で行うために、長時間の連続培養ができる。またこの生体力学的刺激負荷装置は大きな動力も必要とせず、荷重負荷重量は正確でコンパクトな生体力学的刺激負荷装置も製造可能である。
これによって、培養体を生体内の組織の環境に近似した状態で培養することができるため、移植後の力学負荷に耐え得る分化、成熟した培養体が作成可能となり、生体の組織の修復、成熟を効率的に行うことができる。
そして、従来の組織培養技術では得られなかった生体力学負荷刺激を体外で行うとともに、培養体を移植に適する形態で培養することにより、培養体の増殖、分化に影響を与え、移植に適した組織を作成することができる。
また、本発明の生体力学的刺激負荷による細胞培養方法及びその装置を用いた基礎医学研究により、体外で生体力学負荷刺激を受けた組織は、移植後の力学負荷に耐え得る分化成熟した培養組織の作成が可能となり、生体の組織再生、移植医療に貢献することができる。
さらに、本発明は、生体の起立、歩行、走行、飛び跳ね、膝の捻りに極めて類似した刺激を加えることができることから、骨、軟骨、皮膚等の破壊、損傷のメカニズムの解明に寄与することも期待できる。具体的には、鉛直方向の荷重負荷用ピストンの重量を損傷荷重重量に変え、下降スピードを速め鉛直方向の衝撃的刺激も加えることができ、また、損傷荷重重量を加えた状態で強い横方向の剪断応力を加え膝を捻った状態の刺激を加えることもできる。また横方向の移動を繰り返し剪断応力を長時間加え骨の摩耗等の研究も行うことができる。
また、本発明の生体力学的刺激負荷装置は、炭酸ガスインキュべーター２の外部からの操作を行うことができ、培地の入れ替えも外部からの操作で行うために、長時間の連続培養ができる。またこの生体力学的刺激負荷装置は大きな動力も必要とせず、荷重負荷重量は正確でコンパクトな生体力学的刺激負荷装置も製造可能である。
これによって、培養体を生体内の組織の環境に近似した状態で培養することができるため、移植後の力学負荷に耐え得る分化、成熟した培養体が作成可能となり、生体の組織の修復、成熟を効率的に行うことができる。
そして、従来の組織培養技術では得られなかった生体力学負荷刺激を体外で行うとともに、培養体を移植に適する形態で培養することにより、培養体の増殖、分化に影響を与え、移植に適した組織を作成することができる。
また、本発明の生体力学的刺激負荷による細胞培養方法及びその装置を用いた基礎医学研究により、体外で生体力学負荷刺激を受けた組織は、移植後の力学負荷に耐え得る分化成熟した培養組織の作成が可能となり、生体の組織再生、移植医療に貢献することができる。
さらに、本発明は、生体の起立、歩行、走行、飛び跳ね、膝の捻りに極めて類似した刺激を加えることができることから、骨、軟骨、皮膚等の破壊、損傷のメカニズムの解明に寄与することも期待できる。具体的には、鉛直方向の荷重負荷用ピストンの重量を損傷荷重重量に変え、下降スピードを速め鉛直方向の衝撃的刺激も加えることができ、また、損傷荷重重量を加えた状態で強い横方向の剪断応力を加え膝を捻った状態の刺激を加えることもできる。また横方向の移動を繰り返し剪断応力を長時間加え骨の摩耗等の研究も行うことができる。
本発明の生体力学的刺激負荷装置は組織培養装置として力学的刺激負荷をいろいろな条件でかけられ、かつ比較的簡便な装置で小型化も可能であり、力学的刺激を重力鉛直方向や横方向の剪断応力刺激を細胞外マトリックスを介して負荷するという、生体内での環境に類似した負荷をかけ得るという点で従来にない利点を有している。多くの医学生物学の組織再生分野の研究室での標準的な培養装置の製品として普及可能であり、新たな産業化の可能性があり、またこの装置が骨、軟骨の培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体培養に有益な装置であることが認められ、軟骨等の製造装置となれば、半月板だけの再生治療のニーズも、骨のニーズと同等かそれ以上のニーズがあり、日本国内だけでも年間１万症例がその対象例となり得る。
本発明は、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激や横方向の剪断応力刺激と同様の刺激を、体外培養にて培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体（本明細書において、これらを包括して「培養体」という。）に繰り返し生体力学刺激として付与するための生体力学的刺激負荷装置に関するものである。
近年、軟骨病変をもつ患者の治療として、患者本人の残された健常軟骨組織を採取し、体外に取り出し、軟骨細胞を分離し、体外培養にて増殖し、この自家培養軟骨細胞をもとの患者に移植する細胞移植治療方法が、欧米等で行われるようになった。
しかしながら、この方法は、軟骨細胞の培養、増殖を体外で行うものであるが、軟骨組織の再生を体外で行うものでなく、治療効果も不安定で、軟骨組織の修復、成熟に長期間を要するという問題があった。
しかしながら、この方法は、軟骨細胞の培養、増殖を体外で行うものであるが、軟骨組織の再生を体外で行うものでなく、治療効果も不安定で、軟骨組織の修復、成熟に長期間を要するという問題があった。
生体内の組織や細胞は、生化学的刺激だけでなく、重力や筋肉の収縮力、外力による力学的刺激を受けており、培養細胞及び培養組織は、静的あるいは動的な生体力学的刺激を受けることにより、増殖、分化、代謝等の機能が変化することが知られている。
ところで、このような知見に基づき、最近、生体力学的刺激を利用した細胞培養、組織培養を行う細胞培養装置が国内外の幾つかの研究グループにより検討、実施されてきた（例えば、特許文献１参照）。
応力刺激による培養システムとしては、細胞を付着させた膜部材を伸縮又は振動させて軟骨細胞や血管平滑筋細胞を培養する方法や、カラム内に支持体に保持された軟骨細胞を入れ、ポンプで培地を循環させ支持体中の軟骨へ培養液の流れによる応力刺激を行いながら軟骨細胞を培養する方法がある。
また、静水圧刺激による培養システムとしては、ガスシリンダ式の圧力負荷による軟骨細胞の刺激負荷方法があり、油圧シリンダ式ポンプでカラムに関節内圧に相当する５ＭＰａの圧力を負荷する方法で軟骨細胞への刺激負荷を行うようにしている。
また、カラム（カラム内デバイス）にポンプで培地を送液し、バルブ等の操作で培地の流量を変化させることにより圧力負荷のパターンやサイクルを任意に作り出すようにした細胞培養装置も提案されている。
これらの方法や装置は、生体で細胞にかかる圧力レベルや圧力の変化、圧力の上昇と下降のパターン等を培養液を介して生体内に近い状態が再現がされるものであるが、あくまでも、培養細胞の伸張や培養液の流れ、培養液を介した培養細胞への刺激であり、骨、軟骨等の支持組織にかかる重力による鉛直方向の生体力学的刺激が再現されているとはいえないものであった。
ここで、重力による鉛直方向の繰り返し刺激が生体にとって重要であることは、健常な宇宙飛行士が微小重力宇宙空間で生活し重力による刺激が減少したり、疾病や高齢により臥床を余儀なくされると、脊椎、上下肢に骨粗鬆症をきたすことが知られていることからも明らかである。
特開２００３−２６５１６４
このように、上記従来の技術は、培養細胞に対する重力による鉛直方向の荷重負荷刺激や、細胞外組織であるマトリックスに囲まれた状態での細胞にかかる力を再現しているものではない。
本発明は、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激や横方向の剪断応力刺激と同様の刺激を、体外培養にて培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体に繰り返し生体力学刺激として付与するための生体力学的刺激負荷装置を提供することを目的とする。
本発明は、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激や横方向の剪断応力刺激と同様の刺激を、体外培養にて培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体に繰り返し生体力学刺激として付与するための生体力学的刺激負荷装置を提供することを目的とする。
上記目的を達成するため、本発明の生体力学的刺激負荷装置は、炭酸ガスインキュベーター内に設置される力学刺激負荷装置及び培養容器と、制御用コンピューターとで構成した生体力学的刺激負荷装置であって、前記力学刺激負荷装置が、荷重負荷用ピストンと、該荷重負荷用ピストンを所定の範囲内で上下方向に移動可能に支持するピストン上下移動用ステージと、該ピストン上下移動用ステージを上下方向に移動させるためのステージ昇降機構とを備え、制御用コンピューターによってステージ昇降機構を所定のサイクルで駆動することにより、ピストン上下移動用ステージを上下方向に移動させ、ピストン上下移動用ステージの降下時に、荷重負荷用ピストンの重量が培養容器内の培養体にかかるようにした生体力学的刺激負荷装置であって、前記ピストン上下移動用ステージにピストン載置用ステージを載置するようにし、該ピストン載置用ステージに形成した複数個の孔部に、それぞれ荷重負荷用ピストンを嵌挿、支持するようにし、前記ピストン上下移動用ステージに複数個の荷重負荷用ピストンが自由に上下方向に移動できるようにするための共通の孔部を形成したことを特徴とする。
この場合において、荷重負荷用ピストンの上端部に追加荷重重鎮を装着するようにすることができる。
また、荷重負荷用ピストンの下端部に培養体に対応した形状の加圧体を装着するようにすることができる。
また、複数個の荷重負荷用ピストンを支持するようにしたピストン載置用ステージを、ピストン上下移動用ステージに対して、水平面内で移動可能に構成するようにすることができる。
また、荷重負荷用ピストンが、上下方向に移動する際に、回転しないようにピストン上下移動用ステージ又はピストン載置用ステージに支持するようにすることができる。
また、培養容器を力学刺激負荷装置の培養容器固定ステージに着脱可能に装着するようにすることができる。
また、培養容器を水平面内で移動又は振動させる剪断応力負荷機構を設けることができる。
また、培養容器内に所定の形状の受容基を固定可能にし、荷重負荷用ピストンの下端部の加圧体と受容基とで構成される培養体荷重負荷刺激部が、膝関節等の所定の形状に類似した構造となるようにすることができる。
また、荷重負荷用ピストンの下端部の加圧体と受容基とで構成される培養体荷重負荷刺激部に、生体適合合成樹脂材料で製作された部材を装着するようにすることができる。
本発明の生体力学的刺激負荷装置による生体力学的刺激負荷による細胞培養方法によれば、荷重負荷用ピストンの重量を所定のサイクルで培養容器内の培養体にかけることにより、培養容器内の培養体に鉛直方向の荷重負荷刺激を付与するようにしているので、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体に付与することができ、培養体を生体内の組織の環境に近似した状態で培養することができるため、移植後の力学負荷に耐え得る分化、成熟した培養体が作成可能となり、生体の組織の修復、成熟を効率的に行うことができる。
また、培養容器内の培養体に鉛直方向の荷重負荷刺激を付与しながら、培養体を載置した培養容器を水平面内で移動又は振動させることにより、横方向の剪断応力刺激を付与するようにすることにより、地上における生体内で組織に生じている横方向の剪断応力刺激と同様の刺激を培養体に付与することができ、培養体を生体内の組織の環境に近似した状態で培養することができるため、移植後の力学負荷に耐え得る分化、成熟した培養体が作成可能となり、生体の組織の修復、成熟を一層効率的に行うことができる。
そして、本発明の生体力学的刺激負荷装置によれば、力学刺激負荷装置が、荷重負荷用ピストンと、該荷重負荷用ピストンを所定の範囲内で上下方向に移動可能に支持するピストン上下移動用ステージと、該ピストン上下移動用ステージを上下方向に移動させるためのステージ昇降機構とを備え、制御用コンピューターによってステージ昇降機構を所定のサイクルで駆動することにより、ピストン上下移動用ステージを上下方向に移動させ、ピストン上下移動用ステージの降下時に、荷重負荷用ピストンの重量が培養容器内の培養体にかかるように構成するようにしているので、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体に正確に付与する装置を、簡易に、かつ、低コストで得ることができる。
ここで、ピストン上下移動用ステージにピストン載置用ステージを載置するようにし、該ピストン載置用ステージに形成した複数個の孔部に、それぞれ荷重負荷用ピストンを嵌挿、支持するようにし、前記ピストン上下移動用ステージに複数個の荷重負荷用ピストンが自由に上下方向に移動できるようにするための共通の孔部を形成することにより、複数個の培養体に鉛直方向の荷重負荷刺激を、荷重負荷刺激の大きさを同じにしたり、異なるようにして、同時に付与することができ、培養体の培養を効率的に行うことができ、また、種々の荷重負荷用ピストンの支持を簡易に行うことができる。
ここで、ピストン上下移動用ステージにピストン載置用ステージを載置するようにし、該ピストン載置用ステージに形成した複数個の孔部に、それぞれ荷重負荷用ピストンを嵌挿、支持するようにし、前記ピストン上下移動用ステージに複数個の荷重負荷用ピストンが自由に上下方向に移動できるようにするための共通の孔部を形成することにより、複数個の培養体に鉛直方向の荷重負荷刺激を、荷重負荷刺激の大きさを同じにしたり、異なるようにして、同時に付与することができ、培養体の培養を効率的に行うことができ、また、種々の荷重負荷用ピストンの支持を簡易に行うことができる。
また、荷重負荷用ピストンの上端部に追加荷重重鎮を装着するようにすることにより、培養体に付与する鉛直方向の荷重負荷刺激の大きさを正確かつ簡易に調節することができる。
また、荷重負荷用ピストンの下端部に培養体に対応した形状の加圧体を装着するようにすることにより、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体に正確に付与することができる。
また、複数個の荷重負荷用ピストンを支持するようにしたピストン載置用ステージを、ピストン上下移動用ステージに対して、水平面内で移動可能に構成するようにすることにより、１つの培養体に異なる鉛直方向の荷重負荷刺激を付与することができる。
また、荷重負荷用ピストンが、上下方向に移動する際に、回転しないようにピストン上下移動用ステージ又はピストン載置用ステージに支持するようにすることにより、荷重負荷用ピストンの下端部に培養体に対応した形状の加圧体を装着するようにした場合等でも、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体に正確に付与することができる。
また、培養容器を力学刺激負荷装置の培養容器固定ステージに着脱可能に装着することにより、種々の培養容器の装着を簡易に行うことができる。
また、培養容器を水平面内で移動又は振動させる剪断応力負荷機構を設けることにより、地上における生体内で組織に生じている横方向の剪断応力刺激と同様の刺激を培養体に正確に付与する装置を、簡易に、かつ、低コストで得ることができる。
また、培養容器内に所定の形状の受容基を固定可能にし、荷重負荷用ピストンの下端部の加圧体と受容基とで構成される培養体荷重負荷刺激部が、膝関節等の所定の形状に類似した構造となるようにすることにより、細胞外組織であるマトリックスに囲まれた状態での細胞にかかる力を容易に再現することができる。
また、荷重負荷用ピストンの下端部の加圧体と受容基とで構成される培養体荷重負荷刺激部に、生体適合合成樹脂材料で製作された部材を装着するようにすることにより、培養体を生体内の組織の環境に近似した状態で培養することができるため、培養体の移植後の生体に対する適合性を向上することができる。
以下、本発明の生体力学的刺激負荷装置の実施の形態を図面に基づいて説明する。
図１〜図２に、本発明の生体力学的刺激負荷装置の第１実施例を示す。
この生体力学的刺激負荷装置は、炭酸ガスインキュベーター１内に設置される力学刺激負荷装置２及び培養容器３と、制御用コンピューター４とで構成されている。
なお、生体力学的刺激負荷装置の操作は、すべて炭酸ガスインキュベーター２の外から行えるようにし、これにより、炭酸ガスインキュベーター２内の滅菌状態を保って長時間に亘っての培養を可能にすることができる。
なお、生体力学的刺激負荷装置の操作は、すべて炭酸ガスインキュベーター２の外から行えるようにし、これにより、炭酸ガスインキュベーター２内の滅菌状態を保って長時間に亘っての培養を可能にすることができる。
炭酸ガスインキュベーター２は、その内部を滅菌し、温度、湿度、酸素、二酸化炭素、窒素分圧等を制御した環境で使用するようにする。
この炭酸ガスインキュベーター１内に設置される力学刺激負荷装置２は、荷重負荷用ピストン５と、この荷重負荷用ピストン５を所定の範囲内で上下方向に移動可能に支持するピストン上下移動用ステージ２１と、このピストン上下移動用ステージ２１を上下方向に移動させるためのステージ昇降機構２２とを備え、制御用コンピューター４によってステージ昇降機構２２を所定のサイクルで駆動することにより、ピストン上下移動用ステージ２１を上下方向に移動させ、ピストン上下移動用ステージ２１の降下時に、荷重負荷用ピストン５の重量が培養容器３内の培養体Ｃにかかるように構成している。
これにより、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体Ｃに付与することができるようにしている。
これにより、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体Ｃに付与することができるようにしている。
ピストン上下移動用ステージ２１を上下方向に移動させるためのステージ昇降機構２２は、例えば、電動アクチュエーター２２ａと、この電動アクチュエーター２２ａに接続され、ピストン上下移動用ステージ２１を吊り下げるワイヤー２２ｂとからなる。
そして、制御用コンピューター４の指令で電動アクチュエーター２２ａを操作することにより、ピストン上下移動用ステージ２１をワイヤー２２ｂを介して、ガイド部材２０に沿って上下方向に移動できるようにしている。
そして、制御用コンピューター４の指令で電動アクチュエーター２２ａを操作することにより、ピストン上下移動用ステージ２１をワイヤー２２ｂを介して、ガイド部材２０に沿って上下方向に移動できるようにしている。
ところで、本実施例においては、ピストン上下移動用ステージ２１に載置したピストン載置用ステージ２３を介して、複数個（例えば、５個×５個の合計２５個）の荷重負荷用ピストン５を支持するようにしている。
この場合、ピストン上下移動用ステージ２１は、ピストン載置用ステージ２３を載置するためのものであるので、中央部に荷重負荷用ピストン５が自由に上下方向に移動できるようにするための孔部２１ａを形成するようにする。
これにより、種々の荷重負荷用ピストン５の支持を簡易に行うことができる。
なお、参考例として、ピストン載置用ステージ２３を省略して、ピストン上下移動用ステージ２１に荷重負荷用ピストン５を直接支持するようにすることもできる。
この場合、ピストン上下移動用ステージ２１は、ピストン載置用ステージ２３を載置するためのものであるので、中央部に荷重負荷用ピストン５が自由に上下方向に移動できるようにするための孔部２１ａを形成するようにする。
これにより、種々の荷重負荷用ピストン５の支持を簡易に行うことができる。
なお、参考例として、ピストン載置用ステージ２３を省略して、ピストン上下移動用ステージ２１に荷重負荷用ピストン５を直接支持するようにすることもできる。
荷重負荷用ピストン５は、下端部に培養体Ｃに対応した形状の加圧部５１を、中間部にピストン載置用ステージ２３に形成した孔部２３ａに嵌挿されるガイド軸部５２を、その上部に大径部５３を、上端部に追加荷重重鎮５５を装着するための重鎮装着部５４を形成するようにする。
これにより、図２（ａ）に示すように、ピストン載置用ステージ２３に荷重負荷用ピストン５を支持した状態から、ピストン上下移動用ステージ２１を下方向に移動させ、図２（ｂ）に示すように、ピストン上下移動用ステージ２１の降下時に、荷重負荷用ピストン５の大径部５３によるピストン載置用ステージ２３への支持が解除されるようにして、荷重負荷用ピストン５の重量が培養容器３内の培養体Ｃに直接かかるようにする。
その後、ピストン上下移動用ステージ２１を上方向に移動させることによって、図２（ａ）に示すように、ピストン載置用ステージ２３に荷重負荷用ピストン５を支持した状態に復帰させる。
この荷重負荷用ピストン５による鉛直方向の荷重負荷刺激は、制御用コンピューター４の操作で荷重サイクル、荷重時間を自由に操作できる。
また、追加荷重重鎮５５は、必要に応じて、重鎮装着部５４に装着することができ、また、その重さも自由に設定できることから、培養体Ｃに付与する鉛直方向の荷重負荷刺激の大きさを簡易に調節することができる。
これにより、図２（ａ）に示すように、ピストン載置用ステージ２３に荷重負荷用ピストン５を支持した状態から、ピストン上下移動用ステージ２１を下方向に移動させ、図２（ｂ）に示すように、ピストン上下移動用ステージ２１の降下時に、荷重負荷用ピストン５の大径部５３によるピストン載置用ステージ２３への支持が解除されるようにして、荷重負荷用ピストン５の重量が培養容器３内の培養体Ｃに直接かかるようにする。
その後、ピストン上下移動用ステージ２１を上方向に移動させることによって、図２（ａ）に示すように、ピストン載置用ステージ２３に荷重負荷用ピストン５を支持した状態に復帰させる。
この荷重負荷用ピストン５による鉛直方向の荷重負荷刺激は、制御用コンピューター４の操作で荷重サイクル、荷重時間を自由に操作できる。
また、追加荷重重鎮５５は、必要に応じて、重鎮装着部５４に装着することができ、また、その重さも自由に設定できることから、培養体Ｃに付与する鉛直方向の荷重負荷刺激の大きさを簡易に調節することができる。
また、荷重負荷用ピストン５の加圧部５１の形状は、培養体Ｃに対応した任意の形状とすることができ、さらに、図３に示す荷重負荷用ピストン５の変形例のように、培養体Ｃに対応した形状の加圧体５１Ａを別部材で形成し、荷重負荷用ピストン５の下端部５１Ｂに装着するようにすることもできる。
これにより、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体Ｃに正確に付与することができる。
これにより、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体Ｃに正確に付与することができる。
また、荷重負荷用ピストン５が、上下方向に移動する際に、回転しないようにピストン載置用ステージ２３（又はピストン上下移動用ステージ２１）に支持するようにすることができる。
具体的には、ピストン載置用ステージ２３に形成した孔部２３ａを多角形に形成し、ガイド軸部５２をこの多角形の孔部２３ａに適合した多角形の断面形状を有するように形成する。
これにより、荷重負荷用ピストン５の下端部５１Ｂに培養体Ｃに対応した形状（円形以外）の加圧体５１Ａを装着するようにした場合等でも、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体Ｃに正確に付与することができる。
具体的には、ピストン載置用ステージ２３に形成した孔部２３ａを多角形に形成し、ガイド軸部５２をこの多角形の孔部２３ａに適合した多角形の断面形状を有するように形成する。
これにより、荷重負荷用ピストン５の下端部５１Ｂに培養体Ｃに対応した形状（円形以外）の加圧体５１Ａを装着するようにした場合等でも、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を培養体Ｃに正確に付与することができる。
培養容器３は、力学刺激負荷装置２の培養容器固定ステージ２４に着脱可能に装着するようにする。
これにより、種々の培養容器３の装着を簡易に行うことができる。
また、培養容器３には、必要に応じて、培地槽（注入用）３２と、培地槽（排出用）３３とを接続し、培地の注入及び排出を制御用コンピューター４によって制御するようにすることもできる。
これにより、種々の培養容器３の装着を簡易に行うことができる。
また、培養容器３には、必要に応じて、培地槽（注入用）３２と、培地槽（排出用）３３とを接続し、培地の注入及び排出を制御用コンピューター４によって制御するようにすることもできる。
また、培養容器３を水平面内で移動又は振動させる剪断応力負荷機構２６を設けるようにしている。
具体的には、培養容器固定ステージ２４上に、培養容器固定ステージ２４に対して水平面内で移動可能に剪断応力ステージ２５を配設し、この剪断応力ステージ２５上に培養容器３を装着するようにするとともに、剪断応力ステージ２５を、剪断応力負荷機構２６により水平面内で移動又は振動させるようにする。
なお、水平面内で移動又は振動の方向は、１方向に限定されず、Ｘ、Ｙ方向の２方向や円運動等、任意の方向とすることができる。
剪断応力負荷機構２６としては、例えば、電動アクチュエーターや永久磁石と電磁石を組み合わせた移動機構又は振動機構を用いることができ、この剪断応力負荷機構２６の駆動は、制御用コンピューター４によって制御するようにする。
これにより、地上における生体内で組織に生じている横方向の剪断応力刺激、例えば、膝関節に屈曲、伸展の運動時に加わる刺激と同様の刺激を培養体Ｃに付与することができる。
この場合、荷重負荷用ピストン５による培養容器３内の培養体Ｃへの鉛直方向の荷重負荷刺激の付与方法を調整しながら、剪断応力負荷機構２６によって培養容器３を水平面内で移動又は振動させることにより、斜め方向の剪断応力刺激を付与するようにすることもできる。
具体的には、培養容器固定ステージ２４上に、培養容器固定ステージ２４に対して水平面内で移動可能に剪断応力ステージ２５を配設し、この剪断応力ステージ２５上に培養容器３を装着するようにするとともに、剪断応力ステージ２５を、剪断応力負荷機構２６により水平面内で移動又は振動させるようにする。
なお、水平面内で移動又は振動の方向は、１方向に限定されず、Ｘ、Ｙ方向の２方向や円運動等、任意の方向とすることができる。
剪断応力負荷機構２６としては、例えば、電動アクチュエーターや永久磁石と電磁石を組み合わせた移動機構又は振動機構を用いることができ、この剪断応力負荷機構２６の駆動は、制御用コンピューター４によって制御するようにする。
これにより、地上における生体内で組織に生じている横方向の剪断応力刺激、例えば、膝関節に屈曲、伸展の運動時に加わる刺激と同様の刺激を培養体Ｃに付与することができる。
この場合、荷重負荷用ピストン５による培養容器３内の培養体Ｃへの鉛直方向の荷重負荷刺激の付与方法を調整しながら、剪断応力負荷機構２６によって培養容器３を水平面内で移動又は振動させることにより、斜め方向の剪断応力刺激を付与するようにすることもできる。
培養容器３内には、図２（ｂ）及び図４に示すように、培養体Ｃに適合した任意の形状の内部培養容器３０を設置し、この内部培養容器３０の荷重負荷用ピストン５の加圧部５１と相対する位置に培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体の受容基３１を装着し、受容基３１の上に培養体Ｃとしての培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体を載置するようにする。
図３に示す荷重負荷用ピストン５の加圧体５１Ａ及び図４に示す内部培養容器３０の平坦形状の受容基３１は、培養体Ｃとして皮膚の培養組織に適したもので、皮膚の培養組織に鉛直方向の荷重負荷刺激と、横方向の剪断応力刺激を、それぞれ付与することができる。
図３に示す荷重負荷用ピストン５の加圧体５１Ａ及び図４に示す内部培養容器３０の平坦形状の受容基３１は、培養体Ｃとして皮膚の培養組織に適したもので、皮膚の培養組織に鉛直方向の荷重負荷刺激と、横方向の剪断応力刺激を、それぞれ付与することができる。
図５〜図６に、本発明の生体力学的刺激負荷装置の第２実施例を示す。
この生体力学的刺激負荷装置は、上記第１実施例の生体力学的刺激負荷装置に、複数個（複数種類）の荷重負荷用ピストン５ａ、５ｂ（加圧体５１Ａａ、５１Ａｂ）を支持するようにしたピストン載置用ステージ２３を、ピストン上下移動用ステージ２１に対して、水平面内で移動可能に構成するようにしたり、さらには、複数個（複数種類）の追加荷重重鎮５５ａ、５５ｂを支持するようにした追加荷重重鎮載置用ステージ２８を、追加荷重重鎮上下移動用ステージ２７に対して、水平面内で移動可能に構成するようにし、荷重負荷用ピストン５ａ、５ｂと追加荷重重鎮５５ａ、５５ｂとの組み合わせを任意に選択できるようにする機能に付加したものである。
具体的には、ピストン上下移動用ステージ２１上に、ピストン上下移動用ステージ２１に対して水平面内で移動可能（例えば、回転可能）にピストン載置用ステージ２３を配設し、同様に、追加荷重重鎮上下移動用ステージ２７上に、追加荷重重鎮上下移動用ステージ２７に対して水平面内で移動可能（例えば、回転可能）に追加荷重重鎮載置用ステージ２８を配設し、ピストン載置用ステージ２３及び追加荷重重鎮載置用ステージ２８を、ピストン載置用ステージ駆動機構２３ｂ及び追加荷重重鎮載置用ステージ駆動機構２８ｂにより、それぞれ独立して水平面内で移動（例えば、回転）させるようにする。
ピストン載置用ステージ駆動機構２３ｂ及び追加荷重重鎮載置用ステージ駆動機構２８ｂとしては、例えば、電動モーターとギヤを組み合わせた駆動機構を用いることができ、このピストン載置用ステージ駆動機構２３ｂ及び追加荷重重鎮載置用ステージ駆動機構２８ｂの駆動は、制御用コンピューター４によって制御するようにする。
ピストン載置用ステージ駆動機構２３ｂ及び追加荷重重鎮載置用ステージ駆動機構２８ｂとしては、例えば、電動モーターとギヤを組み合わせた駆動機構を用いることができ、このピストン載置用ステージ駆動機構２３ｂ及び追加荷重重鎮載置用ステージ駆動機構２８ｂの駆動は、制御用コンピューター４によって制御するようにする。
そして、図５及び図６に示すように、ピストン載置用ステージ２３に荷重負荷用ピストン５ａ、５ｂを、また、追加荷重重鎮載置用ステージ２８に追加荷重重鎮５５ａ、５５ｂを、それぞれ支持した状態から、ピストン上下移動用ステージ２１及び追加荷重重鎮載置用ステージ２８を下方向に移動させ、ピストン上下移動用ステージ２１及び追加荷重重鎮載置用ステージ２８の降下時に、荷重負荷用ピストン５の大径部５３によるピストン載置用ステージ２３への支持、及び同様に追加荷重重鎮５５ａ、５５ｂの追加荷重重鎮載置用ステージ２８への支持が、順次解除されるようにして、荷重負荷用ピストン５ａ、５ｂ及び追加荷重重鎮５５ａ、５５ｂの重量が培養容器３内の培養体Ｃに直接かかるようにする。
その後、ピストン上下移動用ステージ２１及び追加荷重重鎮載置用ステージ２８を上方向に移動させることによって、図２及び図６に示すように、ピストン載置用ステージ２３に荷重負荷用ピストン５ａ、５ｂを、また、追加荷重重鎮載置用ステージ２８に追加荷重重鎮５５ａ、５５ｂを、それぞれ支持した状態に復帰させる。
これにより、荷重負荷用ピストン５ａ、５ｂと追加荷重重鎮５５ａ、５５ｂとの組み合わせを任意に選択して、１つの培養体Ｃに、異なる荷重負荷用ピストン５ａ、５ｂ（加圧体５１Ａａ、５１Ａｂ）によって、異なる大きさの鉛直方向の荷重負荷刺激を簡易に付与することができる。
その後、ピストン上下移動用ステージ２１及び追加荷重重鎮載置用ステージ２８を上方向に移動させることによって、図２及び図６に示すように、ピストン載置用ステージ２３に荷重負荷用ピストン５ａ、５ｂを、また、追加荷重重鎮載置用ステージ２８に追加荷重重鎮５５ａ、５５ｂを、それぞれ支持した状態に復帰させる。
これにより、荷重負荷用ピストン５ａ、５ｂと追加荷重重鎮５５ａ、５５ｂとの組み合わせを任意に選択して、１つの培養体Ｃに、異なる荷重負荷用ピストン５ａ、５ｂ（加圧体５１Ａａ、５１Ａｂ）によって、異なる大きさの鉛直方向の荷重負荷刺激を簡易に付与することができる。
なお、この生体力学的刺激負荷装置のその他の構成及び作用は、上記第１実施例の生体力学的刺激負荷装置と同様である。
図７に、本発明の生体力学的刺激負荷装置の第３実施例を示す。
この生体力学的刺激負荷装置は、半月板、関節唇、関節円盤等の培養に好適に用いられるもので、培養容器３内に、培養体Ｃに適合した内部培養容器３０を設置し、この内部培養容器３０の荷重負荷用ピストン５の加圧体５１Ｃと相対する位置に培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体の受容基３１を装着し、受容基３１の上に培養体Ｃとしての培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体を載置するようにする。
半月板、関節唇、関節円盤等は、骨に類似した硬度で生体内で負荷刺激を受けているのではなく、骨軟骨で荷重負荷刺激を受けているため、その培養（ここでは、半月板の培養）には、荷重負荷用ピストン５の加圧体５１Ｃに大腿骨骨軟骨に類似した生体適合材料の合成樹脂で製作した人工大腿骨骨軟骨５１Ｄを装着し、受容基３１に脛骨骨軟骨に類似した生体適合材料の合成樹脂で製作した人工脛骨骨軟骨３１Ａを載置することにより、その間に形成された培養体荷重負荷刺激部Ｘが、生体の所定の形状（ここでは、膝関節）に類似した構造となるようにし、この培養体荷重負荷刺激部Ｘに培養体Ｃ（ここでは、半月板用特殊形状培養ディッシュ）を入れて、骨軟骨（ここでは、膝関節の骨軟骨）による荷重負荷刺激を再現するようにする。
これにより、細胞外組織であるマトリックスに囲まれた状態での細胞にかかる力を容易に再現することができるとともに、培養体Ｃを生体内の組織の環境に近似した状態で培養することができるため、培養体の移植後の生体に対する適合性を向上することができる。
この場合、培養組織又は培養細胞を含む構造体からなる培養体Ｃは、予め移植に適した形状に形成することができ、具体的には、培養細胞を含む構造体のマトリックスを、生体適合材料をベースにした３次元の細胞支持体とし、例えば、コラーゲンを主体にした細胞支持体等を用い、軟骨細胞や半月板細胞を播種、接着させた培養細胞を含む構造体とすることができる。
半月板、関節唇、関節円盤等は、骨に類似した硬度で生体内で負荷刺激を受けているのではなく、骨軟骨で荷重負荷刺激を受けているため、その培養（ここでは、半月板の培養）には、荷重負荷用ピストン５の加圧体５１Ｃに大腿骨骨軟骨に類似した生体適合材料の合成樹脂で製作した人工大腿骨骨軟骨５１Ｄを装着し、受容基３１に脛骨骨軟骨に類似した生体適合材料の合成樹脂で製作した人工脛骨骨軟骨３１Ａを載置することにより、その間に形成された培養体荷重負荷刺激部Ｘが、生体の所定の形状（ここでは、膝関節）に類似した構造となるようにし、この培養体荷重負荷刺激部Ｘに培養体Ｃ（ここでは、半月板用特殊形状培養ディッシュ）を入れて、骨軟骨（ここでは、膝関節の骨軟骨）による荷重負荷刺激を再現するようにする。
これにより、細胞外組織であるマトリックスに囲まれた状態での細胞にかかる力を容易に再現することができるとともに、培養体Ｃを生体内の組織の環境に近似した状態で培養することができるため、培養体の移植後の生体に対する適合性を向上することができる。
この場合、培養組織又は培養細胞を含む構造体からなる培養体Ｃは、予め移植に適した形状に形成することができ、具体的には、培養細胞を含む構造体のマトリックスを、生体適合材料をベースにした３次元の細胞支持体とし、例えば、コラーゲンを主体にした細胞支持体等を用い、軟骨細胞や半月板細胞を播種、接着させた培養細胞を含む構造体とすることができる。
なお、この生体力学的刺激負荷装置のその他の構成及び作用は、上記第１実施例及び第２実施例の生体力学的刺激負荷装置と同様である。
本発明は、炭酸ガスインキュベーター内を滅菌し、温度、湿度、酸素、二酸化炭素、窒素分圧等を制御した環境で、体外培養にて培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体からなる培養体に、生体力学的刺激負荷を生体内環境、構造と類似した環境で、鉛直方向の荷重負荷刺激を重力を利用して、さらに、横方向の剪断応力刺激を培養容器を水平面内で移動又は振動させることにより、直接付与することができる。
また、本発明の生体力学的刺激負荷装置は、炭酸ガスインキュべーター２の外部からの操作を行うことができ、培地の入れ替えも外部からの操作で行うために、長時間の連続培養ができる。またこの生体力学的刺激負荷装置は大きな動力も必要とせず、荷重負荷重量は正確でコンパクトな生体力学的刺激負荷装置も製造可能である。
これによって、培養体を生体内の組織の環境に近似した状態で培養することができるため、移植後の力学負荷に耐え得る分化、成熟した培養体が作成可能となり、生体の組織の修復、成熟を効率的に行うことができる。
そして、従来の組織培養技術では得られなかった生体力学負荷刺激を体外で行うとともに、培養体を移植に適する形態で培養することにより、培養体の増殖、分化に影響を与え、移植に適した組織を作成することができる。
また、本発明の生体力学的刺激負荷装置を用いた基礎医学研究により、体外で生体力学負荷刺激を受けた組織は、移植後の力学負荷に耐え得る分化成熟した培養組織の作成が可能となり、生体の組織再生、移植医療に貢献することができる。
さらに、本発明は、生体の起立、歩行、走行、飛び跳ね、膝の捻りに極めて類似した刺激を加えることができることから、骨、軟骨、皮膚等の破壊、損傷のメカニズムの解明に寄与することも期待できる。具体的には、鉛直方向の荷重負荷用ピストンの重量を損傷荷重重量に変え、下降スピードを速め鉛直方向の衝撃的刺激も加えることができ、また、損傷荷重重量を加えた状態で強い横方向の剪断応力を加え膝を捻った状態の刺激を加えることもできる。また横方向の移動を繰り返し剪断応力を長時間加え骨の摩耗等の研究も行うことができる。
また、本発明の生体力学的刺激負荷装置は、炭酸ガスインキュべーター２の外部からの操作を行うことができ、培地の入れ替えも外部からの操作で行うために、長時間の連続培養ができる。またこの生体力学的刺激負荷装置は大きな動力も必要とせず、荷重負荷重量は正確でコンパクトな生体力学的刺激負荷装置も製造可能である。
これによって、培養体を生体内の組織の環境に近似した状態で培養することができるため、移植後の力学負荷に耐え得る分化、成熟した培養体が作成可能となり、生体の組織の修復、成熟を効率的に行うことができる。
そして、従来の組織培養技術では得られなかった生体力学負荷刺激を体外で行うとともに、培養体を移植に適する形態で培養することにより、培養体の増殖、分化に影響を与え、移植に適した組織を作成することができる。
また、本発明の生体力学的刺激負荷装置を用いた基礎医学研究により、体外で生体力学負荷刺激を受けた組織は、移植後の力学負荷に耐え得る分化成熟した培養組織の作成が可能となり、生体の組織再生、移植医療に貢献することができる。
さらに、本発明は、生体の起立、歩行、走行、飛び跳ね、膝の捻りに極めて類似した刺激を加えることができることから、骨、軟骨、皮膚等の破壊、損傷のメカニズムの解明に寄与することも期待できる。具体的には、鉛直方向の荷重負荷用ピストンの重量を損傷荷重重量に変え、下降スピードを速め鉛直方向の衝撃的刺激も加えることができ、また、損傷荷重重量を加えた状態で強い横方向の剪断応力を加え膝を捻った状態の刺激を加えることもできる。また横方向の移動を繰り返し剪断応力を長時間加え骨の摩耗等の研究も行うことができる。
本発明の生体力学的刺激負荷装置は組織培養装置として力学的刺激負荷をいろいろな条件でかけられ、かつ比較的簡便な装置で小型化も可能であり、力学的刺激を重力鉛直方向や横方向の剪断応力刺激を細胞外マトリックスを介して負荷するという、生体内での環境に類似した負荷をかけ得るという点で従来にない利点を有している。多くの医学生物学の組織再生分野の研究室での標準的な培養装置の製品として普及可能であり、新たな産業化の可能性があり、またこの装置が骨、軟骨の培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体培養に有益な装置であることが認められ、軟骨等の製造装置となれば、半月板だけの再生治療のニーズも、骨のニーズと同等かそれ以上のニーズがあり、日本国内だけでも年間１万症例がその対象例となり得る。
１ 炭酸ガスインキュベーター
２ 力学的刺激負荷装置
２０ ガイド部材
２１ ピストン上下移動用ステージ
２１ａ 孔部
２２ ステージ昇降機構
２２ａ 電動アクチュエーター
２２ｂ ワイヤー
２３ ピストン載置用ステージ
２３ａ 孔部
２３ｂ ピストン載置用ステージ駆動機構
２４ 培養容器固定ステージ
２５ 剪断応力ステージ
２６ 剪断応力負荷機構
２７ 追加荷重重鎮上下移動用ステージ
２８ 追加荷重重鎮載置用ステージ
２８ｂ 追加荷重重鎮載置用ステージ駆動機構
３ 培養容器
３０ 内部培養容器
３１ 受容基
３１Ａ 人工脛骨骨軟骨
３２ 培地槽（注入用）
３３ 培地槽（排出用）
４ 制御用コンピューター
５ 荷重負荷用ピストン
５ａ 荷重負荷用ピストン
５ｂ 荷重負荷用ピストン
５１ 加圧体
５１Ａ 加圧体
５１Ａａ 加圧体
５１Ａｂ 加圧体
５１Ｃ 加圧体
５１Ｄ 人工大腿骨骨軟骨
５２ ガイド軸部
５３ 大径部
５４ 重鎮装着部
５５ 追加荷重重鎮
５５ａ 追加荷重重鎮
５５ｂ 追加荷重重鎮
Ｃ 培養体（培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体）
Ｘ 培養体荷重負荷刺激部
２ 力学的刺激負荷装置
２０ ガイド部材
２１ ピストン上下移動用ステージ
２１ａ 孔部
２２ ステージ昇降機構
２２ａ 電動アクチュエーター
２２ｂ ワイヤー
２３ ピストン載置用ステージ
２３ａ 孔部
２３ｂ ピストン載置用ステージ駆動機構
２４ 培養容器固定ステージ
２５ 剪断応力ステージ
２６ 剪断応力負荷機構
２７ 追加荷重重鎮上下移動用ステージ
２８ 追加荷重重鎮載置用ステージ
２８ｂ 追加荷重重鎮載置用ステージ駆動機構
３ 培養容器
３０ 内部培養容器
３１ 受容基
３１Ａ 人工脛骨骨軟骨
３２ 培地槽（注入用）
３３ 培地槽（排出用）
４ 制御用コンピューター
５ 荷重負荷用ピストン
５ａ 荷重負荷用ピストン
５ｂ 荷重負荷用ピストン
５１ 加圧体
５１Ａ 加圧体
５１Ａａ 加圧体
５１Ａｂ 加圧体
５１Ｃ 加圧体
５１Ｄ 人工大腿骨骨軟骨
５２ ガイド軸部
５３ 大径部
５４ 重鎮装着部
５５ 追加荷重重鎮
５５ａ 追加荷重重鎮
５５ｂ 追加荷重重鎮
Ｃ 培養体（培養細胞、培養組織又は培養細胞を含む構造体）
Ｘ 培養体荷重負荷刺激部
Claims (13)
- 炭酸ガスインキュベーター内に設置された培養容器内の培養体に生体力学的刺激を付与する方法であって、荷重負荷用ピストンの重量を所定のサイクルで培養容器内の培養体にかけることにより、培養容器内の培養体に鉛直方向の荷重負荷刺激を付与するようにしたことを特徴とする生体力学的刺激負荷による細胞培養方法。
- 培養容器内の培養体に鉛直方向の荷重負荷刺激を付与しながら、培養体を載置した培養容器を水平面内で移動又は振動させることにより、横方向の剪断応力刺激を付与するようにしたことを特徴とする請求項１記載の生体力学的刺激負荷による細胞培養方法。
- 炭酸ガスインキュベーター内に設置される力学刺激負荷装置及び培養容器と、制御用コンピューターとで構成した生体力学的刺激負荷装置であって、前記力学刺激負荷装置が、荷重負荷用ピストンと、該荷重負荷用ピストンを所定の範囲内で上下方向に移動可能に支持するピストン上下移動用ステージと、該ピストン上下移動用ステージを上下方向に移動させるためのステージ昇降機構とを備え、制御用コンピューターによってステージ昇降機構を所定のサイクルで駆動することにより、ピストン上下移動用ステージを上下方向に移動させ、ピストン上下移動用ステージの降下時に、荷重負荷用ピストンの重量が培養容器内の培養体にかかるようにしたことを特徴とする生体力学的刺激負荷装置。
- 荷重負荷用ピストンの上端部に追加荷重重鎮を装着するようにしたことを特徴とする請求項３記載の生体力学的刺激負荷装置。
- 荷重負荷用ピストンの下端部に培養体に対応した形状の加圧体を装着するようにしたことを特徴とする請求項３又は４記載の生体力学的刺激負荷装置。
- ピストン上下移動用ステージに複数個の荷重負荷用ピストンを支持するようにしたことを特徴とする請求項３、４又は５記載の生体力学的刺激負荷装置。
- ピストン上下移動用ステージに載置したピストン載置用ステージを介して、荷重負荷用ピストンを支持するようにしたことを特徴とする請求項３、４、５又は６記載の生体力学的刺激負荷装置。
- 複数個の荷重負荷用ピストンを支持するようにしたピストン載置用ステージを、ピストン上下移動用ステージに対して、水平面内で移動可能に構成するようにしたことを特徴とする請求項７記載の生体力学的刺激負荷装置。
- 荷重負荷用ピストンが、上下方向に移動する際に、回転しないようにピストン上下移動用ステージ又はピストン載置用ステージに支持するようにしたことを特徴とする請求項３、４、５、６、７又は８記載の生体力学的刺激負荷装置。
- 培養容器を力学刺激負荷装置の培養容器固定ステージに着脱可能に装着するようにしたことを特徴とする請求項３、４、５、６、７、８又は９記載の生体力学的刺激負荷装置。
- 培養容器を水平面内で移動又は振動させる剪断応力負荷機構を設けたことを特徴とする請求項１０記載の生体力学的刺激負荷装置。
- 培養容器内に所定の形状の受容基を固定可能にし、荷重負荷用ピストンの下端部の加圧体と受容基とで構成される培養体荷重負荷刺激部が、膝関節等の所定の形状に類似した構造となるようにしたことを特徴とする請求項３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１記載の生体力学的刺激負荷装置。
- 荷重負荷用ピストンの下端部の加圧体と受容基とで構成される培養体荷重負荷刺激部に、生体適合合成樹脂材料で製作された部材を装着するようにしたことを特徴とする請求項１２記載の生体力学的刺激負荷装置。
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