WO2004069268A1 - Ｏｔｘ２遺伝子を用いた網膜視細胞の再生と新生 - Google Patents

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Osaka Bioscience Institute
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Definitions

  • the present invention relates to a differentiation inducing agent for retinal photoreceptors containing a gene encoding tX2 protein or OtX2 protein, and prevention / treatment / progression inhibitor of retinal diseases.
  • Retinal photoreceptors are the only photosensors in mammals, and have been extensively studied physiologically, biochemically, anatomically, and clinically (Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 0 2-3 2 5 5 7 No. 1).
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 0 2-3 2 5 5 7 No. 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 0 2-3 2 5 5 7 No. 1.
  • the mechanism of differentiation into retinal photoreceptors was unclear at all times.
  • at least 14 45 loci are known as causative loci for human genetic reticulitis, a disease caused by abnormalities in retinal photoreceptors, there is still no established treatment for the disease. Suffers from severe visual impairment. Therefore, it is highly desired to elucidate the cause of retinal degeneration causing blindness or severe visual impairment and to establish a treatment method.
  • retinal diseases such as diabetic retinopathy or macular degeneration
  • retinal photoreceptor degeneration or damage so that they can regenerate or regenerate retinal photoreceptors. Therefore, it is very important to elucidate the molecular mechanism of retinal photoreceptor development and differentiation.
  • An object of the present invention is to provide a preventive, therapeutic or progression inhibitor for retinal diseases including retinal degeneration. It is another object of the present invention to provide a method for screening a compound useful as the pharmaceutical. Furthermore, the present invention provides a diagnosis of retinal diseases. An object is to provide a withdrawal or diagnostic method. Another object of the present invention is to provide a method for inducing differentiation into a retinal photoreceptor cell or a differentiation-inducing agent suitable for transplantation into the retina of a patient suffering from retinal disease.
  • the present inventor has focused on the O t X 2 protein belonging to the same gene family as the transcription factor C r X, which has been analyzed so far as the key to differentiation into retinal photoreceptor cells.
  • the role in cell fate determination was analyzed.
  • the present inventor has found that the tX 2 protein is very important for determining the fate of retinal photoreceptor cells. 'That is, ⁇ tX2 gene is integrated into virus vector, the recombinant vector is infected into undifferentiated retinal stem cells of mouse, and OtX2 protein is expressed in undifferentiated retinal stem cells of mice.
  • OtX2 protein is expressed in undifferentiated retinal stem cells of mice.
  • most undifferentiated retinal stem cells differentiated into retinal photoreceptor cells. Based on such knowledge, further studies were made to complete the present invention.
  • a preventive, therapeutic or progression inhibitor for retinal diseases comprising 0 t X2 protein or a partial peptide thereof or a salt thereof,
  • ⁇ t X2 protein is a protein containing an amino acid sequence that is identical to or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5.
  • SEQ ID NO: 1 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 3 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • the DNA comprises the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6, or the base sequence that hybridizes with the above sequence under highly stringent conditions (3) Listed agents,
  • O t X 2 protein or a partial peptide thereof or a salt thereof An agent for inducing differentiation into retinal photoreceptors, characterized by comprising:
  • a method of inducing differentiation into retinal photoreceptors characterized by expressing ⁇ tX2 protein or ⁇ tX2 protein expression level
  • Ot X 2 protein is expressed or the expression level of O t X 2 protein is increased in ocular tissue-derived cells, embryonic stem cells, neural stem cells or neural progenitor cells
  • a method for preventing, treating, or inhibiting progression of retinal diseases comprising administering an effective amount of DNA or RNA encoding O t X2 protein or a partial peptide thereof to a mammal,
  • a method for regenerating the retina comprising transplanting retinal photoreceptors or precursor cells thereof induced to differentiate by tX2 protein into the retina,
  • O t X 2 protein or a partial peptide thereof or a salt thereof for the prevention, treatment, or production of a progression inhibitor of retinal diseases
  • a diagnostic agent for retinal diseases comprising an antibody against
  • a method for diagnosing retinal disease comprising using an antibody against O t X2 protein or a partial peptide thereof or a salt thereof,
  • a pharmaceutical comprising the compound or a salt thereof according to (24).
  • the protein of the present invention or the like or the DNA of the present invention it is possible to differentiate ocular tissue-derived cells, embryonic stem cells, neural stem cells or neural progenitor cells into retinal photoreceptor cells. Therefore, by using the protein of the present invention or the DNA of the present invention to regenerate or regenerate retinal photoreceptor cells, for example, retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, retinal detachment, glaucoma or retinal blood vessels It can prevent, treat or suppress progression of retinal diseases such as obstruction.
  • abnormalities in the O t x2 gene cause structural or functional abnormalities in the retinal photoreceptors.
  • the above retinal diseases can also be diagnosed.
  • FIG. 1 shows the structures of a control virus vector and an O t X2 virus vector.
  • AP represents an alkaline phosphatase gene derived from human placenta
  • LTR represents a viral promoter.
  • Fig. 2 shows the outline of the virus infection experiment.
  • Re ti na is reticulum
  • Pigment Ep ithelium is retinal pigment epithelium
  • virus is the area infected by virus
  • Remove Retina is retinal excision
  • F ixand S tain is tissue fixation and staining
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of a frozen retina slice image after staining with Al force phosphatase.
  • Bi is a bipolar cell
  • A is an amacrine cell
  • R is a retinal photoreceptor cell
  • M is a Mueller glial cell
  • R + Bi is a retinal photoreceptor cell and Mueller glial cell
  • a + Bi Represents amacrine and bipolar cells.
  • FIG. 4 shows the abundance ratio of cells differentiated from retinal stem cells infected with a control virus vector (L IA) or Otx2 virus vector (Otx2ZL IA) with respect to the total number of cells in a single visual field.
  • L IA control virus vector
  • Otx2ZL IA Otx2 virus vector
  • Examples of the O t X2 protein used in the present invention include a protein containing an amino acid sequence identical to or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5. .
  • the present invention is limited to a human-derived 0 t X 2 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 and 3, or a rat-derived 0 t X 2 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5. It has an amino acid sequence derived from another animal, particularly a warm-blooded animal (for example, guinea pig, mouse, chicken, rabbit, pig, hidge, ushi, monkey, etc.) or an amino acid sequence substantially identical to that sequence. You may do it.
  • a warm-blooded animal for example, guinea pig, mouse, chicken, rabbit, pig, hidge, ushi, monkey, etc.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5 for example, about 50% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5
  • proteins having the same amino acid sequence and having an action of inducing differentiation into retinal photoreceptor cells are preferred.
  • the transcriptional activity and the differentiation-inducing action on retinal photoreceptors are equivalent to the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5 (eg, about 0.01 to 100 times, preferably Or about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times), but quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • the differentiation-inducing action on retinal photoreceptor cells can be measured according to a known method. For example, it can be measured according to a screening method described later.
  • the transcription activity can be measured using a known method such as reporter assay or RT-PCR.
  • the O t X2 protein used in the present invention includes (a) one or more of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5 (preferably about 1 to 30 or more, Preferably about 1-10, more preferably several (1-5) amino acid sequences deleted, (b) 1 or 2 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5 (C) SEQ ID NOs: 1, 3 (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids.
  • amino acids substituted with other amino acids or (d) combining them Protein or the like is used comprising an amino acid sequence that has.
  • the amino acid added in (b) and the amino acid substituted in (c) may be non-natural amino acids other than the 20 types of amino acids encoded by the gene.
  • the proteins described in the above (a) to (d) more preferably have an action of inducing differentiation into retinal photoreceptor cells.
  • R in the ester is, for example, 6 alkyl groups such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n_butyl, for example, C 3 _ 8 such as cyclopentyl, cyclohexyl and the like.
  • Cycloalkyl groups for example, C 6 ⁇ 2 aryl groups such as phenyl, mononaphthyl, etc., for example, phenyls such as benzyl, phenethyl, etc. — — 2 alkyl groups or 0! — C 7 1 such as naphthyl alkyl groups such as naphthylmethyl, etc. 1
  • the pivaloyloxymethyl group which is widely used as an oral ester, is used.
  • a forceloxyl group is amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the O t X 2 protein in the present invention in the evening and the protein, Amino group protecting groups Mechionin residues of N-terminal (e.g., ho mill group, such as C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechiru Such as a 6- acyl group), a dartamyl group cleaved in vivo by cleavage of the N-terminal side, and a glutamine-oxidized substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (eg, 1 OH, 1 SH, which amino group, imidazole group, indole group, etc.
  • Mechionin residues of N-terminal e.g., ho mill group, such as C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechiru Such as a 6- acyl group
  • a dartamyl group cleaved in viv
  • Guanijino group is protected with a suitable protecting group (e.g., formyl group, etc. C 2 _ 6 Arukanoiru which C Bok 6 Ashiru group group such Asechiru) Or a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
  • a suitable protecting group e.g., formyl group, etc.
  • C 2 _ 6 Arukanoiru which C Bok 6 Ashiru group group such Asechiru
  • a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
  • the partial peptide of tX2 protein (hereinafter sometimes abbreviated as partial peptide) used in the present invention may be any partial peptide of Otx2 protein described above.
  • the number of amino acids of the partial peptide in the present invention is at least about 20 or more, preferably about 50 or more, more preferably about 100 or more amino acids among the above-described amino acid sequences of the tx2 protein. Peptides containing acid sequences are preferred.
  • the partial peptide of the present invention includes the above-mentioned Similar to the O tx 2 protein of the present invention, the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group, and the G 1 n produced by cleavage of the N-terminal side in vivo is pyroglutamine oxidized Also included are those in which a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, or a complex peptide such as a so-called glycopeptide to which a sugar chain is bound.
  • Examples of the salt of the o tX2 protein or a partial peptide thereof according to the present invention include physiologically acceptable salts with acids or bases, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferable.
  • Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citrate, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid. Acid, tartaric acid, citrate, malic acid, o
  • O t X2 protein or a salt thereof in the present invention is an animal, preferably a warm-blooded animal, more preferably a human or rat, more preferably a human cell or tissue, particularly preferably a human brain neuron, or an eye retinal pigment.
  • Transformants containing DNA or RNA encoding the tX2 protein of the present invention described later can be produced by known protein purification methods from epithelial cells or reticulocytes. It can also be produced by culturing. Moreover, it can also be produced according to the protein synthesis method described later or this. When producing from animal tissues or cells, homogenize animal tissues or cells, extract with acid, etc., and combine the extract with chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. It can be purified and isolated.
  • resins for protein synthesis can be used for the synthesis of the tX2 protein or a partial peptide thereof or a salt thereof or an amide thereof.
  • resins include chloromethyl resin, Hydroxymethyl resin, Benzhydrylamine resin, Aminomethyl resin, 4 resin, PAM resin, 4-Hydroxymethylmethylphenylamidomethyl resin, Polyacrylamide resin, 4 (2, 4, 4'-dimethoxy (Fuel-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenol Fmoc aminoethyl) phenoxy resin, and the like.
  • an amino acid in which the amino group and the side chain functional group are appropriately protected is condensed on the resin according to various known condensation methods according to the sequence of the target protein.
  • the protein is excised from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed, and an intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein or its amide.
  • various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and as the activating reagent, calpositimides are particularly preferable.
  • carpositimides examples include DCC, N, N, —diisopropyl carpositimide, N-ethyl-N, mono (3-dimethylaminoprolyl) carpositimide, and the like.
  • a protective amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor (eg, HBt, HOOBt), or the protected amino acid is added to a symmetric anhydride or HO B t ester.
  • the protected amino acid can be activated in advance by conversion to a HOOB t ester and then added to the resin.
  • the solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone
  • halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and blackform
  • trifluoroethanol etc.
  • Alcohols; sulfoxides such as dimethyl sulfoxide; ethers such as pyridine, dioxane and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitryl; vinegar Esters such as methyl acid and ethyl acetate or appropriate mixtures thereof are used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range known to be usable for protein bond formation reaction, and is usually selected appropriately from the range of about 120 ° C. to 50 ° C.
  • Activated amino acid derivatives are usually used in excess of 1.5 to 4 times.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include Z, B oc, t-pentyloxycarbonyl, isoponyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxy-powered sulfonyl, C 1 1 Z, B r—Z, and adamant Tyroxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc, etc. are used.
  • Forced loxyl groups can be, for example, alkyl esterified (e.g., methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • alkyl esterified e.g., methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • Cyclic alkyl esterification aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyl It can be protected by oxycarbonyl hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Examples of the group suitable for esterification include a lower alkanoyl group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from a carbonate such as a benzyloxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group.
  • groups suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
  • H Examples of protecting groups for the phenolic hydroxyl group of mouth cin include Bz 1, C 1 2 -B z
  • 1,2-Nitrobenzyl, Br-Z, t-butyl, etc. are used.
  • protecting groups for histidine imidazole include Tos, 4-methoxy-2, 3,
  • activated raw force lpoxyl groups include the corresponding acid anhydrides, azides, activated esters [alcohols (eg, pentachlorophenol,
  • the elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of about 120 ° C. to 40 ° C.
  • the protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw material, the removal of the protective group, the removal of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of a protein for example, first, after protecting the carboxy group at the carboxy terminal amino acid by amidation, the peptide (protein) chain was extended to the desired chain length on the amino group side. Thereafter, a protein from which only the protecting group of the ⁇ -amino group at the N-terminal of the peptide chain was removed and a protein from which only the protecting group of the force loxyl group at the C-terminal was removed were produced, and both proteins were described above.
  • the condensation is performed in such a mixed solvent.
  • the details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the desired crude protein can be obtained.
  • This crude protein can be purified using various known purification means, and the main fraction can be lyophilized to obtain the amide form of the desired protein.
  • the desired protein ester is obtained in the same manner as the amide of a protein. You can get a body.
  • the protein obtained by the above method is a free form, it can be converted into a suitable salt by a known method. Conversely, when it is obtained as a salt, it is converted into a free form by a known method. can do.
  • the partial peptide of O t X2 protein or a salt thereof in the present invention can be produced according to a known peptide synthesis method or by cleaving the o tX2 protein in the present invention with an appropriate peptidase.
  • a peptide synthesis method for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid capable of constituting the ⁇ tX2 protein of the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the target peptide is removed by removing the protecting group. Can be manufactured.
  • Known condensation methods and protecting groups Examples of the elimination include the methods described in the following (a) to (e).
  • the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by combining ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method.
  • it when it is obtained as a salt, it can be converted into a free form by a known method.
  • the DNA encoding the O t X2 protein used in the present invention includes any one of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA. But you can.
  • the vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Further, it can also be amplified directly by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • the DNA encoding the tX2 protein includes, for example, (a) DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6, or (b) SEQ ID NO: 2, It has a base sequence represented by 4 or 6 and a base sequence that hybridizes under highly stringent conditions, and has substantially the same activity as the ⁇ tX2 protein of the present invention (eg, transcriptional activity and retinal photoreceptor differentiation) DNA that encodes O t X 2 protein And so on.
  • SEQ ID NOs: 2 and 4 are DNAs encoding human O tx 2 protein (Kastury, K., et. Al., Chromosome locations of human EMX and OTX genes ", Genomics 22 (1), 41-45.
  • SEQ ID NO: 6 is a DNA encoding the mouse tx 2 protein (Simeone, A., et. Al., Nested expression domains of four homeobox genes in developing rostral brain ", Nature 358 ( 6388), 687-690 (1992)).
  • DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, or 6 include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, or 6.
  • DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more is used.
  • the hybridization can be performed according to a known method or a method similar thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sarabrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).
  • it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed according to high stringency conditions.
  • the highly stringent conditions include, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. .
  • it is most preferable when the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C.
  • the DNA encoding the partial peptide used in the present invention may be any DNA as long as it contains the base sequence encoding the partial peptide of the present invention described above. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-mentioned cell 'tissue, cDNA library derived from the above-mentioned cell' tissue, and synthetic DNA may be used.
  • the vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • Amplification can also be carried out by verse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR).
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes, for example, a partial base sequence of DNA containing the base sequence represented by: (a) SEQ ID NO: 2, 4 or 6 Or (b) a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6, and a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions, and substantially equivalent to the ⁇ t x2 protein of the present invention
  • DNA encoding a protein having the same quality of activity eg, transcriptional activity, retinal photoreceptor differentiation inducing action, etc.
  • RNA encoding the tX2 protein or partial peptide used in the present invention is not particularly limited as long as it can express the tX2 protein or partial peptide by reverse transcriptase. It can be obtained by means.
  • a partial base of the protein of the present invention is used as a means for cloning DNA that completely encodes the tX2 protein or a partial peptide thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the protein of the present invention) in the present invention.
  • a partial base of the protein of the present invention is used. Amplified by PCR using a synthetic DN A primer containing the sequence, or encodes part or all of the labeled protein of the present invention from DN A incorporated into an appropriate vector It can be selected by hybridization using DNA fragments or synthetic DNA.
  • the hybridization method can be carried out, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Saibrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When using a commercially available library, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • Substitution of DNA base sequence can be done using PCR or known kits such as Mutan TM -superExpress Km (Takara Shuzo), Mutan TM -K (Takara Shuzo), etc. 0DA-LAPCR method, gapped duplex method, Kunkel method, etc. In accordance with known methods or similar methods. Can be done.
  • the cloned DNA encoding the protein of the present invention can be used as it is or after digestion with a restriction enzyme or addition of a linker as desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA or TAG as a translation stop codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • DNA or RNA encoding the protein of the present invention may be modified based on the following policy. That is, to make the DNA of the present invention in cells more stable, to increase the cell permeability of the DNA of the present invention, and to reduce the toxicity of the DNA of the present invention if it is toxic. To do. Many such modifications are known in the art, such as J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992; Vol. 8, pp. 395, 1992; ST Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993.
  • the DNA of the present invention may be used in a special form encapsulated in liposomes or microspheres.
  • the DNA of the present invention may have a substance other than the base added thereto.
  • the other substances include sugars; acids or bases; polycationic substances such as polylysine that works to neutralize the charge of the phosphate group skeleton; or the interaction with cell membranes or the incorporation of nucleic acids.
  • Hydrophobic substances such as lipids (eg, phospholipids, cholesterol, etc.)
  • Preferred lipids to be added include cholesterol and derivatives thereof (for example, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • the other substance can be attached to the 3 ′ end or 5 ′ end of the nucleic acid, and can be attached via a base, a sugar, or an intramolecular nucleoside bond.
  • the DNA or the like of the present invention may have its ends chemically modified.
  • the terminal modification group is the 3 'end of the nucleic acid.
  • Another example is a cap group specifically located at the 5 'end to prevent degradation by nucleases such as exonuclease and RNAse.
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • an expression vector that can express OtX2 protein or its partial peptide is used as a recombinant vector containing DNA or RNA encoding tX2 protein or its partial peptide. Is preferred.
  • the protein expression vector of the present invention is, for example, (i) a DNA fragment containing DNA encoding the protein of the present invention is excised from, for example, cDNA, and (ii) the DNA fragment is downstream of a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by connecting to.
  • the expression vector examples include plasmids derived from E. coli (eg, pCR4, pCR2.1, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), pacteriophages such as ⁇ phage, viruses such as retrovirus, adenovirus, lentivirus, vaccinia virus, baculovirus, pAl-11, pXTl, pRcZ CMV, pRcZRSV, pc DNA I / Neo, etc. are used.
  • the vector used in the present invention is preferably a virus, more preferably a retrovirus, an adenovirus or a lentivirus.
  • the promoter may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SR «promoter, SV40 promoter, LTR promoter-, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
  • LTR promoter, CMV promoter, SRo! Is preferred.
  • the host is Eshierihia genus bacterium, trp promoter, l ac promoter, re cA promoter, AP L promoter of all, like 1 pp promoter, if the host is Bacillus, S P01 promoter, SP02 promoter PEN 5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. are preferred when the host is yeast, such as pen P promoter.
  • a polyhedrin promoter, P10 promoter or the like is preferable.
  • the expression vector contains an enhancer, splicing signal, poly A addition signal, cap structure, protein synthesis initiation signal, selection marker, marker marker, SV40 replication origin, etc. Can be used.
  • the selection marker examples include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter referred to as Amp 1 "). ), Neomycin resistance gene (hereinafter sometimes referred to as Ne ⁇ 1 , G418 resistance), etc.
  • dh fr gene-deficient Chinese hamster cell CHO is used and the dh fr gene is used as a selection marker.
  • the target gene can be selected even in a medium not containing thymidine.
  • an alkaline phosphatase (hereinafter sometimes abbreviated as AP) gene, a marginal fluorescent protein (GFP) gene, or the like can be preferably used.
  • a signal sequence suitable for the host may be added to the expression vector. If the host is Escherichia, ⁇ ⁇ signal sequence, ⁇ m pA ⁇ signal sequence, etc. If the host is Bacillus, one amylase ⁇ signal sequence, subtilisin ⁇ signal sequence, etc. Is yeast, MF a signal sequence, SUC2 signal sequence, etc. In this case, an insulin signal sequence, a hyperinferon / signal sequence, an antibody molecule / signal sequence, etc. can be used.
  • an I RES internal ribosome binding site
  • a transformant can be produced by introducing an expression vector containing the DNA encoding the protein of the present invention thus constructed into a host.
  • Examples of hosts that can be used include Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, and animal cells.
  • Specific examples of the genus Escherichia include: Escherichia col i K 12 ⁇ DH 1 [Procedures' Ob ⁇ The ⁇ National ⁇ Academy ⁇ Ob ⁇ Sciences ⁇ Ob ⁇ The ⁇ U Esue (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • yeast include Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) AH 22, AH22 R ⁇ , NA87-11 A, DKD-5 D, 2 OB — 1 2, Schizosaccharomyces pombe NCYC 1913, NCYC2036, Pichia pastoris (Pichia pastoris) Used.
  • insect cells for example, when the virus is AcNPV, larvae derived from night stealing larvae (Spodoptera frugiperda cell; S f cells), MG 1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, derived from eggs of Trichoplusia ni High Five TM cells, cells derived from Mamestrabrassicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • S f cells larvae derived from night stealing larvae
  • BmNP V silkworm-derived cell lines (Bombyx mori N; Bm N cells) are used.
  • S ⁇ cells examples include S f 9 cells (ATCC CRL1711), S f 21 cells (above, Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)). Used. Examples of insects include silkworm larvae [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • Animal cells include, for example, monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), dh fr gene-deficient Chinese 8 muster cells CHO (hereinafter CHO (dh fr ”) Abbreviated cells), mouse L cells, mouse At T_20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, and the like.
  • Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, Vol. 6, 47-55 (1988).
  • To transform animal cells see, for example, Cell Engineering Supplement 8 New Cell Engineering Experimental Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973) Can be done according to the method.
  • a transformant transformed with an expression vector containing a DNA encoding the protein of the present invention is obtained.
  • a liquid medium is suitable as the medium used for the cultivation, and carbon necessary for the growth of the transformant is included therein. Source, nitrogen source, inorganic substances and others.
  • Examples of carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn stee liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, and potato extract.
  • Examples of inorganic or organic substances such as liquids and inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • M 9 medium containing glucose and casamino acids For example, M 9 medium containing glucose and casamino acids [Miller, Journal of Experimen, In, More Thousand Yura, Sienetics Journal of Experiments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972].
  • a drug such as 3] 3-indolylacrylic acid can be added.
  • the host is Escherichia
  • the culture is usually about 15 to 43 ° C and about 3 Perform for ⁇ 24 hours. If necessary, aeration and agitation can be added.
  • the culture is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
  • examples of the medium include a Burkholder's minimum medium [Bostian, KL et al., Proceedings of the National Academy. Yenci's' Ob 'The' USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Volume 77, 4505 (1980)] and SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Proceedings of ⁇ The National Academy 'Ob ⁇ Sciences' Ob The Usci (Pro Natl.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. Cultivation is usually carried out at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours, with aeration and agitation as necessary.
  • the culture medium When cultivating transformants whose hosts are insect cells or insects, the culture medium was immobilized to Grace's Insect Medium (Grace, T., Nature, 195, 7 88 (1962)) 10 For example, an appropriate addition of additives such as% urine serum is used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Cultivation is usually carried out at about 27 ° C for about 3-5 days, with aeration and agitation as necessary.
  • the medium When cultivating transformants in which the owner is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing about 5-20% fetal bovine serum [Science, Vol.
  • the protein of the present invention can be produced in the cell, in the cell membrane or outside of the transformant.
  • Separation and purification of the protein of the present invention from the culture can be performed, for example, by the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme and Z or freeze-thaw, etc. Therefore, after destroying the cells or cells, a method of obtaining a crude protein extract by centrifugation or filtration is appropriately used.
  • the buffer may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-1100 TM.
  • the cells or cells are separated from the culture supernatant by a known method, and the culture supernatant is collected. Purification of the protein contained in the extract or culture supernatant thus obtained can be performed by appropriately combining known separation and purification methods.
  • known separation and purification methods include methods that utilize solubility, such as salting-out solvent precipitation; mainly methods such as permeation, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Method using molecular weight difference Method using differential charge such as ion exchange chromatography; Method using specific affinity such as affinity chromatography; Hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography
  • the protein thus obtained when obtained in a free form, it can be converted to a salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when obtained by a salt, the known method or It can be converted to the free form or other salts by a similar method.
  • the protein produced by the transformant can be arbitrarily treated by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification. Modifications can be made and the polypeptide can be partially removed.
  • the protein-modifying enzyme include ⁇ ribsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like.
  • O t X 2 protein By inducing O t X 2 protein or increasing the expression level of O t X 2 protein, differentiation induction into retinal photoreceptor cells can be induced.
  • O t X 2 protein is expressed in Ocular tissue-derived cells, embryonic stem cells, neural stem cells or neural progenitor cells, or the expression level of O t X 2 protein is increased.
  • the cells can be induced to differentiate into retinal visual cells. Therefore, (a) ⁇ tX2 protein or its partial peptide or a salt thereof, or (b) DNA or RNA encoding OtX2 protein or its partial peptide is transmitted to retinal photoreceptors. It can be used as an agent for inducing differentiation.
  • the “induction of differentiation into retinal photoreceptors” may occur in vivo or in vitro. That is, the differentiation-inducing agent for retinal photoreceptors according to the present invention may be administered to a living body to induce differentiation into retinal photoreceptors in vivo. Also, in vitro, for example, the differentiation inducer for retinal photoreceptors according to the present invention is applied to ocular tissue-derived cells, embryonic stem cells, neural stem cells or neural progenitor cells, and the cells are induced to differentiate into retinal photoreceptors. May be.
  • the DNA of the present invention is introduced into ocular tissue-derived cells, embryonic stem cells, neural stem cells or neural progenitor cells, and the obtained cells are cultured to differentiate the cells into retinal visual cells. Can be guided.
  • other genes may also be introduced. Examples of other genes include a retina-specific homebox gene. Examples of the retina-specific homeobox gene include genes that have a specific expression pattern in the eye region and control region-specific morphogenesis in the developmental process, and genes that are involved in the expression of differentiation traits. Specifically, Crx, Chxl0, Pax6, Rax and the like can be mentioned. Suitable examples of the “eyeball tissue” include ocular embryonic inner layer tissue.
  • Such tissue may be derived from an adult or an embryonic individual.
  • eyeball tissue-derived cells include ciliary somatic cells such as fetal neural retina and ciliary pigment epithelial cells, or retinal pigment epithelial cells, ciliary epithelial cells, iris cells and the like.
  • the ocular tissue-derived cells are treated with, for example, dispase or EDTA after removing the tissue extracted by appropriate means, then trypsinized to separate single cells, and then confluent in an appropriate medium. And the obtained cells can be collected by trypsin treatment and collagenase treatment.
  • a medium such as a medium containing basic fibroblast growth factor, a medium containing epidermal growth factor, or a medium containing LIF (leukocyte migration inhibitory factor) is used. be able to.
  • the medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) include a serum-free medium containing bFGF, and more specifically, DMEM ZF 12 containing N 2 supplement. .
  • the content of the bFGF in such a medium is preferably about 1 OngZml or more, preferably about 20 ngZml or more, more preferably about 40 ngZm1 or more.
  • N 2 supplements include insulin of about 5 gZml, transferrin of about 100 g / ml, progesterone of about 20 nM, butretsin of about IOOM, and sodium selenate of about 3 OnM. Conditions such as temperature, oxygen concentration, carbon dioxide concentration, etc. in the culture can be appropriately set according to the cells.
  • Neural stem cells or neural progenitor cells may be derived from ocular tissue-derived cells, embryonic stem cells, or other cells or tissues. Specifically, fetal retina-derived neural stem cells, adult ciliary body-derived retinal stem cells, iris-derived retinal stem cells, brain-derived neural stem cells, retinal progenitor cells, iris-derived neural progenitor cells, and the like.
  • the method for inducing neural stem cells or neural progenitor cells from ocular tissue-derived cells or embryonic stem cells or other cells or tissues may be in accordance with known methods. For example, methods for inducing embryonic stem cells into neural stem cells or neural progenitor cells include, for example, Kawasaki, Sakurai et al.
  • the neural stem cell or neural progenitor cell may be obtained as a neural sphere including the neural stem cell, but in the present invention, the neural sphere may be subjected to the following operation.
  • the method for introducing the DNA of the present invention and, if desired, other genes into the neural stem cell or neural progenitor cell, preferably the neural stem cell or neural progenitor cell, and preferably other genes is not particularly limited, Known methods may be used.
  • a gene introduction method using an adenovirus vector a gene introduction method using a retrovirus vector, a gene introduction method using an adeno-associated virus, lipofussion, and Eleg small mouth position, etc.
  • a gene introduction method using an adenovirus vector and a gene introduction method using a retrovirus vector are preferable.
  • the transfected cells are cultured under differentiation-inducing conditions suitable for differentiation into retinal photoreceptors.
  • Differentiation induction conditions vary depending on the type of cell into which the gene has been introduced and the like, and thus cannot be generally stated, and can be appropriately selected.
  • the differentiation-inducing condition includes culturing in the presence of retinoic acid and serum.
  • examples of the medium that can be used for the culture include the above-mentioned DMEM / F 12 medium containing the N 2 supplement.
  • the amount of retinoic acid used is about 0.1 M or more, preferably about 0.5 M or more, about 10 M or less, preferably about 5 M or less. Is desirable.
  • the amount of serum used is preferably about 1% when differentiation is induced. More
  • conditions such as the temperature during culture, oxygen concentration, and carbon dioxide concentration can be appropriately set according to the cell into which the gene has been introduced.
  • the retinal photoreceptors obtained by the differentiation induction method of the present invention as described above are, for example, cells for transplantation for patients with retinal membrane degeneration such as retinal membrane degeneration, age-related macular degeneration, retinal detachment, glaucoma or retinal vascular occlusion. It can be applied as Further, the transplanted cells are not limited to those fully differentiated into retinal photoreceptor cells, but may be progenitor cells before differentiation into retinal photoreceptor cells.
  • O t X 2 protein or a partial peptide thereof or a salt thereof, or a DNA or RNA encoding a t X 2 protein or a partial peptide thereof can be used as a medicament for prevention, treatment or progression inhibitor of retinal diseases.
  • retinal diseases include diabetes, hypertension, arteriosclerosis, anemia, leukemia, connective tissue diseases such as systemic lupus erythematosus and scleroderma, and Ty-Sacks disease and folk toe spill meyer.
  • Vascular and inflammatory and degenerative lesions of the retina caused by systemic diseases such as inborn errors of metabolism such as (Vogt-Shme yer) disease, and retinopathy of prematurity, retinal vein occlusion, retinal artery occlusion, retinal vein Retinal vascular disorders such as peripheral inflammation, retinal inflammation and degeneration resulting from retinal detachment or trauma, aging-related retinal degenerative diseases such as senile disciform macular degeneration, and congenital retinal degenerative diseases Examples include local diseases of the retina.
  • the preventive, therapeutic or progression inhibitor for retinal diseases according to the present invention is particularly suitable for congenital retinal degenerative diseases, retinitis pigmentosa, macular degeneration, diabetic retinopathy, retinal detachment, glaucoma or retinal vascular occlusion. It can be used effectively.
  • the protein of the present invention When used as a prophylactic / therapeutic / progressive inhibitor for the above retinal diseases, it can be formulated according to conventional means.
  • the DNA of the present invention when used as a prophylactic / therapeutic / progressive inhibitor for the above-mentioned retinal diseases, the DNA of the present invention alone or a retroviral vector,
  • adenovirus associated virus vector After insertion into an appropriate vector such as evening, it can be formulated according to conventional means.
  • the DNA or the like of the present invention can be administered as it is or together with an auxiliary agent for promoting intake by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • the protein of the present invention or the DNA of the present invention can be administered orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., sugar-coated as necessary, or water or It can also be administered parenterally in the form of injections such as sterile solutions or suspensions with other pharmaceutically acceptable solutions.
  • the preparation of the present invention includes, for example, known carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like that physiologically recognize the protein of the present invention or the DNA of the present invention. It can be produced by mixing.
  • Additives that can be mixed in tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic; excipients such as crystalline cellulose; corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Such as swelling agents; lubricants such as magnesium stearate; sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin; flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • a liquid carrier such as fats and oils can be further contained.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active ingredients in an injectable aqueous or oily liquid.
  • aqueous solution for injection for example, isotonic solution containing physiological saline, bud sugar and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D_mannitol, sodium chloride, etc.) is used.
  • adjuvants such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene dallicol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80 TM, HCO-5 0) etc.
  • oily liquids include sesame oil, large Benzoic acid, a solubilizing agent that uses soybean oil
  • the sterile composition includes, for example, a buffer (for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (for example, benzalkonium chloride, pro-in hydrochloride, etc.), a stabilizer (for example, , Human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc. may be blended.
  • a buffer for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, benzalkonium chloride, pro-in hydrochloride, etc.
  • a stabilizer for example, Human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants etc.
  • the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, it is administered to mammals (eg, humans, rats, mice, rabbits, hidges, pigs, sushi, cats, dogs, monkeys, etc.) can do.
  • mammals eg, humans, rats, mice, rabbits, hidges, pigs, sushi, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dosage of the protein of the present invention or the DNA of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc., and cannot be generally stated.However, in the case of parenteral administration, it is about 0 per day. It is about 0 1 to 10 mg Z kg, and preferably about 0.05 to 5 mg / kg.
  • the prophylactic / therapeutic / progressive inhibitor for retinal diseases according to the present invention is preferably administered locally to the eye.
  • Examples of the dosage form of such a preparation for topical ophthalmic administration include eye drops, eye ointments, powders, granules, tablets, capsules, injections and the like, and particularly eye drops (eg, aqueous eye drops, aqueous suspension points). Ophthalmic preparations, non-aqueous eye drops or non-aqueous suspension eye drops, etc.), eye ointments and injections are preferred. Such formulations can be prepared according to conventional means.
  • aqueous solution or suspension diluent used in the preparation of eye drops examples include distilled water and physiological saline.
  • Non-aqueous diluents or suspensions include vegetable oils, liquid paraffin, mineral oil, propylene glycol, P-year-old cutyl decanol, and the like.
  • the eye drops of the present invention usually include various kinds of buffers, isotonic agents, preservatives, thickeners, stabilizers, antioxidants, PH adjusters, chelating agents and the like that can be incorporated into eye drops. Additives can be blended as appropriate. Eye drops should be prepared aseptically or sterilized at an appropriate stage This is done by applying processing.
  • the buffer is added for the purpose of maintaining the pH constant at, for example, about 5.0 to 8.0.
  • a borate buffer, a kenate buffer, a tartrate buffer, phosphorus Acid buffer solution, acetate buffer solution, etc. are used.
  • the addition amount of these buffering agents is added within the range in which pH can be kept constant within the above range, for example, the purpose of adding the buffering agent.
  • the tonicity agent is added for the purpose of making it isotonic with tear fluid, for example, sugars such as glucose, mannyl, and sorbitol; polyhydric alcohols such as glycerin, polyethylene glycol, and propylene glycol. Salts such as sodium chloride and sodium quenate are included.
  • isotonic agents are added in such an amount that the osmotic pressure of the eye drops is the same as that of tears.
  • preservative for example, benzalkonium chloride, parabens, chlorobutanol and the like are used.
  • the thickener include glycerin, carboxymethyl cellulose, and strong oxyoxyvinyl polymer.
  • stabilizer include sodium sulfite and propylene glycol.
  • the antioxidant include Examples include ascorbic acid, sodium ascorbate, tocopherol, sodium thiosulfate, etc.
  • pH adjusting agent examples include hydrochloric acid, citrate, phosphoric acid, acetic acid, tartaric acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, Examples thereof include sodium hydrogen carbonate, and examples of the chelating agent include sodium edetate and sodium quenate.
  • the eye drops may be lyophilized and dissolved in distilled water for injection before use.
  • An eye ointment can be prepared aseptically by mixing an active ingredient in a commonly used eye ointment base and formulating it according to a conventional method.
  • the base for ophthalmic ointment include petrolatum, selenium 50, plastibase, macrogol and the like, and a surfactant can be added for the purpose of further improving hydrophilicity.
  • the above additives such as preservatives may be added. You can also.
  • preparations for topical ophthalmic administration include sustained-release preparations and DDS (drug delivery) preparations together with release-controlling substances that can control the release of O tx 2 protein or its partial peptides or DNA encoding them in the eye. It can also be an intraocular implant preparation.
  • Examples of the release controlling substance include ⁇ -hydroxycarboxylic acids known per se (eg, glycolic acid, lactic acid, hydroxybutyric acid, etc.), hydroxydicarboxylic acids (eg, malic acid, etc.), hydroxytricarboxylic acids (eg, que A polymer synthesized by non-catalytic dehydration polycondensation from one or more of such as acid, etc.), a copolymer or a mixture thereof, polymonocyananoacrylate, polyamino acid (eg, polybenzyl-L-glutamic acid) And the like, and biodegradable polymer materials such as maleic anhydride copolymers (eg, styrene monomaleic acid copolymers).
  • ⁇ -hydroxycarboxylic acids known per se eg, glycolic acid, lactic acid, hydroxybutyric acid, etc.
  • hydroxydicarboxylic acids eg, malic acid, etc.
  • hydroxytricarboxylic acids
  • the dose and frequency of administration of the preparation for topical ophthalmic administration of the present invention vary depending on the administration subject, symptoms, administration form, treatment period, etc., but cannot generally be said.
  • the protein of the present invention Or a preparation containing 0.001 to 10.0 w / v%, preferably 0.01 to 1.0 wZv% of the present invention, etc., several times a day for an adult, preferably 1 to 6 times per day 1 to 4 drops, preferably 1 to 4 drops.
  • a preparation containing 0.001 to 10.0 wZw%, preferably 0.01 to 1.0 w / w% of the protein of the present invention or the DNA of the present invention for adults.
  • it can be applied several times a day, preferably 1 to 6 times.
  • the 0 t X 2 protein or a partial peptide thereof or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the protein of the present invention) in the test solution is detected or the amount thereof is measured.
  • diagnosis of retinal diseases can be performed. For example, if a decrease in the concentration of the protein of the present invention is detected, for example, it is highly likely that the subject has a retinal disease or is likely to suffer in the future. Can be diagnosed.
  • An antibody against O t X2 protein or a partial peptide thereof or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as an antibody of the present invention) can specifically recognize the protein of the present invention, etc. It can be used for detection and quantification of proteins of the present invention in a liquid.
  • the antibody of the present invention can be used as a diagnostic agent for retinal diseases.
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ′) 2 , Fab, or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the protein of the present invention in the test solution can also be detected by tissue staining or the like.
  • the antibody of the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein of the present invention.
  • the antibody of the present invention can be produced according to a known antibody or antiserum production method using the protein of the present invention as an antigen.
  • the protein or the like of the present invention is administered to a mammal together with itself or a carrier and diluted homogeneous lj at a site where antibody production is possible by administration.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production at the time of administration. Administration is usually once every 2 to 6 weeks, for a total of 2 to 10 times. Examples of mammals to be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, hidges and goats, and mice or rats are preferably used.
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared by fusing the antibody-producing cells contained therein with myeloma cells.
  • the antibody titer in antiserum can be measured by, for example, After reacting labeled protein or the like with antiserum, the activity of the labeling agent bound to the antibody can be measured.
  • the fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein (Nature; 256, 495 (1975)).
  • fusion promoters include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • PEG polyethylene glycol
  • myeloma cells include NS-1, P 3 Ul, SP 2Z0, etc., and P 3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) used and the number of myeloma cells is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is at a concentration of about 10 to 80%.
  • Hyperidoma is applied to a solid phase (eg, microplate) on which an antigen such as the protein of the present invention is adsorbed directly or with a carrier
  • Add culture supernatant then add anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or enzyme (if the cell used for cell fusion is a mouse, anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A.
  • a method for detecting a monoclonal antibody bound to a phase (b) a protein of the present invention labeled with a radioactive substance or an enzyme, etc., by adding a hyperidoma culture supernatant to a solid phase adsorbed with an anti-immunoglobulin antibody or protein A, etc. And a method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase.
  • Selection of the monoclonal antibody can be performed according to a known method or a method similar thereto, but can usually be performed in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminobuterin, thymidine) is added.
  • HAT hyperxanthine, aminobuterin, thymidine
  • RPMI 16 40 medium containing baby serum, GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing approximately 1 to 10% fetal bovine serum, or serum-free medium for eight-hybridoma culture (SFM—100, 1 day) Mizu Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culture temperature is usually about 20 to 40 ° C., preferably about 37.
  • the culture time is usually about 5 days to 3 weeks, preferably about 1 week to 2 weeks. Cultivation can usually be performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hyperidoma culture supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer in the above antiserum.
  • the monoclonal antibody is separated and purified. Separation and purification of monoclonal antibodies can be carried out in the same way as conventional polyclonal antibody separation and purification methods (eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchanger (eg, DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification method to obtain antibody by dissociating the binding using active adsorbent such as protein A or protein G ] Can be performed.
  • conventional polyclonal antibody separation and purification methods eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchanger (eg, DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification method to obtain antibody by dissociating the binding using active adsorbent such as protein A or protein G ] Can
  • polyclonal rod of the present invention An example of a production method with a polyclonal antibody against the protein or the like of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as “polyclonal rod of the present invention”) is described below.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced by a known method or a method analogous thereto. For example, a complex of an immune antigen (such as the protein of the present invention) and a carrier protein is prepared, and a mammal is immunized in the same manner as the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting the antibody-containing material and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten are such that antibodies are more efficient than hapten immunized by cross-linking to carrier.
  • it is not particularly limited as long as it can be improved, for example, ushi serum albumin, ushithyroglobulin, keyhole limpet hemocyanin, etc. by weight ratio of about 0 to hapten 1.
  • a method of coupling at a ratio of 1 to 20, preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents can be used for coupling between the hapten and the carrier, but dartal aldehyde, carpositimide, maleimide active ester, or an active ester reagent containing a thiol group or dithiopyridyl group is used.
  • the condensation product of a hapten and a carrier is administered to a warm-blooded animal with itself or a carrier and a diluent at a site where antibody production is possible.
  • complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered. Administration can be performed about once every 2 to 6 weeks, usually about 3 to 10 times in total.
  • the polyclonal antibody can be collected from blood or ascites of mammals immunized by the above method, preferably from blood.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the above-described measurement of the antibody titer in the antiserum.
  • the separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • the method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited.
  • an antibody, antigen or antibody corresponding to the amount of antigen in the test solution (amount of the protein of the present invention).
  • the amount of one antigen complex is detected by chemical or physical means, and the amount of antigen in the test solution is calculated from the detected value based on a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen.
  • the method of doing is mentioned.
  • nephrometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used, but the sandwich method described later is particularly preferable in terms of sensitivity and specificity.
  • radioisotopes examples include [ 1 2 5 I], [ 1 3 1 I], [ 3 H], [ 1 4 C], and the like.
  • the enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • i3-galactosidase, / 3-darcosidase, alkaline phosphatase, One-year-old xidase, malate dehydrogenase, etc. are used.
  • the fluorescent material for example, fluorescamine, fluorescene isothiocyanate and the like are used.
  • the luminescent substance include luminol, luminol derivatives, luciferin, and lucigenin.
  • a biotin-avidin system can also be used for binding of an antibody or antigen to a labeling agent.
  • insolubilization of the antigen or antibody in the above-described quantification method physical adsorption may be used, and chemical bonds usually used for insolubilizing / immobilizing proteins or enzymes may be used.
  • the carrier for example, insoluble polysaccharides such as glue mouth, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; or glass is used.
  • sandwich method the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), the labeled monoclonal antibody of the present invention is reacted (secondary reaction), and then the labeling agent on the insolubilized carrier.
  • the amount of the protein of the present invention in the test solution can be quantified.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, or may be performed simultaneously.
  • the labeling agent and insolubilization method are the same as described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity. It may be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used for the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different binding site to the protein of the present invention.
  • the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, the antibody used in the primary reaction when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminus of the protein of the present invention.
  • an antibody that recognizes other than the C end for example, the N end is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can also be used for quantitative methods other than the sandwich method, for example, competition method, immunometric method, nephrometry, etc. .
  • competition method the antigen in the test solution and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated ( BZF separation), measure the amount of labeled B or F, and quantify the amount of antigen in the test solution.
  • the present method includes (a) a liquid phase method using a soluble antibody as an antibody, B / F separation using polyethylene glycol, a second antibody against the above antibody, and (b) a solid phase as the first antibody.
  • a phased antibody may be used, or the first antibody may be soluble and the second antibody may be a solid phased antibody.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are labeled with a certain amount.
  • the solid phase and the liquid phase are separated, or in the test solution.
  • the solid phase antigen is added and unreacted labeled antibody is bound to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the amount of labeled antibody in either phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
  • Nephrometry measures the amount of insoluble precipitate produced as a result of antigen-antibody reaction in gel or solution.
  • laser nephrometry using laser scattering is preferably used.
  • the antibody of the present invention comprises the production of an antibody column used for purifying the protein of the present invention, detection of the protein of the present invention in each fraction during purification, and the present invention in a test cell. It can also be used for analysis of protein behavior.
  • An antisense polynucleotide containing a DNA sequence of the present invention, or a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the DNA of the present invention, can be used in vivo by using it as a probe.
  • the DNA or mRNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof in vivo in mammals eg, humans, rats, mice, rabbits, hidges, pigs, mice, cats, nu, monkeys, etc.
  • mammals eg, humans, rats, mice, rabbits, hidges, pigs, mice, cats, nu, monkeys, etc.
  • abnormalities gene abnormalities
  • it is useful, for example, as a genetic diagnostic agent for DNA, mRNA damage, mutation or decreased expression.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA or the like of the present invention or an antisense polynucleotide can be performed by, for example, a known Northern hybridization method or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 ( 1989), Proceedings of the National Academy of Sciences, Volume 86, pp.
  • the “antisense polynucleotide” is a polynucleotide having at least a part of a base sequence complementary to the base sequence of the DNA of the present invention and capable of hybridizing with the DNA of the present invention. That's fine.
  • the antisense polynucleotide may contain not only a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the DNA of the present invention but also a substantially complementary nucleotide sequence. Examples thereof include those containing a nucleotide sequence that hybridizes with the DNA of the present invention under conditions of high stringency.
  • Antisense polynucleotides contain 2-deoxy D-lipose-containing polynucleotides, D-lipose-containing polynucleotides, purine or pyrimidine base N-glycosides.
  • polynucleotides other than those mentioned above, or other polymers having a non-nucleotide backbone (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds (That said, the polymer contains nucleotides having a configuration that allows base pairing and base attachment as found in DNA and RNA).
  • polymers having a non-nucleotide backbone eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers
  • the polymer contains nucleotides having a configuration that allows base pairing and base attachment as found in DNA and RNA.
  • These can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and also DNA: RNA hybrids, and can also be unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides).
  • Modified polynucleotides include, for example, those known in the art, capped, methylated, one or more natural nucleotides substituted with analogs, and intramolecular nucleotides.
  • nucleoside may contain not only purine and pyrimidine bases but also those having other heterocyclic bases modified. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles.
  • the sugar moiety of the side chain may be further modified, for example, one or more hydroxyl groups of the sugar may be substituted with a halogen or an aliphatic group, or It may be converted to a functional group such as ether or amine.
  • the antisense polynucleotide of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acids include, but are not limited to, nucleic acid sulfur derivatives, thiophosphate derivatives, and polynucleoside amides that are resistant to degradation of oligonucleoside amides. .
  • a compound or a salt thereof having an action of inducing differentiation into retinal photoreceptors can be screened with the expression or increase in the expression level of O t X2 protein or a partial peptide thereof as an indicator.
  • the screening can be performed using, for example, a cell having an ability to express an O t x2 protein or a partial peptide thereof.
  • cells capable of expressing O t X 2 protein or its partial peptide are cultured in the presence of a test compound, and the expression of O t X 2 protein or its partial peptide is detected, or Measure the expression level of And a method of screening a compound having an action of inducing differentiation into retinal photoreceptors or a salt thereof.
  • Examples of the “cell having the ability to express Otx 2 protein or a partial peptide thereof” include the above-mentioned transformed cells having the DNA of the present invention.
  • it may be a cell that originally has the ability to express an O tx 2 protein or a partial peptide thereof.
  • the expression level of the protein of the present invention is determined from the cultured cells described above.
  • the protein of the present invention can be separated and purified by the method and measured using the above-described method for quantifying the protein of the present invention.
  • a cell having the ability to express a tx2 protein or a partial peptide thereof is cultured in the presence of a test compound, and the DNA encoding the protein of the present invention or its complement Retinal photoreceptors characterized by measuring the amount of mRNA encoding 0 t X 2 protein (hereinafter sometimes abbreviated as O t X 2 mRNA) using DNA or a partial DNA thereof. And a method of screening a compound having a differentiation-inducing action or a salt thereof.
  • O t X 2 mRNA expression level when cells capable of expressing ⁇ t x2 protein or partial peptide thereof are cultured and (b) ⁇ t x2 protein or partial peptide thereof.
  • the measurement of the amount of mRNA encoding tx 2 protein is carried out by measuring mRNA extracted from cells according to a known method and DNA encoding the protein of the present invention or its complementary D It is carried out by contacting NA or a partial DNA thereof and measuring the amount of mRNA bound to the DNA encoding the protein of the present invention or its complementary DNA or the partial DNA.
  • a DNA encoding the protein of the present invention or a complementary DNA thereof or a partial DNA thereof for example, by labeling with a radioisotope or a dye, for example, a DNA encoding the protein of the present invention or a complementary DNA thereof or a partial DNA thereof
  • a radioisotope or a dye for example, a DNA encoding the protein of the present invention or a complementary DNA thereof or a partial DNA thereof
  • the amount of ⁇ tx 2 mRNA bound to can be easily measured.
  • 32 P or 3 H is used as the radioisotope, and as the dye, for example, fluorescein FAM (PE Biosystems), JOE (PE Biosystems), TAMRA (PE Biosystems), A fluorescent dye such as OX (manufactured by PE Biosystems), Cy 5 (manufactured by Amersham) or Cy 3 (manufactured by A mersham) is used.
  • the amount of O t x2 mRNA is determined by converting RNA extracted from cells into cDNA using reverse transcriptase, and then using DNA encoding the protein of the present invention or its complementary DNA or a partial DNA thereof as a primer. It can also be done by measuring the amount of cDNA amplified by PCR.
  • Promoter or enhancer of DNA encoding O t X 2 protein characterized by detecting the expression of a reporter gene instead of O t X 2 protein expression in the presence of a compound
  • the present invention provides a screening method for a compound having an action of controlling one activity or a salt thereof, and further a screening method for a compound having an action of inducing differentiation into retinal photoreceptors or a salt thereof.
  • a staining marker gene such as lacz ( ⁇ -galactosidase gene) is used as the repo overnight gene.
  • the compound can be selected as a compound having an action of promoting the activity of the promoter or enhancer of the O tx 2 gene, that is, a compound having an activity of promoting the expression of the O t X 2 protein or a partial peptide thereof.
  • test compound in the screening method of the present invention described above examples include peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • a cell having the ability to express a tx 2 protein or a partial peptide thereof for example, (a) a cell having the ability to express a tx 2 protein or a partial peptide thereof, (b) D encoding the protein of the present invention NA or its complementary DNA or a partial DNA thereof, or (c) a cell transformed with DNA in which a promoter or enhancer of DNA encoding O t X 2 protein is linked to a reporter gene, etc. is there.
  • the compound or salt thereof obtained by using the screening method or screening kit of the present invention is useful as a pharmaceutical agent for preventing, treating, or suppressing the above-mentioned retinal diseases, or for inducing differentiation into retinal photoreceptor cells.
  • the compound or a salt thereof, an agent for preventing, treating or inhibiting progression of retinal diseases containing them, or an agent for inducing differentiation into retinal photoreceptors containing them is the protein or DNA of the present invention described above. It can be implemented in the same way.
  • mouse Otx 2 cDNA was incorporated into a retroviral vector LIA vector.
  • the LIA vector (control virus vector) contains a human placenta-derived alkaline phosphatase gene, and cells infected with this vector-derived virus express the alkaline phosphatase as the best possible.
  • LIA vector with integrated O t 2 gene Cells infected with the virus derived from (O tx 2 virus vector) express O tx 2 protein and at the same time co-express alkaline phosphatase as a marker.
  • a control virus vector and an O t X2 virus vector were prepared, respectively.
  • virus solutions having an infection efficiency of 1 ⁇ 10? P u u (plaque forming unit) / m 1 were prepared.
  • the pup rat immediately after birth (day 0) was subjected to cold anesthesia, and the skin covering the eye was incised with surgical scissors.
  • an injection needle manufactured by Hami 1 ton
  • 51 1 of the virus solution of the above control virus vector or 0 t X 2 virus vector was injected.
  • the pups were warmed at 37 ° C for about 20 minutes to recover their body temperature, then returned to the mother rat's cage and continued for 4-6 weeks.
  • the heat-treated retina was stained with an alkaline phosphatase staining solution (room temperature, 3 hours), and only retinal cells infected with the virus were stained blue-violet.
  • the stained retina was re-fixed overnight with 4% paraformaldehyde solution, washed with PBS, and then 30% Sucros 6? After soaking in 83 solution, it was transferred to 0-3 c cop und (Sakura Finetek) solution to prepare a frozen block of retina on dry ice.
  • a frozen section preparation device Carl Zeiss
  • Approximately 30 frozen sections were prepared from the sample and observed under an optical microscope (Carl Zeiss).
  • Retinal cell types were identified by their morphology and location (see Figure 3). This was done three times in an independent test.
  • Figure 4 shows the abundance of each cell relative to the total number of cells seen in one field of view. ⁇ When the tX2 viral vector was introduced into retinal stem cells (or retinal progenitor cells), the number of retinal photoreceptor cells increased by approximately 10% compared to when the control virus vector was introduced. From this, it was found that the expression of the tx2 gene strongly suppressed the differentiation of retinal stem cells into bipolar cells, amacrine cells, and Müller-Daria cells, and most retinal stem cells differentiated into retinal photoreceptor cells.
  • the protein or the like of the present invention or the DNA of the present invention is intended to prevent, treat or suppress progression of network diseases such as retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, retinal detachment, glaucoma or retinal vascular occlusion It can be used for pharmaceuticals. Furthermore, because abnormalities in the retinal photoreceptors cause structural or functional abnormalities due to abnormalities in the tX2 gene, detection of abnormalities in the 0tX2 gene or denaturation or decreased expression of the tX2 protein It can be used for diagnosis of retinal diseases.

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Abstract

本発明は、(a)Otx2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩、または(b)Otx2タンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはRNAを含有することを特徴とする医薬を提供する。本発明の医薬は、網膜変性症をはじめとする網膜疾患の予防、治療または進行抑制剤として有用である。また、本発明の医薬は、網膜疾患を患う患者の網膜などへの細胞移植に際し、例えば網膜幹細胞から網膜視細胞への分化誘導剤としても有用である。

Description

〇 t x 2遺伝子を用いた網膜視細胞の再生と新生
技術分野
本発明は、 〇 t X 2タンパク質または O t X 2タンパク質をコードする遺伝 子を含有する網膜視細胞への分化誘導剤、 網膜疾患の予防 ·治療 ·進行抑制剤 明
および網膜疾患の診断剤等に関する。
田 背景技術
網膜視細胞は、 哺乳動物において唯一の光センサーであり、 従来から生理学 的、 生化学的、 解剖学的および臨床学的に盛んに研究されてきた （特開 2 0 0 2 - 3 2 5 5 7 1号公報)。 しかし、 網膜視細胞への分化発生機構は全くといつ ていい程不明であった。 網膜視細胞の異常に起因する病気であるヒト遺伝的網 膜変性症の原因遺伝子座として少なくとも 1 4 5座が知られているが、 当該疾 患に対する確立した治療方法はいまだに存在せず、 患者は重篤な視力障害に苦 しんでいる。 それゆえ、 失明または重篤な視力障害をもたらす網膜変性症の原 因解明と治療方法の確立が待ち望まれている。 また、 網膜色素変性症のみなら ず、 糖尿病性網膜症または黄斑部変性症などの多くの網膜疾患で網膜視細胞の 変性または障害が見られるので、 網膜視細胞の再生または新生を可能にするた めに、 網膜視細胞の発生と分化の分子機構の解明は非常に重要である。
発明の開示
本発明は、 網膜変性症をはじめとする網膜疾患の予防、 治療または進行抑制 剤を提供することを目的とする。 また、 前記医薬として有用な化合物のスクリ 一二ング方法を提供することを目的とする。 さらに、 本発明は、 網膜疾患の診 断剤または診断方法を提供することを目的とする。 また、 本発明は、 網膜疾患 を患う患者の網膜などへの移植に好適な網膜視細胞への分化誘導方法または分 化誘導剤を提供することを目的とする。
本発明者は、 網膜視細胞への分化の鍵をにぎるとして今まで解析してきた転 写因子 C r Xと同じ遺伝子ファミリーに属する O t X 2タンパク質に注目し、 O t X 2タンパク質の網膜視細胞の運命決定における役割を解析した。 マウス の生体レベルでの解析の結果、 本発明者は〇 t X 2タンパク質が網膜視細胞の 運命決定に非常に重要であることを知見した。'すなわち、 〇 t X 2遺伝子をゥ ィルスべクタ一に組み込んで、 当該組換えベクターをマウスの未分化網膜幹細 胞に感染させ、 マウスの未分化網膜幹細胞において O t X 2タンパク質を発現 させたところ、 ほとんどの未分化網膜幹細胞は網膜視細胞へと分化した。 かか る知見に基づき、 さらに検討を重ねて、 本発明を完成した。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 0 t X 2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を 含有することを特徴とする網膜疾患の予防、 治療または進行抑制剤、
( 2 ) 〇 t X 2タンパク質が、 配列番号： 1、 配列番号： 3もしくは配列 番号： 5で表されるアミノ酸配列と同一または前記配列と実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質である前記 （1 ) 記載の剤、
( 3 ) 〇 t x 2タンパク質またはその部分ペプチドをコードする D NAま たは R NAを含有する網膜疾患の予防、 治療または進行抑制剤、
( 4 ) D N Aが、 配列番号： 2、 配列番号： 4もしくは配列番号： 6で表 される塩基配列または前記配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズする塩基配列を含有する前記 （3 ) 記載の剤、
( 5 ) O t X 2タンパク質またはその部分ペプチドをコードする D NAま たは R NAを含有する組換えべクタ一を含有する前記 （3 ) 記載の剤、
( 6 ) O t X 2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を 含有することを特徴とする網膜視細胞への分化誘導剤、
(7) 0 t X 2タンパク質またはその部分ペプチドをコ一ドする DNAま たは R N Aを含有する網膜視細胞への分化誘導剤、
(8) 〇 t X 2タンパク質を発現させるか、 または〇 t X 2タンパク質の 発現量を上昇させることを特徴とする網膜視細胞への分化誘導方法、
(9) 眼球組織由来細胞、 胚性幹細胞、 神経幹細胞または神経前駆細胞に おいて、 O t X 2タンパク質を発現させるか、 または O t X 2タンパク質の発 現量を上昇させることを特徴とする前記 （8) に記載の網膜視細胞への分化誘 導方法、
(10) 眼球組織由来細胞、 胚性幹細胞、 神経幹細胞または神経前駆細胞 に、 O t X 2タンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNAまたは R NAを導入し、 得られた細胞を培養することを特徴とする前記 （8) に記載の 網膜視細胞への分化誘導方法、
(1 1) 〇 t x2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩 の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする網膜疾患の予防、 治療または 進行抑制方法、
(12) O t X 2タンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNA または RN Aの有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする網膜疾患の予防、 治療または進行抑制方法、
(13) 〇 t X 2タンパク質により分化誘導された網膜視細胞またはその 前駆細胞を網膜に移植することを特徴とする網膜の再生方法、
(14) 網膜疾患の予防、 治療または進行抑制剤の製造のための O t X 2 タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の使用、
(15) 網膜疾患の予防、 治療または進行抑制剤の製造のための〇 t X 2 夕ンパク質またはその部分べプチドをコードする DNAまたは RNAの使用、
(16) 〇 t X 2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩 に対する抗体を含有する網膜疾患の診断剤、
(17) O t X 2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩 に対する抗体を用いることを特徴とする網膜疾患の診断方法、
(18) 〇 t x 2タンパク質、 その部分ペプチドの発現量または変異を検 出することを特徴とする網膜疾患の診断方法、
(19) (a) 〇 t X 2タンパク質もしくはその部分ペプチドをコードす る DNAもしくは RNA、 または （b) 該 D N Aもしくは RN Aの塩基配列に 相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列を含有するアンチセンス ·ポリヌク レオチドを含有する網膜疾患の診断剤、
(20) (a) 〇 t X 2タンパク質もしくはその部分ペプチドをコードす る DNAもしくは RNA、 または （b) 該 DNAもしくは RNAの塩基配列に 相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列を含有するアンチセンス ·ポリヌク レオチドを用いることを特徴とする網膜疾患の診断方法、
(21) O t X 2タンパク質またはその部分ペプチドの発現または発現量 の上昇を指標とすることを特徴とする網膜視細胞への分化誘導作用を有する化 合物またはその塩のスクリーニング方法、
(22) 〇 t X 2タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有 する細胞を用いることを特徴とする前記 （21) 記載のスクリーニング方法、 (23) 0 t X 2タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有 する細胞を含有することを特徴とする網膜視細胞への分化誘導作用を有する化 合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(24) 前記 （21) もしくは （22) 記載のスクリーニング方法、 また は前記 （23) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、 網膜視細 胞への分化誘導作用を有する化合物またはその塩、
(25) 前記 （24) に記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、 に関する。 本発明のタンパク質等または本発明の DN A等を用いれば、 眼球組織由来細 胞、 胚性幹細胞、 神経幹細胞または神経前駆細胞を網膜視細胞に分化させるこ とができる。ゆえに、本発明のタンパク質等または本発明の DNA等を用いて、 網膜視細胞を再生または新生することにより、 例えば網膜色素変性、 加齢黄斑 変性、 糖尿病性網膜症、 網膜剥離、 緑内障または網膜血管閉塞症など網膜疾患 を予防、 治療または進行抑制することができる。 さらに、 O t x2遺伝子の異 常によつて網膜視細胞は構造的または機能的異常をきたすので、 O t X 2遺伝 子の異常または〇 t X 2タンパク質の変性もしくは発現低下を検出することに より、 上記網膜疾患の診断も行うことができる。
図面の簡単な説明
第 1図はコントロールウィルスベクターと O t X 2ウィルスベクターの構造 を示す図である。 図中、 APはヒト胎盤由来のアルカリホスファターゼ遺伝子 を、 LTRはウィルスのプロモーターを表す。 0 t X 2ウィルスベクタ一にお いて、 O t X 2と APとの間に I RES配列を有することにより、 該ベクター は両遺伝子 （〇 1; 2と八 ） の共発現が可能となる。 なお、 I RES配列は ウィルス由来の遺伝子である。
第 2図はウィルス感染実験の概要を示す図である。 図中、 Re t i naは網 膜、 P i gmen t Ep i t h e l i umは網膜色素上皮、 v i r u sはゥ ィルスが感染する範囲、 Remove R e t i n aは網膜摘出、 F i x a n d S t a i nは組織の固定と染色、 S e c t i on and An a 1 y s e C l one sは凍結切片とその解析を表す。
第 3図はアル力リホスファターゼ染色後の網膜凍結切片像の例を示す図であ る。 図中、 B iは双極細胞、 Aはアマクリン細胞、 Rは網膜視細胞、 Mはミュ —ラーグリア細胞、 R + B iは網膜視細胞とミューラーグリア細胞、 A + B i はアマクリン細胞と双極細胞を表す。
第 4図はコントロールウィルスベクター （L IA) 又は Otx2ウィルスべ クタ一 （〇tx2ZL IA) が感染した網膜幹細胞から分化した細胞それぞれ の、 顕微鏡一視野における全細胞数に対する存在率を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明で用いる O t X 2タンパク質としては、 配列番号： 1、 3もしくは 5 で表されるァミノ酸配列と同一または前記配列と実質的に同一のァミノ酸配列 を含有するタンパク質を挙げることができる。 本発明においては、 配列番号： 1、 3で示されるアミノ酸配列を有するヒト由来の 0 t X 2タンパク質または 配列番号： 5で示されるアミノ酸配列を有するラット由来の〇 t X 2タンパク 質に限定されず、 他の動物、 特に温血動物 （例えば、 モルモット、 マウス、 二 ヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サル等） 由来のアミノ酸配列またはそ の配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有していてもよい。
「配列番号： 1、 3または 5で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のァ ミノ酸配列」 としては、 例えば、 配列番号： 1、 3または 5で表わされるアミ ノ酸配列と約 50%以上、 好ましくは約 60%以上、 より好ましくは約 70% 以上、 さらに好ましくは約 80%以上、 なかでも好ましくは約 90%以上、 最 も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。 本発明の配列番号： 1、 3または 5で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 1、 3ま たは 5で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 網 膜視細胞への分化誘導作用を有するタンパク質などが好ましい。 なかでも、 転 写活性や網膜視細胞への分化誘導作用が配列番号： 1、 3または 5で表わされ るアミノ酸配列を有するタンパク質と同等 （例、 約 0. 01〜100倍、 好ま しくは約 0. 5〜20倍、 より好ましくは約 0. 5〜 2倍） であることが好ま しいが、 これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なって いてもよい。 網膜視細胞への分化誘導作用の測定は、 公知の方法に準じて行う ことができるが、 例えば、 後に記載するスクリーニング方法に従って測定する ことができる。 転写活性の測定は公知の方法、 例えばレポーターアツセィや、 RT— PC Rなどの方法を用いて行うことができる。
具体的に、本発明で用いる O t X 2タンパク質としては、 （a)配列番号： 1、 3または 5で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1 〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜 5個）） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （b) 配列番号： 1、 3または 5 で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上（好ましくは、 1〜 30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個)） のァミノ 酸が付加したアミノ酸配列、 （c) 配列番号： 1、 3または 5で表わされるアミ ノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましく は 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個）） のアミノ酸が他のアミ ノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または （d) それらを組み合わせたアミノ酸 配列を含有するタンパク質などが用いられる。 前記 （b) において付加される アミノ酸、 前記 （c) において置換されるアミノ酸は、 遺伝子によりコードさ れる 20種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。 前記 （a) 〜 (d) に記載のタンパク質は、 網膜視細胞への分化誘導作用を有することがよ り好ましい。
本発明の O t X 2タンパク質においては、 C末端が力ルポキシル基 （― C〇 OH)、 カルポキシレート (一 C〇〇—）、 アミド （一 C〇NH2) またはエステ ル（一 COOR) の何れであってもよい。 ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピルもしくは n_ブチルな どの 6アルキル基、 例えば、 シクロペンチル、 シクロへキシルなどの C3_8 シクロアルキル基、例えば、フエニル、 一ナフチルなどの C 6 ^ 2ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエニル— — 2アルキル基もしくは 0!— ナフチルメチルなどのひ一ナフチルー アルキル基などの C 7一 1 4ァラルキ ル基のほか、 経口用エステルとして汎用されるピバロィルォキシメチル基など が用いられる。 本発明における〇 t X 2タンパク質が C末端以外にカルポキシ ル基 （またはカルボキシレート） を有している場合、 力ルポキシル基がアミド 化またはエステル化されているものも本発明における〇 t X 2タンパク質に含 まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエステルなど が用いられる。 さらに、 本発明における O t X 2タンパク質には、 上記した夕 ンパク質において、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホ ルミル基、 ァセチルなどの C 2_ 6アルカノィル基などの 6ァシル基など） で 保護されているもの、 N末端側が生体内で切断され生成したダルタミル基がピ 口グルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 一 OH、 一 S H、 アミノ基、 イミダゾール基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基（例えば、 ホルミル基、 ァセチルなどの C 2_ 6アルカノィル基な どの C卜 6ァシル基など）で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわ ゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いる〇 t X 2タンパク質の部分ペプチド （以下、 部分ペプチドと 略記する場合がある） としては、 上記した O t x 2タンパク質の部分ペプチド であれば何れのものであってもよい。 本発明における部分ペプチドのアミノ酸 の数は、 上記した〇 t x 2タンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも約 2 0個以上、 好ましくは約 5 0個以上、 より好ましくは約 1 0 0個以上のアミ ノ酸配列を含有するべプチドなどが好ましい。
本発明の部分ペプチドにおいては、 C末端が力ルポキシル基 （― C〇〇H)、 カルポキシレート （一 C〇〇_)、 アミド （一 C〇NH 2) またはエステル （一 C O O R) の何れであってもよい。 さらに、 本発明の部分ペプチドには、 上記し た本発明の O t x 2タンパク質と同様に、 N末端のメチォニン残基のアミノ基 が保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成した G 1 nが ピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保 護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなど の複合ペプチドなども含まれる。
本発明の〇 t X 2タンパク質またはその部分ペプチドの塩としては、 酸また は塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、 とりわけ生理学的に許容され る酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸（例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ 酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが 挙げられる。
本発明における O t X 2タンパク質またはその塩は、 動物、 好ましくは温血 動物、 より好ましくはヒトまたはラット、 さらに好ましくはヒトの細胞または 組織、 特に好ましくはヒトの脳のニューロン、 眼の網膜色素上皮細胞または網 膜視細胞から公知のタンパク質の精製方法によつて製造することもできるし、 後に記載する本発明の〇 t X 2タンパク質をコードする D NAまたは R NAを 含有する形質転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後に記載するタンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。 動 物の組織または細胞から製造する場合、 動物の組織または細胞をホモジナイズ した後、 酸などで抽出を行い、 該抽出液を逆相クロマトグラフィ一、 イオン交 換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精 製単離することができる。
本発明における〇 t X 2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれら の塩またはそれらのアミド体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を 用いることができる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一 脂、 P AM樹脂、 4ーヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹 脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4一 （2， ， 4 ' ージメトキシフエエル—ヒド 口キシメチル） フエノキシ樹脂、 4— ( 2 ' ， 4 ' —ジメトキシフエ二ルー F m o cアミノエチル） フエノキシ樹脂などを挙げることができる。 このような 樹脂を用い、 —ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的と するタンパク質の配列通りに、 公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させ る。 反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフイド結合形成反応を実施し、 目的のタン パク質またはそのアミド体を取得する。 上記した保護アミノ酸の縮合に関して は、 タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、 活 性化試薬としては、特にカルポジイミド類がよい。カルポジイミド類としては、 D C C、 N, N， —ジイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチル— N， 一 ( 3 ージメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。 これらによる 活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H〇B t、 H O O B t ) とともに保 護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、 または、 保護アミノ酸を対称酸無水物ま たは HO B tエステルあるいは H O O B tエステルに変換することにより予め 保護アミノ酸の活性化を行つた後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク 質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例え ば、 N， N—ジメチルホルムアミド， N, N—ジメチルァセトアミド， N—メ チルピロリドンなどの酸アミド類；塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲ ン化炭化水素類； トリフルォロエタノールなどのアルコール類；ジメチルスル ホキシドなどのスルホキシド類； ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフラン などのェ一テル類；ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類；酢 酸メチル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが 用いられる。 反応温度は夕ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られ ている範囲から適宜選択され、 通常約一 2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択さ れる。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 二 ンヒドリン反応を用いたテス卜の結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離 を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチ ルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をァセチル化することができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t—ペンチルォキ シカルポニル、 イソポルニルォキシカルポニル、 4ーメトキシベンジルォキシ 力ルポニル、 C 1一 Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフル ォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—ニトロフエニルスルフエニル、 ジ フエニルホスフイノチオイル、 Fm o cなどが用いられる。力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 (例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 プチル、 tーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロへプチル、 シクロォク チル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状アルキルエステル 化）、 ァラルキルエステル化 (例えば、 ベンジルエステル、 4—ニトロべンジル エステル、 4—メトキシベンジルエステル、 4 _クロ口べンジルエステル、 ベ ンズヒドリルエステル化）、 フエナシルエステル化、 ベンジルォキシカルポニル ヒドラジド化、 t—ブトキシカルボニルヒドラジド化、 トリチルヒドラジド化 などによって保護することができる。 セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化 またはエーテル化によつて保護することができる。 このエステル化に適する基 としては、 例えば、 ァセチル基などの低級アルカノィル基、 ベンゾィル基など のァロイル基、 ベンジルォキシカルポニル基、 エトキシカルポニル基などの炭 酸から誘導される基などが用いられる。また、ェ一テル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロピラニル基、 t一ブチル基などである。 チ 口シンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz 1、 C 12-B z
1、 2—二トロベンジル、 B r— Z、 t—ブチルなどが用いられる。 ヒスチジ ンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 To s、 4ーメトキシー 2， 3，
6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、ベンジルォキシメチル、 Bum、 Bo c、 Tr t；、 Fmo cなどが用いられる。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無 水物、 アジド、 活性エステル〔アルコール (例えば、 ペンタクロロフエノール、
2, 4, 5—トリクロ口フエノール、 2， 4ージニトロフエノール、 シァノメ チルアルコール、 パラニトロフエノール、 HONB、 N—ヒドロキシスクシミ ド、 N—ヒドロキシフタルイミド、 HOB t) とのエステル〕 などが用いられ る。 原料のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸ァ ミドが用いられる。 保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 (a) Pd- 黒あるいは Pd—炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元、 （b) 無水フッ化水素、 メタンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフ ルォロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理、 （C) ジイソプロピルェ チルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 または （d) 液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。 上記 酸処理による脱離反応は、 一般に約一 20°C〜40°Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソ一ル、 フエノール、 チオアニソール、 メタ クレゾ一ル、 パラクレゾール、 ジメチルスルフイド、 1, 4—ブタンジチォ一 ル、 1, 2—エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効であ る。 また、 ヒスチジンのイミダゾ一ル保護基として用いられる 2, 4—ジニト 口フエニル基はチオフエノール処理により除去され、 トリブトファンのインド ール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1 , 2—エタンジチオール、 1, 4一ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸 化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去され る。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保 護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段 から適宜選択しうる。 タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、 例えば 、 まず、 カルポキシ末端アミノ酸の —力ルポキシル基をアミド化して保護し た後、 アミノ基側にペプチド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の N末端の α—ァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質と C末 端の力ルポキシル基の保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、 この両夕 ンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細について は上記と同様である。 縮合により得られた保護タンパク質を精製した後、 上記 方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗タンパク質を得ることができる 。 この粗タンパク質は 知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結 乾燥することで所望のタンパク質のアミド体を得ることができる。 タンパク質 のエステル体を得るには、 例えば、 カルポキシ末端アミノ酸の 0!—力ルポキシ ル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 タンパク質の アミド体と同様にして、 所望のタンパク質のエステル体を得ることができる。 上記方法で得られるタンパク質が遊離体である場合は、 公知の方法によって適 当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法によ つて遊離体に変換することができる。
本発明における O t X 2タンパク質の部分ペプチドまたはその塩は、 公知の ペプチドの合成法に従って、 あるいは本発明における〇 t X 2タンパク質を適 当なぺプチダーゼで切断することによって製造することができる。 ぺプチドの 合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれでも良い。 すなわ ち、 本発明の〇 t X 2タンパク質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸 と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離するこ とにより目的のペプチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の 脱離としては、 例えば、 以下の （a) 〜ズ e) に記載された方法が挙げられる。
(a) M. Bodanszky および M.A. Ondetti、 ペプチド シンセシス （Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)、 (b) Schroeder および Luebke、 ザペプチド（The Peptide), Academic Press, New York (1965 年)、 （c)泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）、 （d) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (1977年)、 (e) 矢島治明監修、 続医薬品の開発第 14巻ペプチド合成広川書 店。
また、 反応後は通常の精製方法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマト グラフィ一 ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明の部 分ペプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分ペプチドが 遊離体である場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法によって遊離体に変換することができる。 本発明で用いる O t X 2タンパク質をコードする DNAとしては、 ゲノム D NA、 ゲノム DN Aライブラリ一、 上記した細胞 ·組織由来の cDNA、 上記 した細胞 ·組織由来の cDNAライブラリ一、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリーに使用するベクターは、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コス ミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 上記した細胞 ·組織よ り total RN Aまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT— P C R法と略称する） によって増幅することもできる。 具体的には、 〇 t X 2タンパク質をコードす る DNAとしては、 例えば、 （a) 配列番号： 2、 4または 6で表わされる塩基 配列を含有する DNA、 または （b) 配列番号： 2、 4または 6で表わされる 塩基配列とハイストリンジェントな条件下で八イブリダイズする塩基配列を有 し、 本発明の〇 t X 2タンパク質と実質的に同質の活性 （例、 転写活性や網膜 視細胞分化誘導作用など） を有する O t X 2タンパク質をコードする DNAな どが挙げられる。 なお、 配列番号： 2および 4は、 ヒトの O t x 2タンパク質 をコードする DNA (Kastury, K. , et. al. , Chromosome locations of human EMX and OTX genes" , Genomics 22 (1), 41-45 (1994)) であり、 配列番号： 6は、 マウスの〇 t x 2タンパク質をコードする DNA (Simeone,A., et. al., Nested expression domains of four homeobox genes in developing rostral brain" ， Nature 358 (6388), 687-690 (1992))である。 配列番号： 2、 4また は 6で表わされる塩基配列とハイブリダィズできる D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 2、 4または 6で表わされる塩基配列と約 70%以上、 好ましくは 約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の 相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。 ハイプリダイゼ ーシヨンは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー - クローニンク (Molecular Cloning) 2nd (J. Sarabrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行うことができる。 また、 市販 のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行う ことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェン卜な条件に従って行うこ とができる。 該ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が 約 19〜 40 mM、 好ましくは約 19〜 20 mMで、 温度が約 50〜 70 °C、 好ましくは約 60〜65°Cの条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 19 mM で温度が約 65 °Cの場合が最も好ましい。
本発明で用いる部分ペプチドをコードする DNAとしては、 上記した本発明 の部分べプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるもので あってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ一、 上記した細 胞'組織由来の cDNA、 上記した細胞'組織由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリーに使用するベクターは、 パクテリ オファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい 。 また、 上記した細胞 ·組織より mRNA画分を調製したものを用いて直接 Re verse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT— PCR法と略 称する） によって増幅することもできる。 具体的には、 本発明の部分ペプチド をコ一ドする DNAとしては、 例えば、 ，（a) 配列番号： 2、 4または 6で表わ される塩基配列を含有する DNAの部分塩基配列を含有する DNA、 または （ b) 配列番号： 2、 4または 6で表わされる塩基配列を含有する DNAとハイ ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含有し、 本発明の 〇 t x2タンパク質と実質的に同質の活性 （例、 転写活性や網膜視細胞分化誘 導作用など） を有するタンパク質をコードする DNA、 以上 （a) または （b ) の部分塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。
本発明で用いる〇 t X 2タンパク質または部分ペプチドをコードする RNA も、 逆転写酵素により〇 t X 2夕ンパク質または部分べプチドを発現すること ができるものであれば特に限定されず、 公知の手段により得ることができる。 本発明における〇 t X 2タンパク質またはその部分ペプチド （以下、 本発明 のタンパク質と略記する場合がある） を完全にコードする DN Aのクロ一ニン グの手段としては、 本発明のタンパク質の部分塩基配列を含有する合成 DN A プライマ一を用いて PCR法によって増幅するか、 または適当なベクターに組 み込んだ DN Aの中から、 標識された本発明のタンパク質の一部あるいは全領 域をコードする DNA断片もしくは合成 D N Aを用いて、 ハイブリダィゼーシ ョンさせることによって選別することができる。 ハイブリダィゼーシヨンの方 法は、 例えば、 モレキュラー ·クローニング （Molecular Cloning) 2nd (J. Saibrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法など に従って行うことができる。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付 の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
DNAの塩基配列の置換は、 P CRや公知のキット、 例えば、 Mutan™— superExpress Km (宝酒造）、 Mutan™— K (宝酒造） 等を用いて、 0DA— LAPCR法、 gapped duplex法、 Kunkel 法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従 つて行うことができる。 クローン化された本発明のタンパク質をコードする D NAは目的によりそのまま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ 一を付加したりして使用することができる。 該 DNAはその 5' 末端側に翻訳 開始コドンとしての ATGを有し、 また 3 ' 末端側には翻訳終止コドンとして の TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよい。 これらの翻訳開始コドン や翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNAアダプターを用いて付加することもで さる。
本発明のタンパク質をコードする DNAまたは RNA (以下、 本発明の DN A等と略記する場合がある） は、 '次のような方針に基づき修飾されていてもよ い。 すなわち、 細胞内での本発明の DNA等をより安定なものにする、 本発明 の D N A等の細胞透過性をより高める、 そしてもし毒性があるなら本発明の D N A等の毒性をより小さなものにする。 このような修飾は当該分野で数多く知 られており、 例えば J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol.8, pp.247, 1992; Vol.8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed. , Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993などに開示がある。 本発明の DNA等は、 リポ ゾームまたはミクロスフエアなどに内包された特殊な形態で用いてもよい。 ま た、 本発明の DNA等は、 塩基以外の他の物質が付加されたものであってもよ い。 前記他の物質としては、 糖；酸または塩基； リン酸基骨格の電荷を中和す るように働くポリリジンのようなポリカチオン体；または、 細胞膜との相互作 用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめたりするような脂質 （例えば、 ホス ホリピド、 コレステロールなど） といった疎水性のものが挙げられる。 付加す るに好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステ リルクロ口ホルメート、 コール酸など） が挙げられる。 前記他の物質は、 核酸 の 3' 端あるいは 5' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオ シド結合を介して付着させることができうる。 本発明の DNA等は、 その末端 が化学修飾されたものであってもよい。 末端の修飾基としては、 核酸の 3' 端 あるいは 5 '端に特異的に配置されたキャップ用の基で、ェキソヌクレアーゼ、 RNa s eなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレン グリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護 基が挙げられるが、 それに限定されるものではない。
本発明で用いる〇 t X 2タンパク質またはその部分ペプチドをコードする D NAまたは RNAを含有する組換えベクターとしては、 O t X 2タンパク質ま たはその部分ペプチドを発現することができる発現べクタ一が好ましい。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、 例えば、 （i) 本発明のタンパク質を コードする DNAを含む DNA断片を例えば cDNAから切り出し、 （ii) 該 D N A断片を適当な発現べクタ一中のプロモーターの下流に連結することにより 製造することができる。
前記発現べクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pCR4、 pC R2. 1、 pBR 322、 pBR 325、 pUC 12、 pUC 13)、 枯草菌由 来のプラスミド （例、 pUB 110、 pTP 5、 pC 194)、 酵母由来プラス ミド （例、 pSH19、 pSH15)、 λ ファージなどのパクテリオファージ、 レトロウイルス、 アデノウイルス、 レンチウィルス、 ワクシニアウィルス、 バ キュロウィルスなどのウィルスなどの他、 pAl— 11、 pXTl、 pRcZ CMV、 pRcZRSV、 p c DNA I/Ne oなどが用いられる。 中でも、 本発明で用いるベクタ一としては、 ウィルスが好ましく、 レトロウイルス、 ァ デノウィルスまたはレンチウィルスがより好ましい。
前記プロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプ 口モータ—であればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿主として用 いる場合は、 SR«プロモー夕一、 SV40プロモ一ター、 LTRプロモ一夕 ―、 CMVプロモ一ター、 HSV— TKプロモーターなどが挙げられる。 これ らのうち、 LTRプロモーター、 CMVプロモーター、 SRo!プロモーターな どを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロ モーター、 l acプロモーター、 r e cAプロモーター、 APLプロモータ一、 1 p pプロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 S P01プロ モーター、 SP02プロモータ一、 p e n Pプロモ一夕一など、 宿主が酵母で ある場合は、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモ一夕一、 GAPプロモータ 一、 ADHプロモ一夕一などが好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリ ヘドリンプロモーター、 P 10プロモ一夕一などが好ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシング シグナル、 ポリ A付加シグナル、 キャップ構造、 蛋白質合成開始シグナル、 選 択マ一カー、 標識マーカー、 S V40複製オリジンなどを含有しているものを 用いることができる。
選択マ一カーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f rと 略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕、 アンピシリ ン耐性遺伝子 （以下、 Amp1"と略称する場合がある）、 ネオマイシン耐性遺伝 子 （以下、 Ne ο 1·と略称する場合がある、 G418耐性） 等が挙げられる。 特 に、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 CHOを用いて dh f r 遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子を、 チミジンを含まな い培地によっても選択できる。
標識マーカ一としては、 アルカリホスファタ一ゼ （以下、 APと略称する場 合がある。） 遺伝子、 縁色蛍光蛋白質 （GFP) 遺伝子などを好ましく用いるこ とができる。
また、 所望により、 宿主に合ったシグナル配列を発現ベクターに付加しても よい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 ΡίιοΑ ·シグナル配列、 〇m pA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 ひ一アミラー ゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母である場 合は、 MF a ·シグナル配列、 SUC2 ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞 である場合には、 インシュリン 'シグナル配列、 ひ—イン夕一フエロン ·シグ ナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
また、 ベクターとしてウィルスを用いる場合には、 翻訳機構を高めるため、 蛋白質合成開始シグナルとして I RES (内部リボゾーム結合サイト） 配列を 配することが好ましい。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする DN Aを含有す る発現ベクターを宿主に導入することにより、 形質転換体を製造することがで きる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。 ェシエリヒア属菌の具体例としては、 ェシ エリヒア 'コリ （Escherichia col i) K 12 · DH 1 〔プロシ一ジングズ 'ォ ブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一ェ スエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60巻， 160 (1968)〕， JM 1 03 〔ヌクイレック 'ァシッズ' リサーチ， （Nucleic Acids Research), 9 巻， 309 (1 98 1)〕， JA221 〔ジャーナル'ォブ 'モレキュラー .バイ ォロジ一 （Journal of Molecular Biology), 120巻， 51 7 (1 978)〕， HB 10 1 〔ジャーナル ·ォブ 'モレキュラー ·バイオロジー， 41巻， 45 9 (1969)〕， C 600 〔ジェネティックス （Genetics), 39巻， 440 (1 954)], DH 5 Clnoue, H. , No j ima, H. and Okayama, H. , Gene, 96, 23-28 (1990) ] , DH 10 B 〔プロシージングズ .ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー .ォブ · サイェンシィズ ·ォブ ·ザ■ユーエスェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 87巻， 4645— 4649 (1990)〕 などが用いられる。 バチルス属菌ど しては、 例えば、 バチルス ·サブチルス （Bacillus subtilis) MI 1 14 〔ジ —ン （Gene), 24巻， 255 (1 983)〕， 207 - 2 1 〔ジャーナル'ォブ' バイオケミストリー （Journal of Biochemistry), 95卷， 87 (1 984)〕 などが用いられる。 酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス ·セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) AH 22, AH22 R~, NA87-11 A, D K D - 5 D , 2 O B — 1 2 、 シゾサッカ ロマイセス ' ボンべ (Schizosaccharomyces pombe) NCYC 1913, NCYC2036、 ピキア · パストリス (Pichia pastoris) などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが AcNPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞）、 Tric oplusia ni の 中腸由来の MG 1細胞、 Trichoplusia ni の卵由来の High Five™ 細胞、 Mamestrabrassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いら れる。 ウィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N； Bm N細胞） などが用いられる。 該 S ί細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711), S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J.L.ら、 イン ·ヴイボ (In Vivo) , 13, 213-217, (1977)) などが用いられる。 昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫な どが用いられる〔前田ら、ネィチヤ一（Nature), 315巻， 592 (1985)〕。 動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7、 Ve r o、 チャイニーズハ ムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記)、 dh f r遺伝子欠損チヤィニ ーズ八ムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r") 細胞と略記）、 マウス L細胞、 マウス A t T_20、 マウスミエローマ細胞、 ラット GH3、 ヒト F L細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシ一ジングズ ·ォブ · ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ ― (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69卷， 21 10 (1972)やジーン (Gene), 17巻， 107 ( 1982)などに記載の方法に従って行うことができ る。 バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー ·アンド .ジェ ネラル'ジェネティックス （Molecular & General Genetics), 168卷， 1 1 1 (1979)などに記載の方法に従って行うことができる。 酵母を形質転換 するには、例えば、メソッズ 'イン'ェンザィモ口ジー（Me t hods i n Enzymo 1 ogy) , 194巻， 182— 187 (1991)、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショ ナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ 'ォブ ·ザ ·ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75巻， 1929 (1978) などに記載の方法に従って行 うことができる。 昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ Z テクノロジー （Bio/Techno logy), 6巻， 47— 55 (1988) などに記載の 方法に従って行うことができる。 動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞 工学別冊 8新細胞工学実験プロトコール. 263— 267 (1995) (秀潤社 発行）、 ヴイロロジ一 （Virology), 52巻， 456 (1973) に記載の方法 に従って行うことができる。 このようにして、 本発明のタンパク質をコードす る DNAを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。 宿 主がェシエリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培 養に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体 の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源と しては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素 源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ ·リカー、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または 有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナ卜リウ ム、 塩化マグネシウムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生 長促進因子などを添加してもよい。 培地の pHは約 5〜8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザ ミノ酸を含む M 9培地 〔ミラ一 （Miller), ジャーナル ·ォブ ·ェクスペリメン ッ ·イン ·モレ千ユラ一 ·シエネティックス (Journal of Experiments in Molecular Genetics), 431— 433， Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモータ一を効率よく働か せるために、 例えば、 3 ]3—インドリルアクリル酸のような薬剤を加えること ができる。 宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 15〜43°Cで約 3 〜24時間行い、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。 宿主がバチ ルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜40°Cで約 6〜24時間行い、 必要によ り通気や撹拌を加えることもできる。 宿主が酵母である形質転換体を培養する 際、培地としては、例えば、バークホールダ一 (Burkholder)最小培地 [Bostian, K. L. ら、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル 'アカデミー .ォブ ·サ イエンシィズ 'ォブ 'ザ'ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 77 巻， 4505 (1980)〕や 0.5 %カザミノ酸を含有する S D培地〔Bitter, G. A. ら、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー'ォブ ·サイエ ンシィズ 'ォブ ·ザ ·ユーエスェ一 （Pro Natl. Acad. Sci. USA), 81巻， 5330 (1984)] が挙げられる。 培地の p Hは約 5〜 8に調整するのが好 ましい。 培養は通常約 20°C〜35°Cで約 24〜72時間行い、 必要に応じて 通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace's Insect Medium (Grace, T. ，ネィチヤ一 （Nature), 195巻， 7 88 (1962)) に非動化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものな どが用いられる。 培地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培 養は通常約 27°Cで約 3〜 5日間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 宿 主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜 20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science), 122巻， 5 01 (1952)〕， DMEM培地 〔ヴイロロジ一 （Virology), 8巻， 396 (1 959)〕， RPMI 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ ·ザ ·アメリカン ·メデ ィカル ·ァソシェ——ション (The Journal of the American Medical Association) 199巻， 519 (1967)〕， 199培地 〔プロシ一ジング 'ォブ ·ザ ·ソサ イエティ ·フォー'ザ 'バイオロジカル 'メディスン（Proceedingof the Society for the Biological Medicine), 73巻， 1 (1950)〕 などが用いられる。 pHは約 6〜 8であるのが好ましい。 培養は通常約 30°C〜4 Otで約 15〜 6 0時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 以上のようにして、 形質転 換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめること ができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方 法により行うことができる。 本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から 抽出するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを 適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによ つて菌体あるいは細胞を破壊したのち、 遠心分離やろ過によりタンパク質の粗 抽出液を得る方法などが適宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジン などのタンパク質変性剤や、 トリトン X— 1 0 0™などの界面活性剤が含まれて いてもよい。 培養液中にタンパク質が分泌される場合には、 培養終了後、 公知 の方法で菌体あるいは細胞と培養上清とを分離し、 培養上清を集める。 このよ うにして得られた抽出液または培養上清中に含まれるタンパク質の精製は、 公 知の分離 ·精製方法を適切に組み合わせて行うことができる。 これらの公知の 分離、 精製方法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透 析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミドゲル電気 泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフ ィ一などの荷電の差を利用する方法；ァフィ二ティークロマトグラフィーなど の特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水 性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法な どが用いられる。
このようにして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、 公知の方 法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得ら れた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の 塩に変換することができる。 なお、 形質転換体が産生するタンパク質を、 精製 前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、 任意に 修飾を加えたり、 ポリペプチドを部分的に除去したりすることもできる。 タン パク質修飾酵素としては、 例えば、 卜リブシン、 キモトリブシン、 アルギニル エンドべプチダーゼ、プロティンキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
O t X 2タンパク質を発現させるか、 または O t X 2タンパク質の発現量を 上昇させることにより、 網膜視細胞への分化誘導を惹起することができる。 具 体的には、 例えば、 眼球組織由来細胞、 胚性幹細胞、 神経幹細胞または神経前 駆細胞において、 O t X 2タンパク質を発現させるか、 または O t X 2タンパ ク質の発現量を上昇させることにより、 前記細胞を網膜視細胞へ分化誘導する ことができる。 そのゆえに、 （a ) 〇 t X 2タンパク質もしくはその部分べプチ ドまたはそれらの塩、 または （b ) O t X 2タンパク質もしくはその部分ぺプ チドをコードする D NAもしくは R NAは網膜視細胞への分化誘導剤として使 用することができる。
前記 「網膜視細胞への分化誘導」 は、 生体内で起こってもよいし、 生体外で 起こってもよい。 すなわち、 本発明にかかる網膜視細胞への分化誘導剤を生体 に投与し、 生体内において網膜視細胞への分化誘導を惹起させてもよい。 また 、 生体外において例えば、 眼球組織由来細胞、 胚性幹細胞、 神経幹細胞または 神経前駆細胞に対し本発明にかかる網膜視細胞への分化誘導剤を適用し、 前記 細胞を網膜視細胞へ分化誘導させてもよい。 より具体的には、 眼球組織由来細 胞、 胚性幹細胞、 神経幹細胞または神経前駆細胞に、 本発明の D N A等を導入 し、 得られた細胞を培養することにより前記細胞を網膜視細胞へ分化誘導する ことができる。 本発明の D NA等を導入する際に、 他の遺伝子もあわせて導入 してもよい。 他の遺伝子としては、 例えば網膜特異的ホメォボックス遺伝子な どが挙げられる。 網膜特異的ホメォボックス遺伝子としては、 発生過程におい て、 眼の領域における特異的な発現様式を有し、 かつ領域特異的な形態形成を 制御する遺伝子、 分化形質の発現に関与する遺伝子が挙げられる。 具体的には 、 C r x、 C h x l 0、 P a x 6、 R a xなどが挙げられる。 前記 「眼球組織」 としては、 眼胚内層組織などが好適な例として挙げられる 。 また、 かかる組織は、 成体由来であっても、 胎生期の個体由来であってもよ い。 「眼球組織由来細胞」 としては、 例えば、 胎児神経網膜、 毛様体色素上皮細 胞などの毛様体細胞または網膜色素上皮細胞、 毛様体上皮細胞、 虹彩細胞など が挙げられる。
前記眼球組織由来細胞は、 例えば、 適切な手段で摘出した組織を、 D i s p a s eまたは EDTAなどで処理し、 ついで、 トリプシン処理して単一の細胞 まで分離し、 さらに、 適切な培地でコンフルェントになるまで培養し、 得られ た細胞をトリプシン処理およびコラゲナーゼ処理することにより採取されうる 。 ここで、 細胞の採取に際して、 培養を行う場合、 塩基性線維芽細胞増殖因子 を含有した培地、 表皮細胞成長因子を含有した培地、 L I F (白血球遊走阻止 因子） を含有した培地などの培地を用いることができる。 前記塩基性線維芽細 胞増殖因子 （bFGF) を含有した培地としては、 例えば bFGFを含有した 無血清培地が挙げられ、 より具体的には、 N2サプリメントを含有した DMEM ZF 12などが挙げられる。 かかる培地における前記 bFGFの含有量は、 約 l OngZml以上、 好ましくは、 約 20ngZml以上、 より好ましくは、 約 40 n gZm 1以上であることが望ましい。 また、 N2サプリメントとしては 、 インスリン 5 gZml程度、 トランスフェリン 100 g/ml程度、 プ ロジェストロン 20nM程度、 ブトレツシン I O O M程度、 セレン酸ナト リウム 3 OnM程度が挙げられる。 なお、 培養における温度、 酸素濃度、 二酸 化炭素濃度などの条件は、 細胞に応じて適宜設定することができる。
神経幹細胞または神経前駆細胞は、 眼球組織由来細胞由来であってもよいし 、 胚性幹細胞由来であってもよいし、 他の細胞や組織由来であってもよい。 具 体的には、 胎児網膜由来神経幹細胞、 成体毛様体由来網膜幹細胞、 虹彩由来網 膜幹細胞、 脳由来神経幹細胞、 網膜前駆細胞、 虹彩由来神経前駆細胞などが挙 げられる。 眼球組織由来細胞もしくは胚性幹細胞または他の細胞や組織から神経幹細胞 または神経前駆細胞を誘導する方法は、 公知の方法に従えばよい。 例えば、 胚 性幹細胞から、 神経幹細胞または神経前駆細胞に誘導する方法としては、 例え ば、 川崎、 笹井らの文献 [Kawasaki , H.， Sasai Υ·， Neuron. , 2000 Oct ; 28 (1 ) : 31-40] などに記載の手法などが挙げられる。 なお、 胚性幹細胞の培養、 維持 などの条件は、 例えば、 「分子生物学プロトコール」 （南江堂発行） などを参照 できる。 前記神経幹細胞または神経前駆細胞は、 これを含む neural sphere と して得られる場合があるが、 本発明においては、 かかる neural sphere を以下 の操作に供してもよい。
眼球組織由来細胞、 胚性幹細胞、 神経幹細胞または神経前駆細胞、 好ましく は前記神経幹細胞または神経前駆細胞に、 本発明の D N A等および所望により 他の遺伝子を導入する方法としては、 特に限定されず、 公知の方法を用いてよ いが、 例えば、 アデノウイルスベクタ一を用いる遺伝子導入方法、 レトロウイ ルスべクタ一を用いる遺伝子導入方法、 アデノ随伴ウィルスを用いる遺伝子導 入方法、 リポフエクシヨン、 エレグ小口ポレーシヨンなどが挙げられる。 導入 効率の観点から、 好ましくは、 アデノウイルスベクタ一を用いる遺伝子導入方 法およびレトロウイルスベクターを用いる遺伝子導入方法が望ましい。
遺伝子導入された細胞を網膜視細胞への分化に適した分化誘導条件下に培養 する。 分化誘導条件としては、 遺伝子導入された細胞の種類などにより異なる ので一概には言えず、 適宜選択することができる。 例えば、 前記分化誘導条件 としては、 レチノイン酸と血清との存在下における培養などが挙げられる。 こ こで、 培養に用いられうる培地としては、 上述した N 2サプリメントを含有した DMEM/F 1 2培地などが挙げられる。前記レチノイン酸の使用量は、約 0 . 1 M以上であり、 好ましくは、 約 0 . 5 M以上であることが望ましく、 約 1 0 M以下であり、好ましくは、約 5 M以下であることが望ましい。 また、 前記血清の使用量は、 分化誘導時には約 1 %程度であることが望ましい。 さら に、 培養時の温度、 酸素濃度、 二酸化炭素濃度などの条件は、 遺伝子導入され た細胞に応じて適宜設定することができる。
以上のような本発明の分化誘導方法により得られた網膜視細胞は、 例えば網 膜色素変性、 加齢黄斑変性、 網膜剥離、 緑内障または網膜血管閉塞症などの網 膜変性疾患患者に対する移植用細胞として応用することができる。 また、 前記 移植用細胞としては、 網膜視細胞に完全に分化しているもののみならず、 網膜 視細胞に分化する前の前駆細胞であってもよい。
O t X 2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩、 または〇 t X 2タンパク質もしくはその部分ペプチドをコードする D N Aもしくは R N Aは網膜疾患の予防、 治療または進行抑制剤などの医薬として使用することが できる。 前記 「網膜疾患」 としては、 糖尿病、 高血圧症、 動脈硬化症、 貧血症 、 白血病、 全身性エリテマトーデスや強皮症などの結合組織疾患、 およびティ —ザックス （Tay-Sacks) 病やフォークトーシュピールマイヤー （Vogt- Spielme yer) 病などの先天代謝異常などの、 全身疾患に起因する網膜の血管障害や炎症 性および変性病変、 ならびに、 未熟児網膜症、 網膜静脈閉塞症、 網膜動脈閉塞 症、 網膜静脈周囲炎などの網膜血管の障害、 網膜剥離や外傷に由来する網膜の 炎症や変性、 老人性円盤状黄斑変性症などの加齢に伴う網膜の変性疾患、 およ び先天的な網膜変性疾患などの、 網膜局所の疾患などが挙げられる。 特に、 本 発明にかかる網膜疾患の予防、 治療または進行抑制剤は、 先天的な網膜変性疾 患、 網膜色素変性、 黄斑変性、 糖尿病性網膜症、 網膜剥離、 緑内障または網膜 血管閉塞症などに特に有効に使用することができる。
本発明のタンパク質を上記網膜疾患の予防 ·治療 ·進行抑制剤として使用す る場合は、 常套手段に従って製剤化することができる。 一方、 本発明の D N A 等を上記網膜疾患の予防 ·治療 ·進行抑制剤として使用する場合は、 本発明の D NA等を単独あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクタ一、
'—またはアデノウイルスァソシエーテッドウィルスべク 夕一などの適当なベクタ一に挿入した後、 常套手段に従って製剤化することが できる。 本発明の D N A等は、 そのままで、 あるいは摂取促進のための補助剤 とともに、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投 与することもできる。
例えば、 本発明のタンパク質または本発明の D NA等は、 必要に応じて糖衣 を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経 口的に投与することもできるし、 または水もしくはそれ以外の薬学的に許容し 得る液との無菌性溶液または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に投与する こともできる。 本発明の製剤は、 例えば、 本発明のタンパク質または本発明の D NA等を生理学的に認められる公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防 腐剤、 安定剤または結合剤などとともに混和することによつて製造することが できる。
錠剤、 カプセル剤などにおいて混和することができる添加剤としては、 例え ば、 ゼラチン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤； 結晶性セルロースのような賦形剤；コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸な どのような膨化剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；ショ糖、 乳糖 またはサッカリンのような甘味剤；ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリー のような香味剤などが挙げられる。 カプセル剤の場合には、 さらに油脂のよう な液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用水性液 または油性液に有効成分を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従つ て処方することができる。 注射用水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブド ゥ糖やその他の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D _マンニ トール、 塩化ナトリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール (例、 エタノール）、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレンダリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート 8 0™、 H C O - 5 0 ) などを併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大 豆油などが用いられ、 溶解補助剤である安息香酸
ルなどを併用してもよい。 さらに、 前記無菌組成物には、 例えば、 緩衝剤 （例 えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液)、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベン ザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど）、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど）、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノ ールなど）、酸化防止剤などが配合されてもよい。調製された無菌組成物は通常、 適当なアンプルに充填され、 注射剤として供される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動物 (例えば、 ヒト、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。 本発明のタンパク質または本発明 の D NA等の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより異な るので一概には言えないが、 非経口投与の場合、 1日あたり約 0 . 0 1〜1 0 m g Z k g程度であり、 好ましくは約 0 . 0 5〜5 m g / k g程度である。 本発明にかかる網膜疾患の予防 ·治療 ·進行抑制剤は、 眼に局所的に投与す ることが好ましい。 かかる眼局所投与用製剤の剤形としては、 例えば点眼剤、 眼軟膏剤、 散剤、 顆粒剤、 錠剤、 カプセル剤、 注射剤等が挙げられ、 特に点眼 剤 （例えば、 水性点眼剤、 水性懸濁点眼剤、 非水性点眼剤または非水性懸濁点 眼剤など)、 眼軟膏剤および注射剤の形態であることが好適である。 かかる製剤 は、 常套手段に従って調製することができる。
点眼剤の調製に際して用いられる、 水性の溶液剤または懸濁剤用希釈剤とし ては、 蒸留水、 生理食塩水等が挙げられる。 また、 非水性の溶液剤または懸濁 剤用希釈剤としては、 植物油、 流動パラフィン、 鉱物油、 プロピレングリコー ル、 P—才クチルドデカノール等が挙げられる。 更に、 本発明の点眼剤には、 通常点眼剤に配合され得る緩衝剤、 等張化剤、 保存剤、 増粘剤、 安定化剤、 抗 酸化剤、 P H調整剤またはキレート剤等の各種の添加剤を適宜配合することが できる。 点眼剤の調製は無菌操作法により行うか、 あるいは適当な段階で滅菌 処理を施すことにより行われる。
上記緩衝剤は、 p Hを例えば 5 . 0〜8 . 0程度に一定に保持することを目 的として添加され、 例えば、 ホウ酸塩緩衝液、 クェン酸塩緩衝液、 酒石酸塩緩 衝液、 リン酸塩緩衝液、 酢酸塩緩衝液等が用いられる。 これらの緩衝剤の添加 量は、 当該緩衝剤の添加目的、 即ち、 p Hを例えば上記の範囲で一定に保持し 得る範囲で添加される。 上記等張化剤は涙液と等張にすることを目的として添 加され、 例えば、 ブドウ糖、 マンニ1 ル、 ソルビトール等の糖類；グリセリ ン、 ポリエチレングリコ一ル、 プロピレングリコール等の多価アルコール類； 塩化ナトリウム、 クェン酸ナトリウム等の塩類等が挙げられる。 これら等張化 剤の添加量は、 点眼剤の浸透圧が涙液と同じになる量で添加される。 更に上記 保存剤としては、 例えば塩化ベンザルコニゥム、 パラベン類、 クロロブタノ一 ル等が用いられる。 上記増粘剤としては、 例えばグリセリン、 カルポキシメチ ルセルロース、 力ルポキシビ二ルポリマー等が挙げられ、 上記安定化剤として は、 例えば亜硫酸ナトリウム、 プロピレングリコール等が挙げられ、 上記抗酸 化剤としては、 例えばァスコルビン酸、 ァスコルビン酸ナトリウム、 トコフエ ロール、 チォ硫酸ナトリウム等が挙げられ、 上記 p H調整剤としては、 例えば 塩酸、 クェン酸、 リン酸、 酢酸、 酒石酸、 水酸化ナトリウム、 水酸化カリウム、 炭酸ナトリゥム、炭酸水素ナトリゥム等が挙げられ、上記キレート剤としては、 例えばェデト酸ナトリウム、 クェン酸ナトリウム等が挙げられる。 また、 上記 点眼剤は凍結乾燥し、 用時注射用蒸留水などで溶解して用いる形態としてもよ い。
眼軟膏は、 通常用いられる眼軟膏用基剤中に有効成分を混和し、 常法に従つ て製剤化することによつて無菌的に調製することができる。 眼軟膏用の基剤と しては、 ワセリン、 ゼレン 5 0、 プラスチベース、 マクロゴール等が例示され、 更に親水性を高めることを目的として界面活性剤を加えることができる。 また、 眼軟膏についても必要に応じて前記の例えば保存剤等の添加剤を配合すること もできる。
さらに、 眼局所投与用製剤は、 眼内で O t x 2タンパク質もしくはその部分 ぺプチド、 あるいはそれらをコードする D N Aなどの放出を制御できる放出制 御物質と共に徐放性製剤、 DDS (ドラッグデリバリー） 製剤、 眼内埋め込み 型製剤とすることもできる。該放出制御物質としては、 自体公知の例えば α—ヒ ドロキシカルボン酸類 （例、 グリコール酸， 乳酸， ヒドロキシ酪酸等)， ヒドロ キシジカルボン酸類 （例、 リンゴ酸等)， ヒドロキシトリカルボン酸 （例、 クェ ン酸等） 等の 1種以上から無触媒脱水重縮合で合成された重合体、 共重合体あ るいはこれらの混合物、 ポリ一 一シァノアクリル酸エステル、 ポリアミノ酸 (例、 ポリ—ァーベンジルー L—グルタミン酸等）、 無水マレイン酸系共重合体 (例、 スチレン一マレイン酸共重合体等） 等の生体内分解性高分子物質が挙げ られる。
本発明の眼局所投与用製剤の投与量および投与回数は、 投与対象、 症状、 投 与形態、 処置期間等により異なるので一概には言えないが、 通常、 点眼剤の場 合、 本発明のタンパク質等または本発明の DNA等を 0. 001〜10. 0w /v%、 好ましくは 0. 01〜1. 0wZv%含有する製剤を、 成人に対し 1 日一眼あたり数回、 好ましくは 1〜6回、 1回数滴、 好ましくは 1〜4滴投与 することができる。 また、 眼軟膏剤の場合、 本発明のタンパク質等または本発 明の DNA等を 0. 001〜10. 0wZw%、 好ましくは 0. 01〜1. 0 w/w%含有する製剤を、 成人に対し 1日あたり数回、 好ましくは 1〜6回塗 布することができる。
本発明においては、 被検液中の〇 t X 2タンパク質もしくはその部分べプチ ドまたはそれらの塩 （以下、 本発明のタンパク質等と略記する場合がある） を 検出するか、 またはその量を測定することにより、 網膜疾患の診断を行うこと ができる。 例えば、 本発明のタンパク質等の濃度減少が検出された場合は、 例 えば、 網膜疾患を罹患している可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高い と診断することができる。 O t X 2タンパク質もしくはその部分ペプチドまた はそれらの塩に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略称する場合がある） は、 本発明のタンパク質等を特異的に認識することができるので、 被検液中の本発 明のタンパク質等の検出および定量などに使用することができる。 つまり、 本 発明の抗体は、 網膜疾患の診断剤として用いることができる。 前記診断剤にお いては、 抗体分子そのものを用いてもよく、 抗体分子の F ( a b ' ) 2、 F a b，、 あるいは F a b画分を用いてもよい。 また、 被検液中の本発明のタンパク質等 は、 組織染色等によっても検出することができる。
本発明の抗体は、 本発明のタンパク質等を認識し得る抗体であれば、 ポリク 口一ナル抗体、 モノクロ一ナル抗体の何れであってもよい。 本発明の抗体は、 本発明のタンパク質等を抗原として用い、 公知の抗体または抗血清の製造方法 に従って製造することができる。
本発明のタンパク質等に対するモノクローナル抗体の作製方法の一例を以下 に述べる。
( i ) まず、 モノクロナール抗体産生細胞の作製について述べる。 本発明の タンパク質等は、 哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自 体あるいは担体、 希釈斉 ljとともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高め るため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与 してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行なわれる 。 用いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジまたはャギが挙げられるが、 マウスまたはラットが好 ましく用いられる。 モノクローナル坊体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免 疫された温血動物、 例えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終 免疫の 2〜 5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生 細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマを調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の 標識化タンパク質等と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活 性を測定することにより行うことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミルスタインの方法 （ネイチヤー （Nature；)、 256巻、 495頁 （ 1975年)） に従い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポ リエチレングリコール （PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好 ましくは PEGが用いられる。 骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3 Ul、 S P 2Z0などが挙げられるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用い られる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1 〜 20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは、 PEG1000〜PEG600 0) が 10〜80 %程度の濃度で添加され、 約 20〜40° (：、 好ましくは約 3 0〜37 で約 1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合 を作製できる。
モノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリ一ニングには種々の方法が 使用できるが、 例えば、 （a) 本発明のタンパク質等の抗原を直接あるいは担体 とともに吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清 を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体 （細胞 融合に用いられる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いら れる） またはプロテイン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出 する方法、 （b) 抗免疫グロブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相に ハイプリドーマ培養上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識した本発明の タンパク質等を加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法など が挙げられる。 モノクローナル抗体の選別は、 公知あるいはそれに準じる方法 に従って行うことができるが、 通常は HAT (ヒポキサンチン、 アミノブテリ ン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地などで行うことができる。 選別およ び育種用培地としては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培 地を用いても良い。 例えば、 約 1〜20%、 好ましくは約 10〜20%の牛胎 児血清を含む R P M I 1 6 4 0培地、 約 1〜 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T 培地 （和光純薬工業株式会社製） または八イブリドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬株式会社製）などを用いることができる。培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C程度、 好ましくは約 3 7でである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間程度、 好ましくは 1週間〜 2週間程度である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガ ス下で行うことができる。 ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清 中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
(i i) ついで、 モノクロナ一ル抗体を分離精製する。 モノクローナル抗体の 分離精製は、 通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの 分離精製方法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原 結合固相またはプロテイン Aもしくはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗 体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行うこ とができる。
本発明のタンパク質等に対するポリクローナル抗体 （以下、 「本発明のポリク ローナル钪体」 略称する場合がある。） との作製方法の一例を以下に述べる。 本発明のポリクローナル抗体は、 公知あるいはそれに準じる方法にしたがつ て製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （本発明のタンパク質等） とキヤ リア一タンパク質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造方法 と同様に哺乳動物に免疫を行い、 該免疫動物から本発明のタンパク質等に対す る抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行うことにより製造できる。 哺乳 動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体 に関し、 キヤリァ一タンパク質の種類およびキヤリァ一とハプテンとの混合比 は、 キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれ ば特に限定されないが、例えば、 ゥシ血清アルブミン、 ゥシサイログロブリン、 キーホール'リンペット ·へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、 ハプテンとキヤリァ一のカプリングには、 種々の縮合剤を用いることができる が、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステルまたはチ オール基もしくはジチォピリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられ る。 ハプテンとキャリアーの縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可 能な部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して 抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントァ ジュバントを投与してもよい。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3 〜1 0回程度行うことができる。 ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫さ れた哺乳動物の血液または腹水など、 好ましくは血液から採取することができ る。 抗血清中のポリクロ一ナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測 定と同様にして測定できる。 ポリクロ一ナル抗体の分離精製は、 上記のモノク ローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製方法に従って行う ことができる。
本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質等を定量する方法は、 特に制限さ れず、 例えば、 被検液中の抗原量 （本発明のタンパク質等の量） に対応した抗 体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出 し、 検出された値から既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線に 基づいて、 被検液中の抗原量を算出する方法などが挙げられる。 例えば、 ネフ ロメトリ一、 競合法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用い られるが、 感度および特異性の点で、 後に記載するサンドイッチ法を用いるの が特に好ましい。 標識物質を用いる定量方法に用いられる標識剤としては、 例 えば、 放射性同位元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 前記放 射性同位元素としては、 例えば、 〔1 2 5 I〕、 〔1 3 1 I〕、 〔3 H〕、 〔1 4 C〕 などが用 いられる。前記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、 i3—ガラクトシダ一ゼ、 /3—ダルコシダ一ゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 パ 一才キシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 前記蛍光物質として は、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用 いられる。 前記発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標 識剤との結合にビォチンーアビジン系を用いることもできる。
上述の定量方法において抗原または抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用 いてもよく、 また通常、 タンパク質あるいは酵素等を不溶化 ·固定化するのに 用いられる化学結合を用いてもよい。 担体としては、 例えば、 ァガ口一ス、 デ キストラン、 セルロースなどの不溶性多糖類；ポリスチレン、 ポリアクリルァ ミド、 シリコン等の合成樹脂；またはガラス等が用いられる。 サンドイッチ法 においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ （ 1次 反応)、 さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反応 （2次反応） させ た後、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明の タンパク質量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の順序に行つ てもよく、 また、 同時に行なってもよい。 標識化剤および不溶化の方法は上記 と同一である。 また、 サンドイッチ法による免疫定量方法において、 固相用抗 体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。 サンドイツチ法による本発明の夕ンパク質等の定量方法においては、 1次反応 と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は本発明のタンパク質等 との結合部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応およ び 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発 明のタンパク質等の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好 ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の定量方法、 例えば、 競 合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることもできる 。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させ たのち、 未反応の標識抗原（F)と抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し （ BZF分離)、 Bまたは Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量 する。 本方法として具体的には、 （a ) 抗体として可溶性抗体を用い、 B/F分 離をポリエチレングリコール、 上記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法 、 および、 （b ) 第 1抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は 可溶性のものを用い第 2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが挙げられ る。 ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識. 化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液 中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の 標識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれか の相の標識化抗体量を測定し被検液中の抗原量を定量する。 また、 ネフロメト リーでは、 ゲル内あるいは溶液中での抗原抗体反応の結果、 生じた不溶性の沈 降物の量を測定する。 被検波中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降物しか得ら れない場合にはレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適 に用いられる。
これら個々の免疫学的定量方法を本発明において適用するにあたっては、 そ れぞれの方法における通常の条件に従い、 操作法に当業者の通常の技術的配慮 を加えればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書な どを参照することができる 〔例えば、 入江寛編 「ラジオィムノアツセィ」 (講 談社、 昭和 4 9年発行）、 入江寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行)、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行)、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行)、 石川 栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行)、 「メソッ ズ 'イン 'ェンザィモノジー（Methods in ENZYM0L0GY)」 Vo l . 70 (Immunochemi cal Techni ques (Par t A))、 同書 Vo l . 73 (Immunochemi cal Techni ques (Par t B) )、 同 書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)) 、 同 書 Vol. 8 (Immunochemical Techniques (Part D:Selected Immunoassays)), 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I： Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以上、 アカデミックプ レス社発行)など参照〕。
本発明の抗体は、 本発明のタンパク質等を精製するために使用する抗体カラ ムの作製、 精製時の各分画中の本発明のタンパク質等の検出、 被検細胞内にお ける本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用することもできる。 本発明の DNA等、 または本発明の DNA等の塩基配列に相補的もしくは実 質的に相補的な塩基配列を含有するアンチセンス ·ポリヌクレオチドは、 プロ ーブとして使用することにより、 生体内、 特に哺乳動物 （例えば、 ヒト、 ラッ ト、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） の生体内 における本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNAまた は mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば、 該 D NAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下などの遺伝子診断剤と して有用である。 本発明の DNA等またはアンチセンス ·ポリヌクレオチドを 用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 公知のノーザンハイブリダィゼ一シヨン や PCR— SSCP法 （ゲノミックス （Genomics), 第 5巻， 874〜879頁 ( 1989)、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ · サイェンシィズ 'ォブ 'ュ一エスェ一 （Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA), 第 86巻， 2766〜2770頁 （1989)) な どにより実施することができる。 例えば、 ノーザンハイブリダィゼーシヨンに より本発明の夕ンパク質またはその部分べプチドをコードする mRNAの発現 低下が検出された場合は、 網膜疾患を罹患している可能性が高いかまたは将来 罹患する可能性が高レ ^と診断することができる。 前記 「アンチセンス ·ポリヌクレオチド」 は、 本発明の D NA等の塩基配列 と相補的な塩基配列を少なくとも一部に有し、 本発明の D N A等とハイブリダ ィズすることができるポリヌクレオチドであればよい。 ゆえに、 アンチセンス •ポリヌクレオチドは、 本発明の D N A等の塩基配列に相補的な塩基配列を含 有するもののみならず、 実質的に相補的な塩基配列を含有するものであってよ い。 例えば、 本発明の D N A等とハイストリンジェン卜な条件下でハイブリダ ィズする塩基配列を含有するものなどが挙げられる。 アンチセンス ·ポリヌク レオチドは、 2—デォキシー D—リポースを含有しているポリデォキシヌクレ ォチド、 D—リポ一スを含有しているポリヌクレオチド、 プリンまたはピリミ ジン塩基の N—グリコシドを含有しているなど前記以外の他の夕ィプのポリヌ クレオチド、 あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー （例えば 、 市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー） または特殊な 結合を含有するその他のポリマー （伹し、 該ポリマーは D NAや R N A中に見 出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオ チドを含有する） などが挙げられる。 これらは、 二本鎖 D NA、 一本鎖 D N A 、 二本鎖 R NA、 一本鎖 R NA、 さらに D N A： R N Aハイブリッドであるこ とができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド （または非修飾オリゴヌクレオチド ) であっても、 公知の修飾の付加された修飾ポリヌクレオチド （または非修飾 オリゴヌクレオチド） であってもよい。 修飾ポリヌクレオチドとしては、 例え ば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化され たもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内ヌク レオチド修飾のされたもの、 非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホス ホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷 を有する結合または硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォエート、 ホスホロジ チォェ一トなど） を持つもの、 タンパク質 （ヌクレアーゼ、 ヌクレア一ゼ ·ィ ンヒビター、 トキシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ一 L—リジンなど） や 糖 （例えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基を有しているもの、 イン夕 一力レント化合物 （例えば、 ァクリジン、 ソラレンなど） を持つもの、 キレ一 卜化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合を持つもの （ 例えば、 ァノマ一型の核酸など） などが挙げられる。 ここで 「ヌクレオシド 」、 「ヌクレオチド」 および 「核酸」 は、 プリンおよびピリミジン塩基を含有す るのみでなく、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでい て良い。 こうした修飾物は、 メチル化されたプリンおよびピリミジン、 ァシル 化されたプリンおよびピリミジン、 あるいはその他の複素環を含むものであつ てよい。 糖を側鎖基として有する修飾ポリヌクレオチドは、 側鎖の糖部分がさ らに修飾されていてよく、 例えば、 糖の 1個以上の水酸基がハロゲンもしくは 脂肪族基などで置換されていたり、 またはェ一テルもしくはアミンなどの官能 基に変換されていたりしてよい。
つまり、 本発明のアンチセンス ·ポリヌクレオチドは、 R NA、 D NA、 あ るいは修飾された核酸 （R NA、 D NA) である。 修飾された核酸の具体例と しては核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフエ一ト誘導体、 そしてポリヌクレオシド アミドゃオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 そ れに限定されるものではない。
O t X 2タンパク質またはその部分ペプチドの発現または発現量の上昇を指 標として、 網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物またはその塩をスクリ —ニングすることができる。 前記スクリーニングは、 例えば、 O t x 2タンパ ク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞を用いて行うことが できる。
具体的には、 O t X 2タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を 有する細胞を試験化合物の存在下に培養し、 O t X 2タンパク質またはその部 分ペプチドの発現を検出するか、 またはそれらの発現量を測定することを特徴 とする、 網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物またはその塩のスクリー ニング方法が挙げられる。 前記 「O t x 2タンパク質またはその部分ペプチド を発現する能力を有する細胞」 としては、 上述した本発明の DNA等を有する 形質転換細胞が挙げられる。 また、 遺伝子組換え技術によらず、 元来 O t x 2 タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞であってもよ レ^ 本発明のタンパク質の発現量は、 培養された細胞から上述の方法で本発明 のタンパク質を分離精製し、 上述した本発明のタンパク質の定量方法を用いて 、 測定することができる。
また、 本発明のスクリーニング方法の他の態様として、 〇 t x 2タンパク質 またはその部分べプチドを発現する能力を有する細胞を試験化合物の存在下に 培養し、 本発明のタンパク質をコードする DNAもしくはその相補 DNAまた はそれらの部分 DNAを用いて 0 t X 2タンパク質をコードする mRNA (以 下、 O t X 2mRNAと略称する場合がある。） の量を測定することを特徴とす る、 網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物またはその塩のスクリ一ニン グ方法が挙げられる。 より具体的には、 （a) 〇 t x2タンパク質またはその部 分ペプチドを発現する能力を有する細胞を培養した場合の O t X 2mRNAの 発現量と、 （b) 〇 t x2タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を 有する細胞を試験化合物の存在下に培養した場合の 0 t X 2 mRNAの量との 比較を行うことを特徴とする、 網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物ま たはその塩のスクリーニング方法を提供する。
mRNAの発現量の比較をハイブリダイゼ一ション法によつて行うには、 公 知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー ·クローニング （M olecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Pre ss,1989) に記載の方法等に従って行うことができる。 具体的には、 〇 t x 2夕 ンパク質をコードする mRNAの量の測定は、 公知の方法に従って細胞から抽 出した mRNAと本発明のタンパク質をコードする DN Aもしくはその相補 D NAまたはそれらの部分 DNAとを接触させ、 本発明のタンパク質をコードす る DNAもしくはその相補 DNAまたはそれらの部分 DNAに結合した mRN Aの量を測定することによつて行われる。 本発明のタンパク質をコードする D N Aもしくはその相補 D N Aまたはそれらの部分 D N Aを、 例えば放射性同位 元素または色素などで標識することによって、 本発明のタンパク質をコードす る DNAもしくはその相補 DNAまたはそれらの部分 DNAに結合した〇 t x 2mRNAの量が容易に測定できる。 放射性同位元素としては、 例えば32 Pま たは3 Hなどが用いられ、 色素としては、 例えば fluorescein FAM (PE Bio systems社製）、 JOE (PE Biosystems社製）、 TAMRA (PE Biosystems社 製）、 OX (PE Biosystems社製）、 Cy 5 (Amersham社製） または Cy 3 (A mersham社製） などの蛍光色素が用いられる。 また、 O t x2mRNAの量は、 細胞から抽出した RNAを逆転写酵素によって cDNAに変換した後、 本発明 のタンパク質をコードする DN Aもしくはその相補 DN Aまたはそれらの部分 DN Aをプライマ一として用いる PC Rによって、 増幅される c DNAの量を 測定することによつても行うことができる。
〇 t X 2タンパク質をコードする DNAの公知プロモ一夕一ゃェンハンサー 領域をゲノム DNAよりクローエングし、 適当なレポ一夕一遺伝子の上流に連 結させた組換え DN Aで形質転換した細胞を試験化合物の存在下で培養し、 O t X 2タンパク質の発現に代えてレポ一ター遺伝子の発現を検出することを特 徴とする、 O t X 2タンパク質をコードする DNAのプロモ一ターもしくはェ ンハンサ一の活性を制御する作用を有する化合物またはその塩のスクリーニン グ方法、 ひいては網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物またはその塩の スクリーニング方法を提供する。 レポ一夕一遺伝子としては、 例えば、 l a c z (ιδ—ガラクトシダ一ゼ遺伝子） などの染色マーカー遺伝子等などが用いら れる。 レポ一タ一遺伝子産物 （例、 mRNA、 タンパク質） の量を公知の方法 を用いて測定することによって、 レポ一夕一遺伝子産物の量を増加させる試験 化合物を O t x 2遺伝子のプロモー夕一もしくはェンハンサ一の活性を促進す る作用を有する化合物、 すなわち O t X 2タンパク質またはその部分ペプチド の発現を促進する活性を有する化合物として選択できる。
以上述べてきた本発明のスクリーニング方法において試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産 物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙げられ、 これら化合物 は新規な化合物であつてもよいし、 公知の化合物であってもよい。
本発明のスクリーニング用キットには上記スクリーニング方法を実施するた め、 例えば、 ( a ) 〇 t x 2タンパク質、 その部分ペプチドを発現する能力を有 する細胞、 （b) 本発明のタンパク質をコードする D NAもしくはその相補 D N Aまたはそれらの部分 D NA、 または （c ) O t X 2タンパク質をコードする D N Aのプロモータ一もしくはェンハンサ一をレポーター遺伝子に連結させた D N Aで形質転換した細胞などを含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、上述した網膜疾患の予防、治療または進行抑制剤や、 網膜視細胞への分化誘導剤などの医薬として有用である。 該化合物もしくはそ の塩、 それらを含有する網膜疾患の予防、 治療もしくは進行抑制剤、 またはそ れらを含有する網膜視細胞への分化誘導剤は、 前記の本発明のタンパク質また は D N A等と同様にして実施することができる。 実施例
第 1図に示すように、 マウスの O t x 2 c D NAをレトロウイルスベクター である L I Aベクターに組み込んだ。 L I Aベクター （コントロールウィルス ベクター） にはヒト胎盤由来のアルカリホスファタ一ゼ遺伝子が組み込まれて おり、 このべクタ一由来のウィルスに感染した細胞は、 アルカリホスファタ一 ゼをマ一力一として発現する。 O t 2遺伝子を組み込まれた L I Aベクター (O t x 2ウィルスベクタ一） 由来のウィルスに感染した細胞は、 O t x 2夕 ンパク質を発現し、 同時にアルカリホスファターゼをマーカーとして共発現す る。
レトロウイルス産生用培養細胞 （Phoenix cell line) を用いて、 コントロー ルウイルスベクタ一と O t X 2ウィルスベクタ一をそれぞれ作製し、 得られた ウィルスを、 超遠心 (スイング口一夕一、 2, 1000 r pm、 4°C、 2時間） によって濃縮し、 1 X 10?p ί u (plaque forming unit) /m 1の感染効率を 持つウィルス液をそれぞれ作製した。
次に、 第 2図に示すように、 出生直後 （生後 0日） の子ラットに低温麻酔を 施し、 眼部を覆う皮膚を手術用ハサミで切開した。 子ラットの網膜下にインジ ェクシヨンニードル （Hami 1 t on社製） を用いて、 上記のコントロール ウィルスベクタ一又は〇 t X 2ウィルスベクタ一のウィルス液を 5 1注入し た。 注入後、 子ラットを 37°Cで 20分間程暖め体温を回復させた後、 母ラッ トの飼育ケージに戻して引き続き 4〜 6週間飼育した。
成体に育ったラットにペントバルビタール N aを投与して安楽死させた。 ラ ットより眼を摘出し、 次に網膜を取り出した。 網膜を、 4%パラホルムアルデ ヒド溶液を用いて一晩、 4°Cにて固定した。 4%パラホルムアルデヒド溶液を PBS (Phosphate Buffer Saline) に交換し、 固定した網膜を洗浄した。 この 固定 ·洗浄操作を 3回繰り返した。 次に、 4 %パラホルムアルデヒド溶液で固 定した網膜を 65 °Cで熱処理し、 内在性のアルカリホスファターゼを不活化さ せた。 熱処理した網膜をアルカリホスファタ一ゼ染色液で染色し （室温、 3時 間）、 上記ウィルスに感染した網膜細胞のみを青紫色に染色した。 この染色され た網膜を 4%パラホルムアルデヒド溶液にて一晩再固定後、 PBSで洗浄し、 次いで 30 %S u c r o s 6 ？83溶液にー晚浸漬した後、0丁3 c omp o und (Sakura Finetek社） 液中に移してドライアイス上で網膜の凍結ブロッ クを作製した。 凍結切片作製装置 （カールツァイス社） を用いて、 凍結ブロッ クから約 3 0 の凍結切片を作製し、 光学顕微鏡 （カールツァイス社） 下に て観察した。
網膜の各細胞の種類を、 その形態と位置によって同定した （第 3図参照)。 こ れを独立した試験で 3回行った。 一視野内に見られる全細胞数に対するそれぞ れの細胞の存在率を第 4図示す。 〇 t X 2ウィルスベクターを網膜幹細胞 （あ るいは網膜前駆細胞） に導入した場合、 網膜視細胞数はコントロールウィルス ベクターを導入した場合に比べて約 1 0 %増加した。 このことから、 〇 t x 2 遺伝子の発現により、 網膜幹細胞から双極細胞、 アマクリン細胞ならびにミュ ーラ一ダリァ細胞への分化は強く抑制され、 網膜幹細胞はほとんど網膜視細胞 に分化することが分かった。
以上の結果より、 O t X 2遺伝子を未分化の網膜幹細胞に導入し、 該細胞内 で〇 t X 2遺伝子を発現させることにより、 ラットの未分化網膜幹細胞を網膜 視細胞に有効に分化させることが可能であることが確認された。 産業上の利用の可能性
本発明のタンパク質等または本発明の D N A等は、 例えば網膜色素変性、 加 齢黄斑変性、 糖尿病性網膜症、 網膜剥離、 緑内障または網膜血管閉塞症など網 膜疾患を予防、 治療または進行抑制を目的とする医薬に利用できる。 さらに、 〇 t X 2遺伝子の異常によって網膜視細胞は構造的または機能的異常をきたす ので、 0 t X 2遺伝子の異常または〇 t X 2タンパク質の変性もしくは発現低 下を検出することにより、 上記網膜疾患の診断に利用ができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 〇 t x 2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を含有す ることを特徴とする網膜疾患の予防、 治療または進行抑制剤。
2 . 〇 t X 2タンパク質が、 配列番号： 1、 配列番号： 3もしくは配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と同一または前記配列と実質的に同一のアミノ酸配 列を含有するタンパク質である請求の範囲第 1項に記載の剤。
3 . O t X 2タンパク質またはその部分ペプチドをコードする D NAまたは R NAを含有する網膜疾患の予防、 治療または進行抑制剤。
4. D NAが、 配列番号： 2、 配列番号： 4もしくは配列番号： 6で表される 塩基配列または前記配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズす る塩基配列を含有する請求の範囲第 3項に記載の剤。
5 . O t X 2タンパク質またはその部分ペプチドをコードする D N Aまたは R NAを含有する組換えベクターを含有する請求の範囲第 3項に記載の剤。
6 . 〇 t X 2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を含有す ることを特徴とする網膜視細胞への分化誘導剤。
7 . 0 t X 2タンパク質またはその部分ペプチドをコードする D NAまたは R N Aを含有する網膜視細胞への分化誘導剤。
8 . 0 t X 2タンパク質を発現させるか、 または〇 t X 2タンパク質の発現量 を上昇させることを特徴とする網膜視細胞への分化誘導方法。
9 . 眼球組織由来細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞において、 〇 t X 2タンパク質を発現させるか、 または O t X 2タンパク質の発現量を上 昇させることを特徴とする請求の範囲第 8項に記載の網膜視細胞への分化誘導 方法。
1 0 . 眼球組織由来細胞、 胚性幹細胞、 神経幹細胞または神経前駆細胞に、 O t 2タンパク質またはその部分ペプチドをコードする D N Aまたは R NAを 導入し、 得られた細胞を培養することを特徴とする請求の範囲第 8項に記載の 網膜視細胞への分化誘導方法。
1 1 . 0 t X 2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の有効 量を哺乳動物に投与することを特徴とする網膜疾患の予防、 治療または進行抑 制方法。
1 2 . O t X 2タンパク質またはその部分ペプチドをコードする D N Aまたは R N Aの有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする網膜疾患の予防、 治療 または進行抑制方法。
1 3 . 〇 t X 2タンパク質により分化誘導された網膜視細胞またはその前駆細 胞を網膜に移植することを特徴とする網膜の再生方法。
1 4. 網膜疾患の予防、 治療または進行抑制剤の製造のための O t X 2タンパ ク質もしくはその部分べプチドまたはそれらの塩の使用。
15. 網膜疾患の予防、 治療または進行抑制剤の製造のための〇 t X 2タンパ ク質またはその部分ペプチドをコードする DN Aまたは RN Aの使用。
16. 〇 t X 2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩に対す る抗体を含有する網膜疾患の診断剤。
17. 〇 t X 2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩に対す る抗体を用いることを特徴とする網膜疾患の診断方法。
18. O t X 2タンパク質、 その部分ペプチドの発現量または変異を検出する ことを特徴とする網膜疾患の診断方法。
19. (a) O t X 2タンパク質もしくはその部分ペプチドをコードする DNA もしくは RNA、 または （b) 該 DNAもしくは RNAの塩基配列に相補的も しくは実質的に相補的な塩基配列を含有するアンチセンス ·ポリヌクレオチド を含有する網膜疾患の診断剤。
20. (a) O t X 2タンパク質もしくはその部分ペプチドをコードする DNA もしくは RNA、 または （b) 該 DNAもしくは RNAの塩基配列に相補的も しくは実質的に相補的な塩基配列を含有するアンチセンス ·ポリヌクレオチド を用いることを特徴とする網膜疾患の診断方法。
21. O t X 2タンパク質またはその部分ペプチドの発現または発現量の上昇 を指標とすることを特徴とする網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物ま たはその塩のスクリーニング方法。
2 2 . O t x 2タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細 胞を用いることを特徴とする請求の範囲第 2 1項に記載のスクリーニング方法。
2 3 . O t X 2タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細 胞を含有することを特徴とする網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物ま たはその塩のスクリーニング用キット。
2 4 . 請求の範囲第 2 1項もしくは第 2 2項に記載のスクリーニング方法、 ま たは請求の範囲第 2 3項に記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、 網膜視細胞への分化誘導作用を有する化合物またはその塩。
2 5 . 請求の範囲第 2 4項に記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
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