CN105441382A - 一种胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法 - Google Patents

一种胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105441382A
CN105441382A CN201610013182.5A CN201610013182A CN105441382A CN 105441382 A CN105441382 A CN 105441382A CN 201610013182 A CN201610013182 A CN 201610013182A CN 105441382 A CN105441382 A CN 105441382A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
cytodifferentiation
final concentration
group
cell differentiation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610013182.5A
Other languages
English (en)
Inventor
胡安斌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University filed Critical First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Priority to CN201610013182.5A priority Critical patent/CN105441382A/zh
Publication of CN105441382A publication Critical patent/CN105441382A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/148—Transforming growth factor alpha [TGF-a]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/237—Oncostatin M [OSM]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法。本发明将胚胎干细胞摇动培养或悬浮培养为拟胚体，然后将拟胚体贴壁培养，逐渐生长分化为圆形的分化细胞群落，根据分化肝细胞在圆形细胞群落中的空间分布规律，在特定时期选择特定区域的细胞进行分选并重新贴壁培养。在上述贴壁培养过程中，根据细胞分化情况，选择EGF、TGF、HGF、OSM等作为拟胚体向肝细胞分化过程中的肝性生长因子，以促进肝细胞分化，整个分选过程操作简单、成本低、可明显减轻细胞损伤、干细胞分化率相较于现有技术得到大幅度提高，分选后的细胞生长状态良好，可满足肝细胞移植的细胞纯度和细胞功能要求。

Description

一种胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法。
背景技术
既往胚胎干细胞分化中的细胞分选需要利用胰酶消化细胞并离心吹打等，造成细胞严重损伤，不利于细胞移植应用。因为胚胎干细胞向肝细胞分化时，胚胎干细胞经悬浮培养形成拟胚体(embryonicbody，EB)，这相当于体内胚胎的囊胚，然后拟胚体再贴壁生长并向肝细胞方向分化。每个拟胚体包含大量细胞，细胞与细胞之间以及其与培养瓶底部紧密连接，甚至难以分清细胞界限。如果需要将阳性细胞分选，就需要用胰酶消化细胞，使各个细胞之间以及与培养瓶底部之间分离，再用抗体标记细胞后，用流式细胞仪(FCM)或磁珠分选将所需要的阳性细胞分选出来。这种分选方法经过胰酶的消化和FCM等机器分选操作，严重影响细胞活力，细胞生长状态明显变差，很难完成后续的细胞移植实验。
如何在不影响细胞活力的前提下，将胚胎干细胞分化的肝细胞初步分选出来并在新的培养系统中再培养，以提高其分化纯度，用于后续的肝细胞移植是当前的难题。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的目的在于提供一种胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法，包含如下步骤：
(1)胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESC)在拟胚体(embryonicbody，EB)液体培养基中摇动培养或悬浮培养开始分化，得到拟胚体；
(2)将步骤(1)得到的拟胚体进行贴壁培养，每个拟胚体以贴壁点为中心向四周辐射分化生长形成细胞分化群落；胚胎干细胞分化至第15d时，刮取位于细胞分化群落区域1和/或细胞分化群落区域2的正常生长状态细胞，将其再次贴壁培养，得到胚胎干细胞分化的肝细胞；
步骤(1)中所述的胚胎干细胞优选为BALB/c系小鼠胚胎干细胞；
步骤(2)中所述的区域1为位于细胞分化群落中心区域且其边缘至细胞分化群落中心的距离不超过细胞分化群落半径(细胞分化群落边缘至中心距离)的1/4；
步骤(2)中所述的区域1优选为位于细胞分化群落中心区域且其边缘至细胞分化群落中心的距离不超过细胞分化群落半径(细胞分化群落边缘至中心距离)的1/5；
步骤(2)中所述的区域2为细胞分化群落区域3之外的区域；
所述的区域3为位于细胞分化群落中心区域且其边缘至细胞分化群落中心的距离为细胞分化群落半径(细胞分化群落边缘至中心距离)的3/4；
所述的区域3优选为位于细胞分化群落中心区域且其边缘至细胞分化群落中心的距离为细胞分化群落半径(细胞分化群落边缘至中心距离)的4/5；
步骤(1)中所述的摇动培养或悬浮培养的目的在于：使细胞在培养液中处于悬浮状态，避免贴壁，以利于其分化发育为圆球形的拟胚体；
步骤(1)中所述的拟胚体液体培养基优选由基础培养基和添加物组成；
所述的基础培养基优选为DMEM培养基；所述的添加物包含如下组分：体积分数为20％的胎牛血清、终浓度为0.1M的2-巯基乙醇、终浓度为25mM的HEPES、终浓度为100U/mL的青霉素和终浓度为100μg/mL的链霉素；
步骤(1)中所述的摇动培养或悬浮培养的时间优选为培养6天；
步骤(2)中所述的贴壁培养的培养基优选由基础培养基和添加物组成；
所述的基础培养基优选为DMEM培养基；所述的添加物包含如下组分：体积分数为20％的胎牛血清、终浓度为0.1M的2-巯基乙醇、终浓度为25mM的HEPES、终浓度为100U/mL的青霉素和终浓度为100μg/mL的链霉素；
步骤(2)中所述的贴壁培养过程中添加肝性生长因子；
所述的肝性生长因子为EGF、TGF、HGF、OSM、地塞米松、胰岛素和转铁蛋白中的至少一种；
所述的肝性生长因子加入时间和用量优选为：
胚胎干细胞分化第7天～19天(本发明中的分化天数是从胚胎干细胞首次分化开始计)，加入终浓度为30ng/mL的EGF和终浓度为30ng/mL的TGF；
胚胎干细胞分化第7天～10天，加入终浓度为20ng/mL的HGF；
胚胎干细胞分化第11～19天，终浓度为40ng/mL的HGF；
胚胎干细胞分化第15～19天，加入终浓度为10ng/mL的OSM、终浓度为10-7M的地塞米松、终浓度为5μg/mL的胰岛素和终浓度为5μg/mL的转铁蛋白；
胚胎干细胞拟胚体进行贴壁培养过程中，加入EGF、HGF等肝性生长因子后，细胞分化群落外周形成比较均一的细胞群，说明生长因子的定向诱导作用使拟胚体向单一类型细胞分化；
本发明的原理：
本发明是基于对胚胎干细胞向肝细胞分化中的每个胚胎干细胞分化群落的空间形态学观察结果，得出的一种新的细胞分选方法：胚胎干细胞首先经5～6d悬浮发育为拟胚体，拟胚体相当于体内胚胎发育中的囊胚，然后拟胚体再贴壁，形成细胞分化群落并进一步向肝细胞分化，每个细胞分化群落一开始大约包含500～600个细胞，随着分化分裂，细胞数量不断增多并呈分散性生长为圆形细胞群落，经过肝性标记物(如白蛋白)免疫荧光检测，我们发现阳性标记的肝细胞处于每个细胞分化群落的区域1和区域2；本发明在特定时期(胚胎干细胞分化至第15d)选择并分选区域1和区域2(图2)的细胞重新进行贴壁培养，在贴壁培养过程中，本发明根据细胞分化情况，选择EGF、TGF、HGF、OSM、地塞米松、胰岛素和转铁蛋白等作为拟胚体向肝细胞分化过程中的肝性生长因子，在不同分化阶段添加合适的肝性生长因子，以促进肝细胞分化，整个分选过程操作简单、成本低、可明显减轻细胞损伤、干细胞分化率相较于现有技术得到大幅度提高，分选后的细胞生长状态良好，可满足肝细胞移植的细胞纯度和细胞功能要求。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明是基于拟胚体细胞分化群落中肝细胞的独特的空间分布规律，得出的一种新的细胞分选方法。
(2)本发明利用物理性的活体细胞整块刮取方法，将整片区域的细胞整块刮取，可很好的保护单个细胞的功能，相比普通的胰酶消化细胞方法，具有明显减轻细胞损伤的优点。
(3)本发明在不影响细胞活力的情况下，经过多次整块刮取细胞，并重新培养，可以完全达到满足细胞移植时的纯度(大于80％)需求。
(4)本发明在不同分化阶段添加合适的肝性生长因子，以促进肝细胞分化，干细胞分化率相较于现有技术得到大幅度提高。
附图说明
图1是胚胎干细胞体外向肝细胞分化的细胞形态图；其中，A：胚胎干细胞；B：拟胚体；C：细胞分化群落。
图2是本发明细胞分选过程中区域1和区域2的示意图。
图3是细胞分选前后，显微镜下细胞分化群落或制得的肝细胞形态图；其中，A：细胞分选前细胞分化群落形态；B：细胞分选后制得的肝细胞形态。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
拟胚体液体培养基由基础培养基和添加物组成；基础培养基优选为DMEM培养基；添加物包含如下组分：体积分数为20％的胎牛血清、终浓度为0.1M的2-巯基乙醇、终浓度为25mM的HEPES、终浓度为100U/mL的青霉素和终浓度为100μg/mL的链霉素；
实施例1
(1)BALB/c系小鼠胚胎干细胞(购自中山大学实验动物中心)在5％CO2培养箱中37℃条件下在拟胚体液体培养基中摇动培养或悬浮培养开始分化，约10h后即可见胚胎干细胞形成圆球状拟胚体并悬浮在培养液中，拟胚体在6d的培养时间里不断增大；培养6天后，得到拟胚体；
(2)第7天，将步骤(1)得到的拟胚体移至24孔板中进行贴壁培养，每个拟胚体以贴壁点为中心向四周辐射分化生长形成细胞分化群落；
贴壁培养的培养基由基础培养基和添加物组成；所述的基础培养基为DMEM培养基；所述的添加物包含如下组分：体积分数为20％的胎牛血清、终浓度为0.1M的2-巯基乙醇、终浓度为25mM的HEPES、终浓度为100U/mL的青霉素和终浓度为100μg/mL的链霉素；
贴壁培养过程中，肝性生长因子的加入时间和用量为：
胚胎干细胞分化第7天～19天，加入终浓度为30ng/mL的EGF和终浓度为30ng/mL的TGF；
胚胎干细胞分化第7天～10天，加入终浓度为20ng/mL的HGF；
胚胎干细胞分化第11～19天，终浓度为40ng/mL的HGF；
胚胎干细胞分化第15～19天，加入终浓度为10ng/mL的OSM、终浓度为10-7M的地塞米松、终浓度为5μg/mL胰岛素和终浓度为5μg/mL的转铁蛋白；
(3)胚胎干细胞分化第15d时，对拟胚体细胞分化群落进行免疫细胞化学(免疫荧光)检测(第一抗体：兔抗小鼠AFP单抗(浓度1/100)和绵羊抗小鼠ALB单抗(浓度1/50)；第二抗体：山羊抗兔IgG/FITC/TMRITC/DAB和鼠抗绵羊IgG/FITC/TMRITC)，具体操作步骤参照免疫荧光试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)说明书；结果如下所示：
表达肝细胞标记物-白蛋白(ALB)和肝细胞标记物AFP的阳性细胞的空间分布具备一定规律，即：ALB阳性细胞分布在拟胚体细胞分化群落的区域1和区域2(区域1位于细胞分化群落中心区域且其边缘至细胞分化群落中心的距离不超过细胞分化群落半径(细胞分化群落边缘至中心距离)的1/4；区域2为细胞分化群落区域3之外的区域；区域3为位于细胞分化群落中心区域且其边缘至细胞分化群落中心的距离为细胞分化群落半径(细胞分化群落边缘至中心距离)的3/4)，二者之间的中间区域几乎无阳性细胞分布。理论上，这符合肝细胞作为内胚层细胞的空间分布规律。拟胚体是包含三个胚层细胞的胚胎结构，其中内胚层细胞在胚胎发育早期首先分布于胚体外缘。当拟胚体贴壁按二维空间生长后，大部分内胚层细胞就处于细胞分化群落的外周。同时，拟胚体中心的细胞仍然处于各级干细胞水平，可以不断分化出包括内胚层的三胚层细胞，加上拟胚体贴壁时与培养瓶接触点的外缘部分的内胚层细胞，使得内胚层细胞在细胞分化群落的外缘及中心部位存在。
实施例2
(1)BALB/c系小鼠胚胎干细胞(购自中山大学实验动物中心)在5％CO2培养箱中37℃条件下在拟胚体液体培养基中摇动培养或悬浮培养开始分化，约10h后即可见胚胎干细胞形成圆球状拟胚体并悬浮在培养液中，拟胚体在6d的培养时间里不断增大；培养6天后，得到拟胚体；
(2)第7天，将步骤(1)得到的拟胚体移至24孔板中进行贴壁培养，每个拟胚体以贴壁点为中心向四周辐射分化生长形成细胞分化群落；胚胎干细胞分化至第15d时，用细胞铲整块刮取位于细胞分化群落区域1和/或细胞分化群落区域2(区域1位于细胞分化群落中心区域且其边缘至细胞分化群落中心的距离不超过细胞分化群落半径(细胞分化群落边缘至中心距离)的1/5；区域2为细胞分化群落区域3之外的区域；区域3为位于细胞分化群落中心区域且其边缘至细胞分化群落中心的距离为细胞分化群落半径(细胞分化群落边缘至中心距离)的4/5)的正常生长状态细胞，将其再次贴壁培养，得到胚胎干细胞分化的肝细胞；其中：
贴壁培养的培养基由基础培养基和添加物组成；所述的基础培养基为DMEM培养基；所述的添加物包含如下组分：体积分数为20％的胎牛血清、终浓度为0.1M的2-巯基乙醇、终浓度为25mM的HEPES、终浓度为100U/mL的青霉素和终浓度为100μg/mL的链霉素；
贴壁培养过程中，肝性生长因子的加入时间和用量为：
胚胎干细胞分化第7天～19天，加入终浓度为30ng/mL的EGF和终浓度为30ng/mL的TGF；
胚胎干细胞分化第7天～10天，加入终浓度为20ng/mL的HGF；
胚胎干细胞分化第11～19天，终浓度为40ng/mL的HGF；
胚胎干细胞分化第15～19天，加入终浓度为10ng/mL的OSM、终浓度为10-7M的地塞米松、终浓度为5μg/mL胰岛素和终浓度为5μg/mL的转铁蛋白；
(3)胚胎干细胞向肝细胞分化过程中的鉴定
①加入HGF等肝性生长因子后细胞分化群落外周形成比较均一的细胞群，说明生长因子的定向诱导作用使拟胚体向单一类型细胞分化(图1A～图1C)，从图1C中可看出，每个细胞分化群落即是由图1B中的单个拟胚体贴壁生长后分化而成，每个细胞分化群落包含多量细胞。
②本实施例在胚胎干细胞分化第15d，用细胞铲整块刮取拟胚体细胞分化群落的区域1和区域2的正常生长状态细胞，将其转入新的培养瓶继续贴壁培养；经鉴定，分选并重新培养的细胞中，肝细胞比率或纯度明显上升，可由31.2％上升至80.1％，细胞生长状态良好，细胞活力不受影响：其中，继续贴壁培养4d后，采用RT-PCR(引物序列为：AFP-F：5’-TCGTATTCCAACAGGATA-3’；AFP-R：5’-AGGCTTTTGCTTCACCAG-3’；ALB-F：5’-GCTAGGCACACAGTGCTTG-3’；ALB-R：5’-CAGGATTGCAGACAGATAGTC-3’；TAT-F：5’-ACCTTCAATCCCATCCGA-3’；TAT-R：5’-TCCCGACTGGATAGGTAG-3’；G6P-F：5’-CAGGACTGGTTCATCCTT-3’；G6P-R：5’-GTTGCTGTAGTAGTCGGT-3’)免疫细胞化学(抗体及试剂盒同步骤①)和RIA方法(放射免疫法(RIA)试剂盒(北京中国原子能研究院))检测细胞表达ALB和尿素等肝细胞标记物情况，其中，对照组为胚胎干细胞分化至第15d时不进行特定区域(细胞分化群落的区域1和区域2)细胞分选，直接继续贴壁培养4d，整个培养阶段的其他操作同步骤(1)、(2)；
经检测，经过特定区域分选后继续贴壁培养4d后，得到的的肝细胞的肝性标记物ALB、TAT、G6P等表达水平较对照组明显提高，培养上清液中ALB浓度较分选前由4.25±0.50μg/mL明显上升为11.32±1.12μg/mL，尿素浓度较分选前由61.33±0.97μg/mL明显上升为148.31±23.36μg/mL，这表明分选后的细胞生长状态良好，可满足肝细胞移植的细胞纯度和细胞功能要求。
③图3是细胞分选前后，显微镜下细胞分化群落或肝细胞形态图；其中，图3A为细胞分选前细胞分化群落形态，从图中可以看出，拟胚体细胞分化群落为圆形分布，其中包含多种类型分化细胞，肝细胞仅占其中一小部分；图3B为细胞分选后培养得到的肝细胞形态，从图中可以看出，免疫组化染色ALB阳性的分化肝细胞数量和纯度明显提高，细胞贴壁均匀生长。
实施例3
(1)同实施例2；
(2)胚胎干细胞分化至第15d时，用细胞铲整块刮取位于细胞分化群落区域1和/或细胞分化群落区域2(区域1位于细胞分化群落中心区域且其边缘至细胞分化群落中心的距离不超过细胞分化群落半径(细胞分化群落边缘至中心距离)的1/4；区域2为细胞分化群落区域3之外的区域；区域3为位于细胞分化群落中心区域且其边缘至细胞分化群落中心的距离为细胞分化群落半径(细胞分化群落边缘至中心距离)的3/4)的正常生长状态细胞，将其再次贴壁培养，得到胚胎干细胞分化的肝细胞；其他操作同实施例2；
经鉴定，分选并重新培养的细胞中，肝细胞比率或纯度明显上升，可由31.0％上升至75.8％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)胚胎干细胞在拟胚体液体培养基中摇动培养或悬浮培养开始分化，得到拟胚体；
(2)将步骤(1)得到的拟胚体进行贴壁培养，每个拟胚体以贴壁点为中心向四周辐射分化生长形成细胞分化群落；胚胎干细胞分化至第15d时，刮取位于细胞分化群落区域1和/或细胞分化群落区域2的正常生长状态细胞，将其再次贴壁培养，得到胚胎干细胞分化的肝细胞；
步骤(2)中所述的区域1为位于细胞分化群落中心区域且其边缘至细胞分化群落中心的距离不超过细胞分化群落半径的1/4；
步骤(2)中所述的区域2为细胞分化群落区域3之外的区域；
所述的区域3为位于细胞分化群落中心区域且其边缘至细胞分化群落中心的距离为细胞分化群落半径的3/4。
2.根据权利要求1所述的胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的贴壁培养过程中添加肝性生长因子。
3.根据权利要求1所述的胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法，其特征在于：
所述的肝性生长因子为EGF、TGF、HGF、OSM、地塞米松、胰岛素和转铁蛋白中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法，其特征在于：
所述的肝性生长因子加入时间和用量为：
胚胎干细胞分化第7天～19天，加入终浓度为30ng/mL的EGF和终浓度为30ng/mL的TGF；
胚胎干细胞分化第7天～10天，加入终浓度为20ng/mL的HGF；
胚胎干细胞分化第11～19天，终浓度为40ng/mL的HGF；
胚胎干细胞分化第15～19天，加入终浓度为10ng/mL的OSM、终浓度为10-7M的地塞米松、终浓度为5μg/mL的胰岛素和终浓度为5μg/mL的转铁蛋白。
5.根据权利要求1所述的胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的胚胎干细胞为BALB/c系小鼠胚胎干细胞。
6.根据权利要求1所述的胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的区域1为位于细胞分化群落中心区域且其边缘至细胞分化群落中心的距离不超过细胞分化群落半径的1/5；
所述的区域3为位于细胞分化群落中心区域且其边缘至细胞分化群落中心的距离为细胞分化群落半径的4/5。
7.根据权利要求1所述的胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的拟胚体液体培养基由基础培养基和添加物组成；
所述的基础培养基为DMEM培养基；所述的添加物包含如下组分：体积分数为20％的胎牛血清、终浓度为0.1M的2-巯基乙醇、终浓度为25mM的HEPES、终浓度为100U/mL的青霉素和终浓度为100μg/mL的链霉素。
8.根据权利要求1所述的胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的摇动培养或悬浮培养的时间为培养6天。
9.根据权利要求1所述的胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的贴壁培养的培养基由基础培养基和添加物组成；
所述的基础培养基为DMEM培养基；所述的添加物包含如下组分：体积分数为20％的胎牛血清、终浓度为0.1M的2-巯基乙醇、终浓度为25mM的HEPES、终浓度为100U/mL的青霉素和终浓度为100μg/mL的链霉素。
10.权利要求1～9任一项所述的胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法在细胞培养技术领域中的应用。
CN201610013182.5A 2016-01-06 2016-01-06 一种胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法 Pending CN105441382A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610013182.5A CN105441382A (zh) 2016-01-06 2016-01-06 一种胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610013182.5A CN105441382A (zh) 2016-01-06 2016-01-06 一种胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105441382A true CN105441382A (zh) 2016-03-30

Family

ID=55552023

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610013182.5A Pending CN105441382A (zh) 2016-01-06 2016-01-06 一种胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105441382A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107345897A (zh) * 2016-05-04 2017-11-14 上海米洋杨生物科技有限公司 一种视网膜感光细胞特异性表面蛋白的筛选方法
CN110157661A (zh) * 2018-02-12 2019-08-23 中国科学院上海生命科学研究院 一种单倍体胚胎干细胞的分选方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1478888A (zh) * 2003-07-09 2004-03-03 暨南大学 胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法
CN101037669A (zh) * 2006-03-13 2007-09-19 上海交通大学医学院附属新华医院 一种从人胚胎干细胞诱导肝细胞的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1478888A (zh) * 2003-07-09 2004-03-03 暨南大学 胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法
CN101037669A (zh) * 2006-03-13 2007-09-19 上海交通大学医学院附属新华医院 一种从人胚胎干细胞诱导肝细胞的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HU A-B等: "High-ratio differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes in vitro", 《LIVER INTERNATIONAL》 *
张良等: "体外培养拟胚体条件的探讨", 《中国病理生理杂志》 *
胡安斌等: "胚胎干细胞来源的肝细胞对急性肝功能衰竭小鼠的移植治疗作用", 《中华医学杂志》 *
范新兰等: "小鼠胚胎干细胞源性肝细胞的培养体系及分选", 《中国组织工程研究与临床康复》 *
闫益波等: "小鼠胚胎干细胞单层定向诱导分化为肝样细胞的研究", 《南京农业大学学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107345897A (zh) * 2016-05-04 2017-11-14 上海米洋杨生物科技有限公司 一种视网膜感光细胞特异性表面蛋白的筛选方法
CN110157661A (zh) * 2018-02-12 2019-08-23 中国科学院上海生命科学研究院 一种单倍体胚胎干细胞的分选方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103805562B (zh) 培养胎盘间充质干细胞的无血清培养基
CN101864395B (zh) 脐带间充质干细胞体外诱导分化为组织工程皮肤种子细胞
CN102311938B (zh) 一种用于肝细胞培养的无血清培养基
Boyer et al. Reversible transition towards a fibroblastic phenotype in a rat carcinoma cell line
CN102250829B (zh) 人脐带间充质干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法
CN105112366B (zh) 一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基
CN107475188A (zh) 一种细胞培养基和胚胎干细胞的培养方法
CN103849593B (zh) 一种磁分离式细胞三维共培养方法
CN105039248B (zh) 树鼩骨髓间充质干细胞培养系统
CN105132375A (zh) 一种肝癌干细胞的无血清培养基及其培养方法
CN101831403B (zh) 体外扩增人脐带胎盘间充质干细胞的方法
CN104694470A (zh) 一种干细胞无血清培养基
CN107418930A (zh) 一种纯化与扩增人骨髓间充质干细胞的制备方法
CN108315258A (zh) 增大细胞培养面积的细胞培养滚瓶及其应用
Iwai et al. Preparation and characterization of directed, one‐day‐self‐assembled millimeter‐size spheroids of adipose‐derived mesenchymal stem cells
CN105441382A (zh) 一种胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法
CN114317428A (zh) 一种含中药小分子的干细胞无血清培养基及其制备方法
CN103320385B (zh) 人源性高分化肝癌细胞株hl1017及其构建方法
CN103923876A (zh) 一种单细胞克隆培养方法
CN102093977A (zh) 一种诱导iPS细胞向心肌细胞分化的诱导因子及其应用
CN101712947A (zh) 来源于胚胎干细胞的间充质干细胞的制备方法及其用途
CN102212460A (zh) 干细胞筛选系统、其制备方法及干细胞的筛选方法
CN107083355A (zh) 一种饲养层细胞及其制备方法与应用
CN102174471A (zh) 慢病毒介导的三融合报告基因转染标记iPS细胞的方法
CN102363764A (zh) 一种培养胰腺干/祖细胞的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160330