JP2015509381A5 - - Google Patents

Description

最近の努力により、結果として、培地中のノックアウト血清交換（ＫＳＲ）のような、置換培養条件のホストによる、フィーダー細胞又は条件培地の置換がもたらされている（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：１８５〜１８９）。ＫＳＲは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の粗製の未定義画分を含む。他は、ＦＧＦ２、アクチビンＡ、及びインスリンを含む化学的に明確な培地中で多能性の長期間維持を示している（Ｖａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，１１８：４４９５〜４５０９）。ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）及びＳｔｅｍＰｒｏ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を含む市販されている培地処方がまた、ヒト多能性幹細胞を維持及び増殖させるために既に使用されている。明確な培地の開発に焦点をあてた更なる先行技術としては、米国特許第７４４９３３４号、第７４４２５４８号、第７００５２５２号、第２００８／０２６８５３４号、第７４１０７９８号、第７２９７５３９号、及び第６８００４８０号が挙げられる。更に、最近の発行物は、明確な培地中でさえ、ＥＳ細胞の増殖を実際に遅くするか、それらの多能性状態を減少させうる不必要な試薬が存在することを強調して、８つの成分に対するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を更に精製した（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１，８：４２４〜４２９）。精製されたｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地は、ＮａＨＣＯ ₃ によって調整したｐＨを有する、インスリン、セレン、トランスフェリン、アスコルビン酸、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、及びＴＧＦβ又はノーダルを補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地からなる。

^＊＊ Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｃ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．９９〜１７６ １０００ｘ液体は、１．２０ｍｇ／Ｌ ＡｌＣｌ _３・６Ｈ _２ Ｏ、０．１７ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ_３、２．５５ｍｇ／Ｌ Ｂａ（Ｃ_２Ｈ_３Ｏ_２） _２ 、０．１２ｍｇ／Ｌ ＫＢｒ、２．２８ｍｇ／Ｌ ＣｄＣｌ_２、２．３８ｍｇ／Ｌ ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．３２ｍｇ／Ｌ ＣｒＣｌ_３（無水）、４．２０ｍｇ／Ｌ ＮａＦ、０．５３ｍｇ／Ｌ ＧｅＯ_２、０．１７ｍｇ／Ｌ ＫＩ、１．２１ｍｇ／Ｌ ＲｂＣｌ、及び３．２２ｍｇ／Ｌ ＺｒＯＣｌ_２・８Ｈ_２Ｏを含む。

^＊＊＊ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１１９０５０３１は、１００．０ｍＬ／Ｌエチルアルコール（２００ｐｒｏｏｆ）及び２ｍｇ／Ｌアラキドン酸、２２０ｍｇ／Ｌコレステロール、７０ｍｇ／Ｌ酢酸ＤＬ−α−トコフェロール、０ｍｇ／Ｌエチルアルコール１００％、１０ｍｇ／Ｌリノール酸、１０ｍｇ／Ｌリノレン酸、１０ｍｇ／Ｌミリスチン酸、１０ｍｇ／Ｌオレイン酸、１０ｍｇ／Ｌパルミチン酸、１０ｍｇ／Ｌパルミトレイン酸、９００００ｍｇ／ＬプルロニックＦ−６８、１０ｍｇ／Ｌステアリン酸、及び２２００ｍｇ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ ８０（登録商標）（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）を含む。

（実施例３）
ＩＨ−３及びＩＨ−１培地中のＨ１細胞の長期培養が、多能性及び安定核型を維持する 実施例１にて記述したように、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈）コートディッシュ上で培養し、ＥＤＴＡを用いて継代した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（継代３５〜継代４０）を開始集団として用いて、ＩＨ−１、ＩＨ−３−２、ＩＨ−３ＲＴ及びｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を用いた長期培養を評価した。細胞を、室温にて５〜１０分間ＥＤＴＡ処理を用いて、小コロニーとして継代した。被検培地の成分を、表ＶＩＩにて記載する。

Claims (18)

1. 多能性幹細胞の培養、維持及び増殖のための明確な細胞培養処方であって、前記明確な細胞培養処方は、以下：
   ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びＩＧＦ−１からなる、明確な細胞培養処方；
   ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、及びアスコルビン酸からなる、明確な細胞培養処方；
   ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、及び塩化リチウムからなる、明確な細胞培養処方；
   ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、アスコルビン酸、及び塩化リチウムからなる、明確な細胞培養処方；
   ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＡｌＣｌ ₃ ・６Ｈ ₂ Ｏ、ＡｇＮＯ ₃ 、Ｂａ（Ｃ ₂ Ｈ ₃ Ｏ ₂ ） ₂ 、ＫＢｒ、ＣｄＣｌ ₂ 、ＣｏＣｌ ₂ ・６Ｈ ₂ Ｏ、ＣｒＣｌ ₃ （無水）、ＮａＦ、ＧｅＯ ₂ 、ＫＩ、ＲｂＣｌ、及びＺｒＯＣｌ ₂ ・８Ｈ ₂ Ｏからなる、明確な細胞培養処方；
   ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、エチルアルコール、アラキドン酸、コレステロール、酢酸ＤＬ−α−トコフェロール、エチルアルコール１００％、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸、及びＴｗｅｅｎ ８０（登録商標）からなる、明確な細胞培養処方；並びに
   ＭＣＤＢ−１３１、ＡｌＣｌ ₃ ・６Ｈ ₂ Ｏ、ＡｇＮＯ ₃ 、Ｂａ（Ｃ ₂ Ｈ ₃ Ｏ ₂ ） ₂ 、ＫＢｒ、ＣｄＣｌ ₂ 、ＣｏＣｌ ₂ ・６Ｈ ₂ Ｏ、ＣｒＣｌ ₃ （無水）、ＮａＦ、ＧｅＯ ₂ 、ＫＩ、ＲｂＣｌ、ＺｒＯＣｌ ₂ ・８Ｈ ₂ Ｏ、アスコルビン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、塩化リチウム、グルコース、エチルアルコール、アラキドン酸、コレステロール、酢酸ＤＬ−α−トコフェロール、エチルアルコール１００％、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸、Ｔｗｅｅｎ ８０（登録商標）、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドからなる、明確な細胞培養処方；
   からなる群より選択され、前記明確な細胞培養処方中で多能性幹細胞を培養することによって、少なくとも１０継代、細胞の多能性が維持される、細胞培養処方。
2. 前記細胞培養処方が、以下：
   ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びＩＧＦ−１からなる、明確な細胞培養処方；
   ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、及びアスコルビン酸からなる、明確な細胞培養処方；又は
   ＭＣＤＢ−１３１、ＡｌＣｌ ₃ ・６Ｈ ₂ Ｏ、ＡｇＮＯ ₃ 、Ｂａ（Ｃ ₂ Ｈ ₃ Ｏ ₂ ） ₂ 、ＫＢｒ、ＣｄＣｌ ₂ 、ＣｏＣｌ ₂ ・６Ｈ ₂ Ｏ、ＣｒＣｌ ₃ （無水）、ＮａＦ、ＧｅＯ ₂ 、ＫＩ、ＲｂＣｌ、ＺｒＯＣｌ ₂ ・８Ｈ ₂ Ｏ、アスコルビン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、塩化リチウム、グルコース、エチルアルコール、アラキドン酸、コレステロール、酢酸ＤＬ−α−トコフェロール、エチルアルコール１００％、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸、Ｔｗｅｅｎ ８０（登録商標）、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドからなる、明確な細胞培養処方；
   からなる群より選択され、前記明確な細胞培養処方中で幹細胞を培養することによって、少なくとも１０継代、細胞の多能性と核型安定性が維持される、請求項１に記載の明確な細胞培養処方。
3. 前記細胞培養処方が、ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、及び塩化リチウムからなる、請求項１に記載の明確な細胞培養処方。
4. 前記細胞培養処方が、ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、アスコルビン酸、及び塩化リチウムからなる、請求項１に記載の明確な細胞培養処方。
5. 前記細胞培養処方が、ヒト多能性幹細胞の培養、維持及び増殖のためのものである、請求項１に記載の明確な細胞培養処方。
6. 前記細胞培養処方が、ヒト胚性幹細胞の培養、維持及び増殖のためのものである、請求項５に記載の明確な細胞培養処方。
7. 前記脂肪酸を含まないアルブミンが、試薬グレードである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の明確な細胞培養処方。
8. 前記ＴＧＦ−βリガンドが、ＴＧＦ−β１である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の明確な細胞培養処方。
9. ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びＩＧＦ−１からなる、明確な細胞培養処方。
10. ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、及びアスコルビン酸からなる、明確な細胞培養処方。
11. ＭＣＤＢ−１３１、ＡｌＣｌ ₃ ・６Ｈ ₂ Ｏ、ＡｇＮＯ ₃ 、Ｂａ（Ｃ ₂ Ｈ ₃ Ｏ ₂ ） ₂ 、ＫＢｒ、ＣｄＣｌ ₂ 、ＣｏＣｌ ₂ ・６Ｈ ₂ Ｏ、ＣｒＣｌ ₃ （無水）、ＮａＦ、ＧｅＯ ₂ 、ＫＩ、ＲｂＣｌ、ＺｒＯＣｌ ₂ ・８Ｈ ₂ Ｏ、アスコルビン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、塩化リチウム、グルコース、エチルアルコール、アラキドン酸、コレステロール、酢酸ＤＬ−α−トコフェロール、エチルアルコール１００％、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸、Ｔｗｅｅｎ ８０（登録商標）、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドからなる、明確な細胞培養処方。
12. ヒト多能性幹細胞の増殖のための方法であって、以下：
    ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びＩＧＦ−１からなる、明確な細胞培養処方；
    ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、及びアスコルビン酸からなる、明確な細胞培養処方；並びに
    ＭＣＤＢ−１３１、ＡｌＣｌ ₃ ・６Ｈ ₂ Ｏ、ＡｇＮＯ ₃ 、Ｂａ（Ｃ ₂ Ｈ ₃ Ｏ ₂ ） ₂ 、ＫＢｒ、ＣｄＣｌ ₂ 、ＣｏＣｌ ₂ ・６Ｈ ₂ Ｏ、ＣｒＣｌ ₃ （無水）、ＮａＦ、ＧｅＯ ₂ 、ＫＩ、ＲｂＣｌ、ＺｒＯＣｌ ₂ ・８Ｈ ₂ Ｏ、アスコルビン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、塩化リチウム、グルコース、エチルアルコール、アラキドン酸、コレステロール、酢酸ＤＬ−α−トコフェロール、エチルアルコール１００％、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸、Ｔｗｅｅｎ ８０（登録商標）、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドからなる、明確な細胞培養処方；
    からなる群より選択される明確な細胞培養処方中、フィーダーを含まないマトリックス上で、ヒト多能性幹細胞を培養する工程を含み、前記明確な細胞培養処方中で幹細胞を培養することによって、少なくとも１０継代、細胞の多能性と、核型安定性が維持される、方法。
13. 前記明確な細胞培養処方が、ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びＩＧＦ−１からなる、請求項１２に記載の方法。
14. 前記明確な細胞培養処方が、ＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、及びアスコルビン酸からなる、請求項１２に記載の方法。
15. 前記明確な細胞培養処方が、ＭＣＤＢ−１３１、ＡｌＣｌ ₃ ・６Ｈ ₂ Ｏ、ＡｇＮＯ ₃ 、Ｂａ（Ｃ ₂ Ｈ ₃ Ｏ ₂ ） ₂ 、ＫＢｒ、ＣｄＣｌ ₂ 、ＣｏＣｌ ₂ ・６Ｈ ₂ Ｏ、ＣｒＣｌ ₃ （無水）、ＮａＦ、ＧｅＯ ₂ 、ＫＩ、ＲｂＣｌ、ＺｒＯＣｌ ₂ ・８Ｈ ₂ Ｏ、アスコルビン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、塩化リチウム、グルコース、エチルアルコール、アラキドン酸、コレステロール、酢酸ＤＬ−α−トコフェロール、エチルアルコール１００％、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックＦ−６８、ステアリン酸、Ｔｗｅｅｎ ８０（登録商標）、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−βリガンド、ｂＦＧＦ、及びＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドからなる、請求項１２に記載の方法。
16. 前記ＴＧＦ−βリガンドが、ＴＧＦ−β１である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸を含まないアルブミン、ＴＧＦ−β１、ｂＦＧＦ、及びＩＧＦ−１からなる明確な培養培地中で培養した多能性細胞のインビトロ集団であって、前記集団中の細胞の少なくとも７０％が、Ｏｃｔ４＋、ＮＡＮＯＧ＋、ＳＯＸ２＋、ＫＩ６７＋、ＦＯＸＡ２＋及びＺＦＰ４２−である、多能性細胞のインビトロ集団。
18. 前記ヒト多能性幹細胞が、ヒト胚性幹細胞である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。