KR20080056280A - 줄기 세포 분화 방법 및 치아 상태의 치료에서의 그 용도 - Google Patents

줄기 세포 분화 방법 및 치아 상태의 치료에서의 그 용도 Download PDF

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컬트 오스터
크리스티안 클라우센
클라우스 리스캐르 페데르센
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코피게네 에이/에스
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Abstract

본 발명은 포유동물 세포들의 증식 및/또는 분화 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하나이상의 치주 인대 조직, 치주 인대 조직으로부터 유래된 치주 인대 단백질 또는 인자들에 노출하거나 공동 배양하여, PDL 특징들을 갖고, 적어도 하나의 하기 특징을 만족하는 세포들을 수득하는 단계를 포함한다:
i) 인산 칼슘 침전물이 갈색에서 검은색으로 염색되는, 본 코사(Von Kossa) 방법으로 증명된 치주 특징을 나타냄,
ii) 증가된 오스테오폰틴(osteopontin) 및 오스테오칼신(osteocalcin)과 동시에 감소된 뼈의 시알로프로테인(bone sialoprotein)(뼈 시알로프로테인 II 또는 BSP)을 나타냄,
iii) 치주 조직의 복구 및/또는 재생을 위해 이식될 수 있음,
iv) 치주증, 또는 치근막염이라고 불리는 치주염을 비롯한 질환을 치아를 향한 잇몸선(gum line)의 치료에 의해 복구할 수 있음,
v) 중요한 면역 반응 또는 세포 거부 없이 숙주에 허용됨.
치주, 인대, 줄기 세포

Description

줄기 세포 분화 방법 및 치아 상태의 치료에서의 그 용도 {METHODS FOR DIFFERENTIATING STEM CELLS AND USE THEREOFIN THE TREATMENT OF DENTAL CONDITIONS}
본 발명은 분화된 포유동물 세포들을 생산하기 위한 신규한 개념 및 방법에 관한 것으로, 상기 세포들은 치주염 및 다른 치아의 상태 복구를 위해 이식될 수 있고, 세포들은 분화된 치주 인대 줄기 세포 (예컨대, PDLC) 또는 치주 인대 세포 (PDLs)와 같은 특성 및 행동양식을 가진다. PDL은 치근 백악질과 치조골을 연결시켜주고, 치주 상처 치료에 중요하다.
골수는 조혈모세포 뿐만 아니라 내피 및 중간엽 줄기 세포를 포함한 "줄기세포 보유고"의 유력한 풀(pool)이 될 수 있는 것으로 제안된다. 본 발명에 포함된 표적 영역 중 하나는 분화될 정도로 성숙한 적절한 세포를 이식대숙주 반응(graft versus host reaction)을 일으키거나 주입없이 수혈자에게 이식될 수 있는 세포 타입으로 형질전환되는 적절한 자가 세포 및/또는 적절한 동종 세포를 수득하는 것이다.
예컨대, 치주 인대 조직 또는, 치주 인대 조직으로부터 유래된 인자들, 다른 중간엽 골형성, 또는 골형성 또는 섬유모성(fibroblastic) 계통의 전구체(precursor) 및 전구세포(progenitor)와 공동 배양되는 세포들로써, 교차 분화(transdifferentiation) 예컨대, 공동 배양에 의해 형질전환될 수 있는 다른 세포 유형들은 PDL 세포들 생산자에 사용될 수 있다는 것은 생각할 수 있다.
과정들, 조성물 및 조혈모세포의 용도들은 이전에 개시되어왔다. 조혈모세포들은 골아세포들과 공동 배양(co-culturing)할 경우 성숙한 혈액 세포로 분화될 수 있다. 특히, 미국특허 5733541에 개시된 골아세포와 세포들을 공동 배양함으로써 조혈모세포의 미성숙한 형태를 유지하고 증식하는 방법이다.
골아세포(osteoblast)는 사이토카인 및/또는 조혈모세포의 비성숙한 형태를 유지하고 증식하는 미소서식환경(microenvironment)을 제공한다. 조혈모세포는 어떤 혈액 관련 질환들의 치료에 유용하고, 조혈모세포를 필요로하는 환자의 치료에 유용하다.
본 발명의 하나는 실제로 조혈모세포의 미성숙 형태를 유지하는 것이 아니라, PDL세포를 닮은 또는 유사 세포 집단의 결과를 가져오는 BSP(bone sialoprotein)의 감소된 발현을 나타내는 동시에 오스테오폰틴(osteopontin) 및 오스테오칼신(osteeocalcin)의 증가된 발현을 나타내는 것을 비롯한 특징을 갖는 중간엽 줄기세포를 수득하기 위해, 예컨대, 치주 인대 조직으로부터 유래한 치주 인대 조직 또는 인자에서 공동 배양하거나 노출에 의해 예컨대 중간엽 줄기 세포(예컨대, 제대 또는 제대혈로부터 유래된 중간엽 줄기세포를 비롯한), 골아세포 및 그 유사계통의 세포를 교차분화(transdifferentiate)하는 것이다. 그것은 치주 인대 세포 또는 치주 인대 줄기 세포보다 다른 중간엽 줄기세포에서 매우 보기드문 것이다.
다분화능 성체 전구 세포의 주입
초기 배반포(blastocyst)로 단일 다분화능 성체 전구세포(progenitor cell)를 주입한 후, 세포들은 모두 3개의 배엽으로부터 유래된 대부분의 체세포 유형에 기여하는 것으로 나타났다. 또한, 조혈모 전구 세포로부터 유래된 골수는 예컨대, McKinney-Freeman et al. (McKinney-Freeman SL, Jackson, KA, et al., PNAS USA (2002) 99:1341). McKinney-Freeman et al. (McKinney-Freeman SL, Jackson, KA, et al., PNAS USA (2002) 99:1341)에 의해 개시된 근육 조직을 비롯한 비-혈액원성 조직(non-hematogenic tissue)에 존재하는 것으로 나타났다.
골아세포-유사 세포들은 간질층(stromal layers) 내에서 관찰되고, 간질 세포주와 함께 몇몇 표현형적 특징을 공유한다 (Benayahu D et al., Calcif Tissue Int. (1992), 51:195-201; Benayahu D et al., Calcif Tissue Int. (1991), 49:202-207; Mathieu E et al., Calcif Tissue Int. (1992), 50:362-371). 예컨대, 뮤린(murine) 골수 간질 세포주 BMS2는 고 알칼린 포스파타제, 콜라겐(I) 및 오스테오폰틴을 함유한 다수의 골아세포 마커들 뿐만아니라 BSP에서의 증가들을 공유하고, 이것은 치주 인대 골수 세포 또는 치주 인대 세포들의 특징이 아니다. 또한, 오스테오칼신, 골아세포 특이적 단백질을 위한 mRNA는 BMS2 세포들, 뮤린 간질 세포주에서 검출되고 또한 BSP(bone sialoprotein) II pr 로 불리우는 BSP의 증가된 발현을 나타낸다(Dorheim MA et al., J Cell Physiol. (1993)154:317-328); Dorheim et al.에 따르면, 심지어 전지방세포(pre-adipocyte) 및 지방세포들은 이러한 골형성(osteoblastic) 특징을 나타낼 수 있다.
몇몇 간질 세포주를 이용한 일련의 실험들에서, Benayhu et al은 조사된 모든 세포 유형이 (MBA-1: 섬유아세포, MBA-2 내피-유사, MBA-13 fibroendothelial, 13F1.1 클론된 전지방세포, MBA-15 골형성의) 몇몇 골형성 특징을 가지지만, 발현의 정도에 있어서는 다르다(Benayahu D et al., Calcif Tissue Int. (1992), 51:195-201; Benayahu D et al., Calcif Tissue Int. (1991), 49:202-207)는 것을 발견했다. 재조합 인간 골형성 단백질-2(bone morphogenic protein-2)는 W-20-17 뮤린 간질 세포주에서 골형성 분화를 유도하는 것으로 나타났다; 그리고 이소성 골수(ectopic marrow) 이식 실험은 분명히 새롭게 형성된 골수 간질 및 골은 기증자로부터 유래되는 반면, 혈구는 숙주 기원인 것을 입증한다 (Reddi AH, Coll Relat Res. (1981)1:209-226; Kataoka H, Urist MR, Clin Orthop Relat Res. (1993), 286:262-270).
조혈 전구 세포들 및 골아세포 사이의 기능적 연결의 추가적인 증거는 골전구세포(osteoprogenitor cell)가 골수로부터 유래된다는 발견에 의해 제공된다. 몇몇 조사자들은 원시의 및 형질전환된 골수 간질 세포들은 이러한 세포들의 확산 챔버로의 이식 후에 생체 내에서 뼈 형성이 관찰되는 경우, 골아세포적 표현형을 얻을 수 있는 것을 입증했다 (Grigoriadis et al. J Cell Biol. (1988) 106:2139-51). 무혈청 조건에서 비부착 저밀도 골수 세포들의 시험관내(in vitro) 배양은 골 아세포-유사 세포들로 발달시킬 수 있고, 이것은 그들의 세포외 기질을 광물화할 수 있다 (Long et al., 1990 and Campbell et at., 1987).
상기 문헌은 조혈모 계통의 특별한 자극에 도움이 되는 사이토카인 및 다른 인자들의 생산에 의해 자극 세포로서의 소스(source)인 골아세포를 필수적으로 묘사한다.
본 발명의 범위는, 그러나, 동종의 기원, 성숙 또는 미성숙일 수 있는, 하지만, 바람직하게는, 탯줄 또는 제대혈의 수준보다는 계통에서 추가적으로 낮지않은 PDL 특징을 가지는 세포들 또는 PDL 세포들을 비롯한 (치주염을 비롯한) 치아 질환의 복구를 위해 처음으로 사용가능한 세포 유형을 형성하는 것이다. 실제로 예컨대, 탯줄로부터 유래한 줄기 세포 또는 골수 세포로부터와 인간 치주 인대 줄기 세포의 조합의 공동 배양에 의해 교차분화가능한 어떤 중간엽 세포이다. 또는, PDL 또는 PDLC로 사용되는 목적으로 어떤 중간엽 세포 또는 줄기 세포는 분리될 수 있고, 지치(wisdom teeth) 또는 어금니로부터의 치주 인대로부터 배양될 수 있다.
발명의 요약
일 면에서, 본 발명은 예컨대, 자가 용도를 위한, 치아로부터 직접 채취된 PDL 세포들 또는 이상적으로 구강, 더욱 특이적으로는, 치주 부분, 더욱 특이적으로는 치아의 고정 및 복구를 위한 치아 영역 및 치아의 치주 영역으로의 이식시에 거부되지 않을 중간엽 세포, 특히, 중간엽 유형의 세포 및 더욱 특이적으로 PDL 또는 PDLC로 형질전환된 세포 또는 PDL 유사 또는 PDL 세포들을 증식하기 위한 과정을 제공한다. 상기 과정은 탯줄로부터 및/또는 제대혈로부터의 중간엽 줄기 세포들과 치주 인대로부터 유래된 전구체들 또는 줄기 세포들과 공동 배양하는 것에 의해 개시될 수 있고, 적어도 HLA-DR 양성 (HLA-DR+), CD-34 음성 (CD-34 -), Lin 양성 (Lin +), Thy-1 양성 (Thy-1+), Stro-1 양성 (Stro-1 +), CD13 양성, CD44 양성, CD90 양성, CD73 양성 및 대개는 또한 CD146/MUC 18 양성 (CD146/MUC 18 +)를 비롯한 단백질 발현과 관련된 능력을 갖는 중간엽 줄기세포로 나타나는 어떤 단백질의 발현의 관점에서 조망된다. 이러한 줄기세포들 또는 전구세포(progenitor)들은 상기 세포들이 탯줄 또는 제대혈로부터 유래된 중간엽 줄기 세포 또는 전구세포이기 때문에, 수혜자에 덜 면역성일 수 있다.
본 발명의 개시
본 발명은 PDL 세포들의 특징을 갖는 포유동물 중간엽 세포주를 수득하기 위한 신규한 개념 및 방법에 관한 것이다. 수득된 세포들은 HLA-DR 양성 (HLA-DR+), CD-34 음성 (CD-34 -), Lin-1 양성 (Lin-1 +), Thy-1 양성 (Thy-1+), STRO-1 양성 (STRO-1 +), CD13 양성, CD44 양성, CD90 양성, CD73 양성일 것이고, 대개는 또한 CD146/MUC 18 양성 (CD146/MUC 18 +)일 것이다. 이 세포들은 좋게는 치주 인대 세포들이거나 미성숙 형태의 치주 인대 줄기 세포들이거나 좋게는 인간 치주 인대 줄기 세포들(hPDLCs) 형태이거나, 탯줄 좋게는 제대혈 유래 미성숙 간질 또는 중간엽 세포들일 수 있고, 예컨대, 치주 인대 조직으로부터 유래된 인자 또는 치주 인대조직과 함께 공동 배양되는 공동 배양에 의해 수득될 수 있다. 세포들은 또한 치주 인대 조직 또는 이 조직으로부터의 인자에 노출되거나 배양될 때 골원성의 기원일 수 있고, PDL 세포들의 특징을 나타낸다. 치주 인대 세포들 및/또는 치주 인대 줄기 세포들은 이론적으로는 오스테오칼신 및 오스테오폰틴의 발현, 대부분 뼈 시알로프로테인(sialoprotein)의 감소된 또는 심지어 결여된 발현에 의해 특징될 수 있고, 그렇지 않으면, 일반적으로 골원성이고 콘드로제닉(chondrogenic)한 세포 배양에서 관찰된다.
PDL 특징을 가지는 세포들은 치아 질환, 특히 치주염(periodontits)의 복구 또는 치료를 위한 용도에 적절하다.
예상할 수 있는 치주의 재생을 얻기 위해, PDL 세포들의 선택적인 부착 및 증식은 필수적이다. 이러한 유형의 세포들은 손상된 치주 인대들 (예컨대, 치주염 및 유사 질환) 모두를 복구할 수 있고, 동시에 예컨대, 뼈와 함께 섬유 조직과 연결하는 백악질을 생산하고, 치주 결함을 치료할 수 있어서, 치주염으로 인해 상실할 위험이 있는 치아의 부착을 재확립한다.
본 발명에 따르면, 이러한 PDL 세포들은, 먼저 특화된 세포들이고, 이것은 예컨대 치주염을 비롯한 상기한 복구에 사용될 수 있는 세포 배양을 위한 출발 물질일 것이다. 그것은 물론 바람직하고, 만약 이러한 세포들이 자가라면, 지치를 비롯한 치아로부터 채취된 동시에, 뽑아진 것을 의미하는 것으로, (뽑아진 것에 접하여 세포들이 즉각적으로 채취될 수 있거나 또는 예컨대 24시간 이내에 수송 배지내에 뽑아진 치아를 실험실로 보낼 수 있고, PDL 세포들은 나중에 사용하기 위해 액체 질소 탱크에 급속냉동되거나 즉각적으로 배양된다.
다른 세포들은 자가 또는 동종의 골아세포들을 비롯한 동일한 목적을 위해 사용될 수 있고, 환자의 턱뼈 다른 뼈구조물로부터 수득될 수 있다. 이러한 중간엽 전구체 세포 또는 전구 세포들은 치주염, 등을 복구하는 목적으로 또한 사용될 수 있다. 다른 그룹의 세포들, 이것들은 탯줄 또는 제대혈로부터 유래된 다분화능 중간엽 줄기 세포들로부터 유래된 것일 수 있고, 이것은 자가 세포로써 유래될(저장된 제대혈 및 출생시에 기증한 환자의 제대혈을 - 나중에- 환자의 치주염 복구에 사용될 수 있는) 수 있다. 또는 다른 개체로부터의 탯줄로부터의 다분화능 중간엽 줄기 세포들은 적은 면역원성의 경향을 나타낼 수 있고, 그러므로, 치주염 등을 복구하기 위한 "공여자" 세포들로 사용가능하다. 그러한 세포들이 사용될 때, 상기 세포들은 공동 배양 과정을 거칠 수 있는데, 상기 세포들은 PDL 특징을 얻기 위해, 상기 세포들은 하나 이상의 치주 인대 조직, 치주 인대 단백질 또는 치주 인대 조직으로부터 유래된 인자들과 함께 공동 배양되거나 노출될 수 있다.
다른 포유동물 중간엽 전구 세포들(예컨대, 성체 중간엽 전구 세포를 비롯한 다른 포유동물 중간엽 줄기 세포)과 PDL 세포들 또는 PDLC로써 작용하는데 적절한 세포들과 공동 배양할 수 있는 것은 본 발명의 범위 내에 포함된다. PDL 세포들은 또한, 본 발명에 따라, 예컨대, 탯줄 또는 제대혈로부터 유래된 줄기 세포를 비롯한, 다분화능 중간엽 줄기세포와 공동 배양될 수 있고, 이러한 방식으로, 치주염 등의 복구에 사용하기 위한 적절한 공동 배양된 세포들을 얻을 수 있다.
치주 인대 줄기 세포 집단을 얻기 위해, 치주 인대 조직, 치주 인대 조직으로부터의 치주 인대 단백질, 또는 인자를 존재하는 치주 세포들이 있거나 없거나 중간엽 줄기 세포들과 공동 배양할 수 있거나, 치주 인대 조직에서 생존가능한 세포들의 존재를 먼저 제거하는 것에 의해 채취되고 중간엽 세포들이 PDL 세포들로 분화 또는 교차분화되도록 배양되어야 하는 배양 배지에 첨가된다. 배양은 짧은 기간동안 치주 인대 조직 또는 단백질에 세포를 노출하는 것부터, 충분한 양의 세포들이 얻어질 때까지 몇주를 지속하는 적어도 치주 인대 조직, 치주 인대 단백질 또는 그로부터의 인자를 포함하는 배양 배지에서 세포 배양의 완전한 증식(expansion)에 이르는 것으로 예견된다. 이 세포 배양 방법론은 탯줄 및/또는 제대혈로부터 유래된 중간엽 줄기 세포들에 사용될 수 있다. 그리하여 탯줄 또는 제대혈로부터 유래한 중간엽 줄기 세포들은 치주 인대 조직, 치주 인대 단백질 및/또는 그로부터 유래된 인자와 함께 치주 인대 유사 특징을 얻기 위한 중간엽 줄기 세포를 유도할 수 있고, 그리하여 치주 조직의 복구 및 재생을 위한 임상 적용에서 스캐폴드 있거나 또는 없이 세포 임플란트(implant)로써 이용가능하다.
출발 물질- 포유동물 중간엽 세포들
PDL 세포들 뿐만 아니라 상기한 조합의 중간엽 줄기- 또는 전구체 세포들은 치주 인대로부터 유래된 인자 또는 치주 인대 조직과 공동 배양 및/또는 그 세포들에 노출하는 것에 의해 PDL 또는 PDLC로 분화될 수 있고, 이것은 전구체 세포들을 유도할 수 있고, 탈분화된(de-differentiating) 것들로부터 PDL을 비롯한 세포들을 유지할 수 있다.
본 발명의 범위 내에서 상기한 세포 유형들은 치주 인대로부터 유래된 인자 또는 치주 인대 조직과 공동 배양 및/또는 그 세포들에 노출하는 경우, PDL 또는 PDLC 로 분화되거나 교차분화될 수 있다-또는, 사실 ar PDL로 시작하면, 그것들은탈분화(de-differentiate)될 수 없다. 동일한 채취된 치주 인대 또는 그 조직으로 부터 유래된 인자들은 배지에 사용될 때, 탯줄로부터 유래된 중간엽 줄기 세포들을 공동배양하기 위한 배지를 이용할 경우, PDL 또는 PDL과 동일한 능력을 가지는 세포들이 될 수 있고, 그것들을 치주염 등의 치료를 위해 사용할 수 있게 한다.
상기한 방법을 이용하여, 본 발명자들이 골아세포 또는 골형성 세포들의 전구세포(progenitor)을 배양할 수 있고, 예컨대, 포유동물로부터 예컨대 뼈로부터, 특히 환자의 생애 나중에 치주염의 치료를 위해 PDL 또는 PDL 양식을 갖는 세포들로 발달되는 환자로부터 수득된 뼈 구조물로 부터 생체검사(biopsies)의 외식편에 의해 수득되는 것으로, PDL의 초대 배양에 아무런 접근을 하지 못할 때에 자가 세포 임플란테이션 방법론을 활용하는 방식이라는 것을 의미한다.
PDL 의 유도자(inducer)로써의 세포 배양 배지 내에서 사용된 치주 인대 조직들
치주 인대 조직의 소스( source )
치주 인대 조직, 치주 인대 단백질 및/또는 치주인대로부터 유래한 인자들의 원천은 자가, 동종(allogeneic) 또는 이종(xenogenic) 근원일 수 있다 (예컨대, 돼지 치아로부터 떼어내거나 추출하는). 그러나, 치주 인대로부터의 세포들, 치주 인대 또는 인자들의 처리(processing)는 채취되고, 처리되어야 하는 반면, 조직은 여전히 생존가능하고 배양된 PDL 또는 PDLC, 또는 자신을 PDL 또는 PDLC로 발현하는 세포들을 수득하고 가능하게는 유지하는데 필요한 필수성분들 중 어느 것의 분해를 거치치 않는 것으로 예견된다. 치주 조직을 다루기 위한 제안은 "치주 조직의 채취 및 보존" 하에 기재된다.
질문에서 배양된 세포들에서 "PDL 효과"를 유도하기 위해 배양 배지에서 사용될 수 있는 치주 인대는 예컨대 지치로부터 또는 어금니로부터 채취될 수 있다. 그래서, 치주 인대는 치주 인대에서 이미 조합된 PDL 세포들과 함께 채취될 수 있거나, 치주 인대 조직은 이러한 세포들이 고갈될 수 있거나 치주 인대 조직으로 구성되거나 PDL 세포 배양에서 또는 PDL이 되는 상기에서 설명한 다른 중간엽 세포들을 교차분화하는 시도에서 장래에 사용되기 위한 치주 인대 조직으로부터 유래된 인자들일 수 있다.
"치주 인대 조직", 이것은 본 발명에 따르면, PDL 세포 배양 또는 중간엽 세포 배양 (PDL 세포들로 사용되도록 의도된)에 첨가되기 위한 유도 혼합물로써 정의된다. 이것은 급속 동결되어(예컨대, 질소 탱크에서) 저장되거나, 사용되고, 그것은, PDL 또는 PDLC이 되는 또는 닮기 위해 다른 선택된 세포들을 분화 또는 교차분화할 뿐만 아니라 탈분화(de-differentiation)로부터 다른 비PDL 세포들까지 PDL 세포들을 유지하기 위한 목적으로 세포들이 배양되는 적절한 성장 배지(배양 배지)와 함께 직접 혼합되어 사용될 수 있다. 치주 인대 조직 또는 치주 인대로부터의 인자를 함유하는 상기 배지 조성물은 따라서 성장 배지로써 사용될 수 있고, 이것은 PDL 세포들을 유지시킬 수 있고 그리하여 탈분화 또는 세포 "드리프팅(drifting)"을 피할 것이다.
이전에 기재된 것처럼, 이러한 치주인대 조직 (예컨대, 세포로부터 고갈된)은 회수되고, 특징화(characterize)되고, 모아(pool)지며, 또는 치주 인대 세포 또는 그 형태의 전구체 세포로 특징화될 수 있는 상기 세포 집단을 가져오는 PDL 세포 특징을 유도하기 위해 중간엽 세포를 배양하기 위한 배양 배지와 함께 사용될 수 있다. 치주 인대 조직의 유도 사용에 의해 중간엽 세포로부터 예컨대 분화에 의해 수득된 PDL 세포 특징들은 상기 PDL 또는 PDL 유사 세포들이 오스테오폰틴 및 오스테오칼신의 증가된 발현과 뼈 시알로프로테인 II라 불리우는 뼈 시알로프로테인의 감소된 발현 (감소된 BSP 발현)을 나타낼 것이다.
치주 조직의 채취( harvest ) 및 보존
치주 인대 세포들처럼 행동할 수 있는 세포들 또는 치주 인대 세포들을 생산하기 위해 중간엽 세포들의 도입, 교차분화 또는 형질전환에 필요할 수 있는 상당한 양의 치주 조직을 활용하기 위해, 살아있는 추출된 치아의 세포들(예컨대, 다양한 치과 임상에서 회수된 추출된 지치)을 유지하고, 분리로부터 추출된 치아로부터의 치주 조직을 유지하고, 대개는 추출된 치아가 살아있는 상태로 유지되고, 미생물 오염을 방지(미생물 오염은 가능한한 무균 방법에 의해 최소한이 되도록 유지하고, 충분한 양의 항생제 및 항진균제를 저장에 사용되는 배양 또는 수송 배지에 첨가한다)하기 위해 무균 상태로 보관될 수 있는 것을 의미하는 로지스틱(logistic) 시스템을 준비하는 것이 필요하다. Sigalas et al.은 최근 추출된 살아있는 치아의 세포들을 유지하는 방법을 시험했다. 추출된 치아를 위한 가능한 저장 배지로써 많은 용액들이 조사되어 왔다. Sigalas et al.은 인간 치주 인대 (PDL) 세포들이 배양 배지, 우유, Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), Soft Wear, Opti Free, 및 Solo Care 콘택트 렌즈 솔루션, 게토레이드(Gatorade) 및 탭 워터(tap water)에 실온(room temperature) 및 얼음에서 1시간동안 노출한 경우를 최근 보고했다. 살아있는 세포들 수는 트립판 블루 익스클루젼(exclusion) 기술을 이용하여 노출(0h) 즉시 및 24시간, 48시간 후에 계수하였고, 세포들의 증식능은 처리후에 시험하였다 (Sigalas E, Regan JD et al. Dent. Traumatol. (2004) 20:21-28). 이 연구는 HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)가 떼어진 치아에 최적 저장 배지라는 것을 밝혔다. 치주 인대 조직의 첨가가 있거나 없는 많은 다른 형태의 배양 배지가 처음부터 존재하고, 가장 대개는 혈청 단백질을 포함한다는 것을 고려해볼 수 있다. 치아, 치주 인대관련된 세포들 또는 치주 인대 조직은 질소 탱크에서 급속냉동될 수 있다.
세포들이 PDL 세포들로 분화되지 않거나 또는 PDL 세포들이 뼈 시알로프로테인 (또는 뼈 시알로프로테인 II 또는 BSP)으로 드리프트(drift)되거나 탈분화되는 것이 증가한다는 것을 확립해주는 방식은 배양된 세포들이 사실 골아세포이고, PDL 세포들이 아니라는 것을 입증해준다. 실제로, 시알로프로테인 II 또는 BSP가 확인될 수 있는 때(또는 증가되는 것으로 나타날때), PDL 세포 배양은 골형성 세포들(예컨대, 골아세포 및 비(non) PDL- 또는 비(non) PDLC- 분화된 중간엽 줄기세포((Fisher LW, McBride OW, et al. J. Biol. Chemistry (1990), 265:2347-2351)로 변화되는 것을 알 수 있다. 이 유전자에 의해 코딩되는 BSP 단백질은 뼈 기질의 주요한 구조적 단백질이다. 그것은 인간 뼈에서 비 콜라겐성 단백질의 약 12%를 구성하고, 비대성의(hypertrophic) 콘드로사이트, 골아세포, 골세포(osteocyte), 및 파골eob대포(osteoclast)를 함유하는 골격 관련 세포 유형에 의해 합성된다. 이 단백질은 그것의 산성 아미노산 클러스터를 통해 칼슘 및 히드록시아파티트와 결합되고, 비트로넥틴 수용체를 인식하는 RGD 서열을 통해 세포 부착을 조절한다. BSP 유전자는 또한 유전자ID: 3381로 확인되고, 인테그린-결합 시알로프로테인(뼈 시알로프로테인, 또한, 뼈 시알로프로테인 II, 줄여서 IBSP)를 발현한다.
우리는 이전에 Affymetrix Gene Chip analysis에 의해 비트로넥틴(vitronectin) 수용체의 발현이 또한 골관절염 환자 및 비골관절염 환자들(own observation) 모두의 콘드로사이트에서 존재하는 것을 발견하였다. 그러나, 이러한 발현은 아직 PDL 또는 PDLC로 시험되지 않았다.
치주 복구 및/또는 치아의(dental) 복구를 위해 임플란트된 세포들은 자가 중간엽 줄기 세포들, 예컨대, 치주 영역 또는 치주 인대로부터 줄기세포 또는 전구체(precursor)로써 채취된 전구체 세포들 또는 전구세포(progenitor)일 수 있고, 또는 심지어 턱뼈 생체검사법(biopsies)으로부터 유래된 중간엽 세포는 치주 인대 조직에 노출될 때 PDL로 분화될 수 있다는 것은 본 발명의 범위 내이다. 그러므로, 우리는 이론적으로 및 실제 사용에서 실제로 PDL 세포들을 생산하기 위해 중간엽 세포들 또는 골아세포 또는 그 전구체들을 증식하는 외식편(explant) 배양 기술을 사용할 수 있다. 이러한 PDL 세포들은 치주염 등을 복구하기 위해 환자 내에 임플란테이션(implantation)용으로 사용될 수 있다.
이러한 세포들은 추가적으로 포유동물 중간엽 세포들로 분화되는 것을 기대할 수 있고, 이것은 다소 복잡한 과정에 포함될 수 있으며, 포유동물 중간엽 세포주를 닮은 세포 동일성(identity)을 생산하고, 이 세포들은 적어도 HLA-DR 양성 (HLA-DR+), CD-34 음성 (CD-34 -), Lin-1 양성 (Lin-1 +), Thy-1 양성 (Thy-1+) 및 Stro-1 양성 (Stro-1 +), CD13 양성, CD44 양성, CD90 양성, CD73 양성 그리고, 가능하게는, 다른 단백질, CD146/MUC18 양성, 그러나 CD31 (조혈모세포 마커) 음성인 것을 유지하는 것에 의해 확인될 수 있다.
세포사멸이거나 세포사멸을 유도하는 것이 아니고, 이식될 때, 불사화세포주로 변화하는 것 없이, "이식대숙주" (GVH) 거부를 생산하거나 이식(transplant)된 또는 임플란트된 세포들의 거부를 일으키는 것 없이 인간을 포함한 포유동물들에 이식될 수 있는 하나 또는 몇몇 포유동물 세포 형태에 도달하는 것은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
예컨대 관절에 임플란테이션을 위한 배아 중간엽 줄기 세포를 사용할 때, 연골 또는 O.A. 복구용 방법을 발달시키는 시도로, 그러한 배아 중간엽 줄기세포와 함께하는 임플란테이션은 이러한 세포들이 실험하에서 SCID 마우스의 중요한 양으로 테라토마(teratomas)으로써 나타나는 불사화된 양식으로 혼합된 내배엽, 중배엽, 외배엽 세포들로 분화되는 동안에 형질전환의 기능을 유지할 수 있다는 것을 밝혔고, 여기서 상기 배아 줄기 세포들은 실제로, 더 많은 미성숙 세포들이 사용되는 경우, 예컨대, 치주 인대 세포들을 생산할 목적으로, 그러한 교차분화가 실제로, 예컨대, 테라토마와 같은 종양을 생산할 수 있다는 이유로, 배아 줄기 세포 대신에 탯줄 또는 제대혈로부터 중간엽 줄기세포를 사용하는 것을 권할 수 있다는 것을 가리키는, 불사화된 테라토마들( Wakitani S, Takaoka K, Hattori T, Miyazawa N, Iwanaga T, Takeda S, Watanabe TK and Tanigami A, Rheumatology (2003), 42:162-165)을 유도하는 것이다.
성체 동종 이식 내에 인간 제대혈(UCB)의 증가된 이용을 위한 주요 제한적 요소들 중 하나는 회수되고 주입될 수 있는 적은 수의 전구 세포들이다. UCB의 생체 외(ex vivo) 증식(expansion)은 이러한 제한을 극복하는데 도움을 준다. UCB 세포들의 배양이 또한 모계(maternal) 세포 오염의 공동-증식(co-expension)을 가져와서, 세포 주입의 증가된 빈도를 가져오는 이식 특징을 바꾸는 것인지는 아직 관찰되지 않았으나, 제대혈로부터의 중간엽 줄기 세포를 사용할 경우 고려되어야만 한다.
이것은 예컨대, 줄기세포 인자(SCF), flt-3L, Il-3, IL-6, EPO 및 G-CSF을 함유하는 표준 배지에서 단핵 세포들 (MNC)의 배양 개시에 의해, UCB 세포들을 비롯한 중간엽 줄기 세포들을 분리하는 방법을 조사하는 것에 의해 연구될 수 있다. 모계(maternal) 세포의 오염 질문에 답하기 위해, 동시에 X 및 Y 염색체의 소위 간기(interphase) FISH 분석을 동시에 수행할 수 있다. 남성(XY) 탯줄 샘플은 모계 (XX) 세포를 위해 0일와 배양 동안에 몇몇 시점에서 조사될 수 있다.
PDL 세포들을 수득하기 위한 방법
포유동물 중간엽 세포들, UC 또는 UCB 세포들을 함유한 동종 포유동물 중간엽 세포들, 자가 포유동물 중간엽 세포들, 자가 포유동물 골아세포들 또는 골아세포의 전구체/전구인자는 하나 이상의 치주 인대 조직, 치주 인대 단백질 또는 치주 인대 조직으로부터 유래된 인자와 함께 배양될 수 있다. 이러한 세포들은 체크되고, CD13, CD44, CD90, Cd73 및 CD31에 대하여 콘쥬게이트된 모노클로날 항체를 이용하여 플로우 사이토미트리에서 분석된다. CD13, CD44, CD90, CD73를 비롯한 마커들은 모두 중간엽 줄기 세포 마커들로 생각되는 반면, CD31은 조혈모세포 마커로 생각된다. hPDLC는 모든 4개의 줄기 세포 마커에 대해 양성인 반면, CD31에 대하여 음성인 것으로 입증되었다.
치주 인대 조직이 전개된다면, 이 조직은 먼저 예컨대, 실시예 1 또는 6에 기재된 적절한 배지를 이용하여 배양될 수 있다. 성장 배지는 규칙적으로, 예컨대, 전체 배양기간에서 3-4일을 비롯한 1-5일마다 변화시킨다. 시간이 경과한 후에 (보통 8-11일) 세포들 (hPDLC)은 인대로부터 이동하고, 충분한 콘플루언트(confluent)가 되면, 세포들은 예컨대, 트립신/EDTA 처리와 유사한 효소적 처리를 이용하여 채취된다.
포유동물 세포들 및 hPDLC 세포들은 적절한 배양 접시에서 배양되고, 37℃, 5% CO2에서 성장 배지 (예컨대, DMEM/F12, 16% FCS 함유, 아스코르브산, 젠타마이신 및 펀지존(fungizone)이 공급된다. 성장 배지는 전체 배양 기간동안 3-4일에 한번씩 변화시켰다.
8-11일 후에 세포들(hPDLC라고 불리는)은 치주 인대의 작은 조각들로부터 이동한다. 배양이 70-80% 콘플루언트 (약 3주)된 때, 세포들은 트립신/EDTA 처리를 이용하여 분리하였고, 하기 기재된 실험을 위해 사용되었다.
또한, 포유동물 세포들은 FCS 및 상기 기재된 다른 구성성분들을 포함한 상기 기재된 DMEM/F12에서 적절한 배양 접시에서 전 배양 기간 동안 3-4일에 한번씩 배지 변화를 주며 배양될 수 있고, 11일 이상 지난후에, 예컨대, 치주 인대 단백질과 같은 그러한 인자들은 세포 내에서 유도인자로써 첨가될 수 있고, 이것들은 PDL로 분화되는 것을 시도할 수 있다.
스캐폴드
다양한 생분해성 스캐폴드상에 배양된 뼈 세포들 또는 골원성의 세포들은 이식(transplantaion) 또는 임플란테이션(implantation) 동안에 그들을 고정하게 할 때, 스캐폴드와 상기 세포들 사이에 상호작용을 형성할 수 있다. 이것은 다른 것들 중에 PLGA 스캐폴드를 비롯한 다양한 흡수성(bioresorbable) 폴리머의 사용에 의해 성취될 수 있다.
다양한 유형의 스캐폴드들은 시험될 것이고, 치주 인대 줄기 세포들 또는 중간엽 줄기 세포들 및/또는 치주 인대를 위해 성공적으로 사용가능할 수 있고, 이것은 치주 인대 조직으로써 사용되도록 유도된다.
이식되는 세포들은 예컨대, 히드록실 아파타이트(apatite) 담체를 비롯한 스캐폴드와 함께 이식될 수 있고, 이것은 치주 인대 그리고 심지어 백악질 뿐만 아니라 샤페이 섬유(sharpey's fiber)와 닮은 섬유 구조를 생산하는 것을 증가시키고, 이것은 치아를 자리에 유지하는 동안 백악질과 뼈 사이에 삽입된다.
치주염의 치료를 위해 이식된( transplanted ) 또는 임플란트된 ( implanted ) 세포들의 용도
분화된 또는 교차분화된 세포들의 목적 중 하나는 예컨대, 망가진 치주 조직, 다른 것들 중에서 "치주염"을 일으키는 것을 치료하기 위해 사용될 수 있는 세포 또는 조직을 발달시키는 것이다. 치주염으로 불리는 경구 질환은 일반적으로 치은염 또는 급성 치은염으로 진단되는, 예컨대 잇몸 선에서 미생물 (예컨대, 박테리아, 곰팡이) 감염에 의해 유도되는 감염으로써 시작한다. 감염의 유형은 먼저 무해해 보이지만, 시간이 지나면, 감염은 구강에 필수적인 조직, 특히 치조골과 치아를 연결하는 (백악질과 함께) 치주 인대의 괴사를 가져온다. 괴사(necrosis)는, 골세포에 의해 야기되는 뼈 조직 부식의 활성 뿐만 아니라 예컨데 콜라게네이즈를 비롯한 조직 파괴 효소의 증가된 합성에 의해서 다른 것 중에서 일어난다. 이러한 과정들은 그러한 조직 구조들을 파괴할 수 있고, 이것은 위턱 및 아래턱에서 뼈에 고정된 치아들을 보통 유지시켜준다 (도 1 참고).
방법들은 가능하게는 스캐폴드와 함께, 세포 임플렌테이션(implentation) 복구를 위해 상당하게 치주염의 치료를 바꿀 수 있다.
건강한 치주 조직에서 뼈 구조(치조골)에서 치아의 뿌리는 정확하게 "그 구멍(pocket)"에 딱 맞는다 (도 1 참조). 치아는 치주 인대에 의해 시험관 내에서 유지된다.
치주염동안, 치주 인대는 실제로 영향을 받고, 도 2에 나타난 바와 같이 치아 유리(loosening)로 이어진다.
세포 치료는 따라서, 예컨대 상기에서 설명한 바와 같이 치주 인대 또는 그 유도물에 노출되거나 공동배양에 의해 또는 예컨대, 전구세포 또는 전구체세포들로써 중간엽 줄기 세포 집단과 뼈 세포들을 조합하는 것에 의해 수득될 수 있고, 예컨대 세포 거부 또는 자가 유래로써 반응이 일어나는 경향이 적고 그래서 거부 증거가 나타나지 않는 동종 세포들로써 예컨대 탯줄 또는 제대혈로부터 유래된 예를 들어 중간엽 다분화능 줄기세포를 비롯한 중간엽 줄기 세포들과 조합가능할 수 있는, PDL 및 PDLC를 비롯한 다른 유형의 중간엽 줄기 세포들일 수 있는 예컨대 PDL 및/또는 PDLC를 비롯한 세포들의 생체 외 세포 배양에 기초할 수 있다. 자가 중간엽 세포들은 골형성 기원 또는 섬유아세포성 기원, 또는 분화하는 중간엽 세포로부터 수득할 수 있는 어떤 종류의 세포들로 될 수 있다.
적절한 스캐폴드와 함께 이식되는 세포를 조합하는 것도 본 발명의 범위 포함되며, 그리하여 적용의 특정 영역을 위해 의도된 생산물을 맞추고 형상(shape)할 수 있으며, 심지어 이식된 세포를 포함하고, 그 기능을 유지하고, 감염에 대하여 보호하고, 구강 내에 원치않는 영역으로 성장하는 것으로부터 세포를 제한할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예
1. 포유동물 중간엽 세포 증식 과정으로, 상기 세포를 치주 인대 조직, 치주 인대 조직으로부터 유래된 치주 인대 단백질 또는 인자에 노출하거나 공동배양하고,
a. 치주 특징을 얻음
b. 증가된 오스테오폰틴(osteopontin) 및 오스테오칼신(osteocalcin)과 뼈 시알로프로테인 II 또는 BSP라고 불리는 뼈 시알로프로테인(bone sialoprotein)의 감소를 나타냄
c. 치주 조직의 복구 및/또는 재생을 위해 이식될 수 있음
d. 치주증이라고 불리는 치주염을 비롯한 질환을 복구할 수 있음
e. 중요한 면역 반응 또는 세포 거부 없이 숙주에 허용됨
을 위해 이러한 인자들에 의해 유도되는 것인 과정.
2. 탯줄 및/또는 제대혈로부터 유래된 동종 포유동물 중간엽 세포의 증식 과정으로, 상기 세포를 치주 인대 조직, 치주 인대 조직으로부터 유래된 치주 인대 단백질 또는 인자에 노출하거나 공동배양하고,
a. 치주 특징을 얻음
b. 증가된 오스테오폰틴(osteopontin) 및 오스테오칼신(osteocalcin)과 뼈 시알로프로테인(bone sialoprotein)의 감소를 나타냄
c. 치주 조직의 복구 및/또는 재생을 위해 이식될 수 있음
d. 치주증이라고 불리는 치주염을 비롯한 질환을 복구할 수 있음
e. 중요한 면역 반응 또는 세포 거부 없이 숙주에 허용됨
을 위해 이러한 인자들에 의해 유도되는 것인 과정.
3. 자가 중간엽 세포의 증식 과정으로, 상기 세포를 치주 인대 조직, 치주 인대 조직으로부터 유래된 치주 인대 단백질 또는 인자에 노출하거나 공동배양하고,
a. 치주 특징을 얻음
b. 증가된 오스테오폰틴(osteopontin) 및 오스테오칼신(osteocalcin)과 뼈 시알로프로테인(bone sialoprotein)의 감소를 나타냄
c. 치주 조직의 복구 및/또는 재생을 위해 이식될 수 있음
d. 치주증이라고 불리는 치주염을 비롯한 질환을 복구할 수 있음
e. 중요한 면역 반응 또는 세포 거부 없이 숙주에 허용됨
을 위해 이러한 인자들에 의해 유도되는 것인 과정.
4. 자가 골아세포 또는 전구체(precursor)/전구(progenitor) 세포 증식 과정으로, 상기 세포를 치주 인대 조직, 치주 인대 조직으로부터 유래된 치주 인대 단백질 또는 인자에 노출하거나 공동배양하고,
a. 치주 특징을 얻음
b. 증가된 오스테오폰틴(osteopontin) 및 오스테오칼신(osteocalcin)과 뼈 시알로프로테인(bone sialoprotein)의 감소를 나타냄
c. 치주 조직의 복구 및/또는 재생을 위해 이식될 수 있음
d. 치주증이라고 불리는 치주염을 비롯한 질환을 복구할 수 있음
e. 중요한 면역 반응 또는 세포 거부 없이 숙주에 허용됨.
을 위해 이러한 인자들에 의해 유도되는 것인 과정.
5. 제1-4항목(item)에 기재된 세포 증식 과정이고, 남아있는 치주 인대 직접 아래에 주사되는 과정.
6. 시험관 내에서 치주 인대로 직접 자가 중간엽 세포들이 주사되고, 그것에 의해 시험관 내에서 교차분화할 수 있는 자가 중간엽 세포 증식 과정.
7. 포유동물 세포들의 미성숙 형태를 유지하고 증식하는 과정으로, HLA-DR 양성 (HLA-DR+), Lin 양성 (Lin +), Thy-1 양성 (Thy-1+), Stro-1 양성 (Stro-1 +), CD-13 양성, CD-44 양성, CD-90 양성, CD-73 양성 그리고, 가능하게 CD146/MUC 18 양성인 것으로 정의되는 상기 미성숙 형태는
a. 탯줄로부터의 포유동물 중간엽 줄기 세포들과 공동 배양될 수 있음
b. 제대혈로부터의 포유동물 중간엽 줄기 세포들과 공동 배양될 수 있음
c. 치주 조직의 복구 및/또는 재생을 위해 이식될 수 있음
d. 치주증이라고 불리는 치주염을 비롯한 질환을 복구할 수 있음
e. 중요한 면역 반응 또는 세포 거부 없이 숙주에 허용됨
인 것인 과정.
8. 포유동물 세포들의 미성숙 형태를 유지하고 증식하는 과정으로, HLA-DR 양성 (HLA-DR+), CD-34 음성 (CD-34 -), Lin 양성 (Lin +), Thy-1 양성 (Thy-1+), Stro-1 양성 (Stro-1 +), CD-13 양성, CD-44 양성, CD-90 양성, CD-73 양성 그리고, 가능하게 CD146/MUC 18 양성으로 정의되는 상기 미성숙 형태는
a. 탯줄로부터의 포유동물 중간엽 줄기 세포들과 공동 배양될 수 있음
b. 제대혈로부터의 포유동물 중간엽 줄기 세포들과 공동 배양될 수 있음
c. 치주 조직의 복구 및/또는 재생을 위해 이식될 수 있음
d. 치주증이라고 불리는 치주염을 비롯한 질환을 복구할 수 있음
e. 중요한 면역 반응 또는 세포 거부 없이 숙주에 허용됨
인 것인 과정.
9. 자가 또는 동종 공여자로부터 골수 세포 또는 그 군집으로부터 유래된 포유동물 세포들과 공동 배양할 수 있는 것으로, 치주 인대 조직, 치주 인대 조직으로부터 유래된 치주 인대 단백질 또는 인자에 노출된 또는 공동배양되고,
a. 치주 특징을 얻음
b. 증가된 오스테오폰틴(osteopontin) 및 오스테오칼신(osteocalcin)과 뼈 시알로프로테인 (bone sialoprotein)의 감소를 나타냄
c. 치주 조직의 복구 및/또는 재생을 위해 이식될 수 있음
d. 치주 조직의 복구 및/또는 재생을 위해 이식될 수 있음
e. 치주증이라고 불리는 치주염을 비롯한 질환을 복구할 수 있음
f. 중요한 면역 반응 또는 세포 거부 없이 숙주에 허용됨
을 위해 상기 인자들에 의해 유도되는 것이다.
10. 포유동물 세포들의 미성숙 형태를 유지하고 증식하는 과정으로, 상기 미성숙 형태는 HLA-DR 양성 (HLA-DR+), Lin 양성 (Lin +), Thy-1 양성 (Thy-1+), Stro-1 양성 (Stro-1 +), CD-13 양성, CD-44 양성, CD-90 양성, CD-73 양성 그리고, 가능하게 CD146/MUC 18 양성으로 정의되고, 상기 과정은,
a. 탯줄로부터의 포유동물 중간엽 줄기 세포들과 공동 배양될 수 있음
b. 제대혈로부터의 포유동물 중간엽 줄기 세포들과 공동 배양될 수 있음
c. 치주 조직의 복구 및/또는 재생을 위해 이식될 수 있음
d. 치주증이라고 불리는 치주염을 비롯한 질환을 복구할 수 있음
e. 중요한 면역 반응 또는 세포 거부 없이 숙주에 허용됨
일 수 있는 포유동물 치주 인대 세포들의 동일성(identity)의 일부를 포함하는 것인 과정.
11. 상기 1 및 2에서 기재된 것처럼 처리되고, HLA-DR 양성 (HLA-DR+), Lin 양성 (Lin +), Thy-1 양성 (Thy-1+), Stro-1 양성 (Stro-1 +), CD-13 양성, CD-44 양성, CD-90 양성, CD-73 양성 그리고, 가능하게 CD146/MUC 18 양성으로 정의되는 결과로써 나타나는 집단은 포유동물 내에
a. 거부없이 그들의 구강(oral cavity)내로
b. 거부없이 치주 영역 내로
c. 거부없이 치아(dental) 결손내로
이식가능한 것인 집단.
12. 상기 1 및 2에서 기재된 것처럼 처리되고, HLA-DR 양성 (HLA-DR+), Lin 양성 (Lin +), Thy-1 양성 (Thy-1+), Stro-1 양성 (Stro-1 +), CD-13 양성, CD-44 양성, CD-90 양성, CD-73 양성 그리고, 가능하게 CD146/MUC 18 양성으로 정의되는 결과로써 나타나는 집단은 포유동물 내에
d. 거부없이 그들의 구강(oral cavity)내로
e. 거부없이 치주 영역 내로
f. 거부없이 치아(dental) 결손내로
이식가능한 것인 집단.
13. 세포 및 스캐폴드의 조합을 이용한 제1 내지 11항목에서 기재된 세포의 이식하는 방법.
14. a. 거부없이 구강(oral cavity)내로
b. 거부없이 치주 영역 내로
c. 거부없이 치아(dental) 결손내로
이식가능한 포유동물 자가 치주 인대 양성 세포들 (줄기 세포들)의 증식 방법
15. 세포 및 스캐폴드의 조합을 이용한 상기 청구항에서 기재된 것과 같은 세포의 이식 방법.
16. 세포가 분화가능하게 하는, 자가, 동종 및/또는 이종 소스(source)로부터의 치주 인대 또는 그 추출물의 용도.
17. 세포들이 치주 세포들, 치주 줄기 세포들 및/또는 치주 양식(behavior)을 발현하는 세포들로 분화 가능하게 하는, 자가, 동종 및/또는 이종 소스(source)로부터의 치주 인대 또는 그 추출물의 용도.
도 1. 그 소켓(socket) 내에 놓여진 치아의 그림.
도 2. 치은염(gingivitis)("1" 참고)이라 불리는 부드러운 형태로 시작하는 턱뼈와 치아 사이에 부착의 손실에 의해 특징되는 잇몸의 만성 감염, 치주염.
도 3. hPDLC의 서브콘플루언트(subconfluent) 배양을 나타낸 것이다. 세포가 70% 콘플루언트할 때, 그것들은 트립신화된다.
도 4. 샘플을 Beckman Coulter Epics XL 플로우 사이토미터로 분석하였다. 죽은 세포들 및 잔해물은 포워드(forward)- 및 -사이드스캐터(sidescatter) 게이팅(gating)에 의해 분석에서 배제되었다.
도 5. 세포들은 알칼린 포스파타제 활성으로 염색되었고, 특이적 염색 프로토콜을 이용하여 연구되었으며, 골형성(osteogenic) 분화는 이 도에 나타나있다.
본 발명은 다음의 비제한적인 실시예들에서 설명된다.
실시예 1
hPDLC 배양
인간 제3 구치(third molar)들을 페트리 디쉬에 두고, 상기 구치들에 2ml 성장 배지 (16% FCS, 젠타마이신, 아스코르브산 및 펀지존 함유 DMEM/F12)를 가하였다.
치주 인대는 무균 외과용 메스(scalpel)로 치근 표면으로부터 부드럽게 분리되고, 조직은 새로운 페트리 디쉬에 옮겨졌다.
2 ml 성장 배지는 상기 치주 인대 조직에 가하였고, 무균 외과용 메스로 작은 외식편(explant)이 생성되었다.
치주 인대 조직으로부터의 외식편은 성장 배지가 포함된 75 cm2 배양 플라스크에 옮겨졌고, 37℃ CO2 배양기에서 배양되었다. 외식편은 초대 세포 배양으로부터 분리된 군집 형성 유닛에서 세포 배양물을 생산한다.
실시예 2
표면 마커 발현
초대 배양으로부터의 hPDLC (E1P0) (외식편으로부터 최초로 자라나온 세포들의 초기 CFU로 정의되는, 아직 계대되지 않은)은 CD13, CD44, CD90, CD73 및 CD31에 대한 콘쥬게이트된 모노클로날 항체를 이용하여 플로우 사이토미트리에서 분석되었다.
CD13, CD44, CD90, CD73은 모두 중간엽 줄기 세포 마커들인 반면, CD31은 조혈(haematopoietic) 마커로 고려된다.
hPDLC는 모든 4개의 줄기 세포 마커들에 양성인 반면, CD31에 대해서는 음성인 것으로 입증되었다.
이것은 hPDLC 집단이 중간엽 전구 세포들로 구성되어 있음을 제안하는 것이다.
실시예 3
골형성 분화(유전자 발현)
hPDLC는 6-웰 플레이트에 씨드(seed)되고, 배지를 일반 성장 배지에서 골형성 배지(10% FCS, 아스코르브산, 10-7 M 덱사메타손, 8 mM □-글리세로포스페이트(Glycerophosphate) 함유 DMEM/F12)로 바꿔줌으로써 골형성 경로를 따라 분화하도록 유도되었다.
대조군으로써, hPDLC는 10% FCS를 포함하는 일반 성장 배지에서 배양되었다.
배양 14일후에, hPDLC는 PBS에서 세척되고, RNA는 유도된 배양 및 대조군 배양물로부터 분리되었다.
RT-PCR를 이용하여, 알칼라인 포스파타제(ALP), 콜라겐 1 (Col1) 및 오스테오칼신(OC)dml 발현이 측정되었다.
실시예 4
골형성 분화(조직화학적( histochmical ) 분석)
hPDLC는 6-웰 플레이트에 씨드되고, 배지를 일반 성장 배지에서 골형성 배지(10% FCS, 아스코르브산, 10-7 M 덱사메타손, 8 mM □-글리세로포스페이트(Glycerophosphate) 함유 DMEM/F12)로 바꿔줌으로써 골형성 경로를 따라 분화하도록 유도되었다. 대조군으로써, hPDLC는 10% FCS를 포함하는 일반 성장 배지에서 배양되었다.
배양 14일후에, hPDLC는 PBS에서 한번 세척된 다음, 유도된 배양 및 대조군 배양물은 ALP 활성 또는 칼슘 침전 존재하에 염색되었다 (Von Kossa staining). 증가된 ALP 활성 및 증가된 칼슘 침전은 유도된 배양물이 유전자 발현 결과를 지지한다는 것을 입증하였다.
모든 3개의 마커들은 유도된 배양물에서 상향 조절되었다;이것은 hPDLC가 골형성 경로를 따라 분화될 수 있다는 것을 입증하고, 이 세포 집단은 미성숙 중간엽 줄기 세포로 구성된다는 것을 제시한다.
실시예 5
hPDLC 의 동결
hPDLC를 트립신화하고, 70μm 멸균 필터로 필터링한 다음, 원심분리하였다. 펠렛은 동결 배지(FCS + 10% DMSO)에서 재현탁하였고, 세포는 크라이오-바이알에 옮겨졌다. 농후하게된(graduate) 동결 과정은 초기화되고, 4℃에서 1시간동안으로 시작하여, -20℃에서 4시간동안, -80℃에서 밤새동안 그리고 마지막으로 액체 N2에서 처리되었다.
실시예 6
정상 인간 3구치(third molar)들을 3개의 개체에서 추출 후 즉시 회수하였다. 치주 인대는 부드럽게 뿌리의 표면으로부터 분리하고, 작게 여러조각으로 잘랐다. T-75 배양 플라스크에 옮긴다음, 성장 배지 (16% FCS, 아스코르브산, 젠타마이신 및 펀지존 함유 DMEM/F12)를 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 성장 배지는 전체 배양 기간동안 3-4일마다 갈아주었다.
8-11일 후에, 세포들(hPDLC)은 치주 인대의 작은 조각들로부터 이동하기 시작했다. 배양이 70~80% 컨플루언트(confluent)할 때, 세포들은 트립신/EDTA 처리를 이용하여 분리하고 하기 기재된 실험에 이용되었다.
hPDLC의 서브컨플루언트(subconfluent) 배양은 도 3에 나타나있다.
플로우 사이토미트리 분석
플로우 사이토미트리 분석은 hPDLC의 줄기세포 특징을 연구하기 위해 수행되었다.
hPDLC의 단일 세포 현탁액을 실온(room temperature)에서 중간엽 줄기세포 마커로 알려져있는 CD73, CD90에 대한 FITC-콘쥬게이트된 모노클로날 항체로 배양되었다. 배양후, 시료들은 Beckman Coulter Epics XL 플로우사이토미터 상에서 분석되었다. 죽은 세포들 및 잔해는 포워드(forward)-및 사이드스캐터(sidescatter) 게이팅에 의해 분석에서 배제되었다.
그 결과는 도 4에 나타난 바와 같다.
골형성 분화
세포들을 0.5x104 cells/cm2 에서 씨드하고, 성장 배지에서 밤새 배양하였다. 골형성 분화는 세포들을 성장 배지에서, 10% FBS, 85 □g/mL L-아스코르브산 2-포스페이트, 10-7 M 덱사메타손, 및 8 mM β-글리세로포스페이트가 있는 DMEMF12로 구성된 골형성유도 배지(OIM)로 전환하는 것에 의해 3주동안 유도되었다. 대조군 배양은 10% FBS를 함유한 SCM에서 분화자극없이 배양되었다. 배지는 1주일에 2번 갈아주었다.
세포외기질(ECM)의 석회침착(Calcification)은 칼슘 포스페이트 침전물이 갈색에서 검은색으로 염색되는 본 코사(Von Kossa) 방법에 의해 검출될 수 있다. 세포들은 0.5x104 cells/cm2 and 의 밀도로 6-웰 플레이트에서 씨드되고, OIM에서 21일동안 배양되었다. 또한, 알칼린 포스파타제 활성은 특정 염색 프로토콜을 이용하여 연구되었다. 골형성 분화의 결과는 도 5에 나타난 바와 같다.
상기한 발견에 근거하여, 우리는 상기 기재된 성장 배지에서 배양된 hPDLC가 골형성 경로를 따라서 분화될 수 있는 것으로 결론지었다. 또한, 이 세포 집단은 중간엽 줄기세포를 위한 특징인 2 개의 표면 마커를 나타낸다.

Claims (11)

  1. 포유동물 세포들의 증식 및/또는 분화 방법으로, 상기 방법은 포유동물 세포들을 하나 이상의 치주 인대 조직, 치주 인대 조직으로부터 유래된 치주 인대 단백질 또는 인자에 노출하거나 공동배양하는 단계를 포함하고, PDL 특징들을 갖고, 다음 중 적어도 하나를 충족하는 세포들을 수득하는 것인 방법:
    i) 인산 칼슘 침전물이 갈색에서 검은색으로 염색되는, 본 코사(Von Kossa) 방법으로 증명된 치주 특징을 나타내고,
    ii) 증가된 오스테오폰틴(osteopontin) 및 오스테오칼신(osteocalcin)과 동시에 감소된 뼈의 시알로프로테인(sialoprotein) (뼈 시알로프로테인II 또는 BSP)을 나타내고,
    iii) 치주 조직의 복구 및/또는 재생을 위해 이식될 수 있고,
    iv) 치주증, 또는 치근막염이라고 불리는 치주염을 비롯한 질환을 치아를 향한 잇몸선(gum line)의 치료에 의해 복구할 수 있고,
    v) 중요한 면역 반응 또는 세포 거부 없이 숙주에 허용됨.
  2. 제1항에 있어서, 상기 포유동물 세포들은 성장 배지에서 증식되고, 성장 배지에서 골형성 유도 배지를 비롯한 분화 배지로 전환되는 것에 의해 분화가 유도되고, 수득된 PDL 특징들을 가진 세포가 채취되는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 포유동물 세포들은 포유동물 중간엽 세포들, 탯줄 및/또는 제대혈로부터 유래된 동종(allogenic) 포유동물 중간엽 세포들, 자가 포유동물 중간엽 세포들, 자가 포유동물 골아세포 또는 골아세포의 전구체(precursor)/전구인자(progenitor)들이고, 상기 세포들은 치주 인대 단백질에 노출됨으로써 PDL 세포들로 분화될 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증식된 포유동물 중간엽 세포들은 자가 중간엽 세포들이고, 수득된 세포들은 PDL 세포들 또는 PDL 특징들을 나타내는 세포들로 시험관 내(in situ)에서 교차분화할 수 있는 것인 방법.
  5. 전술항 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 PDL 특징들을 가진 수득된 세포들은 HLA-DR 양성 (HLA-DR+), Lin 양성 (Lin +), Thy-1 양성 (Thy-1+), Stro-1 양성 (Stro-1 +), CD-13 양성, CD-44 양성, CD-90 양성, CD-73 양성 그리고, 가능하게 CD146/MUC 18 양성이지만, CD31 음성인 것인 방법.
  6. 전술항 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 PDL 특징을 가진 세포들은 CD-34 음성인 것인 방법.
  7. PDL 특징들을 가지고, 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의해 수득가능한 세포 집단.
  8. 치주 조직 내 질환을 치료하는 방법으로, 상기 방법은 치주 인대 아래에 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 수득된 세포들을 직접 주입하여 근관(root canal) 주변에 세포들이 부착하는 단계를 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 세포의 임플란테이션(implanation)은 세포들과 스캐폴드(scaffold)(들)의 조합을 이용(employ)하는 것인 방법.
  10. PDL 세포 특징들을 유도할 수 있는 치주 인대 단백질로 주로 구성된 조성물로, 상기 조성물은 배양 배지에 치주 인대 외식편(explant)을 배양하여 세포의 이동 및 세포를 채취하는 것에 의해 수득가능한 조성물.
  11. 치주 인대 조직, 치주 인대 조직으로부터 유래된 치주 인대 단백질 또는 인자들에 노출되거나 공동배양되고,
    a. 증가된 오스테오폰틴(osteopontin) 및 오스테오칼신(osteocalcin)과 뼈의 시알로프로테인(bone sialoprotein)상에 감소를 나타내는 치주 특징을 얻음
    b. 치주 조직의 복구 및/또는 재생을 위해 이식될 수 있음
    c. 치주 조직의 복구 및/또는 재생을 위해 이식될 수 있음
    d. 치주증이라고 불리는 치주염을 비롯한 질환을 복구할 수 있음
    e. 중요한 면역 반응 또는 세포 거부 없이 숙주에 허용됨
    을 위해 이 인자들에 의해 유도되는 것인, 자가 또는 동종 공여자로부터의 골수 세포들 또는 그 군집으로부터 유래된 포유동물 세포들과 공동 배양될 수 있는 제10항에 기재된 세포들.
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