CN102227501B

CN102227501B - 基因治疗载体和胞嘧啶脱氨酶

Info

Publication number: CN102227501B
Application number: CN200980147509.6A
Authority: CN
Inventors: 哈利·E·格鲁贝尔; 道格拉斯·乔利; 奥马尔·佩雷斯; 克里斯托弗·R·洛格
Original assignee: Tocagen Inc
Current assignee: Suoyuan Biomedical Usa Co ltd
Priority date: 2008-09-26
Filing date: 2009-09-26
Publication date: 2016-11-16
Anticipated expiration: 2029-09-26
Also published as: ZA201102115B; JP2015119712A; CN105274125A; CN105624193A; KR20160079149A; JP2019141088A; CO6362050A2; EP2344648A2; JP2012503986A; IL264214A; MX357418B; JP5771147B2; EA201790824A2; MX2011003039A; ES2709481T3; KR101870056B1; JP2015186479A; EP2346995A2; JP5684130B2; IL211847A0

Abstract

本公开提供修饰的胞嘧啶脱氨酶(CD)。本公开还涉及表达或包含此类修饰CD的细胞和载体以及使用此类修饰CD治疗疾病和病症的方法。

Description

基因治疗载体和胞嘧啶脱氨酶

与相关申请的交叉引用

本申请要求于2008年9月26提出的美国临时申请系列号61/100,666、于2008年12月8日提出的美国临时申请系列号61/120,618和于2009年6月13日提出的美国临时申请系列号61/186,823的优先权，它们的公开内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及修饰的胞嘧啶脱氨酶(CD)。本公开还涉及表达此类修饰CD的细胞和使用此类修饰CD治疗疾病和病症的方法。

背景技术

酵母或细菌胞嘧啶脱氨酶将无毒性的抗生素前体药物5-FC转变成细胞毒性的化学治疗剂5-氟尿嘧啶(5-FU)。尚不知晓人(一般而言，哺乳动物)具有编码具有显著胞嘧啶脱氨酶活性的酶的天然存在基因。酵母和细菌胞嘧啶脱氨酶在使用基因递送和病毒载体用于递送酶、然后用5-FC治疗的癌症治疗中得到认可，其中5-FC然后被酶转变成细胞毒性药物(Miller等，Can Res62：773-7802002；Kievit等，Can Res59：1417-14211999)。

发明内容

本文提供将5-FC转变成5-FU的多肽。还提供编码此类多肽的核酸分子、表达此类多肽的细胞、包含此类多核苷酸和多肽的载体以及适宜地使用此类多肽合成5-FU或其衍生物的方法。因此，在多个实施方案中，提供了包含具有SEQ ID NO：2所示序列的胞嘧啶脱氨酶的分离的或重组的多肽。在其它实施方案中，多肽包含具有选自A23L、V108I、I140L及其任何组合的突变的SEQ ID NO：2。在又一实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：4中所示序列并且包括除残基：(a)23、108和140之外的可达50、25、10或5个保守氨基酸取代。通常，本文提供的多肽表现出用于将5-FC转变成5-FU的胞嘧啶脱氨酶活性。

本公开还提供包含与SEQ ID NO：4至少80%、90%、95%、98%或99%相同的序列的多肽，其中多肽在第23位具有亮氨酸，在第108位具有异亮氨酸并且在第140位具有亮氨酸，并且其中多肽具有胞嘧啶脱氨酶活性。在又一实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：4中所示序列。

本公开还提供包含可操作连接至尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(UPRT)或乳清酸磷酸核糖基转移酶(OPRT)的任何一种前述多肽的融合构建体。在一个实施方案中，融合构建体包含连接至具有UPRT或OPRT活性的第二多肽的第一多肽，所述第一多肽包含具有选自A23L、V108I、I140L及其任何组合的突变的SEQ ID NO：2。在又一实施方案中，融合构建体包含具有SEQ ID NO：4中所示序列的第一多肽并且包括除残基23、108和140之外可达50、25、10或5个保守氨基酸取代，其中第一多肽连接至具有UPRT或OPRT活性的第二多肽。本公开还提供融合构建体，其包含具有胞嘧啶脱氨酶活性并且含有与SEQ ID NO：4至少80%、90%、95%、98%或99%相同的序列的第一多肽，其中该多肽在第23位具有亮氨酸，在第108位具有异亮氨酸并且在第140位具有亮氨酸，并且其中第一多肽连接至包含UPRT或OPRT活性的第二多肽。在一个实施方案中，具有UPRT或OPRT活性的多肽包含分别在SEQ ID NO：8和10中所示序列或其变体。在又一实施方案中，包含胞嘧啶脱氨酶活性的第一多肽连接至具有UPRT或OPRT活性的多肽，其中多肽通过肽连接体分开。在另一实施方案中，融合构建体包含选自SEQ ID NO：12、14、16或18的序列。

本公开还提供编码任何前述多肽的多核苷酸。例如，本公开提供多核苷酸，所述多核苷酸编码包含具有选自A23L、V108I、I140L及其任何组合的突变的SEQ ID NO：2的多肽。在又一实施方案中，多核苷酸编码包含SEQ ID NO：4所示序列的多肽并且包括除残基：(a)23、108和140外可达50、25、10或5个保守氨基酸取代。在进一步的实施方案中，本公开提供多核苷酸，所述多核苷酸编码包含与SEQ ID NO：4至少80%、90%、95%、98%或99%相同的序列的多肽，其中多肽在第23位具有亮氨酸，在第108位具有异亮氨酸并且在第140位具有亮氨酸，并且其中多肽具有胞嘧啶脱氨酶活性。在又一实施方案中，多核苷酸编码包含SEQ IDNO：4的多肽。在又一实施方案中，多核苷酸编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、11、12或13所示序列的多肽。

本公开提供编码胞嘧啶脱氨酶的人密码子优化的多核苷酸。在一个实施方案中，人密码子优化的多核苷酸包含SEQ ID NO：3所示序列。在又一实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO：5、7或9所示序列。

在其它实施方案中，本公开的胞嘧啶脱氨酶或融合构建体使用基因递送系统(GDS)递送。在另一方面中，编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸使用其为病毒或病毒衍生载体的GDS递送。病毒载体可以是复制型或者非复制型，并且可以是腺病毒载体、麻疹病毒载体、疱疹病毒载体、反转录病毒载体(包括慢病毒载体)、弹状病毒载体例如水泡性口炎病毒载体、呼肠孤病毒载体、矽尼卡谷病毒载体、痘病毒载体(包括动物疹或痘病毒衍生的载体)、细小病毒属载体(包括AAV载体)、甲病毒属载体或本领域技术人员已知的其它病毒载体。在一个实施方案中，病毒载体可以是能感染正在复制的哺乳动物细胞的可复制型反转录病毒载体。可复制型反转录病毒载体可以包括正反转录病毒(Orthoretrovirus)或更有代表性的γ反转录病毒载体。在一个方面中，可复制型反转录病毒载体包含在编码本公开胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸5’端的内部核糖体进入位点(IRES)。在一个实施方案中，编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸在反转录病毒载体ENV多核苷酸的3’端。

在其它实施方案中，提供用本公开的胞嘧啶脱氨酶或融合构建体或者包括本公开多核苷酸或融合构建体的载体转染的宿主细胞。宿主细胞包括真核细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞。宿主细胞还包括原核细胞，例如细菌细胞。

本公开还提供治疗细胞增殖性病症（包括癌症）的方法，包括向受试者施用本公开的多核苷酸或多肽和使受试者接触包含5-氟胞嘧啶(5-FC)的细胞毒性药物。

本公开提供重组的可复制型反转录病毒(RCR)，包含：反转录病毒GAG蛋白；反转录病毒POL蛋白；反转录病毒包膜；包含位于反转录病毒多核苷酸序列3'端的长末端重复(LTR)序列、位于反转录病毒多核苷酸5'端的启动子序列、gag核酸结构域、pol核酸结构域和env核酸结构域的反转录病毒多核苷酸，所述启动子适宜于在哺乳动物细胞中表达；包含可操作连接至异源多核苷酸的内部核糖体进入位点(IRES)的盒，其中盒位于3'LTR的5'端并且位于编码反转录病毒包膜的env核酸结构域的3'端；和在靶细胞内进行反转录、包装和整合必需的顺式作用序列，其中与pACE载体(SEQ ID NO：21)相比，RCR在6次传代后保持了较高的复制能力。在一个实施方案中，反转录病毒多核苷酸序列衍生自鼠白血病病毒(MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、猫科白血病病毒或长臂猿白血病病毒(GALV)。在另一实施方案中，MLV是双嗜性MLV。在又一实施方案中，反转录病毒是致癌反转录病毒。在又一实施方案中，靶细胞是具有细胞增殖性病症的细胞。细胞增殖性病症可以选自，但不限于，肺癌、结肠-直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、泌尿道癌、子宫癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、黑素瘤、胃癌和卵巢癌、类风湿性关节炎和其它自身免疫病。在一个实施方案中，启动子包括具有SEQID NO：19、20或22的从核苷酸1至大约核苷酸582所示序列的CMV启动子并且可包括对一个或更多个核酸碱基的修饰，所述启动子能够指导和起始转录。在仍然进一步的实施方案中，启动子包含SEQ ID NO：19、20或22从核苷酸1至大约核苷酸582所示序列。在又一实施方案中，启动子包含CMV-R-U5结构域多核苷酸。在一个实施方案中，CMV-R-U5结构域包含连接至MLV R-U5区的人巨细胞病毒立即早期启动子。在又一实施方案中，CMV-R-U5结构域多核苷酸包含SEQ ID NO：19、20或22从大约核苷酸1至大约核苷酸1202所示序列或者与SEQ IDNO：19、20或22所示序列至少95%相同的序列，其中多核苷酸促进与其可操作连接的核酸分子的转录。在另一实施方案中，所述多核苷酸的gag和pol衍生自致癌反转录病毒。gag核酸结构域可包含SEQ ID NO：19从大约核苷酸1203至大约核苷酸2819的序列或者与其具有至少95%、98%、99%或99.8%同一性的序列。pol结构域可包含SEQ ID NO：19从大约核苷酸2820至大约核苷酸6358的序列或与其具有至少95%、98%、99%或99.9%同一性的序列。在一个实施方案中，env结构域编码两性env蛋白质。env结构域可包含SEQ ID NO：19从大约核苷酸6359至大约核苷酸8323的序列或与其具有至少95%、98%、99%或99.8%同一性的序列。载体的IRES结构域可以是任何IRES，然而，在一个实施方案中，IRES衍生自脑心肌炎病毒。在又一实施方案中，IRES包含SEQ ID NO：19从大约核苷酸8327至大约核苷酸8876的序列或与其具有至少95%、98%或99%同一性的序列。在仍然进一步的实施方案中，异源多核苷酸包括具有SEQID NO：3、5、11、13、15或17所示序列的多核苷酸。在又一实施方案中，异源序列编码包含SEQID NO：4所示序列的多肽。异源核酸是人密码子优化的并且编码如SEQ ID NO：4中所示多肽。在又一实施方案中，异源核酸包含SEQ ID NO：19从大约核苷酸8877至大约9353所示序列。在一个实施方案中，3’LTR衍生自致癌反转录病毒。在又一实施方案中，3’LTR包含U3-R-U5结构域。在仍然进一步的实施方案中，3’LTR包含SEQ ID NO：19从大约核苷酸9405至大约9998所示序列或与其至少95%、98%或99.5%相同的序列。

本公开提供包含SEQ ID NO：19、20或22所示序列的多核苷酸。

本公开提供分离的多核苷酸，从5’至3’包含：人巨细胞病毒立即早期启动子与MLVR-U5区的CMV-R-U5融合物；PBS，对于反转录酶的引物结合位点；5’剪接位点；ψ包装信号；MLV组特异性抗原的gag编码序列；MLV聚合酶多蛋白的pol编码序列；3’剪接位点；MLV株4070A包膜蛋白的4070A env编码序列；来自脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(IRES)；修饰的胞嘧啶脱氨酶编码序列；多嘌呤段；和U3-R-U5MLV长末端重复。

本公开提供治疗患有细胞增殖性病症的受试者的方法，包括使受试者与具有胞嘧啶脱氨酶活性的本公开多肽的多核苷酸在多核苷酸表达的条件下接触，和使受试者与5-氟胞嘧啶接触。

本公开还提供治疗受试者中细胞增殖性病症的方法，包括使受试者与本公开的反转录病毒接触，其中异源核酸序列编码抑制赘生性细胞增殖的治疗蛋白质。在一个实施方案中，反转录病毒包含编码具有SEQ ID NO：4、12、14、16或18所示序列的多肽的多核苷酸。

本公开的一个或更多个实施方案的细节在附图和下面的说明书中描述。根据说明书和附图以及根据权利要求书，其它特征、目的和优点将是显而易见的。

附图简述

图1A-D显示(a)本公开重组反转录病毒载体的示意图；(b)本公开多核苷酸的质粒图谱；(c和d)本公开的多核苷酸的序列(SEQ ID NO：19)。

图2A-D显示包含具有CD、OPRT和UPRT活性的多肽的本公开各个实施方案产生的方案。

图3显示观察到与感染的U-87细胞内野生型yCD蛋白相比yCD2蛋白水平更高。

图4显示包含本公开CD多肽的载体的稳定性和与本公开的其它载体的比较。

图5A-B显示，当感染的细胞暴露于增加水平的5-FC时，与野生型yCD活性(T5.0007)相比，本公开的胞嘧啶脱氨酶活性和载体提供相当的或更好的表达，并且因此杀死感染的大鼠RG2(5A)或U87细胞(5B)。

图6显示感染的U87细胞内T5.0002(yCD2)的比活性高于T5.0001(部分优化的yCD)，T5.0001高于T5.0007(野生型yCD)。

不同图中相同参考符号表示着相同的元素。

详细描述

如本文和后附权利要求书中所使用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，当提到“一细胞(a cell)”时包括多数的此类细胞并且当提到“该试剂(the agent)”时包括提到本领域技术人员已知的一种或多种试剂，等等。

同样，“或”的使用意思是指“和/或”，除非另外说明。类似地，“包含/包括(comprise,comprises,comprising)”、“包括（includes,including）”可互换并且不旨在是限制性的。

还应当进一步理解，当使用术语“包含/包括”描述各种实施方案时，本领域技术人员将理解在一些特别情况下实施方案可选地使用语言“基本上由……组成”或“由……组成”描述。

除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实施所公开的方法和组合物，但是本文描述示例性的方法、装置和材料。

上面以及本文通篇所讨论的出版物被提供，原因仅仅在于它们的公开先于本申请的提交日。但无论如何不能解释为承认发明人因在先公开而无权占先于此类公开。

胞嘧啶脱氨酶(EC3.5.4.1)是催化下列化学反应的酶：

胞嘧啶+H₂O→尿嘧啶+NH₃

因此，该酶的两个底物是胞嘧啶和H₂O，而其两个产物是尿嘧啶和NH₃。该酶属于水解酶家族，这些酶作用于肽键之外的碳-氮键，特别是环脒中的碳-氮键。该酶类的系统名称是胞嘧啶氨基水解酶。该酶也叫作异胞嘧啶脱氨酶。该酶参与嘧啶代谢。

更加具体而言，胞嘧啶脱氨酶是参与嘧啶代谢途径的酶，通过该酶外源胞嘧啶经水解脱氨基作用转化成尿嘧啶。了胞嘧啶脱氨酶(CD酶或CD)活性已经展示于原核生物和低等真核生物中，但是它们在哺乳动物中缺乏(Koechlin等，1966，Biochem.Pharmacol.15，435-446；Polak等，1976，Chemotherapy22，137-153)。分别编码酿酒酵母和大肠杆菌两种生物CD酶的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，S.cerevisiae)FCY1基因和大肠杆菌(E.coli)coda基因是已知的并且它们的序列已经公布(EP402108；Erbs等，1997，Curr.Genet.31，1-6；WO93/01281)。CD酶也将胞嘧啶类似物5-氟胞嘧啶(5-FC)脱氨成为5-氟尿嘧啶(5-FU)，其是高度细胞毒性的化合物，特别是当其被转变成5-氟-UMP(5-FUMP)时。因为编码该酶的基因的钝化突变或者因为该酶天然缺乏(例如哺乳动物细胞)而缺乏CD酶活性的细胞对5-FC有抗性(Jund和Lacroute，1970，J.Bacteriol.102，607-615；Kilstrup等，1989，J.Bacteriol.，171，2124-2127)。另一方面，已经证明可以将5-FC敏感性传递给已经转移入编码CD酶活性的序列的哺乳动物细胞(Huber等，1993，Cancer Res.53，4619-4626；Mullen等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89，33-37；WO93/01281)。因此，CD的使用在基因治疗、特别是抗癌基因治疗情况下是有利的。

然而，5-FC敏感性取决于细胞系而极大不同。在例如以表达大肠杆菌coda基因的反转录病毒转导的PANC-1(胰腺的癌)和SK-BR-3(乳腺癌)人肿瘤细胞系中观察到低敏感性(Harris等，1994，Gene Therapy1，170-175)。该现象被解释为由CD酶的酶作用所形成的5-FU向细胞毒性5-FUMP的内源转变缺乏或差。在哺乳动物细胞中正常由乳清酸磷酸核糖基转移酶(OPRT酶)实现的这一步骤可能在某些肿瘤中缺乏并且因此使得基于CD酶的基因治疗无效。在原核生物和低等真核生物中，通过尿嘧啶磷酸核糖基转移酶的作用(UPRT酶活性)尿嘧啶被转变成UMP。该酶也将5-FU转变成5-FUMP。重要的是，细菌尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(UPRT)与哺乳动物细胞的乳清酸磷酸核糖基转移酶(OPRT)或尿苷-5'-一磷酸合酶功能等效。这些酶介导5-氟尿嘧啶(5-FU)(尿嘧啶的氟化类似物)向5-氟尿苷5'一磷酸(5-FUMP)的转变。5-氟尿苷5'一磷酸之后通过哺乳动物嘧啶从头合成途径被转变成5-FdUDP和FdUTP。每一5-FdUTP是胸苷酸合酶(Thy-A)的不可逆抑制剂并且导致dTTP饥饿。广泛公认的是，这种转变是实现5-氟尿嘧啶的细胞毒性作用必需途径之一并且细菌来源的细菌尿嘧啶磷酸核糖基转移酶能够向哺乳动物乳清酸磷酸核糖转移酶一样将5-氟尿嘧啶转变成相同的活性代谢物。在UPRT酶活性或OPRT酶活性缺乏情况下，源于5-FC被CD酶的脱氨作用产生的5-FU不被转变成细胞毒性的5-FUMP(Jund和Lacroute，1970，J.Bacteriol.102，607-615)。

如本文所述，本公开提供编码多肽的多核苷酸和包含具有胞嘧啶脱氨酶活性的第一多肽与包含UPRT或OPRT活性的第二多肽融合的多肽。此种融合构建体可用于将尿嘧啶或其衍生物转变成一磷酸类似物，并且具体而言将5-FU转变成5-FUMP。

如将在下面更加详细地描述，本公开至少部分地基于催化5-FC转变成5-FU的新的多肽的产生和表达。在一个实施方案中，提供了已经被工程改造而具有将5-FC转变成5-FU的改良催化特性的新多肽。此种多肽包括已经被改变成在指定残基处包括氨基酸取代的变体。虽然这些变体将在下面更加详细地描述，但是应当理解，本公开的多肽可包含一个或更多个修饰的氨基酸。修饰的氨基酸的存在将在例如(a)增加多肽体内半寿期，(b)降低或增加多肽抗原性，和(c)增加多肽保存稳定性中是有利的。一个或多个氨基酸通过例如重组产生过程中的共翻译或者翻译后修饰(例如在哺乳动物细胞中在表达过程中N--X--S/T基序处的N-连接糖基化)或者通过合成手段修饰。因此，“突变体”、“变体”或者“修饰的”蛋白质、酶、多核苷酸、基因或者细胞意思是指已经被改变或衍生，或者以一定方式与亲本蛋白质、酶、多核苷酸、基因或者细胞不同或者改变的蛋白质、酶、多核苷酸、基因或细胞。突变体或修饰的蛋白质或酶通常，虽然不是必须，从突变体多核苷酸或基因表达。

“突变”意思是指产生突变体蛋白质、酶、多核苷酸、基因或细胞的任何过程或者机制。这包括其中蛋白质、酶、多核苷酸或基因序列被改变的任何突变，和源于此突变的在细胞中的任何可检测的改变。有代表性地，突变以单个或多个核苷酸残基的点突变、缺失或插入出现在多核苷酸或者基因序列中。突变包括基因的蛋白质编码区内出现的多核苷酸改变以及蛋白质编码区序列外的区域(例如但不限于调节序列或启动子序列)的改变。基因中的突变可以是“沉默的”，即不反映在表达时的氨基酸改变，产生基因的“序列保守”变体。这通常在一个氨基酸对应于一个以上密码子时发生。

修饰的氨基酸的非限定性实例包括糖基化氨基酸、硫酸化氨基酸、异戊二烯化(例如法呢基化、牻牛儿基牻牛儿基化)氨基酸、乙酰化氨基酸、酰化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、生物素化氨基酸、羧化氨基酸、磷酸化氨基酸，等等。足以指导技术人员修饰氨基酸的参考文献在文献中到处都是。实例方案存在于Walker(1998)Protein Protocols on CD-ROM(Humana Press，Towata，N.J.)中。

本文描述了用于产生、分离和使用本公开的修饰的CD多肽和多核苷酸的重组方法。除了重组生产外，多肽可以通过使用固相技术的直接肽合成(例如，Stewart等(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis(WH Freeman Co，San Francisco)；和Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154)产生。肽合成可以使用手工技术开展或者自动开展。自动合成可以使用例如Applied Biosystems431肽合成仪(Perkin Elmer，Foster City，Calif.)按照制造商提供的说明书实现。

通过例证方式，编码大肠杆菌(Anderson等，1992，Eur.J.Biochem204，51-56)、乳酸链球菌(Lactococcus lactis)(Martinussen和Hammer，1994，J.Bacteriol.176，6457-6463)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(Kim等，1997，Biochem Mol.Biol.Int41，1117-1124)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Martinussen等，1995，J.Bacteriol.177，271-274)UPRT酶的核酸序列可以在本公开背景中使用。然而，使用酵母UPRT酶，并且特别是由酿酒酵母FUR1基因编码的UPRT酶，其序列公开于Kern等(1990，Gene88，149-157)中，通过引用整合入本文。通过明示方式，基因的序列和相应UPRT酶的那些序列可以在文献中和专门的数据库(SWISSPROT，EMBL，Genbank Medline，等)中找到。

在本文中互换使用的术语“蛋白质”或“多肽”包含称作氨基酸的化学结构块通过称作肽键的化学键连接在一起的一个链或更多个链。“酶”意思是指尤其是或多或少催化或促进一种或更多种化学或生物化学反应的任何物质，优选全部或大部分由蛋白质组成。术语“酶”还可指催化多核苷酸(例如RNA或DNA)。“天然”或“野生型”蛋白质、酶、多核苷酸、基因或细胞意思是指天然存在的蛋白质、酶、多核苷酸、基因或细胞。

因此，在几个实施方案中，提供分离的或重组的多肽，其包含具有选自A23L、V108I、I140L及其任何组合的突变的SEQ ID NO：2。在又一实施方案中，多肽包含SEQ IDNO：4中所示序列并且包括除残基：(a)23、108和140外可达50、25、10或5个保守氨基酸替代。通常，本文提供的多肽表现出用于将5-FC转变成5-FU的胞嘧啶脱氨酶活性。

本公开还提供包含可操作连接至尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRT)或乳清酸磷酸核糖转移酶(OPRT)的任何一个前述多肽的融合构建体。在一个实施方案中，融合构建体包含连接至具有UPRT或OPRT活性的第二多肽的第一多肽，所述第一多肽包含具有选自A23L、V108I、I140L及其任何组合的突变的SEQ IDNO：2。在又一实施方案中，融合构建体包含具有SEQ ID NO：4中所示序列并且包括除残基23、108和140之外可达50、25、10或5个保守氨基酸替代的第一多肽，其中第一多肽连接至具有UPRT或OPRT活性的第二多肽。本公开还提供融合构建体，其包含具有胞嘧啶脱氨酶活性并包含与SEQ ID NO：4至少80%、90%、95%、98%或99%相同的序列的第一多肽，其中多肽在第23位具有亮氨酸，在第108位具有异亮氨酸并且在第140位具有亮氨酸，并且其中第一多肽连接至包含UPRT或OPRT活性的第二多肽。在一个实施方案中，具有UPRT或OPRT活性的多肽分别包含SEQ ID NO：8和10所示序列或其变体。在又一实施方案中，包含胞嘧啶脱氨酶活性的第一多肽连接至具有UPRT或OPRT活性的多肽，其中多肽通过肽连接体分开。在另一实施方案中，融合构建体包含选自SEQ ID NO：11、12或13的序列。

术语“可操作连接”或“可操作结合”指调节序列与调节序列所调节多核苷酸之间或者两个不同的多肽或编码此种多肽的多核苷酸之间的功能性连接或者结合。

包含具有CD活性多肽和包含UPRT或OPRT活性多肽的融合构建体可以被工程改造成包含切割位点以帮助蛋白质回收或者其他连接体部分。有代表性地，连接体将是肽连接体部分。连接体部分的长度被选择来优化CD多肽和UPRT或OPRT多肽的生物学活性，并且可以无需过度实验而经验性确定。连接体部分应该足够长且足够灵活以便底物与CD多肽相互作用以及底物与UPRT或OPRT多肽相互作用。连接体部分是长度上大约1个和30个氨基酸残基之间，有代表性的大约2个和15个氨基酸残基之间的肽。连接体部分的实例是--Gly--Gly--、GGGGS(SEQ ID NO：22)、(GGGGS)N(SEQ ID NO：23)、(SGGGG)N(SEQ ID NO：24)、GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO：25)、GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO：26)、GSTSGSGKSSEGSGSTKG(SEQ ID NO：27)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO：28)或EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO：29)。连接部分描述于例如Huston等，Proc.Nat'l Acad.Sci85：5879，1988；Whitlow等，Protein Engineering6：989，1993；和Newton等，Biochemistry35：545，1996中。其他适宜的肽连接体是描述于美国专利号4,751,180和4,935,233中的那些，该两篇文献通过引用并入本文。编码期望肽连接体的DNA序列可以使用任何适宜的常规技术以与编码CD多肽和后随UPRT或OPRT多肽的多核苷酸相同的读码框插入在编码CD多肽和后随UPRT或OPRT多肽的多核苷酸之间。例如，编码连接体的化学合成的寡核苷酸可以连接在两个编码多核苷酸之间。在特别的实施方案中，包含2至4个分开结构域(例如CD结构域和UPRT或OPRT)的融合多肽由肽连接体分开。

特定序列的“保守氨基酸取代”或简单地说“保守变异”指一个氨基酸或系列氨基酸被基本相同的氨基酸序列置换。技术人员将认识到，改变、添加或缺失编码序列中单个氨基酸或一定百分比的氨基酸的各个取代、缺失或添加导致在其中改变导致氨基酸缺失、氨基酸添加或以化学相似氨基酸进行氨基酸取代的“保守变体”。

提供功能相似的氨基酸的保守取代表在本领域众所周知。例如，一个保守取代组包括丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。另一保守取代组包括天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。另一保守取代组包括天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。又一保守取代组包括精氨酸(R)和赖氨酸(K)。另一保守取代组包括异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)。另一保守取代组包括苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。

因此，所列多肽序列(例如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、11、12、13等)的“保守氨基酸取代”包括以同一保守取代组的保守选择氨基酸对多肽序列氨基酸的一定百分比进行取代，有代表性地小于10%。因此，本公开多肽的保守取代变异可包含以同一保守取代组的保守取代变异进行的100、75、50、25或10个取代。

酶的“活性”是其催化反应的能力(即“功能”)的量度，并且可以表示为产生反应产物的速率。例如，酶活性可以表示为每单位时间或每单位酶产生的产物的量(例如浓度或重量)或者以亲和性或解离常数表示。如在本文可互换使用，“胞嘧啶脱氨酶活性”、“胞嘧啶脱氨酶生物学活性”或“胞嘧啶脱氨酶功能活性”指根据标准技术体内或体外测定的、由本公开的胞嘧啶脱氨酶蛋白或多肽对胞嘧啶脱氨酶底物所发挥的活性。用于测量胞嘧啶脱氨酶活性的测定法在本领域已知。例如，胞嘧啶脱氨酶活性可以通过测定5-FC转变成5-FU或胞嘧啶转变成尿嘧啶的速率来测量。5-FC、5-FU、胞嘧啶和尿嘧啶的检测可以通过层析和本领域已知的其它方法开展。

本领域技术人员将理解，所公开的核酸构建体的许多保守变异产生功能相同的构建体。例如，如上所述，由于遗传密码子的简并性，“沉默取代”(即核酸序列中的不导致所编码多肽改变的取代)是编码氨基酸的每一核酸序列的隐含特征。本领域技术人员将理解，由于遗传密码子的简并性，可以产生许多编码修饰的本公开胞嘧啶脱氨酶多肽的核苷酸序列，它们当中一些与本文所明确公开核酸序列具有相当大的同一性。例如，密码子AGA、AGG、CGA、CGC、CGG和CGU均编码精氨酸。因此，在本公开核酸中密码子指定为精氨酸的每一位置中，密码子可以改变成上述的相应密码子而不改变所编码的多肽。应当理解，RNA序列中的U对应于DNA序列中的T。

相似的，在氨基酸序列中一个或少数几个氨基酸的“保守氨基酸取代”是以具有高度相似特性的不同氨基酸的取代，并且由于与所公开构建体高度相似也容易鉴定。每一所公开序列的此类保守变异是本文所提供多肽的一特征。

“保守变体”是这样的蛋白质或酶，其中给定氨基酸残基已经被改变而没有改变蛋白质或酶的总体构象和功能，包括但不限于以具有相似特性(包括极性或非极性特征、大小、形状和电荷)的氨基酸进行的氨基酸取代。在蛋白质或酶中除了所指出为保守的那些氨基酸之外的氨基酸可不同，使得任何两个相似功能的蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似性百分数可变化并且可以是例如至少30%、至少50%、至少70%、至少80%或至少90%，如根据比对方案所测定。如本文中所提到，“序列相似性”意思是指核苷酸或蛋白质序列相关的程度。两个序列之间的相似性程度可以基于序列同一性和/或保守百分数。本文中的“序列同一性”意思是指两个核苷酸或氨基酸序列不变化的程度。“序列比对”意思是指为了评价相似性程度将两个或更多个序列排队以达到最大同一性(并且对于氨基酸序列而言为保守性)水平的过程。用于比对序列和评价相似性/同一性的许多方法在本领域中是已知的，例如其中相似性基于MEGALIGN算法的Cluster方法以及BLASTN、BLASTP和FASTA(Lipman和Pearson，1985；Pearson和Lipman，1988)。当使用所有的这些程序时，优选的设置是导致最高序列相似性的那些设置。例如，对于特定的所比对氨基酸序列对，“同一性”或“同一性百分数”可以指通过ClustalW分析(W1.8版，可从European Bioinformatics Institute，Cambridge，UK得到)得到的氨基酸序列同一性百分数，所述分析为计算比对中相同匹配的数量并将此相同匹配的数量除以(i)所比对序列的长度和(ii)96的较大者，并且使用下列默认ClustalW参数以实现慢/精确配对比对—缺口罚分：10；缺口延长罚分：0.10；蛋白质加权矩阵：Gonnet series；DNA加权矩阵：IUB；切换慢/快配对比对=SLOW或FULL Alignment。

当两个序列使用所确定的氨基酸取代矩阵(例如BLOSUM62)、缺口存在罚分和缺口延长罚分以便得到对于该序列对的可能的最高分数进行相似性得分比对时，该两个序列是“最佳比对的”。氨基酸取代矩阵及它们在定量两个序列之间相似性中的使用是本领域众所周知的并且描述于例如Dayhoff等(1978)，"Atlas of Protein Sequence andStructure，"第5卷，增刊3(编者M.O.Dayhoff)第345-352页的"A model of evolutionarychange in proteins"，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.和Henikoff等(1992)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA89：10915-10919中。BLOSUM62矩阵(图10)常常用作序列比对方案例如Gapped BLAST2.0中的默认得分取代矩阵。对于向所比对序列之一引入单个氨基酸缺口赋予缺口存在罚分，并且对于插入在已经开放的缺口中的每一额外的空氨基酸位置赋予缺口延长罚分。比对由每一序列中比对开始和结束的氨基酸位置限定，并且任选地，由在一个或两个序列中插入缺口或多个缺口以得到最高可能得分限定。虽然最佳比对和得分可以人工实现，但是通过使用计算机执行的比对算法，如描述于Altschul等(1997)Nucl.Acids Res.25：3389-3402并且可在National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)网址(www.ncbi.nlm.nih.gov)公开获得的gapped BLAST2.0容易地开展。最佳比对，包括多重比对，可以使用例如通过NCB1网站可获得并且描述于Altschul等(1997)Nucl.Acids Res.25：3389-3402中的PSI-BLAST进行。

对于与参照序列最佳比对的氨基酸序列，氨基酸残基“对应于”参照序列中在比对中残基与其配对的位置。“位置”由数字表示，该数字基于参照序列中每一氨基酸相对于N-末端的位置顺序确定每一氨基酸。由于当确定最佳比对时必须考虑的缺失、插入、截断、融合等原因，如通过简单地从N-末端开始计数所确定，通常测试序列中氨基酸残基数字将不必要与参照序列中的其对应位置的数字相同。例如，在所比对测试序列中存在缺失的情况下，在发生缺失位点处将没有氨基酸对应于参照序列中的位置。在所比对参照序列中存在插入的情况下，该插入将不对应于参照序列中的任何氨基酸位置。在截断或融合的情况下，在参照序列或者比对序列中存在不对应相应序列中任何氨基酸的氨基酸序列段。

特定多肽的非保守修饰是未表征为保守取代的任何氨基酸取代的那些修饰。例如，跨上述6个组边界的任何取代。这包括碱性或酸性氨基酸取代中性氨基酸(例如Asp、Glu、Asn或Gln取代Val、Ile、Leu或Met)、芳香族氨基酸取代碱性或酸性氨基酸(例如Phe、Tyr或Trp取代Asp、Asn、Glu或Gln)或者不以相似氨基酸置换氨基酸的任何其它取代。碱性侧链包括赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)；酸性侧链包括天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；不带电荷的极性侧链包括甘氨酸(G)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)；非极性侧链包括丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、色氨酸(W)；β分支侧链包括苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)；芳香族侧链包括酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、组氨酸(H)。

因此，在多肽中特定位置上的一些氨基酸残基被从保守氨基酸取代“排除”。例如，本公开提供包含SEQ ID NO：4所示序列的多肽。在一些实施方案中，多肽可以以如上所述保守氨基酸取代来改变，然而，期望某些残基不被取代，例如位置23、108和140上的残基。

“亲本”蛋白质、酶、多核苷酸、基因或细胞是使用任何方法、工具或技术从其衍生或制造任何其它蛋白质、酶、多核苷酸、基因或细胞的任何蛋白质、酶、多核苷酸、基因或细胞，并且不管亲本自身是天然的还是突变体。亲本多核苷酸或基因标码亲本蛋白质或酶。

当多核苷酸、多肽或其它成分部分或者完全地与其所天然伴随的成分(其它蛋白质、核酸、细胞、合成试剂等)分开时，则多核苷酸、多肽或其它成分是“分离的”。当核酸或多肽是人工的或者工程化的或者衍生自人工的或者工程化的蛋白质或核酸时，则核酸或多肽是“重组体”。例如，插入至载体或者任何其它异源位置(例如重组生物的基因组中)使得其与天然发现在正常情况下位于多核苷酸侧翼的核苷酸序列不再相关的多核苷酸是重组多核苷酸。从重组多核苷酸体外或体内表达的蛋白质是重组多肽的实例。同样，天然不存在的多核苷酸序列(例如天然存在基因的变体)是重组体。

在其它实施方案中，提供编码本公开胞嘧啶脱氨酶多肽或融合构建体的分离的多核苷酸。在一个方面中，本公开提供分离的或重组的多核苷酸，在本文中称作“CD优化的多核苷酸”、“CD多核苷酸”或“CD-融合多核苷酸”。术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”和“核酸分子”用于指核苷酸(A、C、T、U、G等或者天然存在或人工的核苷酸类似物)的聚合物，例如DNA或RNA，或者其表示法，例如字符串等，这取决于相关的语境。给定的多核苷酸或互补多核苷酸可以从任何指定的核苷酸序列确定。

本公开的一个实施方案涉及编码胞嘧啶脱氨酶或者突变体胞嘧啶脱氨酶多肽或其生物学活性部分的分离的多核苷酸。如本文所使用，术语“核酸分子”或者“多核苷酸”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)和使用核苷酸类似物产生的DNA和RNA的类似物。核酸分子可以是单链的或者双链的。

在一个实施方案中，CD优化的多核苷酸或CD多核苷酸包括从生物体如细菌或酵母菌株分离的天然存在核酸的重组、工程化或分离形式。示例性的CD多核苷酸包括编码SEQID NO：2中所示野生型多肽的那些。在本公开的另一实施方案中，CD多核苷酸通过将一个或更多个天然存在的、分离的或者重组的CD多核苷酸多样化(例如重组和/或突变)而产生。如在本文别处更加详细地描述，可以产生这样的多样化CD多核苷酸，其编码具有优良功能特性(例如与用作多样化过程中本源或亲本的CD多核苷酸所编码多肽相比提高的催化功能、提高的稳定性或者更高表达水平)的CD多肽。示例性的多核苷酸包括SEQID NO：3和5和编码本公开CD变体多肽的那些。

本公开的多核苷酸在例如本公开CD多肽的重组产生(即表达)中具有多种多样的用途，并且用作进一步多样化产生（例如重组反应或突变反应）以便产生新的和/或改良的CD同系物的本源物等等。

重要的是注意到，CD多核苷酸的某些特定的、重要的和可信的用途不需要多核苷酸编码具有相当大的CD活性或者甚至变体CD活性的多肽。例如，不编码活性酶的CD多核苷酸可以是用于多样化过程中以取得具有期望功能特性(例如高k_cat或k_cat/K_m、低K_m、对热和其它环境因素的高稳定性、高转录或翻译速率、抵抗蛋白水解切割等)的CD多核苷酸变体或非CD多核苷酸的亲本多核苷酸的宝贵来源。

CD多核苷酸，包括编码CD多肽和其变体、CD多肽片段、相关融合蛋白或其功能等效物的核苷酸序列，用于指导CD多肽在适宜宿主细胞如细菌细胞中表达的重组DNA分子中。由于遗传密码子的固有简并性，编码基本相同或者功能等效氨基酸序列的其它核酸序列也可以用于克隆和表达CD多核苷酸。术语“宿主细胞”，如本文所使用，包括易于以核酸构建体转化的任何细胞类型。术语“转化”意思是指引入外源(即外面的或细胞外的)基因、DNA或RNA序列至宿主细胞中，使得宿主细胞将表达所引入的基因或序列以产生期望的物质，有代表性地是由所引入基因或序列编码的蛋白质或酶。所引入的基因或序列可包括调节或控制序列，例如起始序列、终止序列、启动子序列、信号序列、分泌序列或细胞遗传机器所使用的其它序列。接受并表达所引入DNA或RNA的宿主细胞已经“被转化”并且是“转化体”或“克隆”。引入至宿主细胞的DNA或RNA可以来自任何来源，包括与宿主细胞相同属或种的细胞，或者不同属或种的细胞。

如本领域技术人员将理解的那样，修饰编码序列以增强其在特定宿主中的表达可以是有利的。遗传密码子是冗余的，有64种可能的密码子，但是大多数生物体优先使用这些密码子的亚组。在物种中最经常使用的密码子称作最佳密码子，并且不十分经常使用的那些密码子归类为稀有或者低利用密码子(见例如Zhang等(1991)Gene105：61-72)。密码子可以被取代以表现宿主的优先密码子使用，这是一个有时被称作“密码子优化”或者“控制物种密码子偏倚性”的过程。

可以制备包含特定原核或真核宿主优选的密码子的优化的编码序列(还可见Murray等(1989)Nucl.Acids Res.17：477-508)，以例如增加翻译速度或者产生具有期望特征(例如与从非优化序列产生的转录物相比更长的半寿期)的重组RNA转录物。还可以修饰翻译终止密码子以表现宿主偏倚性。例如，对于酿酒酵母(S.cerevisiae)和哺乳动物的优选终止密码子分别是UAA和UGA。对于单子叶植物的优选终止密码子是UGA，而昆虫和大肠杆菌优选使用UAA作为终止密码子(Dalphin等(1996)Nucl.Acids Res.24：216-218)。

密码子使用偏倚性指蛋白质编码性DNA序列(基因)中密码子存在频率在生物体当中的差异。密码子是编码多肽链中特定氨基酸残基的一系列三个核苷酸(三联体)。由于在DNA中有四种核苷酸，即腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)，所以具有64种可能的三联体来编码20种氨基酸，和三个翻译终止(无义)密码子。由于该冗余性，除了两种氨基酸外的所有氨基酸由多于一个三联体编码。不同的生物体常常对编码同一氨基酸的数个密码子中的一个显示出特定的偏好。这些偏好是如何出现的是分子进化的辩论激烈的领域。

普遍接受的是，密码子优先性反映出对于翻译优化的突变偏倚性和自然选择之间的平衡。在快速生长的微生物如大肠杆菌(Escherichia coli)或酿酒酵母(面包酵母)中的优化密码子反映出它们各自的基因组tRNA库的组成。认为优化密码子帮助实现最快的翻译速率和高准确性。由于这些因素的结果，预期翻译选择在高度表达的基因中更强，在上述生物体中的确如此。在不表现出高生长速度或者存在小基因组的其它生物中，通常缺乏密码子使用优化，并且密码子优先性通过在该特定基因组中所见的特征突变偏倚性确定。该情况的实例是智人(Homo sapiens)(人)和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)。表现出中等水平密码子使用优化的生物包括黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)(线虫)或者拟南芥(Arabidopsis thaliana)(墙水芹)。

术语“密码子优化的序列”通常指已经通过将具有小于约20%使用频率的任何密码子替换掉而针对特定宿主物种优化的核苷酸序列。除了密码子优化之外，通过消除假的多腺苷化序列、消除外显子/内含子剪接信号、消除转座子样重复和/或优化GC含量，已经对于在特定宿主物种中表达优化的核苷酸序列在本文中称作“表达增强序列”。

表1：人密码子选择和密码子优先性。对于每一密码子，该表显示人编码区每一密码子的使用频率(每一千)(第一列)和在同义密码子当中每一密码子的相对频率(第二列)。

因此，在本公开的一些实施方案中，多核苷酸包含对于在人细胞中翻译优化的分子密码子。例如，SEQ ID NO：3和5包含已经优化用于在人宿主细胞中产生胞嘧啶脱氨酶的序列。

因此，本公开提供编码具有胞嘧啶脱氨酶活性多肽的人密码子优化的多核苷酸。本公开的人密码子优化的多核苷酸(例如SEQ ID NO：5)还可包含导致保守氨基酸取代和/或增强所编码活性或稳定性的另外的突变。例如，在包含SEQ ID NO：6的多肽的位置23、108和140上的突变提供增强的热稳定性。因此，本公开提供编码具有胞嘧啶脱氨酶活性和增强的热稳定性的多肽的人密码子优化的多核苷酸。在一个实施方案中，人密码子优化的多核苷酸包含编码SEQ ID NO：4的多肽的序列，其中编码多肽氨基酸的密码子已经对于在人细胞中的表达进行优化。在另一实施方案中，本公开的多核苷酸包含SEQ ID NO：3或5。

在一个实施方案中，本公开提供多核苷酸，包含连接至编码具有UPRT或OPRT活性的多肽的异源多核苷酸的胞嘧啶脱氨酶多核苷酸或密码子优化的多核苷酸或者突变体。

包含例如编码SEQ ID NO：4、8、10、12、14、16或18的多肽的序列，或者具有SEQ IDNO：3、5、7、9、11、13、15或17任何一个所示核苷酸序列或其部分的序列的本公开的多核苷酸，可以使用标准分子生物学技术和本文提供的序列信息分离和产生。

本公开的多核苷酸可以使用cDNA、mRNA或可选的基因组DNA作为模板和适宜的寡核苷酸引物，按照标准的PCR扩增技术扩增。如此扩增的核酸可以克隆入适宜的载体中并且通过DNA序列分析表征。此外，对应于核苷酸序列的寡核苷酸可以通过标准合成技术制备，例如，使用自动DNA合成仪。在一些实施方案中，本发明的分离的核酸分子包括这样的核酸分子，其是编码SEQ NO：2、4、6、8、10、12、14、16和18任何一个所示多肽或者具有SEQ ID NO：1，3、5、7、9、11、13、15或17任何一个所示核苷酸序列的核苷酸序列的互补体。

在另一实施方案中，本公开的分离的多核苷酸包括在严格条件下与由编码SEQNO：4、12、14、16或18任何一个所示多肽的核苷酸序列组成或由SEQ ID NO：3、5、11、13、15或17任何一个所示核苷酸序列组成的核酸分子杂交的核酸分子。在其它实施方案中，核酸长度为至少30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600个核苷酸。当一条多核苷酸的至少一个链在所确定严格条件下可与另一多核苷酸复性时，核酸分子是彼此“可杂交的”。杂交的严格性通过例如(a)开展杂交和/或洗涤时的温度，和(b)杂交和洗涤溶液中的离子强度和极性(例如甲酰胺)以及其它参数确定。杂交需要两个多核苷酸包含基本互补的序列；然而，取决于杂交的严格性，错配可以容忍。有代表性地，在高严格性下(例如，在0.5X SSC的水溶液中于65℃)两个序列的杂交需要序列在它们的整个序列上表现出一定高程度的互补性。中等严格性(例如，在2XSSC的水溶液中于65℃)和低严格性(例如，在2X SSC的水溶液中于55℃)的条件需要在杂交序列间相应较小的总体互补性(1X SSC是0.15MNaCl，0.015M柠檬酸钠)。杂交的核酸分子包括在适宜严格条件下复性的那些核酸分子和编码本公开的具有相同功能(如催化5-氟胞嘧啶(5-FC)转变成5-氟尿嘧啶(5-FU)的能力)的多肽或酶的那些核酸分子。此外，术语“在严格条件下杂交”旨在描述用于杂交和洗涤的条件，在此条件下彼此至少30%、40%、50%或60%同源的核苷酸序列通常保持彼此杂交。优选地，条件是如此的条件，使得彼此至少大约70%、更优选至少大约80%、甚至更优选至少大约85%或90%同源的序列通常保持彼此杂交。在一些情况下，本公开的分离的核酸分子在严格条件下与编码SEQ ID NO：4、12、14、16或18任何一个所示多肽或者具有SEQ ID NO：3、5、11、13、15或17任何一个所示核苷酸序列的核酸序列杂交。如本文所使用，“天然存在”核酸分子指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如编码天然蛋白质)。

技术人员将意识到，可以通过突变向编码SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16和18任何一个所示多肽或者具有SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15或17任何一个所示核苷酸序列的任何多核苷酸的核苷酸序列中引入改变，由此导致所编码蛋白质的氨基酸序列的改变。在一些情况中，改变将导致多肽功能改变。在其它情况中，改变将不改变所编码多肽的功能能力。通常，不改变多肽功能的取代包括导致“非必需”氨基酸残基处的氨基酸取代的核苷酸取代。“非必需”氨基酸残基是可以从亲本序列中改变而不改变所得到多肽的生物学活性例如催化5-FC向5-FU的转变的残基。

还考虑了这样的一些情况，其中期望改变亲本多肽的活性使得多肽对特定底物具有新的或者提高的活性、或者具有提高的稳定性或者降低的降解。应当理解，这些氨基酸取代将通常不构成“保守”取代。相反，这些取代构成引入至序列中的非保守取代以便得到新的或改善的活性。例如，SEQ ID NO：1提供对于酿酒酵母胞嘧啶脱氨酶的亲本核酸序列(SEQID NO：2提供相应的多肽)。SEQ ID NO：3提供突变体序列的核酸序列，其包括致使多肽稳定性提高的氨基酸取代。因此，编码SEQ ID NO：2氨基酸序列的核酸分子提供“亲本”核酸分子，可以从该“亲本”核苷酸进行突变以得到编码包含氨基酸取代的修饰多肽的核酸分子。

还应当理解，修饰的多肽可以构成从其可以进行另外取代的“亲本”多肽。因此，亲本多肽和编码亲本多肽的核酸分子，包括修饰的多肽并且不仅仅是“野生型”序列。例如，SEQ ID NO：5的多核苷酸是关于SEQ ID NO：1(即“亲本”多核苷酸)的修饰的多核苷酸。类似地，SEQ ID NO：3的多核苷酸是关于SEQ ID NO：5的修饰的多核苷酸。因此，SEQ ID NO：5是SEQ ID NO：3的亲本序列。

产生多样性的突变方法包括例如，定点诱变(Ling等(1997)"Approaches to DNAmutagenesis：an overview"Anal Biochem.254(2)：157-178；Dale等(1996)"Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioatemethod"Methods Mol.Biol.57：369-374；Smith(1985)"In vitro mutagenesis"Ann.Rev.Genet.19：423-462；Botstein和Shortle(1985)"Strategies and applicationsof in vitro mutagenesis"Science229：1193-1201；Carter(1986)"Site-directedmutagenesis"Biochem.J.237：1-7；and Kunkel(1987)"The efficiency ofoligonucleotide directed mutagenesis"in Nucleic Acids&Molecular Biology(Eckstein,F.and Lilley,D.M.J.eds.,Springer Verlag,Berlin))；使用包含尿嘧啶的模板的诱变(Kunkel(1985)"Rapid and efficient site-specific mutagenesis withoutphenotypic selection"Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-492；Kunkel等(1987)"Rapidand efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection"Methodsin Enzymol.154，367-382；和Bass等(1988)"Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities"Science242：240-245)；寡核苷酸定向诱变(Methods inEnzymol.100：468-500(1983)；Methods in Enzymol.154：329-350(1987)；Zoller和Smith(1982)"Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors：anefficient and general procedure for the production of point mutations in anyDNA fragment"Nucleic Acids Res.10：6487-6500；Zoller和Smith(1983)"Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13vectors"Methods in Enzymol.100：468-500；以及Zoller和Smith(1987)"Oligonucleotide-directed mutagenesis：a simple method using two oligonucleotide primers and asingle-stranded DNA template"Methods in Enzymol.154：329-350)；磷硫酰修饰的DNA诱变(Taylor等(1985)"The use of phosphorothioate-modified DNA in restrictionenzyme reactions to prepare nicked DNA"Nucl.Acids Res.13：8749-8764；Taylor等(1985)"The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at highfrequency using phosphorothioate-modified DNA"Nucl.Acids Res.13：8765-8787；Nakamaye和Eckstein(1986)"Inhibition of restriction endonuclease Nci Icleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis"Nucl.Acids Res.14：9679-9698；Sayers等(1988)"Y-TExonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis"Nucl.Acids Res.16：791-802；以及Sayers等(1988)"Strand specific cleavage ofphosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases inthe presence of ethidium bromide"Nucl.Acids Res.16：803-814)；使用缺口双链体DNA的诱变(Kramer等(1984)"The gapped duplex DNAapproach to oligonucleotide-directed mutation construction"Nucl.Acids Res.12：9441-9456；Kramer和Fritz(1987)Methods in Enzymol."Oligonucleotide-directed construction of mutationsvia gapped duplex DNA"154:350-367；Kramer等(1988)"Improved enzymatic in vitroreactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directedconstruction of mutations"Nucl.Acids Res.16：7207；以及Fritz等(1988)"Oligonucleotide-directed construction of mutations：a gapped duplex DNAprocedure without enzymatic reactions in vitro"Nucl.Acids Res.16：6987-6999)。

另外适宜的方法包括点错配修复(Kramer等(1984)"Point Mismatch Repair"Cell38：879-887)、使用修复缺陷宿主株的诱变(Carter等(1985)"Improvedoligonucleotide site-directed mutagenesis using M13vectors"Nucl.Acids Res.13：4431-4443；以及Carter(1987)"Improved oligonucleotide-directed mutagenesisusing M13vectors"Methods in Enzymol.154：382-403)、缺失诱变(Eghtedarzadeh和Henikoff(1986)"Use of oligonucleotides to generate large deletions"Nucl.AcidsRes.14：5115)、限制性选择和限制性纯化(Wells等(1986)"Importance of hydrogen-bondformation in stabilizing the transition state of subtilisin"Phil.Trans.R.Soc.Lond.A317：415-423)、通过总基因合成的诱变(Nambiar等(1984)"Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein"Science223：1299-1301；Sakamar和Khorana(1988)"Total synthesis and expression ofa gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein(transducin)"Nucl.Acids Res.14：6361-6372；Wells等(1985)"Cassette mutagenesis：an efficient method for generation of multiple mutationsat defined sites"Gene34：315-323；以及Grundstrom等(1985)"Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale`shot-gun`gene synthesis"Nucl.Acids Res.13：3305-3316)；双链打断修复(Mandecki(1986)；Arnold(1993)"Protein engineering forunusual environments"Current Opinion in Biotechnology4：450-455；和"Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids ofEscherichia coli:a method for site-specific mutagenesis"Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：7177-7181)。关于上面方法的许多方法的另外的细节可以在Methods in Enzymology第154卷中找到，其还描述了用于多种诱变方法的故障排除的有用对照。

关于各种产生多样性的方法的另外的细节可以在下列美国专利、PCT公布和EPO公布中找到：Stemmer的美国专利号5,605,793(1997年2月25日)，"Methods for In vitroRecombination"；Stemmer等的美国专利号5,811,238(1998年9月22日)，"Methods forGenerating Polynucleotides having Desired Characteristics by IterativeSelection and Recombination"；Stemmer等的美国专利号5,830,721(1998年11月3日)，"DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"；Stemmer等的美国专利号5,834,252(1998年11月10日)，"End-Complementary Polymerase Reaction"；Minshull等的美国专利号5,837,458(1998年11月17日)，"Methods and Compositions for Cellularand Metabolic Engineering"；Stemmer和Crameri的WO95/22625，"Mutagenesis byRandom Fragmentation and Reassembly"；Stemmer和Lipschutz的WO96/33207，"EndComplementary Polymerase Chain Reaction"；Stemmer和Crameri的WO97/20078，"Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics byIterative Selection and Recombination"；Minshull和Stemmer的WO97/35966，"Methodsand Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"；Punnonen等的WO99/41402，"Targeting of Genetic Vaccine Vectors"；Punnonen等的WO99/41383，"AntigenLibrary Immunization"；Punnonen等的WO99/41369，"Genetic Vaccine VectorEngineering"；Punnonen等的WO99/41368，"Optimization of ImmunomodulatoryProperties of Genetic Vaccines"；Stemmer和Crameri的EP752008，"DNA Mutagenesisby Random Fragmentation and Reassembly"；Stemmer的EP0932670，"Evolving CellularDNA Uptake by Recursive Sequence Recombination"；Stemmer等的WO99/23107，"Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling"；Apt等的WO99/21979，"Human Papillomavirus Vectors"；del Cardayre等的WO98/31837，"Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination"；Patten和Stemmer的WO98/27230,"Methods and Compositions for PolypeptideEngineering"；Stemmer等的WO98/13487，"Methods for Optimization of Gene Therapyby Recursive Sequence Shuffling and Selection"；WO00/00632，"Methods forGenerating Highly Diverse Libraries"；WO00/09679，"Methods for Obtaining invitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences"；Arnold等的WO98/42832，"Recombination of Polynucleotide Sequences Using Randomor Defined Primers"；Arnold等的WO99/29902，"Method for Creating Polynucleotideand Polypeptide Sequences"；Vind的WO98/41653，"An in vitro Method forConstruction of a DNA Library"；Borchert等的WO98/41622，"Method forConstructing a Library Using DNA Shuffling"；Pati和Zarling的WO98/42727，"Sequence Alterations using Homologous Recombination"；Patten等的WO00/18906，"Shuffling of Codon-Altered Genes"；del Cardayre等的WO00/04190，"Evolution ofWhole Cells and Organisms by Recursive Recombination"；Crameri等的WO00/42561，"Oligonucleotide Mediated Nucleic Acid Recombination"；Selifonov和Stemmer的WO00/42559，"Methods of Populating Data Structures for Use in EvolutionarySimulations"；Selifonov等的WO00/42560，"Methods for Making Character Strings,Polynucleotides&Polypeptides Having Desired Characteristics"；Welch等的WO01/23401，"Use of Codon-Varied Oligonucleotide Synthesis for SyntheticShuffling"；和Affholter的WO01/64864，"Single-Stranded Nucleic Acid Template-Mediated Recombination and Nucleic Acid Fragment Isolation"。

还提供包含一个或更多个上面广泛描述的核酸序列的重组构建体。构建体包括本公开的多核苷酸已经以正向或反向方向插入其中的载体，例如，质粒、粘粒、噬菌体、病毒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、病毒载体等。大量的适宜载体和启动子是本领域技术人员已知的，并且是商业可得到的。在一个实施方案中，病毒载体是反转录病毒载体。

术语“载体”、“载体构建体”和“表达载体”意思是指通过其可将DNA或RNA序列(例如外源基因)引入到宿主细胞内以转化宿主并促进所引入序列表达(例如转录和翻译)的运载体。载体通常包括可传递剂的DNA，在其中编码蛋白质的外源DNA通过限制性酶技术插入。常见类型的载体是“质粒”，其通常是双链DNA的自携式(self-contained)分子，其可容易地接受另外(外源)DNA并且可容易地引入到适宜宿主细胞中。大量的载体，包括质粒和真菌载体，已经描述用于在各种各样真核和原核宿主中复制和/或表达。非限定性实例包括pKK质粒(Clonetech)、pUC质粒、pET质粒(Novagen，Inc.，Madison，Wis.)、pRSET或pREP质粒(Invitrogen，San Diego，Calif.)、或pMAL质粒(New England Biolabs，Beverly，Mass.)和许多适宜宿主细胞，使用本文所公开或引用的方法或者相关领域技术人员已知的那些方法。重组克隆载体将常常包括用于克隆或表达的一个或更多个复制系统、用于在宿主中选择的一个或更多个标记如抗生素抗性、和一个或更多个表达盒。

术语“表达”意思是指允许或引起基因或DNA序列中的信息表现出来，例如通过活化相应基因或DNA序列转录和翻译所涉及的细胞功能产生蛋白质。DNA序列在细胞中表达或由细胞表达，以形成“表达产物”如蛋白质。表达产物自身，例如所得到的蛋白质，也可以称作是由细胞“表达的”。多核苷酸或多肽被重组表达，例如当其在外源宿主细胞中在外源或天然启动子的控制下，或者在天然宿主细胞中在外源启动子的控制下表达或产生。

本文提供的多核苷酸可以整合入适宜表达多肽的各种表达载体的任何一种中。适宜的载体包括染色体、非染色体和合成DNA序列，例如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；从质粒和噬菌体DNA、病毒DNA(如牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒、腺病毒、腺伴随病毒、反转录病毒和许多其它病毒)的组合衍生的载体。可以使用将遗传物质转导进入细胞并且如果期望复制的话则在相关宿主中为可复制的和有活力的任何载体。这些核酸载体可以使用例如描述于P.Midoux等Brit J Pharm157：166-1782009或者Kamimura和Liu J AAPS10：589-595(2008)的非病毒递送系统或者如下描述的病毒系统递送。

在另一方面中，编码胞嘧啶脱氨酶或其变体的多核苷酸以基因递送系统（其为病毒或病毒衍生载体）递送。病毒载体可以是复制型或非复制型，并且可以是腺病毒载体、麻疹病毒载体、疱疹病毒载体、反转录病毒载体(包括慢病毒载体)、弹状病毒载体例如水泡性口炎病毒载体、呼肠孤病毒载体、矽尼卡谷病毒载体、痘病毒载体(包括动物疹或痘衍生的载体)、细小病毒载体(包括AAV载体)、甲病毒载体或本领域技术人员已知的其它病毒载体(还见例如Concepts in Genetic Medicine，编者Boro Dropulic和Barrie Carter，Wiley，2008，Hoboken，NJ.；The Development of Human Gene Therapy，编者TheodoreFriedmann，Cold Springs Harbor Laboratory Press，Cold springs Harbor，New York，1999；Gene and Cell Therapy，编者Nancy Smyth Templeton，Marcel Dekker Inc.，NewYork，New York，2000和Gene Therapy：Therapeutic Mechanism and Strategies，编者Nancy Smyth Templetone和Danilo D Lasic，Marcel Dekker，Inc.，New York，New York，2000；其公开通过引用并入本文)。

在一个实施方案中，病毒载体可以是能够仅感染正在复制的哺乳动物细胞的可复制型反转录病毒载体。反转录病毒已经以多种方式分类，但是在最近十年命名法已经标准化(见ICTVdB–在万维网(www)ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/和教科书“Retroviruses”编者Coffin，Hughs和Varmus，Cold Spring Harbor Press1997上的通用病毒数据库，v4；其公开通过引用并入本文)。可复制型反转录病毒载体可以包括正反转录病毒或者更通常地包括γ反转录病毒载体。在一个方面中，可复制型反转录病毒载体包括位于编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸5’端的内部核糖体进入位点(IRES)。在一个实施方案中，编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸在反转录病毒载体ENV多核苷酸的3’端。

因此，在其它实施方案中，提供包括本公开多核苷酸的载体。在其它实施方案中，提供以本公开核酸分子转染的宿主细胞或者包含本公开多核苷酸的载体。宿主细胞包括真核细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞。宿主细胞还包括原核细胞例如细菌细胞。

如先前所讨论，描述用于本文的分子生物学技术(包括载体、启动子和许多其它相关主题的使用)的一般教科书包括Berger和Kimmel，Guide to Molecular CloningTechniques，Methods in Enzymology第152卷，(Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.)("Berger")；Sambrook等，Molecular Cloning--A Laboratory Manual，第2版，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989("Sambrook")以及Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等编，Current Protocols，a joint venture between Greene Publishing Associates，Inc.以及John Wiley和Sons，Inc.，(经过1999补充)("Ausubel")。足以指导技术人员通过体外扩增方法，包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增和其它RNA聚合酶介导技术(例如NASBA)例如用于产生本公开的同源核酸的方案的实例存在于Berger、Sambrook和Ausubel，以及在Mullis等(1987)美国专利号4,683,202；Innis等编者，(1990)PCR Protocols：AGuide to Methods and Applications(Academic Press Inc.San Diego，Calif.)("Innis")；Arnheim和Levinson(1990年10月1日)C&EN36-47；The Journal Of NIH Research(1991)3：81-94；Kwoh等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：1173；Guatelli等(1990)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA87：1874；Lomell等(1989)J.Clin.Chem35：1826；Landegren等(1988)Science241：1077-1080；Van Brunt(1990)Biotechnology8：291-294；Wu和Wallace(1989)Gene4：560；Barringer等(1990)Gene89：117；以及Sooknanan和Malek(1995)Biotechnology13：563-564中。用于体外克隆所扩增核酸的改良方法描述于Wallace等，美国专利号5,426,039中。用于通过PCR扩增大核酸的改良的方法总结于Cheng等(1994)Nature369：684-685和其中引用的参考文献中，其中产生可达40kb的PCR扩增子。技术人员将意识到，基本上任何RNA可以转变成适宜限制性消化、PCR扩大和使用反转录酶和聚合酶测序的双链DNA。见例如Ausubel、Sambrook和Berger，同上。

还提供以本文提供的载体(例如克隆载体或者表达载体)转导（转化或转染）的工程改造宿主细胞，以及通过重组技术的本公开多肽的生产。载体可以是例如质粒、病毒颗粒、噬菌体等。工程改造的宿主细胞可以培养在经修改适宜活化启动子、选择转化子或者扩增编码性多核苷酸的常规营养培养基中。培养条件如温度、pH等等是先前对于使用选择用于表达的宿主细胞的那些条件，并且对于本领域技术人员而言是显而易见的并且在本文所引用的参考文献中，包括例如Sambrook、Ausubel和Berger，以及例如Freshney(1994)Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique，第3版，(Wiley-Liss，NewYork)以及本文所引用的参考文献中。

可采用载体转化适宜宿主以允许宿主表达蛋白质或多肽。适宜表达宿主的实例包括：细菌细胞例如大肠杆菌、枯草杆菌(B.subtilis)、链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；真菌细胞例如酿酒酵母、毕赤酵母(Pichia pastoris)和粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；昆虫细胞例如果蝇属和草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)；哺乳动物细胞例如CHO、COS、BHK、HEK293或Bowes黑素瘤；或者植物细胞或外植体等。

在细菌系统中，取决于胞嘧啶脱氨酶多肽的意图用途，可以选择许多表达载体。例如，当大量CD多肽或其片段需要用于商业生产或者用于诱导抗体时，指导容易纯化的融合蛋白质高水平表达的载体可以是期望的。此类载体包括，但不限于，多功能大肠杆菌克隆和表达载体，例如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中CD多肽编码序列可以与β半乳糖苷酶的氨基末端Met和随后的7个残基以符合读框的方式连接入载体以便产生杂合蛋白质；pIN载体(Van Heeke和Schuster(1989)J.Biol.Chem.264：5503-5509)；pET载体(Novagen，MadisonWis.)等等。

相似地，在酿酒酵母中包含组成型或者诱导型启动子如α因子、醇氧化酶和PGH的许多载体可以用于产生本公开的CD多肽。对于综述，见Ausubel(在上)和Grant等(1987)Methods in Enzymology153：516-544。

本公开还提供相对于现有反转录病毒载体具有增加的稳定性的复制型反转录病毒载体。此种在感染和复制过程中的增加的稳定性对于细胞增殖性病症的治疗是重要的。由可复制型反转录病毒提供转导效率、转基因稳定性和靶选择性的组合。组合物和方法提供插入物稳定性并维持转基因的转录活性和所编码多肽的翻译活力。

反转录病毒可以水平和垂直传播。反转录病毒的有效传染性传播需要特异识别病毒包膜蛋白的受体在靶细胞上表达，尽管病毒可利用受体不依赖性的非特异途径以低效率进入。此外，靶细胞类型必须能够支持病毒结合和穿透后复制循环的所有阶段。当病毒基因组整合入宿主的种系中时，发生垂直传播。然后，原病毒将从一代传递到另一代，似乎它是细胞基因一样。因此，建立起内源性原病毒，其常常是潜伏的，但是当宿主暴露于适宜试剂下时其被活化。

如上面所提到，整合入的DNA中间物被称为原病毒。现有的基因治疗或基因递送系统使用这样的方法和反转录病毒，其要求在适宜辅助病毒存在下或者在包含能够包膜而不同时产生污染性辅助病毒的适宜序列的细胞系中原病毒转录并装配进入感染性病毒。如下面所述，辅助病毒不需要产生本公开的重组反转录病毒，因为用于包膜的序列在基因组中提供，由此提供用于基因递送或治疗的可复制型反转录病毒载体。

可用于本公开方法和组合物的反转录病毒基因组包括具有至少下列三个基因的原病毒DNA：gag、pol和env，这些基因的侧翼是一个或两个长末端(LTR)重复，或者在原病毒中侧翼为两个长末端重复(LTR)和包含顺式作用序列如psi的序列。gag基因编码内部结构蛋白(基质、衣壳和核衣壳)；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(反转录酶)、蛋白酶和整合酶；并且env基因编码病毒包膜糖蛋白。5'和/或3'LTR用于促进病毒体RNA的转录和多腺苷化。LTR包含对于病毒复制所必需的所有其它顺式作用序列。慢病毒具有额外的基因，包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx(在HIV-1、HIV-2和/或SIV中)。

与5'LTR邻近的是对于基因组反转录(tRNA引物结合位点)和将病毒RNA有效衣壳化进入颗粒(Psi位点)所需要的序列。如果对于衣壳化(或者反转录病毒RNA包装进入感染性病毒体)所需的序列从病毒基因组中丢失，结果是顺式缺陷，这阻止基因组病毒RNA的衣壳化。该类型的修饰载体是通常已经用于现有基因递送系统的载体(即缺乏对于病毒体衣壳化所需要的元件的系统)。

在一个实施方案中，本公开提供能够感染非分裂细胞、分裂细胞或者具有细胞增殖性病症的细胞的重组反转录病毒。本公开的重组的可复制型反转录病毒包括编码病毒体之内包封的病毒GAG、病毒POL、病毒ENV、内部核糖体进入位点(IRES)之后的异源多核苷酸的多核苷酸序列。

异源核酸序列可操作连接至IRES。如本文所使用，术语“异源”核酸序列或转基因指(i)在野生型反转录病毒中正常不存在的序列，(ii)源于外源物种的序列，或者(iii)如果来自相同物种，则它是根据其最初形式相当大地修饰。备选地，正常情况下在细胞中不表达的未改变的核酸序列是异源核酸序列。在特定实施方案中，异源多核苷酸是具有胞嘧啶脱氨酶活性的本公开多肽。

短语“非分裂”细胞指不经历有丝分裂的细胞。非分裂细胞可以在细胞周期的任何点(例如G₀/G₁、G_1/S、G_2/M)阻断，只要细胞不活跃地分裂即可。对于先体外后体内感染，可以通过本领域技术人员使用的标准技术处理分裂的细胞以阻断细胞分裂，包括辐射、蚜肠霉素处理、血清饥饿和接触抑制。然而，应当理解，先体外后体内感染常常在不阻断细胞的情况下开展，因为许多细胞已经停止(例如干细胞)。例如，重组慢病毒载体能够感染任何非分裂的细胞，而不管用于阻断细胞分裂的机制如何或者细胞被阻断的细胞周期点如何。机体中预先存在的非分裂细胞的实例包括神经元细胞、肌肉细胞、肝脏细胞、皮肤细胞、心脏细胞、肺脏细胞和脊髓细胞以及它们的衍生物。对于分裂细胞，可以使用致癌-反转录病毒载体。

“分裂”细胞意思是指经历活跃有丝分裂或者减数分裂的细胞。此类分裂细胞包括干细胞、皮肤细胞(例如成纤维细胞和角质形成细胞)、配子和本领域已知的其它分裂细胞。特别感兴趣的和术语分裂细胞所包括的是具有细胞增殖性病症的细胞，例如赘生性细胞。术语“细胞增殖性病症”指表征为细胞数量异常的病症。该病症可以包括超营养(细胞连续增殖导致组织内细胞群的过度生长)和低营养(组织内细胞缺乏或不足)细胞生长或者过度的内向通量或者细胞迁移至身体的一个区域。细胞群不必是转化的、致瘤的或恶性的细胞，但是也可以包括正常细胞。细胞增殖性病症包括与结缔组织过度生长相关的疾病，例如多种纤维变性病症，包括硬皮病、关节炎和肝硬化。细胞增殖性病症包括肿瘤性疾病例如头颈癌。头颈癌将包括，例如口腔、食道、咽喉、喉头、甲状腺、舌、唇、唾液腺、鼻、鼻旁窦、鼻咽、上鼻腔癌和窦肿瘤、感觉神经母细胞瘤、鳞状细胞癌、恶性黑素瘤、鼻窦未分化癌(SNUC)、脑(包括成胶质细胞瘤)或血液瘤。还包括局部淋巴结包括颈淋巴结、喉前淋巴结、肺近食管淋巴结和下颌下淋巴结癌症(Harrison's Principles of Internal Medicine(编者Isselbacher，等，McGraw-Hill，Inc.，第13版，第1850-1853页，1994)。其它癌症类型包括但不限于，肺癌、结肠-直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、泌尿道癌、子宫癌、淋巴瘤、口腔癌、胰腺癌、白血病、黑素瘤、胃癌、皮肤癌和卵巢癌。

在一个实施方案中，载体内的异源多核苷酸包含已经对于在人细胞中表达优化的胞嘧啶脱氨酶。在又一实施方案中，胞嘧啶脱氨酶包含已经进行人密码子优化的序列和包含与野生型胞嘧啶脱氨酶相比增加胞嘧啶脱氨酶稳定性(例如减少降解或者增加热稳定性)的突变。在又一实施方案中，异源多核苷酸编码融合构建体，融合构建体包含可操作连接至编码具有UPRT或OPRT活性的多肽的多核苷酸的胞嘧啶脱氨酶(或者是人密码子优化的或者是非优化的，或者是突变的或者是非突变的)。在另一实施方案中，异源多核苷酸包含本公开的CD多核苷酸或融合构建体(例如SEQ ID NO：3、5、11、13、15或17)。

在另一实施方案中，可复制型反转录病毒载体可包含编码含有胞嘧啶脱氨酶(如本文所述)的多肽的异源多核苷酸并且还可包含含有连接至细胞类型或组织特异性启动子的miRNA或siRNA分子的多核苷酸。

术语“调节核酸序列”集体地指启动子序列、多腺苷化信号、转录终止序列、上游调节结构域、复制起点、增强子等等，其共同地提供用于编码序列在受体细胞中复制、转录和翻译。这些控制序列并非需要全部一直存在，只要所选择的编码序列能够在适宜宿主细胞中复制、转录和翻译即可。本领域技术人员可以容易地从公共数据库和材料中鉴定调节核酸序列。此外，本领域技术人员可以鉴定适用于目的用途如体内、先体外后体内、或体外的调节序列。

术语“启动子区”在本文中以其通常的含义使用来指包含DNA调节序列的核苷酸区，其中调节序列衍生自能够结合RNA聚合酶并起始下游(3'方向)编码序列转录的基因。调节序列可以与期望基因序列同源或者异源。例如，广范围的启动子可以采用，包括如上所述的病毒或哺乳动物启动子。

内部核糖体进入位点(“IRES”)指在通常位于IRES3’的编码序列翻译过程中促进核糖体进入或者保持的核酸片段。在一些实施方案中，IRES可包含剪接受体/供体位点，然而，优选的IRES缺乏剪接受体/供体位点。正常情况下，核糖体进入信使RNA通过位于所有真核mRNA的5'端的帽进行。然而，对于该通用规则存在例外。在一些病毒mRNA中缺乏帽表明在这些RNA的内部位点存在允许核糖体进入的备选结构。目前，因为其功能而指定为IRES的大量的这样的结构已经在非帽化病毒mRNA(例如特别是小核糖核酸病毒如脊髓灰质炎病毒(Pelletier等，1988，Mol.Cell.Biol.，8，1103-1112)和EMCV病毒(脑心肌炎病毒)(Jang等，J.Virol.，1988，62，2636-2643)的mRNA)的5'非编码区中鉴定出来。本公开提供IRES在可复制反转录病毒载体中的使用。

异源核酸序列有代表性地在病毒LTR启动子-增强子信号或内部启动子的控制下，在反转录病毒LTR内的保留的信号可仍然将载体有效地整合入宿主细胞基因组中。因此，本公开的重组反转录病毒载体、目的序列、基因和/或基因片段可以插入在数个位点并且在不同的调节序列之下。例如，用于插入的位点可以是病毒增强子/启动子近端位点(即5'LTR驱动的基因座)。备选地，目的序列可以插入至远端位点(例如env基因3'的IRES序列)或者在存在两个或更多个异源序列的情况下一个异源序列可以处于第一调节区的控制之下并且第二个异源序列处于第二调节序列控制之下。其它远端位点包括病毒启动子序列，其中在一个或更多个目的序列的表达经由启动子近端顺反子剪接的情况下，可以使用内部异源启动子，如SV40或CMV，或内部核糖体进入位点(IRES)。

在一个实施方案中，本公开的反转录病毒基因组包含含有用于目的多核苷酸序列插入的克隆位点的IRES。在一个实施方案中，IRES位于反转录病毒载体env基因的3'，但是位于目的异源核酸的5’。因此，编码目的多肽的异源多核苷酸序列可以可操作连接至IRES。

在另一实施方案中，靶向性多核苷酸序列作为本公开重组反转录病毒载体的一部分而包括在内。靶向性多核苷酸序列是靶向性配体(例如肽激素如调蛋白、单链抗体、受体或者受体的配体)、组织特异性或细胞类型特异性调节元件(例如组织特异性或细胞类型特异性启动子或增强子)、靶向性配体和组织特异性/细胞类型特异性调节元件的组合。优选地，靶向配体可操作连接至反转录病毒的env蛋白质，产生嵌合反转录病毒env蛋白。病毒GAG、病毒POL和病毒ENV蛋白可以衍生自任何适宜的反转录病毒(例如MLV或慢病毒衍生的)。在另一实施方案中，病毒ENV蛋白是非反转录病毒衍生的(例如CMV或VSV)。

因此，本公开的重组反转录病毒以如此方式遗传修饰，使得病毒靶向于特定细胞类型(例如平滑肌细胞、肝细胞、肾脏细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、间质干细胞、骨髓细胞、软骨细胞、上皮细胞、肠细胞、赘生性细胞、神经胶质瘤细胞、神经元细胞和本领域已知的其它细胞)从而核酸基因组被递送至靶非分裂细胞、靶分裂细胞或者具有细胞增殖性病症的靶细胞。靶向可以以两种方式实现。第一种方式通过结合至在细胞外表面上具有分子的细胞而指导反转录病毒至靶细胞。该种靶向反转录病毒的方法利用靶向性配体在反转录病毒衣壳上的表达，以辅助将病毒靶向至具有与反转录病毒表面上靶向性配体相互作用的受体或结合分子的细胞或组织。在病毒感染细胞后，病毒注射其核酸至细胞内并且反转录病毒遗传材料可以整合入宿主细胞基因组中。用于靶向的第二个方法利用细胞或组织特异性调节元件来促进病毒基因组在所靶向的活跃利用调节元件的细胞内表达和转录，如下面更加全面的描述。然后，转染的反转录病毒遗传物质在宿主细胞内转录并翻译成蛋白质。靶向性调节元件通常连接至5'和/或3'LTR，产生嵌合LTR。

通过将目的异源核酸序列连同编码如特异性靶细胞上受体的配体的另一基因一起插入至本公开的病毒载体中，载体成为靶特异性的。通过连接例如糖、糖脂或蛋白质，病毒载体可以被制作成靶特异性的。靶向可以通过使用靶向病毒载体的抗体实现。本领域技术人员将已知或者容易地确定可以插入至病毒基因组中的特异多核苷酸序列或者可以连接至病毒包膜的蛋白质以便使得包含目的核酸序列的病毒载体进行靶特异性递送。

因此，在一个实施方案中，本公开包括含有可操作连接至靶向性多肽的反转录病毒env蛋白的嵌合env蛋白。靶向性多肽可以是细胞特异性受体分子、细胞特异性受体的配体、细胞特异性抗原表位的抗体或抗体片段或者在本领域中容易鉴定的能够与靶细胞结合或相互作用的任何其它配体。靶向性多肽或分子的实例包括使用生物素-链霉抗生物素作为连接体的二价抗体(Etienne-Julan等，J.Of General Virol.，73，3251-3255(1992)；Roux等，Proc.Natl.Acad.Sci USA86，9079-9083(1989))、在其包膜中包含编码抗半抗原的单链抗体可变区序列的重组病毒(Russell等，Nucleic Acids Research，21，1081-1085(1993))、肽激素配体向反转录病毒包膜中的克隆(Kasahara等，Science，266，1373-1376(1994))、嵌合EPO/env构建体(Kasahara等，1994)、抗亲嗜性MLV包膜中低密度脂蛋白(LDL)受体的单链抗体，导致特异性地感染表达LDL受体的HeLa细胞(Somia等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，92，7570-7574(1995))，类似地，ALV宿主范围可以通过整合整联蛋白配体而改变，能够使病毒跨物种特异性地感染大鼠成胶质细胞瘤细胞(Valsesia-Wittmann等，J.Virol.68，4609-4619(1994))，并且Dornberg和同事(Chu和Dornburg，J.Virol69，2659-2663(1995))已经报导了使用包含抗肿瘤标志物的单链抗体的包膜使脾脏坏死病毒(SNV)(一种禽反转录病毒)组织特异性靶向。

本公开提供产生能够感染靶细胞的重组反转录病毒的方法，包括以下列感染适宜的宿主细胞：包含编码病毒gag、病毒pol和病毒env的多核苷酸序列的载体，其中载体包含用于将可操作连接至调节核酸序列的异源基因引入的克隆位点；和回收重组病毒。

本公开的反转录病毒和方法提供可复制型反转录病毒，其不需要辅助病毒或另外的核酸序列或蛋白质以繁殖并产生病毒体。例如，本公开的反转录病毒的核酸序列分别编码例如一组特异抗原和反转录酶(和对于成熟和反转录必需的整合酶和蛋白酶)，如上所述。病毒gag和pol可以衍生自慢病毒例如HIV或致癌病毒例如MoMLV。此外，本公开的反转录病毒的核酸基因组包括编码病毒包膜(ENV)蛋白的序列。env基因可以衍生自任何反转录病毒。env可以是允许转导人和其它物种细胞的双嗜性包膜蛋白，或者可以是仅仅能转导小鼠和大鼠细胞的亲嗜性包膜蛋白。此外，通过将包膜蛋白与抗体或用于靶向特定细胞类型受体的特定配体连接来将重组病毒靶向可以是期望的。如上面所提到，通过插入例如糖脂或蛋白质可将反转录病毒载体制成靶特异性的。靶向常常通过使用抗体实现，以将反转录病毒载体靶向至特定细胞类型(例如在某些组织中存在的细胞类型，或者癌细胞类型)上的抗原。本领域技术人员将知道或者无需过度实验而容易地确定实现将反转录病毒载体递送至特定靶标的特异方法。在一个实施方案中，env基因衍生自非反转录病毒(例如CMV或VSV)。反转录病毒衍生的env基因的实例包括，但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、人免疫缺陷性病毒(HIV)和Rous肉瘤病毒(RSV)。其它env基因例如水泡性口炎病毒(VSV)(蛋白G)、巨细胞病毒包膜(CMV)或流感病毒血凝素(HA)也可以使用。

在一个实施方案中，反转录病毒基因组衍生自致癌反转录病毒或者γ反转录病毒，并且特别是哺乳动物致癌反转录病毒或γ反转录病毒。“衍生的”意思是指亲本多核苷酸序列是野生型致癌病毒，其通过插入或去除天然存在序列而被修饰(例如插入IRES、插入编码例如具有本公开胞嘧啶脱氨酶活性的多肽的异源多核苷酸等等)。

在另一实施方案中，本公开提供使用调节序列靶向的反转录病毒载体。细胞或者组织特异性调节序列(例如启动子)可以用于靶向基因序列在特定细胞群体中的表达。对于本公开的适宜哺乳动物和病毒启动子在本文别处描述。因此，在一个实施方案中，本公开提供在反转录病毒基因组5'具有组织特异性启动子元件的反转录病毒。优选地，组织特异性调节元件/序列在反转录病毒基因组LTR的U3区内，包括例如对于赘生性细胞的细胞或组织特异性启动子和增强子(例如肿瘤细胞特异性增强子和启动子)，和可诱导启动子(例如四环素)。

在一些情况中，希望调节表达。例如，取决于期望表达水平，可以采用具有不同活性强度的不同病毒启动子。在哺乳动物细胞中，CMV立即早期启动子如果经常使用的话提供强的转录活化。当希望转基因的表达水平降低时也可以使用具有较差能力的修饰形式CMV启动子。当希望转基因在造血细胞中表达时，可以使用反转录病毒启动子，例如来自MLV或MMTV的LTR。可以使用的其它病毒启动子包括SV40、RSV LTR、HIV-1和HIV-2LTR、腺病毒启动子(例如来自E1A、E2A或MLP区)、AAV LTR、花椰菜花叶病毒、HSV-TK和禽肉瘤病毒。

同样地，可以使用组织特异性或者选择性启动子来实现在特异组织或细胞中转录，以便降低对非靶向组织的潜在毒性或者副作用。可以使用例如，启动子如PSA、前列腺碱性蛋白(probasin)、前列腺酸性磷酸酶或前列腺特异性腺激肽释放酶(hK2)以靶向在前列腺中的基因表达。可以使用的其它启动子/调节结构域列于表1中。

在某些适应症中，希望在基因治疗载体施用后的特定时间激活转录。这可以通过使用如激素或细胞因子可调节性的启动子实现。例如在其中适应症是产生特异类固醇或者特异类固醇输送至其的性腺组织的治疗应用中，雄激素或雌激素调节的启动子的使用将是有利的。此类激素可调节性启动子包括MMTV、MT-1、蜕皮激素和RuBisco。其它激素调节的启动子例如对甲状腺、垂体和肾上腺激素应答的那些启动子可以使用。可以使用的细胞因子和炎性蛋白应答启动子包括K和T激肽原(Kageyama等，1987)、c-fos、TNF-α、C反应蛋白(Arcone等，1988)、触珠蛋白(Oliviero等，1987)、血清淀粉状蛋白A2、C/EBPα、IL-1、IL-6(Poli和Cortese，1989)、补体C3(Wilson等，1990)、IL-8、α1酸性糖蛋白(Prowse和Baumann，1988)、α1抗胰蛋白酶、脂蛋白脂酶(Zechner等，1988)、血管紧张素原(Ron等，1990)、纤维蛋白原、c-jun(可通过佛波醇酯、TNFα、UV辐射、视黄酸和过氧化氢诱导)、胶原酶(通过佛波醇酯和视黄酸诱导)、金属硫蛋白(重金属和糖皮质激素诱导性的)、基质裂解素(可通过佛波醇酯、白细胞介素-1和EGF诱导)、α2巨球蛋白和α1抗胰凝乳蛋白酶。肿瘤特异性启动子例如骨钙素、低氧-应答元件(HRE)、MAGE-4、CEA、甲胎蛋白、GRP78/BiP和酪氨酸酶也可以用于调节肿瘤细胞内的基因表达。

此外，该启动子列表不应当解释为穷尽性的或限制性的，本领域技术人员将知道可与本公开启动子和方法结合使用的其它启动子。

表1组织特异性启动子

“组织特异性调节元件”是能够驱动基因在一种组织中转录而在其它组织类型中大多保持“沉默”的调节元件(例如启动子)。然而，应当理解，组织特异性启动子会在它们沉默的那些组织中具有可检测量的“背景”或“基础”活性。启动子在靶组织中被选择性活化的程度可以表示为选择性比(在靶组织内的活性/在对照组织内的活性)。在这一点上，用于实施本公开的组织特异性启动子有代表性地具有大于约5的选择性比。优选地，选择性比大于约15。

应当进一步理解，某些启动子的活性虽然不局限于单一组织类型，但是它们可表现出选择习性，即它们在一组组织中可以是活性的，而在另一组组织中活性较小或者沉默。此类启动子也称作是“组织特异性的”并且考虑在本公开中使用。因此，用于本公开的组织特异性调节元件可适用于调节异源蛋白，例如具有本公开胞嘧啶脱氨酶活性的多肽，以及可适用于在反转录病毒载体中作为靶向多核苷酸序列。

本公开的反转录病毒载体和CD多核苷酸和多肽可以用于治疗广范围的疾病和病症，包括许多细胞增殖性疾病和病症(见例如美国专利号4,405,712和4,650,764；Friedmann，1989，Science，244：1275-1281；Mulligan，1993，Science，260：926-932，R.Crystal，1995，Science270：404-410，它们当中每一个的全文通过引用并入本文，还可见The Development of Human Gene Therapy，Theodore Friedmann，编者，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1999.ISBN0-87969-528-5，其全文通过引用并入本文)。

本公开还提供用于治疗细胞增殖性疾病的基因治疗。此种治疗将通过向患有增殖性病症的受试者的细胞内引入适当的治疗性多核苷酸序列(例如具有胞嘧啶脱氨酶活性的本公开的多肽)实现其治疗效果。多核苷酸构建体的递送可以使用本公开的重组反转录病毒载体实现。

此外，如本文所述的治疗方法(例如基因治疗或基因递送方法)可以体内或者先体外后体内开展。例如，在用于治疗细胞增殖性疾病或病症的方法中，在基因治疗前去除大多数的肿瘤，例如手术去除或者通过辐射去除可以是有益的。在一些实施方案中，反转录病毒治疗在化学治疗之后或之前。

因此，本公开提供能够感染非分裂细胞、分裂细胞或赘生性细胞的重组反转录病毒，其中重组反转录病毒包含病毒GAG；病毒POL；病毒ENV；可操作连接至IRES的异源核酸(例如包含具有胞嘧啶脱氨酶活性的本公开多肽)；和对于包装、反转录和整合所需的顺式作用核酸序列。重组反转录病毒可以是慢病毒，例如HIV，或者可以是致癌病毒。如上所述，对于产生重组反转录病毒的方法，本公开的重组反转录病毒可进一步包括VPR、VIF、NEF、VPX、TAT、REV和VPU蛋白中的至少一种。尽管不希望被特定的理论所束缚，据信这些基因/蛋白质产物中的一种或更多种对于增加所生产的重组反转录病毒的病毒滴度而言是重要的(例如NEF)或者对于病毒体的感染和包装是必需的。

本公开还提供将核酸转移至靶细胞以提供特定核酸(例如异源序列，例如编码具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽的多核苷酸)表达的方法。因此，在另一实施方案中，本公开提供用于将异源核酸引入靶细胞中并表达的方法，包括以本公开的重组病毒感染靶细胞并且在靶细胞中表达异源核酸。如上面所提及，靶细胞可以是任何细胞类型，包括分裂细胞、非分裂细胞、赘生性细胞、永生化细胞、修饰细胞和本领域技术人员公认的其它细胞类型，只要它们能够被反转录病毒感染即可。

本公开还提供用于治疗细胞增殖性或免疫性病症的基因治疗。在一个实施方案中，细胞增殖性病症如下治疗:引入本公开的CD多核苷酸，表达多核苷酸以产生包含胞嘧啶脱氨酶活性的多肽和使细胞与一定量的5-氟胞嘧啶接触一段时间以产生细胞毒性量的5-FU。

此外，本公开提供编码本公开重组反转录病毒载体的多核苷酸序列。多核苷酸序列可以整合入多种病毒颗粒中。例如，可以用于基因治疗的多种病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒，或者优选RNA病毒如反转录病毒和更加优选的哺乳动物致癌病毒。反转录病毒载体可以是鼠、猿或人反转录病毒的衍生物。外源基因(例如异源多核苷酸序列)可以插入其中的反转录病毒载体实例包括，但不限于莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)和Rous肉瘤病毒(RSV)的衍生物。所有这些载体可以转移或整合用于选择标记的基因，以便可以鉴定和产生所转导的细胞。在又一实施方案中，本公开提供包含重组反转录病毒衍生的构建体的质粒。质粒可以直接引入到靶细胞或细胞培养物中，例如NIH3T3、HT1080(人)、CF2(狗)或其它组织培养细胞。所得到的细胞释放反转录病毒载体进入培养基中。

本公开提供多核苷酸构建体，从5’至3’包括：用于起始转录的启动子或调节区；psi包装信号；gag编码核酸序列，pol编码核酸序列；env编码核酸序列；内部核糖体进入位点核酸序列；编码标记的异源多核苷酸，治疗(例如具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽)或诊断多肽；和LTR核酸序列。在特定的实施方案中，编码具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽的异源多核苷酸还可包含编码包含UPRT或OPRT活性的多肽的区域。

如在本文别处和下面所述，部分地取决于所希望的宿主细胞、表达时限或量以及异源多核苷酸，对本公开多核苷酸构建体的不同片段(例如重组的可复制型反病毒多核苷酸)进行工程改造。本公开的可复制型反转录病毒构建体可以分成可由本领域技术人员个别修饰的许多区域。

例如，启动子可以包含具有SEQ ID NO：19、20或22的从核苷酸1至大约核苷酸582所示序列的CMV启动子并且可以包括一个或更多个的修饰(例如2-5、5-10、10-20、20-30、30-50、50-100或更多个核酸碱基)，只要修饰的启动子能够指导和起始转录即可。在一个实施方案中，启动子或调节区包含CMV-R-U5结构域多核苷酸。CMV-R-U5结构域包含来自人巨细胞病毒的立即早期启动子至MLV R-U5区。在一个实施方案中，CMV-R-U5结构域多核苷酸包含SEQ ID NO：19、20或22从大约核苷酸1至大约核苷酸1202所示序列或与SEQ ID NO：19、20或22所示序列至少95%相同的序列，其中多核苷酸促进与其可操作连接的核酸分子的转录。多核苷酸的gag结构域可以衍生自许多反转录病毒，但是有代表性地将衍生自致癌反转录病毒并且更加特别是衍生自哺乳动物致癌反转录病毒。在一个实施方案中，gag结构域包含从大约核苷酸1203至大约核苷酸2819的序列或与其具有至少95%、98%、99%或99.8%(四舍五入至十分之一)同一性的序列。多核苷酸的pol结构域将衍生自许多反转录病毒，但是有代表性地将衍生自致癌反转录病毒并且更加特别是衍生自哺乳动物致癌反转录病毒。在一个实施方案中，pol结构域包含从大约核苷酸2820至大约核苷酸6358的序列或者与其具有至少95%、98%、99%或99.9%(四舍五入至十分之一)同一性的序列。多核苷酸的env结构域可衍生自许多反转录病毒，但是有代表性地将衍生自致癌反转录病毒并且更加特别是衍生自哺乳动物致癌反转录病毒。在一些实施方案中，env编码结构域包含双嗜性env结构域。在一个实施方案中，env结构域包含从大约核苷酸6359至大约核苷酸8323的序列或者与其具有至少95%、98%、99%或99.8%(四舍五入至十分之一)同一性的序列。多核苷酸的IRES结构域可以从许多内部核糖体进入位点得到。在一个实施方案中，IRES衍生自脑心肌炎病毒。在一个实施方案中，IRES结构域包含从大约核苷酸8327至大约核苷酸8876的序列或者与其具有至少95%、98%或99%(四舍五入至十分之一)同一性的序列，只要结构域允许核糖体进入即可。异源结构域可包含本公开的胞嘧啶脱氨酶。在一个实施方案中，CD多核苷酸包含人密码子优化的序列。在又一实施方案中，CD多核苷酸编码具有胞嘧啶脱氨酶的突变体多肽，其中突变赋予提高的热稳定性(其增加解链温度(Tm)10℃使得在更广的温度范围内具有持续的动力学活性)和增加的蛋白质累积水平。在一个实施方案中，胞嘧啶脱氨酶包含SEQ ID NO：19从大约核苷酸编号8877至大约9353所示序列。异源结构域之后可以是富含多嘌呤的结构域。3’LTR可以衍生自许多反转录病毒，通常是致癌反转录病毒并且优选哺乳动物致癌反转录病毒。在一个实施方案中，3’LTR包含U3-R-U5结构域。在又一实施方案中，LTR包含SEQ IDNO：19从大约核苷酸9405至大约9998所示序列或与其具有至少95%、98%或99.5%(四舍五入至十分之一)同一性的序列。

本公开还提供重组反转录病毒载体，从5’至3’包含CMV-R-U5，来自人巨细胞病毒的立即早期启动子与MLV R-U5区的融合物；PBS，反转录酶的引物结合位点；5’剪接位点；ψ包装信号；gag，MLV组特异抗原的ORF；pol，MLV聚合酶多蛋白的ORF；3’剪接位点；4070Aenv，MLV株4070A包膜蛋白的ORF；IRES，脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点；修饰的胞嘧啶脱氨酶(热稳定的和密码子优化的)；PPT，多嘌呤区；和U3-R-U5，MLV长末端重复。该结构进一步描述于图1中。

本公开还提供包含SEQ ID NO：19、20或22所示序列的反转录病毒载体。

在另一实施方案中，本公开提供治疗患有细胞增殖性病症的受试者的方法。受试者可以是任何哺乳动物，并且优选人。受试者与本公开的重组的可复制型反转录病毒载体接触。接触可以是体内接触或先体外后体内接触。施用本公开反转录病毒载体的方法在本领域中已知并且包括，例如全身施用、局部施用、腹膜内施用、肌内施用、颅内施用、脑脊髓施用以及在肿瘤或细胞增殖性病症部位的直接施用。其它施用途径是本领域已知的。

因此，本公开包括可用于治疗细胞增殖性病症的多种药物组合物。根据本公开的药物组合物如下制备：使用媒介物、赋形剂和添加剂或助剂将本公开的包含用于治疗或者调节细胞增殖性病症的异源多核苷酸序列的反转录病毒载体制作成适宜向受试者施用的形式。经常使用的媒介物或助剂包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇和其它糖、滑石、乳蛋白质、明胶、淀粉、维生素、纤维素及其衍生物、动物和植物油、聚乙二醇和溶剂，例如无菌水、醇、甘油和多元醇。静脉内运载体包括包括流体和营养补充剂。防腐剂包括抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。其它可药用媒介物包括水溶液、非毒性赋形剂，包括盐、防腐剂、缓冲液等等，如在例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第15版，Easton：MackPublishing Co.，1405-1412，1461-1487(1975)以及The National Formulary XIV.，第14版，Washington：American Pharmaceutical Association(1975)中所描述，其内容通过引用并入本文。药物组合物的pH和不同成分的精确浓度根据本领域的常规技术调整。见Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis for Therapeutics(第7版)。

例如，但不局限于此，用于治疗细胞增殖性病症的反转录病毒载体将包括双嗜性ENV蛋白、GAG和POL蛋白、反转录病毒基因组U3区的启动子序列，和对于反转录病毒基因组在靶细胞内复制、包装和整合必需的所有顺式作用序列。

下列实施例旨在举例说明本公开，但不限制本公开。虽然此类实施例是可使用的那些实例中的典型，但是本领域技术人员已知的其它方法可备选地采用。

实施例

实施例1修饰的CD基因的构建和向质粒载体内的插入

已经对野生型酵母胞嘧啶脱氨酶基因进行基因增强作用以包括：(1)改变三个氨基酸(A23L、I140L和V108I)的三个位置突变以增加酵母胞嘧啶脱氨酶蛋白的热稳定性和(2)另外的基因序列修改以增强人密码子使用序列至无需进一步改变氨基酸序列而改善在人细胞内的蛋白质翻译效率。

对于CD设计的序列包括CD优化的、CD-UPRT(+/-连接体)和CD-OPRT酶(+/-连接体)。最终的胞嘧啶脱氨酶编码序列可在5’端包含PSI1位点(全长)并且在3’端包含Not1位点加多聚A尾用于基于PSI1/Not1盒的策略。

包含酵母胞嘧啶脱氨酶的下列序列用于克隆、优化和突变(加框的核酸包含用于后续克隆方法的限制位点：

AACACGAATGGTGACAGGGGGAATGGCAAGCAAGTGGGATCAGAAGGGTATGGACATTGCCTATGAGGAGGCGGCCTTAGGTTACAAAGAGGGTGGTGTTCCTATTGGCGGATGTCTTATCAATAACAAAGACGGAAGTGTTCTCGGTCGTGGTCACAACATGAGATTTCAAAAGGGATCCGCCACACTACATGGTGAGATCTCCACTTTGGAAAACTGTGGGAGATTAGAGGGCAAAGTGTACAAAGATACCACTTTGTATACGACGCTGTCTCCATGCGACATGTGTACAGGTGCCATCATCATGTATGGTATTCCACGCTGTGTTGTCGGTGAGAACGTTAATTTCAAAAGTAAGGGCGAGAAATATTTACAAACTAGAGGTCACGAGGTTGTTGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAAAAGATCATGAAACAATTTATCGATGAAAGACCTCAGGATTGGTTTGAAGATATTGGTGAGTAGGCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGG(SEQ ID NO：31)

下表总结基因和产生的质粒载体以及它们的名称。

表：载体构建体和名称

由Kasahara等(美国专利号6,899,871，其公开并入本文)描述的可复制型反转录病毒载体pACE-CD用作进一步修饰的基础。修饰载体(pAC3-yCD)以表达如本文所述的修饰的酵母胞嘧啶脱氨酶基因并且用在构建体中。对于最初转染的可复制反转录病毒的载体构建体简图见下1A。CMV是人CMV立即早期启动子，U3、R和U5是相应的病毒长末端重复(LTR)区。Gag、pol和env是病毒蛋白质编码区。1B和1D显示本公开的质粒构建体和序列。在承包商(Bio Basic Inc.，Markham，Ontario，加拿大)合成基因之后，将它们插入至pAC3载体骨架的Psi1–Not1位点中(图1)。通过以Psi1和Not1切割质粒pAC3-eGFP并纯化编码质粒和反转录病毒骨架的大片段(大约11kb)，正常产生质粒骨架。

A.人密码子优化的CD基因(CDopt，aka CD1，T5.0001)

Conrad等和PCT WO99/60008对人密码子优化的胞嘧啶脱氨酶的比较表明，在两者中总共91个密码子被优化，36个密码子相同，47个密码子具有第三个碱基对改变(所有均编码相同的氨基酸)并且9个密码子是不同的(然而它们编码相同的氨基酸)。在如下不同

AGC(Ser)至TCC(Ser)

CGT(Arg)至AGG(Arg)

CCA(Pro)至CCT(Pro)

的9个不同的密码子中，均具有相当的GC含量并编码相同氨基酸。上面的天然酵母基因序列分别进行密码子优化，得到下列CD基因(CD1)，并当插入至编码带有IRES的可复制型反转录病毒(RCR)的质粒载体pAC3内时称作T5.0001。

ATGGTGACCGGCGGCATGGCCTCCAAGTGGGATCAAAAGGGCATGGATATCGCTTACGAGGAGGCCGCCCTGGGCTACAAGGAGGGCGGCGTGCCTATCGGCGGCTGTCTGATCAACAACAAGGACGGCAGTGTGCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGGTTCCAGAAGGGCTCCGCCACCCTGCACGGCGAGATCTCCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTGTACAAGGACACCACCCTGTACACCACCCTGTCCCCTTGTGACATGTGTACCGGCGCTATCATCATGTACGGCATCCCTAGGTGTGTGGTGGGCGAGAACGTGAACTTCAAGTCCAAGGGCGAGAAGTACCTGCAAACCAGGGGCCACGAGGTGGTGGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAGAAGATCATGAAGCAGTTCATCGACGAGAGGCCTCAGGACTGGTTCGAGGATATCGGCGAGTGATAA AGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGG.(SEQ ID NO：32)

B.热稳定的CD基因

进行另外的修饰以增强胞嘧啶脱氨酶的稳定性。对野生型酵母胞嘧啶脱氨酶基因进行基因增强作用以包括改变三个氨基酸(A23L、I140L和V108I)的三个位置突变以增加酵母胞嘧啶脱氨酶蛋白质的热稳定性。

下列引物对用于产生本公开胞嘧啶脱氨酶多肽的基因：

正义：5'-tcgaggatatcggcgagtgaaacccgttattctttttggc-3'(SEQ ID NO：25)

反义：5'-gccaaaaagaataacgggtttcactcgccgatatcctcga-3'(SEQ ID NO：26)

正义：

5'tcggcgagtgatccggcggcggcgcctccggcggcggcgcctccggcggcggcgcctccggcggcggcgccaa cccgttatt-3'(SEQ ID NO：27)

反义：

5'-aataacgggttggcgccgccgccggaggcgccgccgccggaggcgccgccgccggaggcgccgccgccggat cactcgccga-3'(SEQ ID NO：28)

为了提高天然酵母CD的稳定性，将三个氨基酸取代工程改造入蛋白质中。这些取代是单独的或者与人密码子优化相组合。

三个氨基酸取代是A23L、V108I、I140L。编码这些取代的序列示于下面。ATGGTGACAGGGGGAATGGCAAGCAAGTGGGATCAGAAGGGTATGGACATTGCCTATGAGGAGGCGTTATTAGGTTACAAAGAGGGTGGTGTTCCTATTGGCGGATGTCTTATCAATAACAAAGACGGAAGTGTTCTCGGTCGTGGTCACAACATGAGATTTCAAAAGGGATCCGCCACACTACATGGTGAGATCTCCACTTTGGAAAACTGTGGGAGATTAGAGGGCAAAGTGTACAAAGATACCACTTTGTATACGACGCTGTCTCCATGCGACATGTGTACAGGTGCCATCATCATGTATGGTATTCCACGCTGTGTCATCGGTGAGAACGTTAATTTCAAAAGTAAGGGCGAGAAATATTTACAAACTAGAGGTCACGAGGTTGTTGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAAAAGTTAATGAAACAATTTATCGATGAAAGACCTCAGGATTGGTTTGAAGATATTGGTGAGTAGGCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGG(SEQ ID NO：33)

所编码的多肽包含下列序列(取代的氨基酸用粗体加下划线表示)：

1MVTGGMASKWDQKGMDIAYEEALLGYKEGGVPIGGCLINNKDGSVLGRGHNMRFQKGSAT61LHGEISTLENCGRLEGKVYKDTTLYTTLSPCDMCTGAIIMYGIPRCVIGENVNFKSKGEK121YLQTRGHEVVVVDDERCKKLMKQFIDERPQDWFEDIGE-

最终的构建体设计整合入利用优选密码子的3个氨基酸取代A23L/V108I/I140L并在整个序列中使用优选的人密码子使用(该基因被称作CDopt+3pt[aka CD2]，当插入编码带有IRES的RCR的质粒载体pAC3时称为T5.0002)(SEQ ID NO：34)：

1ATGGTGACCGGCGGCATGGCCTCCAAGTGGGATCAAAAGGGCATGGATATCGCTTACGAG61GAGGCCCTGCTGGGCTACAAGGAGGGCGGCGTGCCTATCGGCGGCTGTCTGATCAACAAC121AAGGACGGCAGTGTGCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGGTTCCAGAAGGGCTCCGCCACC181CTGCACGGCGAGATCTCCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTGTACAAG241GACACCACCCTGTACACCACCCTGTCCCCTTGTGACATGTGTACCGGCGCTATCATCATG301TACGGCATCCCTAGGTGTGTGATCGGCGAGAACGTGAACTTCAAGTCCAAGGGCGAGAAG361TACCTGCAAACCAGGGGCCACGAGGTGGTGGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAGAAGCTG421ATGAAGCAGTTCATCGACGAGAGGCCTCAGGACTGGTTCGAGGATATCGGCGAGTGATAA

加下划线的密码子表示用于氨基酸取代的优选密码子。

CD优化的序列设计(人密码子优先性+3个氨基酸取代)

AACACGAATGGTGACCGGCGGCATGGCCTCCAAGTGGGATCAAAAGGGCATGGATATCGCTTACGAGGAGGCCCTGCTGGGCTACAAGGAGGGCGGCGTGCCTATCGGCGGCTGTCTGATCAACAACAAGGACGGCAGTGTGCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGGTTCCAGAAGGGCTCCGCCACCCTGCACGGCGAGATCTCCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTGTACAAGGACACCACCCTGTACACCACCCTGTCCCCTTGTGACATGTGTACCGGCGCTATCATCATGTACGGCATCCCTAGGTGTGTGATCGGCGAGAACGTGAACTTCAAGTCCAAGGGCGAGAAGTACCTGCAAACCAGGGGCCACGAGGTGGTGGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAGAAGCTGATGAAGCAGTTCATCGACGAGAGGCCTCAGGACTGGTTCGAGGATATCGGCGAGTAAGCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGG(SEQ ID NO:35)

C.CD-UPRT融合基因(CDopt+3pt-UPRT，[aka CDopt-UPRT和CD2-UPRT]，在pAC3质粒RCR载体中为T5.0003)的构建

还开发包含连接至UPRT多肽的如上所述CD多肽的融合构建体以使用如图2A中所述方案I产生CD优化的-UPRT序列。下列引物用于删除CD和UPRT之间的终止密码子-起始密码子。

引物序列：

所得到的融合多核苷酸包含1296bp和下面紧接描述的序列：

AACACGAATGGTGACCGGCGGCATGGCCTCCAAGTGGGATCAAAAGGGCATGGATATCGCTTACGAGGAGGCCCTGCTGGGCTACAAGGAGGGCGGCGTGCCTATCGGCGGCTGTCTGATCAACAACAAGGACGGCAGTGTGCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGGTTCCAGAAGGGCTCCGCCACCCTGCACGGCGAGATCTCCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTGTACAAGGACACCACCCTGTACACCACCCTGTCCCCTTGTGACATGTGTACCGGCGCTATCATCATGTACGGCATCCCTAGGTGTGTGATCGGCGAGAACGTGAACTTCAAGTCCAAGGGCGAGAAGTACCTGCAAACCAGGGGCCACGAGGTGGTGGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAGAAGCTGATGAAGCAGTTCATCGACGAGAGGCCTCAGGACTGGTTCGAGGATATCGGCGAGAACCCGTTATTCTTTTTGGCTTCTCCATTCTTGTACCTTACATATCTTATATATTATCCAAACAAAGGGTCTTTCGTTAGCAAACCTAGAAATCTGCAAAAAATGTCTTCGGAACCATTTAAGAACGTCTACTTGCTACCTCAAACAAACCAATTGCTGGGTTTGTACACCATCATCAGAAATAAGAATACAACTAGACCTGATTTCATTTTCTACTCCGATAGAATCATCAGATTGTTGGTTGAAGAAGGTTTGAACCATCTACCTGTGCAAAAGCAAATTGTGGAAACTGACACCAACGAAAACTTCGAAGGTGTCTCATTCATGGGTAAAATCTGTGGTGTTTCCATTGTCAGAGCTGGTGAATCGATGGAGCAAGGATTAAGAGACTGTTGTAGGTCTGTGCGTATCGGTAAAATTTTAATTCAAAGGGACGAGGAGACTGCTTTACCAAAGTTATTCTACGAAAAATTACCAGAGGATATATCTGAAAGGTATGTCTTCCTATTAGACCCAATGCTGGCCACCGGTGGTAGTGCTATCATGGCTACAGAAGTCTTGATTAAGAGAGGTGTTAAGCCAGAGAGAATTTACTTCTTAAACCTAATCTGTAGTAAGGAAGGGATTGAAAAATACCATGCCGCCTTCCCAGAGGTCAGAATTGTTACTGGTGCCCTCGACAGAGGTCTAGATGAAAACAAGTATCTAGTTCCAGGGTTGGGTGACTTTGGTGACAGATACTACTGTGTTTAAGCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGG(SEQ ID NO：38)

D.CD-连接体UPRT融合基因(CDopt+3pt-LINK-UPRT[aka CDopt-连接体-UPRT和 CD2-L-UPRT])的构建.

还通过将连接体(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)₄结构域符合读框地克隆入CD多肽与UPRT多肽之间而开发融合构建体，以使用如2B中所述方案II产生CD优化的-连接体-UPRT序列。下列引物用于插入连接体。

所得到的构建体大小为1356bp并具有下面紧接的序列：

AACACGAATGGTGACCGGCGGCATGGCCTCCAAGTGGGATCAAAAGGGCATGGATATCGCTTACGAGGAGGCCCTGCTGGGCTACAAGGAGGGCGGCGTGCCTATCGGCGGCTGTCTGATCAACAACAAGGACGGCAGTGTGCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGGTTCCAGAAGGGCTCCGCCACCCTGCACGGCGAGATCTCCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTGTACAAGGACACCACCCTGTACACCACCCTGTCCCCTTGTGACATGTGTACCGGCGCTATCATCATGTACGGCATCCCTAGGTGTGTGATCGGCGAGAACGTGAACTTCAAGTCCAAGGGCGAGAAGTACCTGCAAACCAGGGGCCACGAGGTGGTGGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAGAAGCTGATGAAGCAGTTCATCGACGAGAGGCCTCAGGACTGGTTCGAGGATATCGGCGAGTCCGGCGGCGGCGCCTCCGGCGGCGGCGCCTCCGGCGGCGG CGCCTCCGGCGGCGGCGCCAACCCGTTATTCTTTTTGGCTTCTCCATTCTTGTACCTTACATATCTTATATATTATCCAAACAAAGGGTCTTTCGTTAGCAAACCTAGAAATCTGCAAAAAATGTCTTCGGAACCATTTAAGAACGTCTACTTGCTACCTCAAACAAACCAATTGCTGGGTTTGTACACCATCATCAGAAATAAGAATACAACTAGACCTGATTTCATTTTCTACTCCGATAGAATCATCAGATTGTTGGTTGAAGAAGGTTTGAACCATCTACCTGTGCAAAAGCAAATTGTGGAAACTGACACCAACGAAAACTTCGAAGGTGTCTCATTCATGGGTAAAATCTGTGGTGTTTCCATTGTCAGAGCTGGTGAATCGATGGAGCAAGGATTAAGAGACTGTTGTAGGTCTGTGCGTATCGGTAAAATTTTAATTCAAAGGGACGAGGAGACTGCTTTACCAAAGTTATTCTACGAAAAATTACCAGAGGATATATCTGAAAGGTATGTCTTCCTATTAGACCCAATGCTGGCCACCGGTGGTAGTGCTATCATGGCTACAGAAGTCTTGATTAAGAGAGGTGTTAAGCCAGAGAGAATTTACTTCTTAAACCTAATCTGTAGTAAGGAAGGGATTGAAAAATACCATGCCGCCTTCCCAGAGGTCAGAATTGTTACTGGTGCCCTCGACAGAGGTCTAGATGAAAACAAGTATCTAGTTCCAGGGTTGGGTGACTTTGGTGACAGATACTACTGTGTTTAAGCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGG(SEQ ID NO：41)

E.CD-OPRT融合基因(CDopt+3pt-OPRT[aka CDopt-OPRT和CD2-OPRT]，当插入至 pAC3质粒RCR载体时为T5.0004)的构建

还开发包含连接至OPRT多肽的如上所述CD多肽的融合构建体，以使用如图2C所示方案III产生CD优化的-OPRT酶(CD人源化的+3pt突变+人OPRT酶功能结构域)。

所得到的构建体包含1269bp的大小和下面紧接的序列：

AACACGAATGGTGACCGGCGGCATGGCCTCCAAGTGGGATCAAAAGGGCATGGATATCGCTTACGAGGAGGCCCTGCTGGGCTACAAGGAGGGCGGCGTGCCTATCGGCGGCTGTCTGATCAACAACAAGGACGGCAGTGTGCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGGTTCCAGAAGGGCTCCGCCACCCTGCACGGCGAGATCTCCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTGTACAAGGACACCACCCTGTACACCACCCTGTCCCCTTGTGACATGTGTACCGGCGCTATCATCATGTACGGCATCCCTAGGTGTGTGATCGGCGAGAACGTGAACTTCAAGTCCAAGGGCGAGAAGTACCTGCAAACCAGGGGCCACGAGGTGGTGGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAGAAGCTGATGAAGCAGTTCATCGACGAGAGGCCTCAGGACTGGTTCGAGGATATCGGCGAGGCGGTCGCTCGTGcagctttggggccattggtgacgggtctgtacgacgtgcaggctttcaagtttggggacttcgtgctgaagagcgggctttcctcccccatctacatcgatctgcggggcatcgtgtctcgaccgcgtcttctgagtcaggttgcagatattttattccaaactgcccaaaatgcaggcatcagttttgacaccgtgtgtggagtgccttatacagctttgccattggctacagttatctgttcaaccaatcaaattccaatgcttattagaaggaaagaaacaaaggattatggaactaagcgtcttgtagaaggaactattaatccaggagaaacctgtttaatcattgaagatgttgtcaccagtggatctagtgttttggaaactgttgaggttcttcagaaggagggcttgaaggtcactgatgccatagtgctgttggacagagagcagggaggcaaggacaagttgcaggcgcacgggatccgcctccactcagtgtgtacattgtccaaaatgctggagattctcgagcagcagaaaaaagttgatgctgagacagttgggagagtgaagaggtttattcaggagaatgtctttgtggcagcgaatcataatggttctcccctttctataaaggaagcacccaaagaactcaGCTTCGGTGCACGTGCAGAGCTGCCCAGGATCCACCCAGTTGCATCGAAGTAAGCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGG(SEQ ID NO：42)

F.CD-连接体-OPRT融合基因(CDopt+3pt-LINK-OPRT，[aka CDopt-连接体-OPRT和 CD2-L-OPRT]，在pAC3质粒RCR载体中时为T5.0005)的构建

还通过将连接体(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)₄)结构域符合读框地克隆入CD多肽与OPRT多肽之间开发融合构建体，以使用如图2D所示的方案IV产生CD优化的-连接体-OPRT序列。

所得到的构建体包含1329bp大小和下面紧接的序列：AACACGAATGGTGACCGGCGGCATGGCCTCCAAGTGGGATCAAAAGGGCATGGATATCGCTTACGAGGAGGCCCTGCTGGGCTACAAGGAGGGCGGCGTGCCTATCGGCGGCTGTCTGATCAACAACAAGGACGGCAGTGTGCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGGTTCCAGAAGGGCTCCGCCACCCTGCACGGCGAGATCTCCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTGTACAAGGACACCACCCTGTACACCACCCTGTCCCCTTGTGACATGTGTACCGGCGCTATCATCATGTACGGCATCCCTAGGTGTGTGATCGGCGAGAACGTGAACTTCAAGTCCAAGGGCGAGAAGTACCTGCAAACCAGGGGCCACGAGGTGGTGGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAGAAGCTGATGAAGCAGTTCATCGACGAGAGGCCTCAGGACTGGTTCGAGGATATCGGCGAGTCCGGCGGCGGCGCCTCCGGCGGCGGCGCCTCCGGCGGCGGCGCCTCCGGCGGCGGCGCCGCGGTCGCTCGTGcagctttggggccattggtgacgggtctgtacgacgtgcaggctttcaagtttggggacttcgtgctgaagagcgggctttcctcccccatctacatcgatctgcggggcatcgtgtctcgaccgcgtcttctgagtcaggttgcagatattttattccaaactgcccaaaatgcaggcatcagttttgacaccgtgtgtggagtgccttatacagctttgccattggctacagttatctgttcaaccaatcaaattccaatgcttattagaaggaaagaaacaaaggattatggaactaagcgtcttgtagaaggaactattaatccaggagaaacctgtttaatcattgaagatgttgtcaccagtggatctagtgttttggaaactgttgaggttcttcagaaggagggcttgaaggtcactgatgccatagtgctgttggacagagagcagggaggcaaggacaagttgcaggcgcacgggatccgcctccactcagtgtgtacattgtccaaaatgctggagattctcgagcagcagaaaaaagttgatgctgagacagttgggagagtgaagaggtttattcaggagaatgtctttgtggcagcgaatcataatggttctcccctttctataaaggaagcacccaaagaactcaGCTTCGGTGCACGTGCAGAGCTGCCCAGGATCCACCCAGTTGCATCGAAGTAAGCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGG.(SEQ ID NO：43)

实施例2感染性载体的产生

可以以许多种方式产生载体，但是第一步是将质粒DNA载体引入到细胞中以允许产生感染性颗粒，然后可从细胞上清液中收获感染性颗粒。一旦已经产生感染性颗粒，本领域技术人员可以实施其它生产方法。通过瞬时转染293T细胞产生病毒颗粒(Pear等ProcNatl Acad Sci U S A.90：8392-83961993)。将293T细胞解冻并培养，然后两次传代至包含15mL DMEM培养基的T-75培养瓶中，通过混合DMEM高葡萄糖培养基(Hyclone#30081，500mL)与FBS(Hyclone#SH30070，50mL)、L-谷氨酰胺(Cellgro#25-005-CI，5mL)、NEAA(Hyclone#SH30238，5mL)和青霉素-链霉素(Cellgro#30-002-CI，5mL)制备DMEM培养基。将培养瓶于37℃和5%CO₂下孵育。在第三次传代后，将细胞以1.8×10⁶个细胞/T-25(或7.2×10⁴个细胞/cm²)的细胞密度接种于6个T-25培养瓶中，每个培养瓶包含5mL的培养基。在接种至T-25培养瓶中一天后，使用来自Promega的磷酸钙转染试剂盒(目录号E1200)，以表达病毒载体的T5.0002质粒转染细胞。转染后18小时，一组培养瓶(每组3个培养瓶)中的培养基被换成包含10mM NaB的新鲜培养基。第二组培养瓶中的培养基不替换，充当对照(零NaB)。在NaB处理后8小时，将所有培养瓶中的培养基换成不包含NaB的新鲜培养基。对于两组培养瓶允许其表达持续至第二天(22小时的持续时间)。收获来自两组培养瓶的上清液并通过qPCR测定它们的滴度，表示为转导单位(TU)/ml(见实施例3)。

滴度结果示于下表中。

条件	第一次滴度	第二次滴度(在于-80℃储存68天后)
			无NaB	1.5(±0.05)x106TU/mL	1.2(±0.2)x106TU/mL
10mM NaB	1.4(±0.3)x106TU/mL	7.0(±0.14)x105TU/mL

以此种方式在无丁酸钠的情况下产生随后的载体制剂。其它载体质粒已经以相同方式用于产生具有10e5TU/ml和10e7TU/ml之间滴度的载体制剂。如果希望的话，此类物质可进一步纯化和浓缩，如下所述并且还可见US5792643；T.Rodriguez等J Gene Med9：2332007；美国申请61218063。在本公开的某些实施方案中，剂量方案通过脑重量的克数计算。在此类实施方案中，用于治疗方法的本公开可复制型反转录病毒载体的剂量范围可以从10³至10⁷TU/g脑重。

实施例3定量PCR滴度测定

使用基于定量PCR(qPCR)的方法测定功能性载体浓度或滴度。在该方法中，通过以标准体积的载体感染可转导宿主细胞系(例如PC-3人前列腺癌细胞，ATCC目录号CRL-1435)并测量转导后宿主细胞内存在的原病毒的最终数量，对载体进行滴度测定。将细胞和载体在标准培养条件下(37℃，5%CO₂)孵育24小时，允许在加入抗反转录病毒AZT以终止载体复制之前完全感染。接着，从培养皿收获细胞并使用Invitrogen Purelink gDNA纯化试剂盒纯化基因组DNA(gDNA)并用无菌的无RNA酶/DNA酶的水从纯化柱中洗脱。在分光光度计上测量A260/A280吸光度比值以测定样品的浓度和相对纯度。用额外的无RNA酶/DNA酶的水将gDNA浓度标准化至任何给定组gDNA制剂的最低浓度，使得用于qPCR的输入DNA对于所分析的所有样品都是恒定的。通过将每一样品的等分试样在溴化乙锭染色的0.8%琼脂糖凝胶上电泳进一步评价基因组DNA的纯度。如果样品的A260/A280吸光度范围在1.8-2.0之间并且显示单一gDNA条带，则样品可以用于qPCR分析载体的原病毒拷贝数。使用鉴定原病毒LTR区(整合入宿主gDNA的反转录载体DNA和载体DNA)的引物，开展qPCR以评价当已知量的载体用于转导已知数量的细胞时发生的转导事件的总数。每一反应的转导事件的数量从标准曲线计算，标准曲线是利用从1E7至1E1拷贝的系列稀释的已知拷贝数的携带靶标的质粒并在与样品相同的qRCR条件下测量得出。了解了多少基因组等价物被用于每一qPCR(根据先前测定的浓度)和每一反应发生多少转导事件后，我们基于在转导时存在的细胞总数确定了所出现的转导事件总数。该数值是在最初转导过程中稀释进入包含细胞的培养基之后的载体滴度。为了计算校正的滴度值，通过乘以培养基体积和滴度体积并除以滴度体积校正稀释度。这些实验在一式两份培养物中开展并且通过qPCR分析，对于每一条件使用一式三份测量，以测定平均滴度以及与其伴随的标准偏差和变异系数。

实施例4通过Western印迹测量的表达水平

图3表明，在以编码野生型(ACE-yCD)或全优化的(AC3-yCD2)胞嘧啶脱氨酶基因的病毒所感染的U-87细胞的Western印迹分析中，观察到与野生型yCD蛋白质相比，以用于较高稳定性的3个突变进行优化的人密码子具有较高的水平。

实施例5病毒载体的遗传稳定性。

公认的是，在反转录和第一次整合入所处理细胞内之后，DNA原病毒和任何后代反转录病毒在任一端具有来自MLV的常规LTR结构。该结构已经表明在多次感染循环之后是稳定的(见下图4)。

大约10⁶个幼稚U-87细胞用病毒载体以0.01的MOI最初感染，并生长至完全感染以完成单次感染周期。然后将上清液再传代于未感染细胞上并重复循环。yCD2序列的基因组稳定性通过使用位于转基因插入位点侧翼的MLV特异性引物从感染细胞中PCR扩增所整合的原病毒来评价。对于每一组感染，还开展载体质粒(pAC3-yCD2和Kasahara等载体pACE-CD)的扩增以跟踪在凝胶上分开的全长扩增子。小于全长扩增子的任何条带的出现将是载体不稳定的指示剂。此类实验表明本公开的载体(T5.0002–包含所修饰的载体和CDopt+3pt(CD2)异源多核苷酸)的稳定性比均携带野生型酵母的pACE-CD或T5.0007维持更多代。

实施例6细胞杀死实验

体外细胞培养实验表明，通过在以从pAC3-yCD2/T5.0002)[AC3-yCD2(V)]、从pAC3-yCD/T5.0007[AC3-yCD(V)]或其它载体制造的病毒感染的RG2大鼠细胞(图5A)或U-87细胞(图5B)上开展5-FC滴定，在表达yCD2蛋白的细胞中胞嘧啶脱氨酶至少与来自表达野生型yCD蛋白的细胞中的胞嘧啶脱氨酶有一样的活性。简言之，对于U-87细胞，以0.1的感染复数(即100%感染的)用AC3-yCD(野生型CD)载体或AC3-yCD2(热稳定化和密码子优化的)载体感染5天后5-FC的量增加或者作为阳性对照8天后为0.1mM5-FU。在5-FC处理第8天，使用MTS测定(Promega CellTiter96AQUEOUS One Solution Proliferation Assay)评价细胞培养物的生存力。数据显示，在增加剂量的5-FC处理时在两种反转录病毒载体之间具有相当的杀死结果。相似地处理RG2培养物并且也显示，根据T5.0002CD表达测定杀死曲线，，对于病毒，则是向低浓度5-FC方向稍稍移动(如果有的话)。U87细胞以0.1的感染复数(MOI)转导，培养5天使病毒传播并收获转导5天后的细胞。然后通过800×g离心5分钟收集细胞。从细胞沉淀中吸出上清液并用5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤并再次以800×g离心5分钟。所得到的细胞沉淀置于1.5mL PBS中，通过移液器吸头而重悬并置于-20℃的冰箱中。通过冻/融方法裂解细胞。将先前重悬的细胞在室温下融化，通过移液器吸头，与蛋白酶抑制剂混合物混合并再次在-20℃下冻结。在酶测定之前，再次将样品在室温下融化并经过移液器吸头。然后在台式离心机中以14,000rpm离心悬浮液5分钟。将上清液从沉淀中倾析出并置于新的eppendorf管中并置于冰上。yCD酶活性通过使用HPLC测定法评价。

HPLC测定在与光阵列检测器和自动注射器串联的Shimadzu LC20AT元件上开展。固相是具有5um球大小和4.0×250mm柱尺寸的Hypersil BDS C18HPLC柱。移动相是50mM磷酸铵，pH2.1，包含0.01%叔丁基高氯酸铵和5%甲醇；系统在22℃下平衡。所有试剂是ACS级的并且溶剂是HPLC级的。在PBS中制作由终浓度为0.125mg/mL5FC(1mM)的800μL组成的反应混合物并置于1.5mL自动采样瓶中。然后通过加入200uL的每一细胞裂解液起始反应。反应/自动采样瓶置于自动采样器上并注射5uL的反应混合物。定时设置时间点以从每一反应瓶中取出5uL等分试样并在HPLC柱上分析。通过与根据先前产生的5FU标准曲线的具有已知量的峰面积相比较，计算5FC至5FU的转变率。通过将所产生的5FU的量(单位nmol)对其相应的时间间隔作图得到5FC至5FU的转变率。得到细胞样品的蛋白质浓度并且通过将转变率(nmol/min)除以在测定中使用的以mg计的蛋白质量计算细胞裂解物样品的比活性。图6显示在以0.1MOI转导5天后不同载体的比活性。数据表明，就组织培养细胞内胞嘧啶脱氨酶的比活性而言，pACE-yCD(T5.0000)<pAC3-yCD1(T5.0001)<pAC3-CD2(T5.0002)。

实施例7.与以未修饰的酵母CD基因治疗的肿瘤相比，以完全修饰的CD基因(yCD2) 治疗的肿瘤更有效的被消除并且没有复发(PR-01-08-001)。

为了测定哪一个载体构建体在皮下小鼠/人异种移植模型中产生最有效的载体，评价了三个不同的构建体：T5.0001(部分修饰的CD)；T5.0007(未修饰的酵母CD基因)；T5.0002(完全修饰的yCD2基因)。在人神经胶质瘤(U87)在免疫缺陷小鼠中的皮下模型中评价5-FC前体药物施用后的肿瘤生长、存活和肿瘤退化。评价两个不同的5-FC浓度以确定在5-FC和肿瘤载体构建体之间看到的剂量反应。

研究了总共12组，每组由9-11只雌性小鼠组成。在第0天所有小鼠进行下列的右背侧植入：或者98%的非感染U-87肿瘤细胞系的混合物和2%的已经以三种TOCA511载体构建体(T5.0002、T5.0001、T5.0007)之一感染的U-87细胞系的混合物；或者未感染的对照U-87细胞系(100%)。小鼠以2×10e6个细胞/小鼠接种。第1-3组中的小鼠具有未感染的U87细胞，第4-6组具有包含转导的T5.0002U87的U87细胞混合物，第7-9组具有包含以T5.0001转导的U87细胞混合物，并且第10-12组具有包含以T5.0007转导的U87细胞混合物。使肿瘤生长6天，直到肿瘤大小为大约100mm³。每一载体剂量组的小鼠在第6天开始作为单次IP注射施用随机接受两种5-FC剂量之一(200或者500mg/kg/天)或不接受5-FC。每天持续5-FC施用连续28天。在第29天后存活的小鼠用于评价肿瘤大小，然后在不同天时处死，如果有肿瘤的话则取出肿瘤用于分析。在第29天时，来自第4-12组的小鼠重新随机化并且将小鼠再分为2个亚组(或者继续5-FC施用以监测肿瘤退化或者中断5-FC治疗以监测肿瘤再生长)。

结果：以T5.0002、T5.0000和T5.0007治疗的肿瘤均表明以200和500mg/kg的剂量在第29天时肿瘤退化至检测不到。在中断5FC治疗后所有的T5.0002治疗的动物没有再形成肿瘤，达39天。与此相比，以T5.0001和T5.0007治疗的一些肿瘤在39天的时间点时复发。实验在第39天终止。

结论：T5.0002加5-FC是比T5.0001或T5.0007加5-FC更有效的抗肿瘤治疗法。

已经描述了本公开的许多实施方案。然而，应当理解可以在不脱离本公开的精神和范围的情况下做出多种修改。因此，其它实施方案处于后附权利要求书的范围内。

Claims

1.重组的可复制型哺乳动物致癌反转录病毒载体，其包含分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸插入至pAC3中，其中该分离的多核苷酸包含：

编码SEQ ID NO：4的多肽的、人密码子优化的SEQ ID NO：19从核苷酸编号8877至9353的序列的多核苷酸，其中所述多肽具有胞嘧啶脱氨酶(CD)活性。

2.权利要求1的重组的可复制型哺乳动物致癌反转录病毒载体，其中所述反转录病毒载体包含SEQ ID NO：19所示的序列。

3.权利要求1的重组的可复制型哺乳动物致癌反转录病毒载体，其中所述分离的多核苷酸还包含编码具有UPRT或OPRT活性的多肽的UPRT或OPRT多核苷酸，所述具有UPRT或OPRT活性的多肽可操作连接至具有CD活性的多肽。

4.权利要求3的重组的可复制型哺乳动物致癌反转录病毒载体，其中UPRT或OPRT多核苷酸是密码子优化的。

5.权利要求3的重组的可复制型哺乳动物致癌反转录病毒载体，其中UPRT或OPRT多核苷酸通过连接体与编码具有CD活性的多肽的多核苷酸分开。

6.含有权利要求1-5任一项的重组的可复制型哺乳动物致癌反转录病毒载体的宿主细胞。

7.权利要求6的宿主细胞，其中所述宿主细胞包括人细胞。

8.权利要求7的宿主细胞，其中所述宿主细胞包括细胞增殖性病症的细胞。

9.权利要求7的宿主细胞，其中所述宿主细胞包括稳定转化的人细胞。

10.权利要求9的宿主细胞，其中所述宿主细胞包括细胞增殖性病症的细胞。

11.权利要求8或10的宿主细胞，其中所述宿主细胞包括多形性成胶质细胞瘤的细胞。

12.权利要求1的重组的可复制型哺乳动物致癌反转录病毒载体与5-氟胞嘧啶在制备治疗患有细胞增殖性病症的受试者的药物中的用途。

13.权利要求12的用途，其中反转录病毒载体包含SEQ ID NO：19所示的序列。

14.权利要求12的用途，其中细胞增殖性病症是多形性成胶质细胞瘤。

15.权利要求12的用途，其中细胞增殖性病症选自肺癌、结肠-直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、泌尿道癌、子宫癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、黑素瘤、胃癌和卵巢癌。

16.分离的多核苷酸在用于增加重组的可复制型哺乳动物致癌反转录病毒载体的复制稳定性的用途，所述载体包含所述分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸插入至pAC3中，其中所述分离的多核苷酸包含编码SEQ ID NO：4的多肽的、人密码子优化的SEQ ID NO：19从核苷酸编号8877至9353的序列的多核苷酸，其中所述多肽具有胞嘧啶脱氨酶(CD)活性。

17.权利要求16的用途，其中所述反转录病毒载体包含SEQ ID NO：19所示的序列。

18.权利要求16的用途，其中所述分离的多核苷酸还包含编码具有UPRT或OPRT活性的多肽的UPRT或OPRT多核苷酸，所述具有UPRT或OPRT活性的多肽可操作连接至具有CD活性的多肽。

19.权利要求18的用途，其中UPRT或OPRT多核苷酸是密码子优化的。

20.权利要求18的用途，其中UPRT或OPRT多核苷酸通过连接体与编码具有CD活性的多肽的多核苷酸分开。