CN102227503A - 重组载体 - Google Patents

重组载体 Download PDF

Info

Publication number
CN102227503A
CN102227503A CN2009801475151A CN200980147515A CN102227503A CN 102227503 A CN102227503 A CN 102227503A CN 2009801475151 A CN2009801475151 A CN 2009801475151A CN 200980147515 A CN200980147515 A CN 200980147515A CN 102227503 A CN102227503 A CN 102227503A
Authority
CN
China
Prior art keywords
retrovirus
cell
sequence
polynucleotide
carrier
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2009801475151A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102227503B (zh
Inventor
哈利·E·格鲁贝尔
道格拉斯·乔利
奥马尔·佩雷斯
克里斯托弗·R·洛格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suoyuan Biomedical Usa Co ltd
Original Assignee
Tocagen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tocagen Inc filed Critical Tocagen Inc
Priority to CN201510624987.9A priority Critical patent/CN105624193B/zh
Publication of CN102227503A publication Critical patent/CN102227503A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102227503B publication Critical patent/CN102227503B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/04—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amidines (3.5.4)
    • C12Y305/04001—Cytosine deaminase (3.5.4.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/10—Vectors comprising a special translation-regulating system regulates levels of translation
    • C12N2840/102—Vectors comprising a special translation-regulating system regulates levels of translation inhibiting translation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本公开书提供经修饰的胞嘧啶脱氨酶(CD)。本公开书进一步涉及表达或包含所述经修饰CD的细胞和载体，和使用所述经修饰CD治疗疾病和失调的方法。

Description

重组载体
相关申请的交叉参考
本申请主张2008年9月26日提交的美国临时申请第61/100,666号、200年12月8日提交的美国临时申请第61/120,618号和2009年6月13日提交的美国临时申请第61/186,823号的优先权，其揭示内容以引用方式并入本文中。
技术领域
本公开书涉及用于治疗细胞增殖的可复制逆转录病毒载体。本公开书另外涉及使用所述可复制逆转录病毒载体递送和表达异源核酸。
背景技术
对细胞和受试对象递送基因和异源核酸的有效方法一直是科学研发和疾病和失调的可能疗法的研究目标。
发明内容
本公开书提供一种重组可复制逆转录病毒(RCR)，其包含：逆转录病毒GAG蛋白；逆转录病毒POL蛋白；逆转录病毒包膜；逆转录病毒多聚核苷酸，其包含位于逆转录病毒多聚核苷酸序列3’端的长末端重复(LTR)序列、位于逆转录病毒多聚核苷酸5’端的启动子序列、gag核酸域、pol核酸域和env核酸域，所述启动子适合在哺乳动物细胞中表达；盒，其包含可操作地连接于异源多聚核苷酸的内部核糖体进入位点(IRES)，其中所述盒位于3’LTR的5’和编码逆转录病毒包膜的env核酸域的3’；和靶细胞中的逆转录、包装和整合所必需的顺式作用序列，其中与pACE载体(SEQ ID NO：21)相比，RCR在6次传代后保持较高的复制能力。在一个实施方案中，逆转录病毒多聚核苷酸序列来源于鼠白血病病毒(MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、猫白血病病毒(FeLV)或长臂猿白血病病毒(GALV)。在另一个实施方案中，MLV是双嗜性MLV。在另一个实施方案中，逆转录病毒是致癌逆转录病毒或γ逆转录病毒。在另一个实施方案中，靶细胞是具有细胞增殖失调的细胞。细胞增殖失调可选自由(但不限于)肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、黑素瘤、胃癌和卵巢癌、类风湿性关节炎和其它自身免疫疾病组成的组。在一个实施方案中，启动子包括具有如SEQ ID NO：19、20或22的核苷酸1到约核苷酸582所述的序列的CMV启动子，且可包含对一个或多个核酸碱基的修饰，所述启动子能引导和引发转录。在另一个实施方案中，启动子包括如SEQ ID NO：19、20或22的核苷酸1到约核苷酸582所述的序列。在另一个实施方案中，启动子包括CMV-R-U5域多聚核苷酸。在一个实施方案中，CMV-R-U5域包括与MLV R-U5区域连接的来自人类巨细胞病毒的立即早期启动子。在另一个实施方案中，CMV-R-U5域多聚核苷酸包括如SEQ ID NO：19、20或22的约核苷酸1到约核苷酸1202所述的序列，或与如SEQ ID NO：19、20或22所述的序列具有至少95％同一性的序列，其中所述多聚核苷酸促进与其可操作地连接的核酸分子的转录。在另一个实施方案中，多聚核苷酸的gag和pol来源于致癌逆转录病毒或γ逆转录病毒。gag核酸域可包括SEQ ID NO：19或22的约核苷酸编号1203到约核苷酸2819的序列，或与其具有至少95％、98％、99％或99.8％同一性的序列。pol域可包括SEQ ID NO：19或22的约核苷酸编号2820到约核苷酸6358的序列，或与其具有至少95％、98％、99％或99.9％同一性的序列。在一个实施方案中，env域编码双嗜性env蛋白。env域可包含SEQ ID NO：19或22的约核苷酸编号6359到约核苷酸8323的序列，或与其具有至少95％、98％、99％或99.8％同一性的序列。载体的IRES域可以是任何IRES，但在一个实施方案中，IRES来源于脑心肌炎病毒。在另一个实施方案中，IRES包括SEQ ID NO：19或22的约核苷酸编号8327到约核苷酸8876的序列，或与其具有至少95％、98％或99％同一性的序列。
载体可包含任何数量的不同的异源多聚核苷酸。举例来说，异源多聚核苷酸可包含细胞因子、siRNA、miRNA或RNAi分子、靶向序列、结合域、细胞毒性基因、单链抗体或其任何组合。当异源多聚核苷酸是用于例如siRNA、miRNA或RNAi等非翻译RNA时，不需要IRES，但也可包括IRES以用于另一种被翻译基因RNA，且可使用任何种类的逆转录病毒。在另一个实施方案中，异源多聚核苷酸包括具有如SEQ ID NO：3、5、11、13、15或17所述的序列的多聚核苷酸。在另一个实施方案中，异源序列编码包括如SEQ ID NO：4所述的序列的多肽。异源核酸是经人类密码子优化的且编码如SEQ ID NO：4所述的多肽。在另一个实施方案中，异源核酸包括如SEQ ID NO：19或22的约核苷酸编号8877到约9353所述的序列。在一个实施方案中，3’LTR来源于致癌逆转录病毒或γ逆转录病毒。在另一个实施方案中，3’LTR包括U3-R-U5域。在另一个实施方案中，3’LTR包括如SEQ ID NO：19的约核苷酸9405到约9998所述的序列，或与其具有至少95％、98％或99.5％同一性的序列。
本公开书提供一种包括如SEQ ID NO：19、20或22所述的序列的多聚核苷酸。
本公开书提供一种分离的多聚核苷酸，其从5’到3’包含：人类巨细胞病毒的立即早期启动子与MLV R-U5区的CMV-R-U5融合体；逆转录酶的引物结合位点PBS；5’剪接位点；ψ包装信号；MLV群特异性抗原的gag编码序列；MLV聚合酶多聚蛋白的pol编码序列；3’剪接位点；MLV品系4070A的包膜蛋白的4070A env编码序列；脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(IRES)；经修饰的胞嘧啶脱氨酶编码序列；聚嘌呤束(polypurine tract)；和U3-R-U5 MLV长末端重复序列。
本公开书提供一种治疗患有细胞增殖失调的受试对象的方法，其包含使受试对象与编码具有胞嘧啶脱氨酶活性的本公开书的多肽的多聚核苷酸在允许多聚核苷酸表达的条件下接触，和使受试对象与5-氟胞嘧啶接触。
本公开书还提供一种治疗受试对象的细胞增殖失调的方法，其包含使受试对象与本发明的逆转录病毒接触，其中异源核酸序列编码抑制赘生性细胞增殖的治疗性蛋白。在一个实施方案中，逆转录病毒包含编码具有如SEQ ID NO：4、12、14、16或18所述的序列的多肽的多聚核苷酸。
本公开书的一个或多个实施方案的细节阐述于附图和以下具体实施方式中。根据具体实施方式和附图并根据权利要求书，其它特征、目标和优势可显而易见。
附图说明
图1A-C显示野生型酵母胞嘧啶脱氨酶(SEQ ID NO：2)和本公开书的胞嘧啶脱氨酶(SEQ ID NO：4)和本公开书的其它序列的比对。
图2显示细胞杀死数据的曲线图，其显示经修饰的载体与原始野生型CD相比更为有效。所述曲线图还显示新的经修饰骨架(T5.0007)在细胞杀死方面比老的骨架(pACE-CD)更为有效。还显示将各种载体构建体和其名称按目录分类的表格。
图3A-D显示(a)本公开书的重组逆转录病毒载体的图解；(b)本公开书的多聚核苷酸的质粒图谱；(c和d)本公开书的多聚核苷酸的序列(SEQ ID NO：19)。
图4显示在感染的U-87细胞中观察到的yCD2蛋白的含量高于野生型yCD蛋白。
图5显示如使用PCR扩增所评定，本公开书的载体在12个病毒传代周期后保持遗传稳定。所述图还显示本公开书的载体与载体pACE-CD(Kasahara等人)相比在更长传代后更为稳定。具体来说，pAC3-CD比pACE-CD更稳定，证明经改变的骨架使载体更稳定。此外，pACE-yCD1(T5.0001)和-yCD2(T5-0002)都比pAC-yCD稳定得多，证明对转基因的编码序列所作的微小和沉默改变对稳定性具有很大的影响，从而产生优良性质。T5.0003最不稳定且T5.0004和T5.0005似乎与在小鼠肿瘤中显示功效的pACE-CD(W.Wang等人Hum Gene Ther 14：117 2003；Tai等人Mol Ther 12：842 2005)大致相等。
图6显示(A)细胞杀死分析；和(B)用不同载体感染的细胞的胞嘧啶脱氨酶比活性。(A)显示被感染U87细胞暴露于渐增水平的5-FC时本公开书的胞嘧啶脱氨酶和载体比原始pACE-CD至少一样或更好地杀死被感染细胞。(B)显示本公开书的CD比活性(T5.0007、T5.0001和T5.0002)均高于pACE-CD(T5.0000)，次序为T5.0000＜T5.0007＜T5.0001＜T5.0002。
图7显示用本公开书的CD载体体内处理且从用4个5-FC周期处理的小鼠外植的U-87肿瘤对药物仍然敏感。
图8显示小鼠脑癌模型的Kaplan-Meyer生存分析中的给药信息和治疗效果。
图9显示同系小鼠模型的Kaplan-Meyer生存分析中的给药信息和治疗效果。
图10A-D显示用于产生包含具有CD、OPRT和UPRT活性的多肽的本公开书的各种实施方案的方案。
图11：A是含有人类初级前体miR-128-1、人类初级前体miR-128-2和与人类H1启动子连接的人类前体miR-128的多聚核苷酸序列的MLV逆转录病毒载体pAC3骨架(分别命名为pAC3-miR128-1、pAC3-miR-128-2和pAC3-H1-shRNAmiR128)的图解载体图谱。B是含有与人类H1启动子连接的人类前体miR-128的多聚核苷酸序列的MLV逆转录病毒载体pAC3-yCD2骨架(命名为pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128)的图解载体图谱。
图12：A显示由qPCR分析的含miR-128载体(pAC3-miR-128-1、pAC3-miR-128-2和pAC3-H1-shRNAmiR128)在人类纤维肉瘤细胞HT1080中的复制动力学的比较。所述图是通过将从qPCR获得的C(t)值的倒数与病毒复制期间的各个时间点作图来产生。B显示由qPCR分析的含miR-128载体(pAC3-miR-128-1、pAC3-miR-128-2和pAC3-H1-shRNAmiR128)在人类神经胶质瘤细胞U87-MG中的复制动力学的比较。所述图是通过将从qPCR获得的C(t)值的倒数与病毒复制期间的各个时间点作图来产生。
图13显示从用含miR-128载体转导的细胞中的成熟miR-128表达的相对定量。
图14显示从用含miR-128载体转导的细胞中的Bmi-1基因表达的相对定量。
图15是含有单拷贝142-3pT靶序列(命名为pAC3-emd-142-3pT)和4个串联重复的142-3pT(命名为pAC3-emd-142-3pT4X)的MLV逆转录病毒载体pAC3-emd的图解载体图谱。
图16是含有142-3pT靶序列的单拷贝(命名为pAC3-yCD2-142-3pT)和142-3pT的4个串联重复序列(命名为pAC3-yCD2-142-3pT4X)的MLV逆转录病毒载体pAC3-yCD2的图解载体图谱。
图17：A显示由qPCR分析的含142-3pT载体(pAC3-emd-142-3pT、pAC3-emd-142-3pT4X、pAC3-yCD2-142-3pT和pAC3-yCD2-142-3pT4X)和其母体载体(pAC3-emd和pAC3-yCD2)在人类纤维肉瘤细胞HT1080中的复制动力学的比较。所述图是通过将从qPCR获得的C(t)值的倒数与病毒复制期间的各个时间点作图来产生。B显示通过在载体传播期间的各个时间点的GFP表达的流式细胞分析所分析的，含GFP载体(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT和pAC3-emd-142-3pT4X)在人类纤维肉瘤细胞HT1080中的复制动力学的比较。
图18：A显示由qPCR分析的含142-3pT载体(pAC3-emd-142-3pT、pAC3-emd-142-3pT4X、pAC3-yCD2-142-3pT和pAC3-yCD2-142-3pT4X)和其母体载体(pAC3-emd和pAC3-yCD2)在人类神经胶质瘤细胞U87-MG中的复制动力学的比较。所述图是通过将从qPCR获得的C(t)值的倒数与病毒复制期间的各个时间点作图来产生。B显示通过在载体传播期间的各个时间点的GFP表达的流式细胞分析所分析的，含GFP载体(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT和pAC3-emd-142-3pT4X)在人类神经胶质瘤细胞U87-MG中的复制动力学的比较。
图19显示通过在载体传播期间的各个时间点的GFP表达的流式细胞分析所分析的含GFP载体(pAC3-emd)在小鼠和人类造血细胞中的复制动力学。
图20：A显示通过在载体传播期间的各个时间点的GFP表达的流式细胞分析所分析的含GFP载体(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT和pAC3-emd-142-3pT4X)在小鼠T淋巴细胞EL4中的复制动力学的比较。B显示通过在载体传播期间的各个时间点的GFP表达的流式细胞分析所分析，含GFP载体(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT和pAC3-emd-142-3pT4X)在人类T淋巴细胞SUP-T1中的复制动力学的比较。C显示通过在载体传播期间的各个时间点的GFP表达的流式细胞分析所分析，含GFP载体(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT和pAC3-emd-142-3pT4X)在人类单核细胞U937中的复制动力学的比较。
图21A和图21B是在肿瘤内CED输注Toca 511和钆期间从病患狗获得的MRI影像的静止帧。应注意影像左侧的大肿瘤挤压脑的两侧并使中线结构向右位移。白色区域是钆-Toca 511输注物。图21B显示在肿瘤中安置两个导管。
图22是pAC3骨架中分别编码人类IFN-γ(hIFNg)和小鼠IFN-γ(mIFNg)的MLV逆转录病毒载体的图解载体图谱。
图23显示来自用pAC3-mIFNg载体感染的人类纤维肉瘤细胞系HT1080中RNA水平下的mIFN-γ表达。通过RT-PCR来检测表达。
图24显示用pAC3-hIFNg载体感染的人类纤维肉瘤细胞系HT1080所分泌的hIFN-γ蛋白的表达。
图25显示用pAC3-mIFNg载体感染的人类纤维肉瘤细胞系HT1080所分泌的mIFN-γ蛋白的表达。
图26显示在裸小鼠模型中肿瘤内或静脉内递送AC3-GFP载体后，U87细胞中的GFP表达的流式细胞分析。通过流式细胞术测量细胞的GFP阳性百分比。从稚裸小鼠脑分离的细胞、来自组织培养物的U87细胞或以1的感染复数用AC3-GFP(V)体外转导的U87细胞用作对照。实施例27(静脉内注射GFP载体)。
图27显示另外对来自实施例27(静脉内注射GFP载体)的第1、3和5组进行直方图分析，来测量分离的U87细胞中GFP信号的分布。GFP表达是来自从在载体处理后14天后的小鼠脑分离的U87肿瘤细胞。
图28是pAC3骨架中的编码人类IL-2的MLV逆转录病毒载体的图解载体图谱。
各个图式中的类似参考符号表示类似元件。
具体实施方式
除非上下文明确指示，否则如本文和随附权利要求书中所用，单数形式“一”和“所述”包括复数个指代物。因此，举例来说，提及“一细胞”时包括多个所述细胞，且提及“所述试剂”时包括提及一种或一种以上所属领域技术人员已知的试剂，诸如此类。
除非另外说明，否则“或”也意味着“和/或”。类似地，“包含”和“包括”可互换使用且不打算具有限制性。
应进一步了解，当各个实施方案的描述使用术语“包含”时，所属领域技术人员将认为在一些特定情况下，可替代性地使用措辞“基本上由……组成”或“由……组成”来描述实施方案。
除非另外定义，否则本文所用的所有科学技术术语的含义与本公开书所属领域的一般技术人员通常所了解的含义相同。虽然与本文所述的方法和材料类似或相等的方法和材料也可用于所公开的方法和组合物的实施中，但本文描述示例性的方法、装置和材料。
描述适用于本文的分子生物学技术(包括载体、启动子的使用和许多其它相关课题)的一般文章包括Berger和Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology第152卷，(Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.)(″Berger″)；Sambrook等人，Molecular Cloning--A Laboratory Manual，第2版，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989(″Sambrook″)以及Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人编，Current Protocols，a joint venture between Greene Publishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.，(1999年增补)(″Ausubel″)。足以在体外扩增方法(包括聚合物链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增和其它RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA))中指导所属领域技术人员例如用于产生本公开书的同源核酸的方案的实例见于Berger、Sambrook和Ausubel，以及Mullis等人(1987)美国专利第4,683,202号；Innis等人编，(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press Inc.San Diego，Calif.)(″Innis″)；Arnheim & Levinson(1990年10月1日)C&EN 36-47；The Journal Of NIH Research(1991)3：81-94；Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173；Guatelli等人(1990)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 87：1874；Lomell等人(1989)J.Clin.Chem 35：1826；Landegren等人(1988)Science 241：1077-1080；Van Brunt(1990)Biotechnology 8：291-294；Wu和Wallace(1989)Gene 4：560；Barringer等人(1990)Gene 89：117；和Sooknanan和Malek(1995)Biotechnology 13：563-564。Wallace等人，美国专利第5,426,039号描述用于克隆体外扩增的核酸的改良方法。Cheng等人(1994)Nature 369：684-685和其中所引用的参考文献总结了通过PCR扩增大核酸的改良方法，其中产生高达40kb的PCR扩增子。所属领域技术人员将了解，使用逆转录酶和聚合酶基本上可将任何RNA转化为适合于限制性酶切、PCR扩增和测序的双链DNA。参看例如Ausubel、Sambrook和Berger(所有见上文)。
本文讨论的发表内容仅涉及其在本申请的提交日期之前的公开内容。本文中的任何内容不应被理解为承认发明人没有权利因为先前公开书而早于所述公开书。
本公开书提供适用于细胞或受试对象的基因或蛋白质递送的方法和组合物。所述方法和组合物可用于治疗受试对象的各种疾病和失调，包括癌症和其它细胞增殖疾病和失调。本公开书提供用于基因递送的可复制逆转录病毒载体。
术语“载体”、“载体构建体”和“表达载体”意思是可将DNA或RNA序列(例如外来基因)引入宿主细胞中，以便转化宿主并促进所引入的序列的表达(例如转录和翻译)的运载体。载体典型地包含可传播病原体的DNA，其中通过限制酶技术插入编码蛋白质的外来DNA。常见类型的载体是“质粒”，其一般是双链DNA的自包含式分子，容易接受其它(外来)DNA且容易引入合适宿主细胞中。已描述了可在多种真核和原核宿主中复制和/或表达的许多载体，包括质粒和真菌载体。非限制性实例包括pKK质粒(Clonetech)、pUC质粒、pET质粒(Novagen，Inc.，Madison，Wis.、pRSET或pREP质粒(Invitrogen，San Diego，Calif.)或pMAL质粒(New England Biolabs，Beverly，Mass.)和许多适当的宿主细胞，其中使用本文公开或引用的方法或者相关领域技术人员已知的方法。重组克隆载体通常包括一种或一种以上用于克隆或表达的复制系统、一种或一种以上用于宿主筛选的标志物(例如抗生素抗性)和一种或一种以上表达盒。
术语“表达”意味着允许或导致基因或DNA序列的信息变得明白，例如通过激活对应基因或DNA序列的转录和翻译中所涉及的细胞功能来产生蛋白质。细胞表达DNA序列，从而形成“表达产物”，例如蛋白质。表达产物自身(例如所得蛋白质)也可被称为由细胞“表达”。举例来说，当多聚核苷酸或多肽是在外来或天然启动子的控制下在外来宿主细胞中表达或产生时，或在外来启动子的控制下在天然宿主细胞中表达或产生时，所述多聚核苷酸或多肽是重组表达。
本公开书提供可复制性病毒载体，其含有编码例如胞嘧啶脱氨酶或其突变体、miRNA或siRNA、细胞因子、抗体结合域等的异源多聚核苷酸，所述异源多聚核苷酸可被递送到细胞或受试对象中。病毒载体可以是腺病毒载体、麻疹载体、疱疹载体、逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)、弹状病毒载体(rhabdoviral vector)(例如水泡性口炎病毒载体)、呼肠孤病毒载体(reovirus vector)、西尼加谷病毒载体(Seneca Valley Virus vector)、痘病毒载体(poxvirus vector)(包括动物痘或牛痘递送型载体)、细小病毒载体(parvovirus vector)(包括AAV载体)、α病毒载体或所属领域技术人员已知的其它病毒载体(也参看例如Concepts in Genetic Medicine，Boro Dropulic和Barrie Carter编，Wiley，2008，Hoboken，NJ.；The Development of Human Gene Therapy，Theodore Friedmann编，Cold Springs Harbor Laboratory Press，Cold springs Harbor，New York，1999；Gene and Cell Therapy，Nancy Smyth Templeton编，Marcel Dekker Inc.，New York，New York，2000以及Gene Therapy：Therapeutic Mechanism and Strategies，Nancy Smyth Templetone和Danilo D Lasic编，Marcel Dekker，Inc.，New York，New York，2000；其揭示内容以引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，病毒载体可以是仅能感染复制中的哺乳动物细胞的可复制逆转录病毒载体。在一个实施方案中，可复制逆转录病毒载体在编码例如胞嘧啶脱氨酶、miRNA、siRNA、细胞因子、受体、抗体等的异源多聚核苷酸的5′包含内部核糖体进入位点(IRES)。当异源多聚核苷酸编码例如siRNA、miRNA或RNAi等非翻译RNA时，不需要IRES，但也可包括IRES以用于另一种被翻译基因，且可使用任何种类的逆转录病毒(见下文)。在一个实施方案中，多聚核苷酸位于逆转录病毒载体的ENV多聚核苷酸的3’。
在其它实施方案中，提供用本公开书的可复制逆转录病毒载体转染的宿主细胞。宿主细胞包括真核细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞。宿主细胞也可包括原核细胞，例如细菌细胞。
还提供用本文提供的载体(例如可复制逆转录病毒载体)转导(转化或转染)的经工程改造的宿主细胞。经工程改造的宿主细胞可以在经适当改良以用于激活启动子、筛选转化株或扩增编码多聚核苷酸的常规营养培养基中培养。培养条件(例如温度、pH等)是如先前筛选宿主细胞表达中所用，且对于所属领域技术人员和根据本文引用的参考文献是显而易见的，所述参考文献包括例如Sambrook、Ausubel和Berger，以及例如Freshney(1994)Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique，第3版(Wiley-Liss，New York)和其中引用的参考文献。
适当表达宿主的实例包括：细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌(B.subtilis)、链霉菌(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；真菌细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)和粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；昆虫细胞，例如果蝇(Drosophila)和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)；哺乳动物细胞，例如CHO、COS、BHK、HEK 293或Bowes黑色素瘤；或植物细胞或外植体等。典型地可使用人类细胞或细胞系，然而，可能需要将本公开书的载体和多聚核苷酸克隆到非人类宿主细胞中以用于测序、扩增和克隆。
本公开书还提供相对于先前逆转录病毒载体具有提高的稳定性的可复制逆转录病毒载体。在感染和复制期间所述提高的稳定性对于治疗细胞增殖失调很重要。可复制逆转录病毒提供转导效率、转基因稳定性和靶选择性的组合。组合物和方法提供插入物稳定性且维持转基因的转录活性和所编码多肽的翻译活力。
本公开书提供经修饰的逆转录病毒载体。经修饰的逆转录病毒载体可从逆转录病毒家族的成员衍生得到。逆转录病毒家族由三组组成：泡沫病毒，例如人泡沫病毒(HFV)；慢病毒，例如绵羊髓鞘脱落病毒；和致癌病毒(但不是此组内的所有病毒都是致癌的)。术语“慢病毒”以其常规含义使用，用于描述含有逆转录酶的病毒属。慢病毒包括“免疫缺陷病毒”，其包括人免疫缺陷病毒(HIV)1型和2型(HIV-1和HIV-2)和猴免疫缺陷病毒(SIV)。基于在病毒成熟期间于电子显微镜下观察的粒子形态，致癌病毒在历史上被进一步再分为A、B、C和D组。A型粒子代表在被感染细胞的细胞质中看到的B型和D型病毒的不成熟粒子。这些粒子不具有感染性。通过胞质内A型粒子的包膜作用，B型粒子作为成熟病毒粒子从质膜发芽。所述粒子在膜上具有75nm的环形核，长的糖蛋白从其中突出。在发芽后，B型粒子含有偏心定位的电子致密核心。原型B型病毒是小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)。在被C型病毒感染的细胞中没有观察到胞质内粒子。相反，成熟粒子经由月牙C式缩合直接从细胞表面生长出，然后自我闭合并由质膜封闭起来。可见到包膜糖蛋白突出物以及均匀的电子致密核心。出芽可从表面质膜开始或直接进入胞内液泡。C型病毒被研究地最为广泛，且包括许多禽和鼠白血病病毒(MLV)。因为牛白血病病毒(BLV)和人T细胞白血病病毒I和II型(HTLV-I/II)从细胞表面的出芽形态学，它们被类似地归类为C型粒子。然而，它们还具有规则的六边形形态和比原型C型病毒(例如鼠白血病病毒(MLV))更为复杂的基因组结构。D型粒子与B型粒子的相似之处在于它们都在被感染的细胞质中显示环状结构。D型粒子从细胞表面开始出芽，但病毒粒子包含短的表面糖蛋白突出物。电子致密核心在粒子内也是偏心定位。梅森费舍猴病毒(MPMV)是原型D型病毒。
逆转录病毒的分类存在多种方式，但近十年来命名法已趋于标准化(参看ICTVdB-The Universal Virus Database，v 4 on the World Wide Web(www)at ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/and the text book“Retroviruses”Coffin，Hughs和Varmus编，Cold Spring Harbor Press 1997，其公开内容以引用的方式并入本文中)。在一个实施方案中，可复制逆转录病毒载体可包含正向逆转录病毒(Orthoretrovirus)或更典型地包含γ逆转录病毒载体。
逆转录病毒可根据其复制遗传材料的方式来定义。RNA在复制期间转化为DNA。在细胞感染之后，通过被称为逆转录的分子方法从病毒粒子中携带的两个RNA分子产生双链DNA分子。所述DNA形式作为前病毒共价地整合到宿主细胞基因组中，在细胞和/或病毒因子的帮助下从所述DNA表达病毒RNA。所表达的病毒RNA包装到粒子中且作为感染性病毒粒子释放。
逆转录病毒粒子由两个相同的RNA分子构成。每个野生型基因组具有正义单链RNA分子，其在5’端被加帽并在3’尾端被聚腺苷酸化。二倍体病毒粒子含有与gag蛋白复合的两条RNA链、病毒酶(pol基因产物)和gag蛋白“核心”结构内的宿主tRNA分子。从宿主细胞膜衍生且含有病毒包膜(env)蛋白的脂质双层包围和保护着此衣壳。env蛋白与病毒的细胞受体结合，且粒子典型地通过受体介导的内吞作用和/或膜融合而进入宿主细胞。
在外部包膜脱落后，病毒RNA通过逆转录被拷贝到DNA中。逆转录是由pol区编码的逆转录酶催化且使用包装到病毒粒子中的宿主细胞tRNA作为DNA合成引物。以此方式，RNA基因组被转化为更为复杂的DNA基因组。
逆转录所产生的双链线性DNA可能必须或可能不是必须在核内成环形。前病毒现在在每一端具有两个相同的重复序列，所述重复序列被称为长末端重复序列(LTR)。这两个LTR序列的末端产生被pol产物(催化整合的整合酶蛋白)识别的位点，使得前病毒总是与距离LTR末端两个碱基对(bp)的宿主DNA结合。在两个LTR的末端看到细胞序列的复制，暗示可换位基因元件的整合模式。认为整合基本上是在靶细胞基因组内随机发生。然而，通过修饰长末端重复序列，可以控制逆转录病毒基因组的整合。
所整合的病毒DNA的转录、RNA剪接和翻译是由宿主细胞蛋白介导。产生以各种方式剪接的转录物。在人类逆转录病毒HIV-1/2和HTLV-I/II的情况下，也使用病毒蛋白来调节基因表达。细胞因子和病毒因子之间的相互作用是病毒潜伏期和表达病毒基因的时间序列的控制中的一个因素。
逆转录病毒可水平地和垂直地传播。逆转录病毒的有效感染传播需要在具有可特异性识别病毒包膜蛋白的受体的靶细胞上表达，但病毒也可低效地利用不依赖受体的非特异性进入途径。此外，靶细胞类型必须能够支持在病毒结合和穿透之后复制循环的所有阶段。当病毒基因组整合入宿主的生殖细胞系中时，发生垂直传播。前病毒然后从一代传代到另一代，就好像它是细胞基因一样。因此，产生了内源前病毒，其通常潜伏在体内，但在宿主暴露于适当媒介物时可被激活。
如上所述，整合的DNA中间物被称为前病毒。先前基因疗法或基因递送系统使用需要在适当辅助病毒存在下或在含有允许衣壳化而不会同时产生污染性辅助病毒的适当序列的细胞系中，转录前病毒并组装到感染性病毒中的方法和逆转录病毒。如下所述，产生本公开书的重组逆转录病毒不需要辅助病毒，这是因为在基因组中提供用于衣壳化的序列，从而提供可复制逆转录病毒载体以用于基因递送或疗法。
现有的可复制逆转录病毒载体也容易在水平或垂直传播期间和复制期间从被感染细胞或宿主细胞丢失。这可能是部分因为存在包括重复序列或降低聚合酶效率的额外核苷酸序列。
本公开书的逆转录病毒基因组和前病毒DNA具有至少三个基因：gag、pol和env，这些基因可侧接一个或两个长末端(LTR)重复序列，或在前病毒中侧接两个长末端重复序列(LTR)和含有顺式作用序列(例如psi)的序列。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)、蛋白酶和整合酶；且env基因编码病毒包膜糖蛋白。5’和/或3’LTR用于促进病毒粒子RNA的转录和聚腺苷酸化。LTR含有病毒复制所必需的所有其它顺式作用序列。慢病毒具有其它基因，包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx(在HIV-1、HIV-2和/或SIV中)。
与5’LTR相邻的序列是基因组(tRNA引物结合位点)的逆转录和病毒RNA有效衣壳化入粒子(Psi位点)中所必需的。如果衣壳化(或逆转录病毒RNA包装到感染性病毒粒子中)所必需的序列从病毒基因组丢失，那么将导致顺式缺陷(cis defect)，其防止基因组病毒RNA的衣壳化。这类经修饰的载体是先前基因递送系统(意即缺少病毒粒子衣壳化所必需的元件的系统)中典型使用的载体。
在第一实施方案中，本公开书提供一种能感染非分裂细胞、分裂细胞或具有细胞增殖失调的细胞的重组逆转录病毒。本公开书的重组可复制逆转录病毒包含编码病毒GAG、病毒POL、病毒ENV的多聚核苷酸序列，在封装于病毒粒子内的内部核糖体进入位点(IRES)之后的异源多聚核苷酸。
短语“非分裂”细胞是指未经历有丝分裂的细胞。非分裂细胞可以在细胞周期的任何点(例如G0/G1、G1/S、G2/M)被阻断，只要细胞没有积极地分裂。例如，在间接体内感染中，可通过所属领域技术人员所用的标准技术(包括照射、阿非迪霉素(aphidocolin)处理、血清饥饿和接触抑制)处理分裂细胞以阻断细胞分裂。然而，应了解间接体内感染通常在不阻断细胞的情况下进行，这是因为许多细胞已被抑制(例如干细胞)。举例来说，不论使用何种机制阻断细胞分裂或细胞在细胞周期中哪一点被阻断，重组慢病毒载体能感染任何非分裂细胞。体内预先存在的非分裂细胞的实例包括神经元、肌肉、肝、皮肤、心脏、肺和骨髓细胞和其衍生物。对于分裂细胞，可使用致癌逆转录病毒载体。
“分裂的”细胞意思是经历活跃的有丝分裂或减数分裂的细胞。所述分裂细胞包括干细胞、皮肤细胞(例如成纤维细胞和角质形成细胞)、配子和所属领域中已知的其它分裂细胞。术语分裂的细胞特别关注且涵盖具有细胞增殖失调的细胞，例如赘生性细胞。术语“细胞增殖失调”是指特征为细胞数目异常的状况。所述状况可包括肥大(细胞连续繁殖，导致细胞群体在组织内过度生长)和不足(组织内的细胞缺乏或不足)细胞生长，或细胞过量流入或迁移入身体某区域。细胞群体不一定是被转化、致瘤或恶性细胞，也可包括正常细胞。细胞增殖失调包括与结缔组织的过度生长有关的失调，例如各种纤维化失调，包括硬皮病、关节炎和肝硬化。细胞增殖失调包括赘生失调，例如头颈癌。头颈癌包括例如口癌、食道癌、咽喉癌、喉癌、甲状腺癌、舌癌、唇癌、唾液腺癌、鼻癌、副鼻窦癌、鼻咽癌、上鼻道癌和鼻窦癌、嗅神经母细胞瘤、鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤、鼻腔鼻窦未分化癌(SNUC)、脑肿瘤(包括胶质母细胞瘤)或血液肿瘤。还包括区域淋巴结癌，所述区域淋巴结包括颈淋巴结、喉前淋巴结、肺食管旁淋巴结和下颌下淋巴结(Harrison′s Principles of Internal Medicine(Isselbacher等人编，McGraw-Hill，Inc.，第13版，第1850-1853页，1994)。其它癌症类型包括(但不限于)肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、淋巴瘤、口腔癌、胰腺癌、白血病、黑色素瘤、胃癌、皮肤癌和卵巢癌。细胞增殖疾病还包括类风湿性关节炎(O’Dell NEJM 350：2591 2004)和特征通常为免疫系统细胞不当增殖的其它自身免疫失调(Mackay等人NEJM 345：340 2001)。
异源核酸序列与IRES可操作地连接。如本文所用，术语“异源”核酸序列或转基因是指(i)在野生型逆转录病毒中通常不存在的序列，(ii)来源于外来物种的序列，或(iii)如果来自相同物种，那么可从其原始形式经实质改变。或者，在细胞中通常不表达的未改变的核酸序列是异源核酸序列。
取决于本公开书的逆转录病毒载体的预期用途，可向逆转录病毒载体中插入任何数目的异源多聚核苷酸或核酸序列。举例来说，在体外研究中可使用常用的标志基因或报告基因，包括抗生素抗性和荧光分子(例如GFP)。编码任何期望多肽序列的其它多聚核苷酸序列也可插入本公开书的载体中。当寻求异源核酸序列的体内递送时，可使用治疗性序列和非治疗性序列两者。举例来说，异源序列可编码涉及与细胞增殖失调相关的特定基因或与疾病或失调有关的其它基因相关的的治疗性分子，包括反义分子(miRNA、siRNA)或核酶。异源序列可以是自杀基因(例如HSV-tk或PNP或胞嘧啶脱氨酶；经修饰或未经修饰)、生长因子或治疗性蛋白(例如因子IX、IL2等)。适用于本公开书的其它治疗性蛋白在所属领域中也容易鉴别。
在一个实施方案中，载体内的异源多聚核苷酸包含已经经优化用于在人类细胞中表达的胞嘧啶脱氨酶。在另一个实施方案中，胞嘧啶脱氨酶包含已经人类密码子优化的序列，所述序列包含与野生型胞嘧啶脱氨酶相比增加胞嘧啶脱氨酶稳定性(例如降解减少或热稳定性提高)的突变。在另一个实施方案中，异源多聚核苷酸编码融合构建体，所述构建体包含与编码具有UPRT或OPRT活性的多肽的多聚核苷酸可操作地连接的胞嘧啶脱氨酶(经人类密码子优化或未经优化，突变或未突变)。在另一个实施方案中，异源多聚核苷酸包括本公开书的CD多聚核苷酸(例如SEQ ID NO：3、5、11、13、15或17)。
在另一个实施方案中，可复制逆转录病毒载体可包含编码包括胞嘧啶脱氨酶(如本文所述)的多肽的异源多聚核苷酸，且许多载体可进一步包含包括作为病毒启动子的初级转录物的一部分或连接于启动子的多聚核苷酸的miRNA或siRNA分子，所述启动子可以是细胞型或组织特异型。
微小RNA(miRNA)是小的非编码RNA。其位于编码或非编码基因的内含子、非编码基因的外显子或基因间区域内。miRNA基因由RNA聚合酶II转录，产生被称为初级前体miRNA(pri-miRNA)的前体多聚核苷酸。核中的pri-miRNA由核糖核酸酶Drosha加工，产生miRNA前体(pre-miRNA)，其形成短发夹结构。随后，pre-miRNA通过输出蛋白(Exportin)5被输送到细胞质，且被称为切酶(Dicer)的另一种核糖核酸酶进一步加工，产生活性的成熟miRNA。
成熟miRNA的长度约为21个核苷酸。通过与被靶向基因的mRNA的3’未翻译区域结合，并通过抑制蛋白质翻译或降解mRNA来抑制蛋白表达，所述成熟miRNA发挥其功能。miRNA涉及包括发育、细胞增殖、分化和癌症发展的生物过程。miRNA制谱(profiling)研究表明一些miRNA表达是组织特异性的或在某些组织中富集。举例来说，miR-142-3p、miR-181和miR-223表达已被证明在人类和小鼠的造血组织中富集(Baskerville等人，2005 RNA 11，241-247；Chen等人，2004 Science 303，83-86)。
已经观察到一些miRNA在若干肿瘤中受到上调(致癌miRNA)或下调(阻遏miRNA)(Spizzo等人，2009 Cell 137，586e1)。举例来说，miR-21在胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌、食道癌和宫颈癌、子宫平滑肌肉瘤、DLBCL、头颈癌中过度表达。对比之下，let-7的成员已被报导在胶质母细胞瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌和结肠癌中受到下调。癌症中的miRNA表达的内稳态的重新建立是抑制或逆转癌症发展的必要机制。
由于miRNA在癌症中调节的重要功能，开发潜在治疗方法的焦点已经集中在致癌miRNA的反义介导性抑制(antigomer)。然而，miRNA替换可能代表同样有效的策略。在这种方法中，治疗上最有用的miRNA是在肿瘤中表达水平很低，但在正常组织中表达水平很高且因此可被耐受的miRNA。
在癌症中被下调的miRNA可用作抗癌剂。实例包括mir-128-1、let-7、miR-26、miR-124和miR-137(Esquela-Kerscher等人，2008 Cell Cycle 7，759-764；Kumar等人，2008Proc Natl Acad Sci USA 105，3903-3908；Kota等人，2009 Cell 137，1005-1017；Silber等人，2008 BMC Medicine 6：141-17)。已报导了miR-128表达在中枢神经系统中水平很高，且已观察到其在胶质母细胞瘤中受到下调(Sempere等人，2004 Genome Biology  5：R13.5-11；Godlewski等人，2008Cancer Res 68：(22)9125-9130)。miR-128是由两种不同的基因miR-128-1和miR-128-2编码。这两种基因被加工成相同的成熟序列。已报导Bmi-1和E2F3a是miR-128的直接靶标(Godlewski等人，2008Cancer Res 68：(22)9125-9130；Zhang等人，2009 J.Mol Med 87：43-51)。此外，已观察到Bmi-1表达在各种人类癌症中被上调，所述癌症包括神经胶质瘤、套细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌、B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin’s lymphoma)、乳腺癌、结肠直肠癌和前列腺癌。此外，已经证明Bmi-1是不同组织干细胞自我更新所必需的，所述干细胞包括神经元干细胞以及神经胶质瘤中的“类干”细胞群体。
虽然miRNA介导的细胞功能抑制的可能性已经有了许多的体外证明，但仍然很难像其它分子那样以产生体内作用所必需的效率将这些物质作为寡聚核苷酸或在病毒载体中递送(例如Li等人Cell Cycle 5：2103-21092006)。非复制性载体似乎在任何情况下都不足以有效地将治疗基因递送到很大一部分肿瘤中。然而，也很难发现如何利用复制性载体递送miRNA类型的药剂。特定来说，并不清楚如何将额外RNA序列并入可复制逆转录病毒的RNA基因组中，和如何维持复制效率并保持添加物稳定地并入基因组中。
已经利用复制缺陷性逆转录病毒和慢病毒载体通过例如CMV或LTR等聚合酶II启动子来稳定地表达pri-mi RNA，且证明可产生成熟miRNA。然而，这些载体不是必须经历逆转录病毒或慢病毒的完整生命周期达到复制病毒所必需的次数。基因组必须能经受比简单进入、整合和转录更多的事件。与使用基于RNA的病毒表达miRNA有关的问题包括：(1)病毒RNA基因组在RNA加工期间转录后步骤的完整性；(2)所插入盒在复制期间的稳定性；和(3)作为从LTR启动子转录的病毒RNA的部分的pri-miRNA的适当加工，从而产生成熟miRNA。
因此，已经广泛利用在非复制性逆转录病毒和慢病毒载体中并入III型RNA聚合酶III启动子(例如U6和H1启动子)来表达功能性小干扰RNA(siRNA)，产生短发夹结构RNA(Bromberg-White等人，2004 J Virol 78：9，4914-4916；Sliva等人，2006 Virology 351，218-225；Haga等人，2006，Transplant Proc 38(10)：3184-8)。用切酶裂解环序列，产生长度为21-22个核苷酸的成熟siRNA。shRNA可在细胞中稳定表达以便下调靶基因表达。然而，通过向重组可复制逆转录病毒载体中并入所述盒、表达和切酶加工来产生成熟miRNA仍然存在问题。
在一个实施方案中，本发明提供一种重组可复制逆转录病毒载体，其含有初级前体miRNA的异源多聚核苷酸序列。
在另一个实施方案中，初级前体miRNA是人类来源。在另一个实施方案中，初级前体RNA序列位于env基因下游。
在另一个实施方案中，本发明提供一种重组可复制逆转录病毒载体，其含有位于env基因下游的人类初级前体miR-128-2的异源多聚核苷酸序列(SEQ ID NO：32)。
在癌症中被下调的miRNA可并入用于治疗基因递送的载体中，例如let-7、miR-26、miR-124和miR-137(Esquela-Kerscher等人，2008 Cell Cycle 7，759-764；Kumar等人，2008 Proc Natl Acad Sci USA 105，3903-3908；Kota等人，2009Cell 137，1005-1017；Silber等人，2008 BMC Medicine 6：141-17)。
在另一个实施方案中，本发明提供一种重组可复制逆转录病毒载体，其含有位于env基因下游的与人类H1启动子连接的短发夹结构人类pre-miR-128的异源多聚核苷酸序列(SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34)。在癌症中被下调的miRNA可并入用于治疗基因递送的载体中，例如let-7、miR-26、miR-124和miR-137(Esquela-Kerscher等人，2008 Cell Cycle 7，759-764；Kumar等人，2008Proc Natl Acad Sci USA 105，3903-3908；Kota等人，2009 Cell 137，1005-1017；Silber等人，2008 BMC Medicine 6：141-17)。
反义核酸是与特异性mRNA分子的至少一部分互补的DNA或RNA分子(Weintraub，Scientific American，262：40，1990)。在细胞中，反义核酸与对应mRNA杂交，形成双链分子。因为细胞无法翻译双链mRNA，所以反义核酸干扰mRNA的翻译。优选约15个核苷酸的反义低聚物，这是因为其容易合成且在引入靶细胞中时相比大分子引起问题的可能性较小。使用反义方法抑制体外基因翻译在所属领域中是众所周知的(Marcus-Sakura，Anal.Biochem.，172：289，1988)。
反义核酸可用于阻断突变蛋白或显性激活基因产物(例如在阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s disease)中积聚的淀粉状前体蛋白)的表达。所述方法也可用于治疗亨廷顿氏病(Huntington′s disease)、遗传性帕金森综合症(hereditary Parkinsonism)和其它疾病。特别关注与细胞增殖失调有关的基因的阻断。反义核酸也可用于抑制与毒性有关的蛋白的表达。
使用寡聚核苷酸阻碍转录被称为三螺旋(三螺旋)策略，这是因为寡聚物在双螺旋DNA周围缠绕，形成三螺旋。因此，这些三螺旋化合物可被设计用于识别选定基因上的独特位点(Maher等人，Antisense Res.and Dev.，1(3)：227，1991；Helene，C.，Anticancer Drug Design，6(6)：569，1991)。
核酶是能够以与DNA限制性内切酶类似的方式特异性地裂解其它单链RNA的RNA分子。通过修饰编码这些RNA的核苷酸序列，有可能工程改造识别RNA分子中的特异性核苷酸序列并将其裂解的分子(Cech，J.Amer.Med.Assn.，260：3030，1988)。所述方法的主要优点在于，因为这些分子是序列特异性的，所以只有具有特定序列的mRNA才被失活。
如本文所用，术语“RNA干扰”(RNAi)是指由短的干扰核酸(siRNA或微小RNA(miRNA))介导的序列特异性翻译后基因沉默过程。术语“能介导RNA干扰的介质”是指siRNA以及当在细胞内转录时编码siRNA的DNA和RNA载体。术语siRNA或miRNA打算涵盖能介导序列特异性RNA干扰的任何核酸分子，例如短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡聚核苷酸、短干扰核酸、短干扰修饰寡聚核苷酸、化学修饰siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等。
用于设计发夹双螺旋的茎长度的合适范围包括20-30个核苷酸、30-50个核苷酸、50-100个核苷酸、100-150个核苷酸、150-200个核苷酸、200-300个核苷酸、300-400个核苷酸、400-500个核苷酸、500-600个核苷酸和600-700个核苷酸的茎长度。用于设计发夹双螺旋的环长度的合适范围包括4-25个核苷酸、25-50个核苷酸或更长(如果发夹双螺旋的茎长度很长)的环长度。在某些情况下，具有长度超过21个核苷酸的双螺旋区域的发夹结构可促进有效的siRNA指导的沉默，与环序列和长度无关。
本公开书的复制性逆转录病毒载体可通过表达经工程改造的siRNA或miRNA(Dennis，Nature，418：1222002)而用于治疗疾病，所述siRNA或miRNA关闭或降低控制患病细胞(包括肿瘤细胞)增殖或存活的关键基因的表达。所述靶标包括例如Rad 51等基因，Rad 51是DNA修复中的关键酶，且在没有它的情况下细胞生长会受到显著限制。其它靶标包括控制细胞生长的许多信号传导路径分子(Marquez & McCaffrey Hum Gene Ther.19：272008)。siRNA或miRNA可与从本公开书的相同或不同逆转录病毒载体表达细胞毒性基因组合使用。合适的细胞毒性基因的实例包含本公开书的胞嘧啶脱氨酶或经修饰的胞嘧啶脱氨酶。
在使用中，逆转录病毒载体将通过肿瘤或其它靶组织复制，且在生长抑制发生之前，病毒首先整合入宿主基因组中并在所述细胞的生长被抑制之后继续制造病毒。用于筛选功能性miRNA或siRNA序列的方法在所属领域中是已知的。一般来说，设计有效siRNA或miRNA序列中的关键特征通常是避免“脱靶”作用。然而，对于使用对肿瘤细胞具有高特异性的复制载体(例如本公开书的复制载体)来说，这些副作用不是非常重要，因为预期细胞最终都会死亡。本公开书的逆转录病毒载体可使用来自对应蛋白质没有被显著靶向的其它物种的细胞制得。所述细胞包括狗细胞系或鸡细胞系。或者，病毒可以通过在人类293衍生细胞或允许有效瞬时转染的其它细胞系上的瞬时转染来制得。对于所述用途来说，病毒不需要利用IRES，且siRNA或miRNA序列可仅在病毒基因组的适宜位点插入。所述位点包括包膜下游和复制性逆转录病毒的3’LTR上游的区域。或者，polIII转录单元可以插入具有适当siRNA或miRNA的病毒基因组中，典型地插入3’包膜基因下游。可插入一些不同的siRNA或miRNA序列以确保靶基因的有效下调或一个以上基因的下调。合适的序列和靶标可以从所属领域技术人员已知的来源获得。例如：
●MIT/ICBP siRNA Database http:(//)web.mit.edu/sirna/-″The MIT[Massachusetts Institute of Technology]/ICBP[Integrative Cancer Biology Program]siRNA Database是大学范围的科研成果，其用于分类这些实验上被确认的试剂且使所述信息可供MIT团体内部和外部的其它研究者使用(Massachusetts Institute of Technology)。
●RNAi Central-http:(//)katahdin.cshl.org：9331/RNAi_web/scripts/main2.pl RNAi resources，包括siRNA和shRNA设计工具(Hannon Lab，Cold Spring Harbor Laboratory)。
●The RNAi Web-http:(//)www.rnaiweb.com/General resource。
●siDIRECT-http:(//)genomics.jp/sidirect/用于哺乳动物RNA干扰的在线靶特异性siRNA设计(University of Tokyo，Japan)。
●siRNA Database-含有针对各种生物体中的所有已知mRNA序列的siRNA靶标的综合性siRNA数据库(Protein Lounge系统生物学网站的部分)。
●siRNA Database and Resources for RNA Interference Studies http:(//)www.rnainterference.org/
●siRNA Selector-http:(//)bioinfo.wistar.upenn.edu/siRNA/siRNA.htm.使用一组规则基于热动力学参数(Khvorova等人，2003；Schwarz等人，2003)和由Dharmacon开发的序列相关决定因素(Reynolds等人，2004)来评估siRNA功能性。针对UniGene数据库使用BLAST来确定特异性(Wistar Institute)。
●siRNA Target Finder http:(//)www(.)ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html(Ambion)。
本公开书的复制性逆转录病毒也可表达天然存在的siRNA的靶标，所述靶标在表达上受限于特定细胞类型，使得载体复制在那些细胞类型中被显著抑制。基于鼠白血病病毒的重组可复制逆转录病毒载体的产生可允许高转导水平和因此体内基因递送的高效率。使用可复制逆转录病毒载体的一个主要问题在于先前所报导的病毒传播失控(Donahue等人，J.Exp Med.1992，176：1124-1135；Calmes等人，Blood 2005，106：2530-2533；Seggewiss等人，Blood 2006，107：3865-3867)。因为病毒的性质，病毒传播最初可以在淋巴细胞内发生且随后传播到外周组织。对于抗肿瘤目的，以一定水平天然复制的一些体内正常细胞是造血细胞、肠壁细胞和一些内皮细胞。这些正常细胞是在循环中可有效感染病毒的潜在位点。一般来说这是不合需要的。例如这些正常细胞等细胞的任何离群感染(stray infection)可通过在这些细胞类型中包括天然存在的miRNA或miRNA组合的靶标来抑制。已经展示了使用miRNA靶标抑制免疫反应的一些可行性(Brown等人，Nat Biotechnol.2007 25：1457-67)。这些靶标是与天然存在的miRNA序列具有同源匹配的小RNA序列。这些序列可以插入本发明载体的任何适宜位点中，一般不会对载体活力造成显著有害的后果，除非在期望类型的细胞中。载体可如本文所述来制备和使用。
在一个实施方案中，本发明提供一种重组可复制逆转录病毒载体，其在与IRES连接的转基因(例如yCD2或GFP)下游含有miR-142-3p靶序列(142-3pT，SEQ ID NO：35)的单拷贝。除了miR181和miR-223以外，其它组织或细胞富含的miRNA的靶序列也可并入载体中以限制病毒以特异性组织或细胞型方式传播。举例来说，miR-133和miR206在肌肉组织中的表达水平很高(Kelly等人，2008 Nature Medicine 14：11 1278-1283)。
在另一个实施方案中，本发明提供一种重组可复制逆转录病毒载体，其在与IRES连接的转基因(例如yCD2或GFP)下游含有142-3pT(SEQ ID NO：36)的4个拷贝。除了miR181和miR-223以外，其它组织或细胞富含的miRNA的靶序列也可并入载体中以限制病毒以特异性组织或细胞型方式传播。举例来说，miR-133和miR206在肌肉细胞中的表达水平很高。本发明提供miRNA的单个靶序列、多个靶序列或其组合的灵活性，且因此提供限制病毒在体外和体内(例如造血细胞和/或肌肉细胞)以组织和/或细胞特异性方式的失控传播(Kelly等人，2008 Nature Medicine 14：11 1278-1283)。
miRNA靶标可以插入转基因的3’，但在3’LTR或IRES上游之前，和包膜3’端之后。一般来说，靶标不会插入蛋白质编码序列中。
在其它实施方案中，异源多聚核苷酸可包含细胞因子，例如白细胞介素、γ干扰素等。可以从本公开书的逆转录病毒载体表达的细胞因子包括(但不限于)IL-1α、IL-1beta、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20和IL-21、抗CD40、CD40L 、IFN-γ和TNF-α、可溶形式的TNF-α、淋巴毒素-α(LT-α，也称为TNF-β)、LT-β(在复合异源三聚体LT-α2-β中发现)、OPGL、FasL、CD27L、CD30L、CD40L、4-1BBL、DcR3、OX40L、TNF-γ(国际公开案第WO 96/14328号)、AIM-I(国际公开案第WO 97/33899号)、endokine-α(国际公开案第WO 98/07880号)、OPG和neutrokine-α(国际公开案第WO 98/18921号)、OX40和神经生长因子(NGF)，和可溶形式的Fas、CD30、CD27、CD40和4-IBB、TR2(国际公开案第WO 96/34095号)、DR3(国际公开案第WO 97/33904号)、DR4(国际公开案第WO 98/32856号)、TR5(国际公开案第WO 98/30693号)、TRANK、TR9(国际公开案第WO 98/56892号)、TR10(国际公开案第WO 98/54202号)、312C2(国际公开案第WO 98/06842号)和TR12，和可溶形式的CD154、CD70和CD153。血管生成蛋白可用于一些实施方案中，尤其对于从细胞系产生蛋白质来说。所述血管生成因子包括(但不限于)神经胶质瘤源性生长因子(GDGF)、血小板源性生长因子-A(PDGF-A)、血小板源性生长因子-B(PDGF-B)、胎盘生长因子(PIGF)、胎盘生长因子-2(PIGF-2)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子-A(VEGF-A)、血管内皮生长因子-2(VEGF-2)、血管内皮生长因子B(VEGF-3)、血管内皮生长因子B-1 86(VEGF-B186)、血管内皮生长因子-D(VEGF-D)、血管内皮生长因子-D(VEGF-D)和血管内皮生长因子-E(VEGF-E)。成纤维细胞生长因子可通过本公开书的载体递送，且包括(但不限于)FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14和FGF-15。造血生长因子可使用本公开书的载体递送，所述生长因子包括(但不限于)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(沙格司亭(sargramostim))、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(非格司亭(filgrastim))、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF、CSF-1)、红细胞生成素(阿法依泊汀(epoetinalfa))、干细胞因子(SCF、c-kit配体、青灰因子)、巨核细胞集落刺激因子、PIXY321(GMCSF/IL-3)融合蛋白等。
本公开书的重组病毒一般能够将核酸序列转移到靶细胞中。
术语“调节核酸序列”总体是指启动子序列、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节域、复制起点、增强子等，这些序列总体用于受体细胞中编码序列的复制、转录和翻译。并不是所有的这些控制序列都必须存在，只要所选的编码序列能在适当宿主细胞中复制、转录和翻译即可。所属领域技术人员容易从公开数据库和材料鉴别调节核酸序列。此外，所属领域技术人员可鉴别适用于预期用途(例如体内、体外或体外)的调节序列。
内部核糖体进入位点(“IRES”)是指在通常处于IRES的3’的编码序列翻译期间促进核糖体进入或滞留的核酸片段。在一些实施方案中，IRES可包含剪接受体/供体位点，但优选的IRES缺少剪接受体/供体位点。核糖体通常经由位于所有真核信使RNA的5’端的帽序列进入mRNA。然而，这一普遍规律存在例外。在一些病毒mRNA中缺乏帽序列表明在这些RNA的内部位点上存在可允许核糖体进入的替代结构。迄今为止，已经在未加帽病毒mRNA的5’非编码区中鉴别了许多此类结构(根据其功能命名为IRES)，尤其例如在细小核糖核酸病毒中，例如脊髓灰质炎病毒(Pelletier等人，1988，Mol.Cell.Biol.，8，1103-1112)和EMCV病毒(脑心肌炎病毒)(Jang等人，J.Virol.，1988，62，2636-2643)。本公开书提供IRES在可复制逆转录病毒载体的情况中的用途。
术语“启动子区”在本文中以其普通意义使用，是指包含DNA调节序列的核苷酸区域，其中调节序列来源于能结合RNA聚合酶并起始下游(3’方向)编码序列的转录的基因。调节序列可与期望基因序列同源或异源。举例来说，可利用多种启动子，包括上文所述的病毒或哺乳动物启动子。
异源核酸序列典型地处于病毒LTR启动子-增强子信号或内部启动子的控制下，且逆转录病毒LTR内保留的信号仍可导致载体有效地整合到宿主细胞基因组中。因此，本公开书的重组逆转录病毒载体、期望序列、基因和/或基因片段可在一些位点中和不同调节序列的控制下插入。举例来说，插入位点可以是病毒增强子/启动子邻近位点(即5’LTR驱动的基因座位)。或者，期望序列可插入调节序列远端位点(例如env基因3’的IRES序列)中或存在两个或两个以上异源序列的地方，一个异源序列可处于第一调节区的控制下且第二异源序列可处于第二调节区的控制下。其它远端位点包括病毒启动子序列，其中一个或多个期望序列的表达是通过启动子邻近顺反子的剪接，可使用内部异源启动子(例如SV40或CMV)或内部核糖体进入位点(IRES)。
在一个实施方案中，本公开书的逆转录病毒基因组含有在IRES下游包含克隆位点以用于插入期望/异源多聚核苷酸的IRES。在一个实施方案中，IRES位于逆转录病毒载体中env基因的3’，但位于期望异源多聚核苷酸的5’。因此，编码期望多肽的异源多聚核苷酸可操作地连接于IRES。
在另一个实施方案中，包括靶向多聚核苷酸序列作为本公开书的重组逆转录病毒载体的部分。靶向多聚核苷酸序列是靶向配体(例如肽激素(例如调蛋白(heregulin))、单链抗体、受体或受体的配体)、组织特异性或细胞类型特异性调节元件(例如组织特异性或细胞类型特异性启动子或增强子)或靶向配体与组织特异性/细胞类型特异性调节元件的组合。优选地，靶向配体可操作地连接于逆转录病毒的env蛋白，从而产生嵌合逆转录病毒env蛋白。病毒GAG、病毒POL和病毒ENV蛋白可来源于任何合适的逆转录病毒(例如MLV或慢病毒源性的)。在另一个实施方案中，病毒ENV蛋白是非逆转录病毒源性的(例如CMV或VSV)。
在一个实施方案中，本公开书的重组逆转录病毒可以将病毒靶向于特定细胞类型(例如平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、间质干细胞、骨髓细胞、软骨细胞、上皮细胞、肠细胞、乳房细胞、赘生性细胞、神经胶质瘤细胞、神经元细胞和所属领域中已知的其它细胞)的方式遗传改造：使得逆转录病毒载体的重组基因组被递送到非分裂靶细胞、分裂靶细胞或具有细胞增殖失调的靶细胞。
在一个实施方案中，逆转录病毒载体是通过结合于在细胞外表面上具有分子的细胞而靶向于细胞。所述靶向逆转录病毒的方法利用靶向配体在逆转录病毒包膜上表达，以便帮助病毒靶向于具有与逆转录病毒表面上的靶向配体相互作用的受体或结合分子的细胞或组织。在病毒感染细胞之后，病毒将其核酸注入细胞且逆转录病毒遗传物质可整合入宿主细胞基因组。
在另一个实施方案中，靶向操作利用细胞或组织特异性调节元件，以促进病毒基因组在主动利用调节元件的被靶向细胞中的表达和转录，如下文更详细地描述。转移的逆转录病毒遗传物质然后在宿主细胞内被转录和翻译成蛋白质。靶向调节元件典型地连接于5’和/或3’LTR，从而产生嵌合LTR。
通过将目的异源多聚核苷酸连同编码例如特异性靶细胞上的受体的配体的另一个基因插入本公开书的病毒载体，载体现在具有靶标特异性。病毒载体可通过连接例如糖、糖脂或蛋白质而具有靶标特异性。靶向可使用靶向病毒载体的抗体来完成。所属领域技术人员将了解或容易确定，可插入与病毒包膜连接的病毒基因组或蛋白中以允许含有目的核酸序列的病毒载体的靶特异性递送的特异性多聚核苷酸序列。
因此，在一个实施方案中，本公开书包括嵌合env蛋白，其包含可操作地连接于靶向多肽的逆转录病毒ENV蛋白。靶向多肽可以是细胞特异性受体分子、细胞特异性受体的配体、细胞特异性抗原表位的抗体或抗体片段，或所属领域中容易鉴别的可结合靶细胞或与靶细胞相互作用的任何其它配体。靶向多肽或分子的实例包括使用生物素-链霉亲和素作为连接子的二价抗体(Etienne-Julan等人，J.Of General Virol.，73，3251-3255(1992)；Roux等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 86，9079-9083(1989))；在包膜上含有编码针对半抗原的单链抗体可变区的序列的重组病毒(Russell等人，Nucleic Acids Research，21，1081-1085(1993))；将肽激素配体克隆到逆转录病毒包膜中(Kasahara等人，Science，266，1373-1376(1994))；嵌合EPO/env构建体(Kasahara等人，1994)；针对亲嗜性MLV包膜中的低密度脂蛋白(LDL)受体的单链抗体，导致表达LDL受体的HeLa细胞的特异性感染(Somia等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA，92，7570-7574(1995))；类似地，ALV的宿主范围可通过并入整合素配体而改变，使得病毒现在能跨物种以特异性地感染大鼠胶质母细胞瘤细胞(Valsesia-Wittmann等人，J.Virol.68，4609-4619(1994))；且Dornberg和其合作者(Chu和Dornburg，J.Virol 69，2659-2663(1995))已经报导了脾坏死病毒(SNV)(一种禽类逆转录病毒)的组织特异性靶向，其使用含有针对肿瘤标志物导向的单链抗体的包膜。
本公开书提供一种产生能感染靶细胞的重组逆转录病毒的方法，其包括用以下载体转染合适宿主细胞和回收重组病毒：所述载体包含编码病毒gag、病毒pol和病毒env的多聚核苷酸序列，和可操作地连接于调节核酸序列的异源多聚核苷酸。
本公开书的逆转录病毒和方法提供可复制逆转录病毒，其不需要辅助病毒或其它核酸序列或蛋白质以便传播和产生病毒粒子。举例来说，本公开书的逆转录病毒的核酸序列编码例如本文分别讨论的群特异性抗原和逆转录酶(以及成熟和逆转录所必需的整合酶和蛋白酶)。病毒gag和pol可来源于慢病毒(例如HIV)或致癌病毒或γ逆转录病毒(例如MoMLV)。此外，本公开书的逆转录病毒的核酸基因组包括编码病毒包膜(ENV)蛋白的序列。env基因可来源于任何逆转录病毒。env可为允许人类和其它物种的细胞转导的双嗜性包膜蛋白，或可为只能转导小鼠和大鼠细胞的亲嗜性包膜蛋白。此外，可能需要通过将包膜蛋白与抗体或用于靶向于特定细胞类型的受体的特定配体连接来靶向重组病毒。如上所述，逆转录病毒载体可通过插入例如糖脂或蛋白质而具有靶标特异性。靶向操作通常通过使用抗体将逆转录病毒载体靶向于特定细胞类型上的抗原(例如在某些组织中发现的细胞类型，或癌细胞类型)来实现。所属领域技术人员将认识到或不经过多实验即可容易地确定，用于将逆转录病毒载体递送于特定靶标的特定方法。在一个实施方案中，env基因来源于非逆转录病毒(例如CMV或VSV)。逆转录病毒源性的env基因的实例包括(但不限于)：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈维鼠类肉瘤病毒(Harvey murine sarcoma virus)(HaMuSV)、鼠类乳腺致癌病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)和劳氏肉瘤病毒(RSV)。也可使用其他env基因，例如水泡性口炎病毒(VSV)(蛋白质G)、巨细胞病毒包膜(CMV)或流感病毒血细胞凝集素(HA)。
在一个实施方案中，逆转录病毒基因组来源于致癌逆转录病毒，且更具体地来源于哺乳动物致癌逆转录病毒。“来源”意思是母体多聚核苷酸序列是已经通过插入或去除天然存在的序列(例如插入IRES、插入编码目的多肽或抑制核酸的异源多聚核苷酸、用来自不同逆转录病毒或病毒的更有效的启动子交换野生型启动子等)而被修饰的野生型致癌病毒。
不同于本领域标准方法所产生的重组逆转录病毒，这些病毒存在缺陷且需要帮助以产生感染性载体粒子，本公开书提供可复制逆转录病毒。
在另一个实施方案中，本公开书提供使用调节序列靶向的逆转录病毒载体。可利用细胞或组织特异性调节序列(例如启动子)来靶向基因序列在特异性细胞群体中的表达。本文其它地方描述用于本公开书的合适哺乳动物和病毒启动子。因此，在一个实施方案中，本公开书提供在逆转录病毒基因组的5’端具有组织特异性启动子元件的逆转录病毒。典型地，组织特异性调节元件/序列位于逆转录病毒基因组的LTR的U3区中，包括例如用于赘生性细胞的细胞或组织特异性启动子和增强子(例如肿瘤细胞特异性增强子和启动子)，和诱导型启动子(例如四环素)。
本公开书的转录控制序列也可包括与编码超抗原、细胞因子或趋化因子的基因天然连接的天然存在的转录控制序列。
在一些情况下，可能需要调节表达。举例来说，取决于期望表达水平，可利用具有不同活性强度的不同病毒启动子。在哺乳动物细胞中，经常使用CMV立即早期启动子来提供强转录活化。当期望转基因的表达水平降低时，也已经使用了效力较低的CMV启动子的经修饰形式。当期望转基因在造血细胞中表达时，可使用逆转录病毒启动子，例如来自MLV或MMTV的LTR。可使用的其它病毒启动子包括SV40、RSV LTR、HIV-1和HIV-2LTR、例如来自E1A、E2A或MLP区的腺病毒启动子、AAV LTR、花椰菜花叶病毒、HSV-TK和禽类肉瘤病毒。
可使用类似的组织特异性或选择性启动子来实现在特异性组织或细胞中的转录，以便降低对非靶向组织的潜在毒性或不当影响。举例来说，可使用例如PSA、前列腺碱性蛋白(probasin)、前列腺酸性磷酸酶或前列腺特异性腺激肽释放酶(hK2)来靶向前列腺中的基因表达。乳清辅助蛋白(WAP)可用于乳房组织表达(Andres等人，PNAS 84：1299-1303，1987)。表1列举可使用的其它启动子/调节域。
“组织特异性调节元件”是能驱动基因在一种组织中转录同时在其它组织类型中大体上保持“沉默”的调节元件(例如启动子)。然而，应了解组织特异性启动子在其沉默的那些组织中可具有可检测量的“背景”或“基础”活性。启动子在靶组织中被选择性地活化的程度可用选择性比(靶组织中的活性/对照织中的活性)表示。就此而言，可用于实施本公开的组织特异性启动子典型地具有大于约5的选择性比。选择性比优选地大于约15。
在某些适应症中，可能需要在施用本公开书的重组可复制逆转录病毒(RRCR)之后的特定时间活化转录。这可以用可由激素或细胞因子调节的启动子进行。举例来说，在适应症是产生特异性类固醇或特异性类固醇导向的性腺组织的治疗应用中，使用受雄激素或雌激素调节的启动子可能是有利的。可由激素调节的所述启动子包括MMTV、MT-1、蜕皮激素和RuBisco。可使用其它受激素调节的启动子，例如响应于甲状腺、垂体和肾上腺激素的启动子。可使用的细胞因子和免疫蛋白响应启动子包括K和T激肽原(Kininogen)(Kageyama等人，1987)、c-fos、TNF-α、C反应蛋白(C-reactive protein)(Arcone等人，1988)、结合珠蛋白(haptoglobin)(Oliviero等人，1987)、血清淀粉样蛋白A2、C/EBPα、IL-1、IL-6(Poli和Cortese，1989)、补体C3(Wilson等人，1990)、IL-8、α-1酸性糖蛋白(Prowse和Baumann，1988)、α-1抗胰蛋白酶、脂蛋白脂酶(Zechner等人，1988)、血管紧张素原(angiotensinogen)(Ron等人，1990)、纤维蛋白原(fibrinogen)、c-jun(可由佛波醇酯(phorbol ester)、TNF-α、UV辐射、视黄酸和过氧化氢诱导)、胶原酶(由佛波醇酯和视黄酸诱导)、金属硫蛋白(可由重金属和糖皮质激素诱导)、基质降解酶(Stromelysin)(可由佛波醇酯、白细胞介素-1和EGF诱导)、α-2巨球蛋白和α-1抗胰凝乳蛋白酶(antichymotrypsin)。也可使用肿瘤特异性启动子(例如骨钙素(osteocalcin)、缺氧反应元件(hypoxia-responsive element；HRE)、MAGE-4、CEA、α-甲胎蛋白(α-fetoprotein)、GRP78/BiP和酪氨酸酶)来调节肿瘤细胞中的基因表达。
此外，所述启动子清单不应解释为穷尽性的或限制性的，所属领域技术人员将知晓可与本文所公开的启动子和方法结合使用的其它启动子。
表1 组织特异性启动子
应进一步了解，某些启动子虽然在活性上不受限于单一组织类型，但仍然可能显示选择性，因为其在一组组织中可能有活性，而在另一组组织中活性较低或沉默。所述启动子也称为“组织特异性”，且预期用于本公开书。举例来说，在各种中枢神经系统(CNS)神经元中有活性的启动子可在治疗上用于防止因中风所致的伤害，中风可影响许多不同的大脑区域。因此，本公开书中所用的组织特异性调节元件适用于调节异源蛋白以及可用作本发明逆转录病毒载体中的靶向多聚核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本公开书提供包括重组逆转录病毒源性的构建体的质粒。质粒可以直接引入靶细胞或细胞培养物中，例如NIH 3T3或其它组织培养细胞。所得细胞将逆转录病毒载体释放到培养基中。
本公开书提供一种多聚核苷酸构建体，其从5’到3’包含：可用于起始转录的启动子或调节区；psi包装信号；gag编码核酸序列；pol编码核酸序列；env编码核酸序列；内部核糖体进入位点核酸序列；编码标志物、治疗或诊断多肽的异源多聚核苷酸；和LTR核酸序列。如本文其它地方所述和如下所示，本公开书的多聚核苷酸构建体的各种链段(例如重组可复制逆转录病毒多聚核苷酸)部分取决于期望宿主细胞、表达时间或量和异源多聚核苷酸而经工程改造。本公开书的可复制逆转录病毒构建体可分为多个结构域，它们可由所属领域技术人员单独修饰。
举例来说，启动子可包括具有如SEQ ID NO：19、20或22的核苷酸1到约核苷酸582中所述的序列的CMV启动子，且可包含对一个或多个(例如2-5、5-10、10-20、20-30、30-50、50-100个或以上核酸碱基)核酸碱基所作的修饰，只要经修饰的启动子能够引导和起始转录即可。在一个实施方案中，启动子或调节区包含CMV-R-U5域多聚核苷酸。CMV-R-U5域包含来自人类巨细胞病毒的立即早期启动子和MLV R-U5区的融合体。在一个实施方案中，CMV-R-U5域多聚核苷酸包含如SEQ ID NO：19、20或22的约核苷酸1到约核苷酸1202所述的序列，或与如SEQ ID NO：19、19或22所述的序列具有至少95％同一性的序列，其中所述多聚核苷酸促进与其可操作地连接的核酸分子的转录。多聚核苷酸的gag域可来源于多种逆转录病毒，但典型地来源于致癌逆转录病毒且更具体地来源于哺乳动物致癌逆转录病毒。在一个实施方案中，gag域包含来自约核苷酸1203到约核苷酸2819的序列或与所述序列具有至少95％、98％、99％或99.8％(四舍五入到十分位)同一性的序列。多聚核苷酸的pol域可来源于多种逆转录病毒，但典型地来源于致癌逆转录病毒且更具体地来源于哺乳动物致癌逆转录病毒。在一个实施方案中，pol域包含来自约核苷酸编号2820到约核苷酸6358的序列或与所述序列具有至少95％、98％、99％或99.9％(四舍五入到十分位)同一性的序列。多聚核苷酸的env域可来源于多种逆转录病毒，但典型地来源于致癌逆转录病毒或γ-逆转录病毒且更具体地来源于哺乳动物致癌逆转录病毒或γ-逆转录病毒。在一些实施方案中，env编码域包括双嗜性env域。在一个实施方案中，env域包括来自约核苷酸编号6359到约核苷酸8323的序列或与所述序列具有至少95％、98％、99％或99.8％(四舍五入到十分位)同一性的序列。多聚核苷酸的IRES域可从任何内部核糖体进入位点获得。在一个实施方案中，IRES来源于脑心肌炎病毒。在一个实施方案中，IRES域包含来自约核苷酸编号8327到约核苷酸8876的序列或与所述序列具有至少95％、98％或99％(四舍五入到十分位)同一性的序列，只要所述域允许核糖体进入即可。异源域可包含本公开书的胞嘧啶脱氨酶。在一个实施方案中，CD多聚核苷酸包含经人类密码子优化的序列。在另一个实施方案中，CD多聚核苷酸编码具有胞嘧啶脱氨酶的突变多肽，其中所述突变赋予增加的热稳定性，这使得解链温度(Tm)升高10℃，从而允许在更为宽广的温度范围下的持续动力学活性和提高的蛋白质累积水平。在一个实施方案中，胞嘧啶脱氨酶包含如SEQ ID NO：19或22的约核苷酸编号8877到约9353所述的序列。异源域之后可紧跟聚嘌呤富集域。3’LTR可来源于任何数目的逆转录病毒，典型地致癌逆转录病毒且优选地哺乳动物致癌逆转录病毒。在一个实施方案中，3’LTR包括U3-R-U5域。在另一个实施方案中，LTR包括如SEQ ID NO：19的约核苷酸9405到约9998所述的序列，或与其具有至少95％、98％或99.5％(四舍五入到十分位)同一性的序列。
本公开书还提供一种重组逆转录病毒载体，其从5’到3’依次包含：CMV-R-U5，即人类巨细胞病毒的立即早期启动子与MLV R-U5区的融合体；PBS，即逆转录酶的引物结合位点；5’剪接位点；ψ包装信号；gag，即MLV群特异性抗原的ORF；pol，即MLV聚合酶多聚蛋白的ORF；3’剪接位点；4070Aenv，即MLV品系4070A的包膜蛋白的ORF；IRES，即脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点；经修饰的胞嘧啶脱氨酶(经热稳定化和密码子优化)；PPT，即聚嘌呤束；和U3-R-U5，即MLV长末端重复序列。这个结构在图3中进一步描绘。
本公开书还提供一种包括如SEQ ID NO：19、20或22所述的序列的逆转录病毒载体。
逆转录病毒载体可用于治疗多种疾病和失调，包括许多细胞增殖疾病和失调(参看例如美国专利第4,405,712和4,650,764号；Friedmann，1989，Science，244：1275-1281；Mulligan，1993，Science，260：926-932，R.Crystal，1995，Science 270：404-410，其各自以全文引用的方式并入本文中；另外也参看The Development of Human Gene Therapy，Theodore Friedmann编，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1999.ISBN 0-87969-528-5，其以全文引用的方式并入本文中)。
本公开书还提供用于治疗细胞增殖失调的基因疗法。所述疗法通过将适当的治疗性多聚核苷酸(例如反义分子、核酶、自杀基因、siRNA)引入到患有增殖失调的受试对象的细胞中来实现其治疗作用。多聚核苷酸构建体可使用本公开书的重组逆转录病毒载体来递送，尤其当所述载体是基于能感染分裂细胞的MLV时。
此外，如本文所述的治疗方法(例如基因疗法或基因递送方法)可在体内或体外进行。优选在基因治疗之前去除大部分肿瘤，例如通过外科手术或通过放射。在一些方面，逆转录病毒治疗可在外科手术、化学治疗或放射治疗之后或之前进行。
因此，本公开书提供一种能感染非分裂细胞、分裂细胞或赘生性细胞的重组逆转录病毒，其中重组逆转录病毒包含病毒GAG；病毒POL；病毒ENV；可操作地连接于IRES的异源核酸；和包装、逆转录和整合所必需的顺式作用核酸序列。重组逆转录病毒可以是慢病毒(例如HIV)，或可以是致癌病毒。如上文对于产生重组逆转录病毒的方法所述，本公开书的重组逆转录病毒可进一步包括VPR、VIF、NEF、VPX、TAT、REV和VPU蛋白的至少一种。不希望受特定理论束缚，相信这些基因/蛋白产物中的一种或一种以上对于增加所产生的重组逆转录病毒(例如NEF)的病毒滴度至关重要，或可能是感染和包装病毒粒子所必需的。
本公开书还提供一种将核酸转移到靶细胞以提供特定核酸(例如异源序列)的表达的方法。因此，在另一个实施方案中，本公开书提供一种在靶细胞中引入和表达异源核酸的方法，其包含用本公开书的重组病毒感染靶细胞，和在靶细胞中表达异源核酸。如上文所述，靶细胞可以是任何细胞类型，包括分裂、非分裂、赘生性、永生化、经修饰细胞和所属领域技术人员知晓的其它细胞类型，只要它们能被逆转录病毒感染即可。
可能需要通过用本公开书的方法引入核酸序列(例如异源核酸序列)来调整细胞中的基因表达，其中核酸序列例如产生反义或核酶分子。术语“调整”表示当基因过度表达时抑制基因表达，或者当基因表达不足时增强基因表达。当细胞增殖失调与基因表达相关时，可使用在翻译水平上干扰基因表达的核酸序列。这种方法利用例如反义核酸、核酶或三螺旋介质，通过用反义核酸或三螺旋介质屏蔽特异性mRNA，或通过用核酶裂解特异性mRNA来阻断特定mRNA的转录和翻译。
可能需要将编码生物反应调节剂(例如细胞因子)的核酸转移到细胞或受试对象中。所述类别包括免疫增强剂，包括编码被分类为“白细胞介素”的许多细胞因子的核酸。这些生物反应调节剂包括例如白细胞介素1到15，以及本文其它地方所述的其它反应调节剂和因子。虽然不一定根据相同机制工作，但所述类别也包括干扰素且尤其是γ干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。其它多肽包括例如血管生成因子和抗血管生成因子。可能需要将所述核酸递送到骨髓细胞或巨噬细胞以治疗酶缺陷或免疫缺陷。也可将编码生长因子、毒性肽、配体、受体或其它生理学上重要的蛋白质的核酸引入特定靶细胞中。
本公开书可用于递送促进药物特异性靶向和作用的异源多聚核苷酸。举例来说，EGF受体家族成员HER2(参看例如SEQ ID NO：23和24)是药物曲妥珠单抗(trastuzumab)(赫赛汀(Herceptin)TM，Genentech)的结合靶标。曲妥珠单抗是抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的介导物。活性利用免疫组织化学优先被靶向于2+和3+级过度表达的HER2表达细胞，而不是1+级和非表达细胞(Herceptin prescribing information，Crommelin 2002)。通过在低HER2肿瘤中引入表达HER2或截短HER2(只表达胞外域和跨膜域)的载体来增强HER2的表达可促进ADCC的最佳触发并克服在临床应用上观察到的快速出现HER2抗性。
用yCD2(包含SEQ ID NO：19的约8877到9353)取代HER2的胞内域可允许HER2的细胞表面表达和yCD2的胞质定位。HER2胞外域(ECD)和跨膜域(TM)(SEQ ID NO：23的约175到2200位的约2026bp)可通过PCR扩增(Yamamoto等人，Nature 319：230-234，1986；Chen等人，Canc.Res.，58：1965-1971，1998)或化学合成(BioBasic Inc.，Markham，Ontario，Canada)，并插入载体pAC3-yCD2SEQ ID NO：19中的IRES与yCD2基因之间(例如在SEQ ID NO：19的约核苷酸8876与8877之间)。或者，yCD基因可被切除并用编码HER2多肽或其片段的多聚核苷酸取代。仅具有ECD和TM域的赫赛汀结合域IV(1910到2200位的约290bp)的另一种截短HER2可如上文所述被扩增或化学合成并使用(Landgraf 2007；Garrett等人，J.of Immunol.，178：7120-7131，2007)。具有融合于IV和TM域的天然信号肽(175-237位的约69bp)的所述截短形式的另一种修饰体可如上文所述被化学合成和使用。所得病毒可与曲妥珠单抗或曲妥珠单抗和5-FC结合用于治疗受试对象的细胞增殖失调。
或者，如上所述的HER2和修饰体可在含有不同ENV基因或其它适当表面蛋白的单独载体中表达。这种载体可以是编码目的包膜和基因的可复制性(Logg等人J.Mol Biol.369：1214 2007)或非复制性“第一代”逆转录病毒载体(Emi等人J.Virol 65：1202 1991)。在后一种情况下，已有的病毒感染会提供互补gag和pol以允许“非复制性”载体从任何先前感染细胞进行感染传播。替代性ENV和糖蛋白包括能感染人类细胞的异嗜性和多嗜性ENV和糖蛋白，例如来自MLV的NZB品系的ENV序列和来自MCF、VSV、GALV和其它病毒的糖蛋白(Palu 2000，Baum等人，Mol.Therapy，13(6)：1050-1063，2006)。举例来说，多聚核苷酸可包括如下序列，其中SEQ ID NO：19的GAG和POL和yCD2基因被缺失，ENV对应于NZB MLV或VSV-g的异嗜性ENV域，且IRES或启动子(例如RSV)可操作地直接连接于HER2、HER2 ECDTM、HER2 ECDIVTM或HER2 SECDIVTM。
用VSVG假型病毒和双嗜性逆转录病毒混合感染细胞会产生携带被另一种病毒的包膜蛋白衣壳化的一种病毒的基因组的子代病毒粒子。这一点同样适用于假型逆转录病毒粒子的其它包膜。举例来说，上述来源的逆转录病毒所造成的感染会产生能在被感染细胞中编码yCD2和HER2(或变异体)的子代病毒粒子。所得病毒可与曲妥珠单抗或曲妥珠单抗和5-FC结合用于治疗受试对象的细胞增殖失调。
最近，已经将γ逆转录病毒XMRV与具有在前列腺组织中显示强复制优先性的病毒的人类前列腺癌联系起来(R.Schlaberg等人PNAS106：16351-163562009)。所述病毒似乎非常类似于异嗜性MLV。在本发明的一个实施方案中，提供非复制性逆转录病毒载体，其具有治疗基因(胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶、其它前药活化基因、干扰素、IL-2、IL-12、其它细胞因子、p53其它抗癌基因、抗癌miRNA等)与能由XMRV gag和gagpol功能物互补的包膜基因，例如双嗜性包膜、GALV包膜、VSVg蛋白包膜或所属领域技术人员已知的其它包膜。非复制性载体多聚核苷酸作为DNA或RNA分子利用以下物质中的一种被递送到患者或动物前列腺癌：非病毒或物理递送系统；异源病毒递送系统，例如腺病毒载体；或以所制造的逆转录病毒粒子的形式。一旦被递送后，非复制性载体将通过XMRV互补而传播，且邻近细胞将发生感染，直至到达XMRV感染边界为止，此时XMRV互补不再可用。治疗基因然后可仅在XMRV感染区域具有作用(例如在施用前药后)。可使用本发明的复制性逆转录病毒载体实现相同的拯救作用。这种策略(与治疗基因互补的非复制性载体)可用于任何逆转录病毒疾病(HIV感染、HTLV1感染、其它与逆转录病毒相关的癌症)或任何病毒或病毒相关疾病(在宫颈癌、EBV相关淋巴瘤或癌瘤等中的HPV感染和HPV E6 & E7表达)。
发展曲妥珠单抗抗性的另一方面涉及干扰曲妥珠单抗活性所必需的胞内信号传导。抗性细胞显示缺少PTEN和p27kip1表达较低(Fujita，Brit J.Cancer，94：247，2006；Lu等人，Journal of the National Cancer Institute，93(24)：1852-1857，2001；Kute等人，Cytometry Part A 57A：86-93，2004)。举例来说，编码PTEN(SEQ ID NO：25)的多聚核苷酸可被重组产生或化学合成(BioBasic Inc.，Markham，Canada)，并可操作地直接插入载体pAC3-yCD2 SEQ ID NO：19或22中的yCD2多聚核苷酸之后，或连同先前所述的连接子序列一起插入，或代替yCD2插入。在另一个实施例中，编码PTEN的多聚核苷酸可如上合成并插入IRES与yCD2序列之间，或连同先前所述的连接子一起插入。
或者，PTEN可在含有不同ENV基因或其它适当表面蛋白的单独载体中表达。这种载体可以是编码目的包膜和基因的可复制性(Logg等人J.Mol Biol.369：1214 2007)或非复制性“第一代”逆转录病毒载体(Emi等人J.Virol 65：12021991)。在后一种情况下，已有的病毒感染会提供互补gag和pol以允许“非复制性”载体从任何先前感染细胞进行感染传播。替代性ENV和糖蛋白包括能感染人类细胞的异嗜性和多嗜性ENV和糖蛋白，例如来自MLV的NZB品系的ENV序列和来自MCF、VSV、GALV和其它病毒的糖蛋白(Palu，Rev Med Virol.2000，Baum，Mol.Ther.13(6)：1050-1063，2006)。举例来说，多聚核苷酸可包括如下序列，其中SEQ ID NO：19的GAG和POL和yCD2基因被缺失，ENV对应于NZB MLV或VSV-g的异嗜性ENV域，且IRES或启动子(例如RSV)可操作地直接连接于PTEN。
用VSVG假型病毒和双嗜性逆转录病毒混合感染细胞会产生带有被另一种病毒的包膜蛋白衣壳化的一种病毒的基因组的子代病毒粒子[Emi 1991]。这一点同样适用于假型逆转录病毒粒子的其它包膜。举例来说，上述来源的逆转录病毒所造成的感染会产生能在被感染细胞中编码yCD2和PTEN(或变异体)或只编码PTEN的子代病毒粒子。所得病毒可与曲妥珠单抗或曲妥珠单抗和5-FC结合用于治疗受试对象的细胞增殖失调。
类似地，编码p27kip1(SEQ ID NO：27和28)的多聚核苷酸可被化学合成(BioBasic Inc.，Markham，Canada)，并可操作地直接插入载体pAC3-yCD2 SEQ ID NO：19中的yCD2基因之后，或连同连接子序列一起插入。在另一个实施例中，编码p27kip1的多聚核苷酸可如上合成并插入IRES与yCD2序列之间，或连同先前所述的连接子一起插入或代替yCD2基因插入。
或者，p27kip1可在含有不同ENV基因或其它适当表面蛋白的单独载体中表达。这种载体可以是编码目的包膜和基因的可复制性(CR.Logg等人J.Mol Biol.369：1214 2007)或非复制性“第一代”逆转录病毒载体(Emi等人J.Virol 65：1202 1991)。在后一种情况下，已有的病毒感染会提供互补gag和pol以允许“非复制性”载体从任何先前感染细胞进行感染传播。替代性ENV和糖蛋白包括能感染人类细胞的异嗜性和多嗜性ENV和糖蛋白，例如来自MLV的NZB品系的ENV序列和来自MCF、VSV、GALV和其它病毒的糖蛋白(Palu 2000，Baum 2006，上文)。举例来说，多聚核苷酸可包括如下序列，其中SEQ ID NO：19的GAG和POL和yCD2基因被缺失，ENV对应于NZB MLV或VSV-g的异嗜性ENV域，且IRES或启动子(例如RSV)可操作地直接连接于p27kip1。
用VSVG假型病毒和双嗜性逆转录病毒混合感染细胞会产生一种病毒的基因组被另一种病毒的包膜蛋白衣壳化的子代病毒粒子[Emi 1991]。这一点同样适用于假型逆转录病毒粒子的其它包膜。举例来说，如上所述来源于SEQ ID NO：19和22的逆转录病毒所造成的感染会产生能在被感染细胞中编码yCD2和p27kip1(或变异体)的子代病毒粒子。所得病毒可与曲妥珠单抗或曲妥珠单抗和5-FC结合用于治疗受试对象的细胞增殖失调。
在另一个实施例中，CD20是药物利妥昔单抗(rituximab)(RituxanTM，Genentech)的结合靶标。利妥昔单抗是补体依赖性细胞毒性(CDC)和ADCC的介导物。根据流式细胞术测量，具有较高平均荧光强度的细胞显示提高的利妥昔单抗敏感性(van Meerten等人，Clin Cancer Res 2006；12(13)：4027-4035，2006)。通过在低CD20B细胞中引入表达CD20的载体来增强CD20表达可促进ADCC的最佳触发。
举例来说，编码CD20(SEQ ID NO：29和30)的多聚核苷酸可被化学合成(BioBasic Inc.，Markham，Canada)，并连同先前所述的连接子序列一起可操作地直接插入载体pAC3-yCD2(-2)SEQ ID NO：19或22中的yCD2基因之后，或代替yCD2基因插入。在另一个实施例中，编码CD20的多聚核苷酸可如上合成并插入IRES与yCD2序列之间，或连同先前所述的连接子一起插入。作为另一个替代方案，CD20序列可在通过Psi1和Not1消化切除CD基因后插入pAC3-yCD2载体中。
在另一个实施例中，编码CD20(SEQ ID NO：29和30)的多聚核苷酸可被化学合成(BioBasic Inc.，Markham，Canada)，并插入含有非双嗜性ENV基因或其它适当表面蛋白的载体中(Tedder等人，PNAS，85：208-212，1988)。替代性ENV和糖蛋白包括能感染人类细胞的异嗜性和多嗜性ENV和糖蛋白，例如来自MLV的NZB品系的ENV序列和来自MCF、VSV、GALV和其它病毒的糖蛋白(Palu 2000，Baum 2006)。举例来说，多聚核苷酸可包括如下序列，其中SEQ ID NO：19的GAG和POL和yCD2基因被缺失，ENV对应于NZB MLV或VSV-g的异嗜性ENV域，且IRES或启动子(例如RSV)可操作地直接连接于CD20。
用VSVG假型病毒和双嗜性逆转录病毒混合感染细胞会产生含有被另一种病毒的包膜蛋白衣壳化的一种病毒的基因组的子代病毒粒子[Emi 1991]。这一点同样适用于假型逆转录病毒粒子的其它包膜。举例来说，如上所述来源于SEQ ID NO：19或22的逆转录病毒所造成的感染会产生能在被感染细胞中编码yCD2和CD20的子代病毒粒子。所得病毒可与美罗华(Rituxan)和/或5-FC结合用于治疗受试对象的细胞增殖失调。类似地，用仅编码CD20标志物的载体感染肿瘤可导致肿瘤可通过使用美罗华来治疗。
嘧啶合成代谢中所涉及的酶和辅因子的水平可构成限制。与敏感细胞系相比，OPRT、胸苷激酶(TK)、尿苷磷酸激酶和嘧啶核苷磷酸化酶在5-FU抗性癌细胞中的表达水平很低(Wang等人，Cancer Res.，64：8167-8176，2004)。大群体分析显示酶水平与疾病结果的相关性(Fukui等人，Int’l.J.OF Mol.Med.，22：709-716，2008)。可利用CD和其它嘧啶合成代谢酶(PAE)的共表达来增加活性且因此增加氟嘧啶药物的治疗指数。
为了进一步增加含yCD2/PAE载体的遗传稳定性(参看例如图5)，可化学合成在序列中具有随机突变的酶编码基因。这些突变可以是基本上随机的，或可以仅由每个氨基酸的摆动位置上的突变组成。突变序列的文库如先前对于SEQ ID NO：11和13所述插入yCD2基因下游或代替yCD2基因插入，以产生质粒文库，其可接着通过瞬时转染293T细胞或同等物而用于产生感染粒子文库。可用编码融合多肽的逆转录病毒感染敏感细胞并用适当化学物进行筛选。
DNA改组或“分子育种”允许改组遗传信息，从而产生具有期望特性的重组体。已经利用DNA改组改良了不同的蛋白质和酶(Stemmer 1994 Proc Natl Acad Sci USA 91(22)：10747-51；Stemmer 1994 Nature 370(6488)：389-91)。基因重组是推动许多病毒进化的主要动力。在逆转录病毒中，两个共包装逆转录病毒基因组之间的重组可以每复制周期高达40％的速率发生。每个复制周期中的高重组速率使得遗传信息能被快速改组，从而在短时间内产生具有新突变模式和表型的重组体。举例来说，含有来自6种鼠类白血病病毒的重组亲嗜性包膜序列的文库的逆转录病毒的分子育种产生具有新向性的病毒克隆。使用相同方法，筛选具有提高的稳定性和加工产率的一些病毒克隆(Soong等人，2000 Nat Genet 25(4)：436-9；Powell等人，2000 Nat Biotechnol 18(12)：1279-82)。
并入本发明中的多聚核苷酸序列有时不稳定，从而导致多聚核苷酸序列随着时间会从病毒基因组中缺失。其原因尚未完全了解，但清楚使用本发明筛选已经在异源多聚核苷酸序列内获得最佳重组的重组病毒克隆的序列依赖性分子育种可用于筛选具有较大载体稳定性的病毒克隆。
举例来说，HSV-TK编码序列(SEQ ID NO：37)在一些情形中没有预期中稳定。重组逆转录病毒载体的分子育种涵盖用于筛选具有较大载体稳定性的重组载体的HSV-TK简并编码序列的库。可化学合成(Bio Basic Inc，Markham，Canada)随机突变疱疹胸苷激酶(TK)。合成序列可插入SEQ ID NO：19中的yCD2序列的3’，或在切除CD2基因后独自插入pAC3-yCD2载体骨架中。如先前所述包装逆转录病毒载体混合物。用载体感染小鼠成纤维细胞LMTK细胞或人类143Tk细胞并在HAT培养基中筛选TK活性(Hiller等人，Mol.Cell Biol.8(8)：3298-3302，1988)。在HAT培养基中再次筛选的新鲜LMTK-/143Tk-细胞的抗性细胞上清液的连续传代允许筛选表达TK的稳定载体。可分离TK+抗性细胞并用标准PCR型技术拯救TK序列以用于突变分析(Cowell等人，CDNA Library Protocols，由Humana Press发行，1996)。以此方式，筛选功能蛋白表达和逆转录病毒载体构建体的基因组稳定的序列。类似策略可用于UPRT(SEQ ID NO：11，13)、OPRT(SEQ ID NO：15，17)(Olah等人，Cancer Res.40：2869-2875，1980；和Suttle，Somatic Cell & Mol.Genet.，15(5)：435-443，1989)和其它目的基因。此外，通过PCR在IRES-插入基因中筛检连续传代的全长插入物之后，连续传代策略可用于非筛选基因和基因组DNA。可纯化全长插入物，并重新克隆到病毒载体中，然后进行再测试。所述程序可进行若干循环以筛选最稳定的基因。所述策略也可用于具有或不具有肿瘤的动物和甚至患者组织中的传代。
或者，OPRT、UPRT、TK或其它PAE可在含有不同ENV基因或其它适当表面糖蛋白的单独载体中表达。这种载体可以是编码目的包膜和基因的可复制性(Logg等人J.Mol Biol.369：1214 2007)或非复制性“第一代”逆转录病毒载体(Emi等人J.Virol 65：1202 1991)。在后一种情况下，已有的病毒感染会提供互补gag和pol以允许“非复制性”载体从任何先前感染细胞进行感染传播。替代性ENV和糖蛋白包括能感染人类细胞的异嗜性和多嗜性ENV和糖蛋白，例如来自MLV的NZB品系的ENV序列和来自MCF、VSV、GALV和其它病毒的糖蛋白(Palu 2000，Baum 2006，上文)。举例来说，多聚核苷酸可包括如下序列，其中GAG和POL基因被缺失，ENV对应于NZB MLV或VSV-g的异嗜性ENV域，且IRES或启动子(例如RSV)可操作地直接连接于OPRT、UPRT、TK或其它PAE基因。
用VSV-g假型病毒和双嗜性逆转录病毒混合感染细胞会产生一种病毒的基因组被另一种病毒的包膜蛋白衣壳化的子代病毒粒子[Emi等人，J.Virol.65：1202，1991]。这一点同样适用于假型逆转录病毒粒子的其它包膜。举例来说，如上所述来源于SEQ ID NO：19和22的逆转录病毒所造成的感染会产生能在被感染细胞中编码yCD2和OPRT的子代病毒粒子。所得病毒可与5-FC结合用于治疗受试对象的细胞增殖失调。
本公开书的重组逆转录病毒可用于治疗神经元失调，所述逆转录病毒例如可任选地含有外源基因，例如编码受体的基因或编码配体的基因。如上所述，所述受体包括响应于多巴胺、GABA、肾上腺素、去甲肾上腺素、5-羟色胺、谷氨酸盐、乙酰胆碱和其它神经肽的受体，如上所述。可在神经元失调中提供治疗作用的配体的实例包括多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、乙酰胆碱、γ-氨基丁酸和5-羟色胺。必需配体在被感染供体细胞分泌之后发生扩散和摄取在受试对象的神经细胞在产生所述基因产物方面存在缺陷的失调中是有益的。经遗传改造以分泌神经营养因子(例如神经生长因子(NGF))的细胞可能用于防止胆碱能神经元退化，所述神经元如果不经治疗可能会死亡。
或者，被移植入患有基底神经节失调(例如帕金森症(Parkinson′s disease))的受试对象中的细胞可被修饰以含有编码多巴胺前体L-DOPA的外源基因。帕金森症的特征在于中脑黑质中缺少以基底神经节作为主要靶器官的多巴胺神经元。
可用本公开书的方法类似地治疗的其它神经元失调包括阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、因中风引起的神经元损伤和脊髓损伤。阿尔茨海默氏病的特征在于基底前脑的胆碱能神经元退化。这些神经元的神经递质是乙酰胆碱，其是所述神经元的生存所必需的。可用所述的本公开书的方法植入被含有促进这些神经元生存的因子的外源基因的本公开书的重组逆转录病毒感染的胆碱能细胞。在中风后，海马以及皮层细胞的CA1中的细胞发生选择性损失，这可能是这些患者的认知和记忆损失的基础原因。一旦被鉴别出来，负责CA1细胞死亡的分子可通过本公开书的方法抑制。举例来说，反义序列或编码拮抗剂的基因可被转移到神经元细胞中并植入大脑海马区。
对于因蛋白产物缺乏引起的疾病，基因转移可将正常基因引入被感染组织以用于取代治疗，以及利用反义突变来产生疾病的动物模型。举例来说，可能需要将因子IX编码核酸插入用于感染肌肉或肝细胞的逆转录病毒中。
本公开书还提供用于治疗细胞增殖失调或免疫失调的基因疗法。所述疗法通过将反义或显性阴性编码多聚核苷酸引入具有增殖失调的细胞中来实现治疗作用，其中所述多聚核苷酸结合于细胞增殖失调的相关基因并防止其翻译或表达。可使用本公开书的重组逆转录病毒载体递送适用于治疗或调节细胞增殖失调(例如反义多聚核苷酸)的异源核酸。在另一个实施方案中，通过引入本公开书的CD多聚核苷酸、表达多聚核苷酸以产生包含胞嘧啶脱氨酶活性的多肽和使细胞与可产生细胞毒性量的5-FU的量的5-氟胞嘧啶接触可产生细胞毒性量的5-FU的时间来治疗细胞增殖失调。
目前已有许多化学治疗剂在市面销售，其具有从完全缓解到暂时缓解的不同程度的效果和复发率达到预期的延长寿命。市面销售的一些癌症治疗剂是以肿瘤的血管生成特性为目标。组合物以肿瘤的血管生成为目标，设法减少供应给肿瘤或癌细胞的血液和营养物，从而减小肿瘤并延长受试对象的寿命。VEGF是已知在肿瘤生长中起作用的血管生成因子。因此，已经开发了作为抗癌剂的VEGF拮抗剂。
人类VEGF介导正常和恶性脉管系统中的新生血管生成；其在大多数恶性肿瘤中过度表达，且高含量已经与许多患者的较高转移风险和不良预后有关。当VEGF在体外血管生成模型中与其受体相互作用时，发生内皮细胞增殖和新血管形成。在动物模型中，已经证明了VEGF诱导血管内皮细胞增殖/迁移，维持新形成血管的存活，并提高血管通透性。
VEGF拮抗剂靶向VEGF信号传导路径或负向调节VEGF信号传导路径。实例包括VEGF抑制剂(例如直接抑制VEGF(例如VEGF-A、-B、-C或-D)的介质，例如通过结合VEGF(例如抗VEGF抗体，例如贝伐单抗(bevacizumab)(AVASTIN
Figure BPA00001374548000461
)或兰尼单抗(ranibizumab)(LUCENTIS
Figure BPA00001374548000462
)，或其它抑制剂，例如派加他尼(pegaptanib)、NEOVASTAT
Figure BPA00001374548000463
AE-941、VEGF Trap和PI-88))、VEGF表达调节剂(例如INGN-241、口服四硫钼酸盐(oral tetrathiomolybdate)、2-甲氧基雌二醇、2-甲氧基雌二醇纳米晶体分散液、贝伐西尼钠(bevasiranib sodium)、PTC-299、Veglin)、VEGF受体抑制剂(例如KDR或VEGF受体III(Flt4)，例如抗KDR抗体、VEGFR2抗体(例如CDP-791)、IMC-1121B、VEGFR2阻断剂(例如CT-322))、VEGFR表达调节剂(例如VEGFR1表达调节剂Sirna-027)或VEGF受体下游信号传导抑制剂。在本文所述的一些方面，VEGF拮抗剂是贝伐单抗、派加他尼、兰尼单抗、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、AE-941、VEGF Trap、帕唑帕尼(pazopanib)、凡德他尼(vandetanib)、瓦他拉尼(vatalanib)、西地尼布(cediranib)、芬维A胺(fenretinide)、角鲨胺(squalamine)、INGN-241、口服四硫钼酸盐、四硫钼酸盐、Panzem NCD、2-甲氧基雌二醇、AEE-788、AG-013958、贝伐西尼钠、AMG-706、阿西替尼(axitinib)、BIBF-1120、CDP-791、CP-547632、PI-88、SU-14813、SU-6668、XL-647、XL-999、IMC-1121B、ABT-869、BAY-57-9352、BAY-73-4506、BMS-582664、CEP-7055、CHIR-265、CT-322、CX-3542、E-7080、ENMD-1198、OSI-930、PTC-299、Sirna-027、TKI-258、Veglin、XL-184或ZK-304709。
贝伐单抗(AVASTATIN
Figure BPA00001374548000471
)(rhuMAb-VEGF)(抗VEGF单克隆抗体)是针对血管内皮生长因子(VEGF)的重组人类/鼠类嵌合单克隆抗体。贝伐单抗是通过将鼠类抗VEGF单克隆抗体的VEGF结合残基工程改造到人类免疫球蛋白-1(IgG1)的框架区中来制备(Prod Info Avastin，2004)。只有7％的氨基酸序列来源于鼠类抗体，其余93％来自IgG1。贝伐单抗通过识别两种人类VEGF受体类型(flt-1和flk-1)的结合位点来结合和中和所有人类VEGF形式。在动物模型中，已经显示抗体可通过抑制VEGF所诱导的血管生成来稳定化已形成的肿瘤或抑制肿瘤生长。
贝伐单抗的药物动力学在0.3mg/kg或以上的剂量后是线性的(Anon，2002)。在晚期癌症患者(n＝25)中静脉内输注0.3、1、3和10mg/kg达90分钟后，贝伐单抗的峰值血清浓度分别在5到9mcg/mL、21到39mcg/mL、52到92mcg/mL和186到294mcg/mL范围内；在重复剂量(每周一次)下观察到轻微累积，但这并不显著且药物动力学仍然保持线性。在每周一次、每2周一次或每3周一次施用1到20mg/kg后，于100天内获得贝伐单抗的稳态水平。
贝伐单抗的推荐剂量是每2周一次历经30分钟静脉内输注5毫克/千克，直到疾病发展减轻为止。贝伐单抗应该在化学治疗后面进行。单一介质贝伐单抗的功效尚未确定。贝伐单抗(其可与吉西他滨(gemcitabine)和多西他赛(docetaxel)共同施用，或在化学治疗之前或之后一周内施用)是以约1mg/kg到约15mg/kg、优选约5mg/kg静脉内施用。
本公开书的方法和组合物可用于包括使用贝伐单抗的疗法的组合疗法。如本文所述，本公开的包含治疗介质(例如，细胞毒性基因)的复制逆转录病毒(RCR)可用于治疗细胞细胞增殖失调。本公开的RCR的优点包括其能够感染复制中的细胞癌细胞。当载体的转基因包括细胞毒性基因(例如，编码将肺细胞毒性介质转化为细胞毒性介质的基因)时，提供杀死癌细胞的能力。
本公开书提供治疗例如癌症和赘瘤等细胞增殖失调的方法，其包含施用本公开书的RCR载体，随后用化学治疗剂或抗癌剂进行治疗。在一方面，RCR载体在施用化学治疗剂或抗癌剂之前施用于受试对象，持续允许RCR感染和复制的一段时段。然后在可减少增殖或杀死癌细胞的时段和剂量下用化学治疗剂或抗癌剂治疗受试对象。在一方面，如果化学治疗剂或抗癌剂治疗减少但不杀死癌/肿瘤(例如部分缓解或暂时缓解)，那么受试对象随后可用非毒性治疗剂(例如5-FC)治疗，所述非毒性治疗剂可在表达来自RCR的细胞毒性基因(例如胞嘧啶脱氨酶)的细胞中转化为毒性治疗剂。使用所述方法，本公开书的RXCR载体在肿瘤细胞复制过程中传播，所述细胞然后可通过用抗癌剂或化学治疗剂处理而被杀死，且进一步杀死可使用本文所述的RCR处理过程来进行。
在本公开书的另一个实施方案中，异源基因可包含靶抗原(例如癌抗原)的编码序列。在这个实施方案中，用包含编码靶抗原的异源多聚核苷酸的RCR感染包含细胞增殖失调的细胞以提供靶抗原的表达(例如癌抗原的过度表达)。然后对受试对象施用包含特异性地与靶抗原相互作用的靶向同源部分的抗癌剂。靶向同源部分可操作地连接于细胞毒性剂或自身可以是抗癌剂。因此，被包含靶向抗原编码序列的RCR感染的癌细胞增加靶标在癌细胞上的表达，从而提高细胞毒性靶向作用的效率/功效。
已经显示阻断免疫系统细胞之间的相互作用可具有显著的活化性或抑制性免疫作用(Waldmann Annu Rev Med.57：652006)。举例来说，已经显示阻断CTLA-4(CD 152)与B7.1(CD80)的相互作用(其调节T细胞活化)可引起免疫刺激，推测这是通过阻断此抑制性相互作用而实现的(Peggs等人Curr.Opin.Immunol.18：206，2006)。所述阻断可能用针对CTLA-4的抗体或用可溶性B7.1来实现。全身施用这些类型的分子会具有不合需要的全身作用，其可在最小程度上导致有害副作用或甚至在一种C28激动剂的情况中导致死亡(Suntharalingam等人NEJM 355 1018 2006)。Pfizer一直在开发一种该类抗CTLA-4阻断抗体(CP-675,206)作为抗癌剂，但是因为显著的副作用，最近已经停止开发。局部递送阻断分子(其在感染编码可释放到胞外空间中的所述分子的可复制性载体之后从肿瘤释放到局部环境中)会提供局部免疫调节并避免这些严重副作用。阻断分子是抗体、单链抗体、天然配体的可溶形式或结合所述受体的其它肽。
在另一个实施方案中，本公开书的RCR可包含含有与同源抗原或配体特异性地相互作用的结合域(例如抗体、抗体片段、抗体域或受体配体)的编码序列。包含结合域的编码序列的RCR然后可用于感染患有细胞增殖失调的受试对象的细胞，例如癌细胞或赘生性细胞。被感染细胞然后表达结合域或抗体。然后可将可操作地连接于细胞毒性剂或自身具有细胞毒性的抗原或同源物施用于受试对象。细胞毒性同源物然后选择性地杀死表达结合域的被感染细胞。或者，结合域自身可以是抗癌剂。
如本文所用，术语“抗体”是指包含至少一个免疫球蛋白可变域或免疫球蛋白可变域序列的蛋白质。举例来说，抗体可包含重(H)链可变区(本文缩写为VH)和轻(L)链可变区(本文缩写为VL)。在另一个实施例中，抗体包含两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体”涵盖抗体的抗原结合片段(例如单链抗体、Fab片段、F(ab′)2、Fd片段、Fv片段和dAb片段)以及完整抗体。
VH和VL区可进一步细分为被称为“互补决定区”(CDR)的高变区，其间散布有被称为“框架区”(FR)的更保守区域。框架区和CDR的范围已被精确定义(参看Kabat，E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242，和Chothia，C.等人(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。本文使用Kabat定义。每个VH和VL典型地由三个CDR和四个FR构成，它们从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
“免疫球蛋白域”是指来自免疫球蛋白分子的可变域或恒定域的区域。免疫球蛋白域典型地含有2个由约7个β股形成的β折叠，和保守二硫键(参看例如A.F.Williams和A.N.Barclay 1988 Ann.Rev Immunol.6：381-405)。如Chothia等人(1992)J.Mol.Biol.227：799-817；Tomlinson等人(1992)J.Mol.Biol.227：776-798)；和Tomlinson等人(1995)EMBO J.14(18)：4628-38中所述，可自免疫球蛋白可变域的序列推断其高变环的典型结构。
如本文所用，“免疫球蛋白可变域序列”是指可形成免疫球蛋白可变域结构的氨基酸序列。举例来说，所述序列可包含天然存在的可变域的全部或部分氨基酸序列。举例来说，序列可省略1个、2个或以上N或C端氨基酸、内部氨基酸，可包含一个或多个插入或其它末端氨基酸，或可包含其它改变。在一个实施方案中，包含免疫球蛋白可变域序列的多肽可与另一个免疫球蛋白可变域序列结合以形成靶结合结构(或“抗原结合位点”)，例如与Tie1相互作用(例如结合或抑制Tie1)的结构。
抗体的VH或VL链可进一步包含全部或部分重链或轻链恒定区，从而分别形成重免疫球蛋白链或轻免疫球蛋白链。在一个实施方案中，抗体是两个重免疫球蛋白链和两个轻免疫球蛋白链的四聚体，其中重免疫球蛋白链和轻免疫球蛋白链通过例如二硫键互相连接。重链恒定区包含三个域CH1、CH2和CH3。轻链恒定区包含CL域。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区典型地介导抗体与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。术语“抗体”包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型(以及其子类型)的完整免疫球蛋白。免疫球蛋白的轻链可为κ或λ型。在一个实施方案中，抗体被糖基化。抗体可对于抗体依赖性细胞毒性和/或补体介导的细胞毒性发挥功能。
术语“单特异性抗体”是指对于特定靶标(例如表位)显示单一结合特异性和亲和力的抗体。所述术语包括“单克隆抗体”，其是指例如从同系分离细胞群体作为单一分子物种产生的抗体。“单克隆抗体组合物”是指抗体或其片段在包含抗体的单一分子物种的组合物中的制剂。在一个实施方案中，单克隆抗体由哺乳动物细胞产生。可组合一种或一种以上单克隆抗体物种。
抗体的一个或多个区域可以是人源的或有效地是人源的。举例来说，一个或多个可变区可以是人源的或有效地是人源的。举例来说，一个或多个CDR可以是人源的，例如HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。每个轻链CDR可以是人源的。HC CDR3可以是人源的。一个或多个框架区可以是人源的，例如HC或LC的FR1、FR2、FR3和FR4。在一个实施方案中，所有框架区都是人源的，例如来源于人类体细胞，例如产生免疫球蛋白的造血细胞或非造血细胞。在一个实施方案中，人类序列是例如由生殖系核酸编码的生殖系序列。一个或多个恒定区可以是人源的或有效地是人源的。在另一个实施方案中，至少70、75、80、85、90、92、95或98％的框架区(例如，总地来说FR1、FR2和FR3，或总地来说FR1、FR2、FR3和FR4)或整个抗体可以是人源的或有效地是人源的。举例来说，FR1、FR2和FR3总地来说可与编码重链或轻链序列的座位的人类生殖系V链段所编码人类序列具有至少70、75、80、85、90、92、95、98或99％的同一性。
全部或部分抗体可由免疫球蛋白基因或其链段编码。示例性人类免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因，以及多种免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白轻链(约25Kd或214个氨基酸)是由NH2端的可变区基因(约110个氨基酸)和COOH端的κ或λ恒定区基因编码。全长免疫球蛋白重链(约50Kd或446个氨基酸)类似地由可变区基因(约116个氨基酸)和一种其它上述恒定区基因(例如γ(编码约330个氨基酸))编码。轻链是指包含轻链可变域的任何多肽。重链是指包含重链可变域的任何多肽。
如本文所用的术语全长抗体的“抗原结合片段”(或简称为“抗体部分”或“片段”)是指保留与目的靶标特异性地结合的能力的全长抗体的一个或多个片段。术语全长抗体的“抗原结合片段”所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，其是包含由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其是由VH和CH1域组成；(iv)Fv片段，其是由抗体单臂的VL和VH域组成；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其是由VH域组成；和(vi)保留功能的分离互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个域VL和VH由单独基因编码，但VL和VH可使用重组方法通过合成连接子接合，使得其可作为单一蛋白链制备，其中VL和VH区域配对形成被称为单链Fv(scFv)的单价分子。参看例如Bird等人(1988)Science 242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883。
抗体片段可使用包括所属领域技术人员已知的常规技术的任何适当技术来获得。术语“单特异性抗体”是指对于特定靶标(例如表位)显示单一结合特异性和亲和力的抗体。所述术语包括“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”，其在本文中是指单一分子组合物的抗体或其片段的制剂。如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。
本公开书提供一种治疗患有细胞增殖失调的受试对象的方法。受试对象可以是任何哺乳动物，且优选是人。用本公开书的重组可复制逆转录病毒载体接触受试对象。接触可在体内或体外进行。施用本公开书的逆转录病毒载体的方法在所属领域中已知，且包括例如全身施用、局部施用、腹膜内施用、肌肉内施用、颅内施用、脑脊髓施用以及在肿瘤或细胞增殖失调部位直接施用。其它施用途径也在所属领域中已知。
因此，本公开书包括可用于治疗细胞增殖失调的各种医药组合物。
本公开书的医药组合物是通过使用载剂、赋形剂和添加剂或助剂，将根据本公开书的含有可用于治疗或调节细胞增殖失调的异源多聚核苷酸序列的逆转录病毒载体制成适合于施用于受试对象的形式来制备。经常使用的载剂或助剂包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇和其它糖、滑石粉、乳蛋白、明胶、淀粉、维生素、纤维素和其衍生物、动物和植物油、聚乙二醇和溶剂，例如无菌水、醇类、甘油和多元醇。静脉内运载体包括流体和营养补充物。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。其它医药学上可接受的载剂包括水溶液、无毒赋形剂(包括盐)、防腐剂、缓冲剂等，如例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第15版Easton：Mack Publishing Co.，1405-1412，1461-1487(1975)和The National Formulary XIV.，第14版Washington：American Pharmaceutical Association(1975)中所述，其内容以引用的方式并入本文中。医药组合物的各种组分的pH和确切浓度根据所属领域的常规技术来调节。参看Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis for Therapeutics(第7版)。
举例来说且不构成限制，可用于治疗细胞增殖失调的逆转录病毒载体包含双嗜性ENV蛋白、GAG和POL蛋白、U3区逆转录病毒基因组中的启动子序列，和逆转录病毒基因组在靶细胞中复制、包装和整合所必需的所有顺式作用序列。
以下实施例打算说明但不限制本公开书。虽然所述实施例代表可能被使用的实施例，但仍可替代性地利用所属领域技术人员已知的其它程序。
实施例
实施例1.将pACE-GFPemd的载体骨架修饰成pAC3-GFPemd并插入胞嘧啶脱氨酶基因序列以代替GFP.用图3E所示的3种方式修饰pACE-GFPemd质粒的先前骨架(US6899871，Wang等人Hum Gene Ther 14：117 2003)。所述修饰是通过PCR介导的寡聚核苷酸引导的诱变来进行(Logg等人，J.Mol Biol 369：1214，2007；也参看“Molecular Biology and Biotechnology”J M.Walker，R.Rapley编，Royal Society of Chemistry，London UK，2000)。进行以下修饰。1)双嗜性env基因3’端的p15区的核酸序列起初来源于亲嗜性包膜-用来自4070A双嗜性包膜的对应序列取代此序列；所编码的包膜氨基酸在两个构建体中相同。2)修饰IRES序列3’端以允许插入有PstI1位点的选定转基因能更容易地插入，并去除IRES转基因位点任一端的微小不完全重复序列。3)去除3’LTR下游的残余病毒序列。所得质粒是pACE-emdGFP(aka pACE-GFP、pACE-eGFP和T5.0006)，其用作编码胞嘧啶脱氨酶和其变异体的载体的基础。最初使用两种插入编码盒的方法。第一种方法产生序列5’TTATAAT3’，且第二种方法紧邻ATG起始密码子上游产生5’TTATAA3’。第二种方法比较简单，因为其涉及载体中的简单PstI1和Not1酶切割序列和合成胞嘧啶脱氨酶基因，以及随后的再连接。利用这两种方法用CDopt(CD1)和CDopt+3pt(CD2)(参看图2)编码序列制备具有胞嘧啶脱氨酶插入物的载体，且如实施例3中所述通过瞬时转染293T细胞来制备感染性病毒制剂。然后在培养物中以0.1的MOI感染U87细胞，且细胞生长直到100％被感染为止。如实施例6中所述，分析100％被感染细胞的细胞提取物的胞嘧啶脱氨酶活性，并发现所述酶的比活性对于具有任一种上游序列但在其它方面相同的构建体是相等的。因此，在图2的表中，pACE-eGFP(T5.0006)和pACE-yCD(T5.0007)具有第一个上游序列，而进一步测试的所有其它构建体具有第二个上游序列。随后用简单PStI1和Not 1切割常规构建具有不同基因插入物的载体。
关于初始转染的可复制逆转录病毒的病毒构建体的示意图，请参看以下图3A。CMV是人类CMV立即早期启动子，U3、R和U5是病毒长末端重复序列(LTR)的对应区域。Gag、pol和env是病毒蛋白编码区。图3B和3D显示质粒结构和本公开书的序列。
本公开书的载体与Tai等人，Mol.Ther.12：842，2005的载体相比提供许多差别。Tai等人的载体已被改变以消除3’LTR下游的MLV序列的约70bp。包膜中的ClaI位点下游的DNA序列被变为双嗜性包膜序列。这种改变不会改变包膜的氨基酸序列。此外，已经消除了IRES-CD盒任一侧的小重复序列以避免因同源重组所致的不稳定。这些改变还出乎意料地使载体在宿主细胞中复制和传代期间的稳定性提高(图5)。
已经认识到，在逆转录和第一次整合到被处理细胞中之后，DNA前病毒和任何后续子代逆转录病毒在每一端具有来自MLV的常规LTR结构。已经显示这种构形在多个感染周期后是稳定的(参看以下图5)。
实施例2对野生型酵母胞嘧啶脱氨酶基因的遗传增强
已经进行了两组改变：(1)3个位置突变，其改变3个氨基酸(A23L、I140L和V108I)以增加酵母胞嘧啶脱氨酶蛋白的热稳定性；和(2)其它基因序列修饰，用于增强人类密码子使用序列以提高在人类细胞中的蛋白翻译效率而不会对氨基酸序列造成其它改变。
CD的序列设计包括CD优化型、CD-UPRT(+/-连接子)和CD-OPRTase(+/-连接子)。最终胞嘧啶脱氨酶编码序列可在5’端包含PSI1位点(全长)且在3’端包含Not1位点和用于PSI1/Not1盒策略的poly A尾巴。盒是从商业供应商(BioBasic Inc.，Markham，Ontario，Canada)定购并由其提供。
包含酵母胞嘧啶脱氨酶的以下序列用于克隆、优化和突变(带框核酸包含限制位点Psi1和Not1，用于随后克隆方法中)：
AACACGA
Figure BPA00001374548000551
ATGGTGACAGGGGGAATGGCAAGCAAGTGGGATCAGAAGGGTATGGACATTGCCTATGAGGAGGCGGCCTTAGGTTACAAAGAGGGTGGTGTTCCTATTG GCGGATGTCTTATCAATAACAAAGACGGAAGTGTTCTCGGTCGTGGTCACAACATGAGATTTCAAAAGGGATCCGCCACACTACATGGTGAGATCTCCAC TTTGGAAAACTGTGGGAGATTAGAGGGCAAAGTGTACAAAGATACCACTTTGTATACGACGCTGTCTCCATGCGACATGTGTACAGGTGCCATCATCATG TATGGTATTCCACGCTGTGTTGTCGGTGAGAACGTTAATTTCAAAAGTAAGGGCGAGAAATATTTACAAACTAGAGGTCACGAGGTTGTTGTTGTTGACG
下表总结所制备的基因和所得质粒载体和其名称。
表：载体构建体和名称
Figure BPA00001374548000553
Figure BPA00001374548000561
Kasahara等人pACE-CD(美国专利第6,899,871号，其公开内容以引用的方式并入本文中)所述的可复制逆转录病毒载体用作其它修饰的基础。对载体(pAC3-yCD)进行修饰以表达如本文所述的经修饰酵母胞嘧啶脱氨酶基因并将所述载体用于构建体中。关于初始转染的可复制逆转录病毒的病毒构建体的示意图，请参看以下图3A。CMV是人类CMV立即早期启动子，U3、R和U5是病毒长末端重复序列(LTR)的对应区域。Gag、pol和env是病毒蛋白编码区。图3B和3D显示本公开书的质粒结构和序列。
在由承包商(Bio Basic Inc.，Markham，Ontario，Canada)合成基因后，将其插入pAC3载体骨架的Psi1-Not1位点(图3)。一般通过用Psi1和Not1切割质粒pAC3-eGFP并纯化编码质粒和逆转录病毒骨架的大(约11kb)片段来产生质粒骨架。
A.人源化密码子优化CD基因(CDopt，aka CD1，T5.0001)Conrad等人与PCT WO 99/60008的人类密码子优化胞嘧啶脱氨酶的比较表明，两种胞嘧啶脱氨酶中总共优化91个密码子，其中36个密码子相同，47个密码子具有第三碱基对改变(都编码相同氨基酸)，且9个密码子不同(但其编码相同氨基酸)。不同的9个密码子中：
AGC(Ser)与TCC(Ser)
CGT(Arg)与AGG(Arg)
CCA(Pro)与CCT(Pro)
它们都具有相等的GC含量且编码相同氨基酸。上述天然酵母基因序列单独进行密码子优化以得到以下CD基因(CD1)，且在插入编码具有IRES的可复制逆转录病毒(RCR)的质粒载体pAC3中时被称作T5.0001。
Figure BPA00001374548000571
B.热稳定化CD基因 进行其它修饰以增强胞嘧啶脱氨酶的稳定性。对野生型酵母胞嘧啶脱氨酶基因进行遗传增强以包含3个位置突变，其改变3个氨基酸(A23L、I140L和V108I)以提高酵母胞嘧啶脱氨酶蛋白的热稳定性。
使用以下引物对产生本公开书的胞嘧啶脱氨酶多肽的基因：
定点诱变引物：有义引物：5′-tcgaggatatcggcgagtgaaacccgttattctttttggc-3′(SEQ ID NO：33)
反义引物：5′-gccaaaaagaataacgggtttcactcgccgatatcctcga-3′(SEQ ID NO：34)
有义引物：
5′tcggcgagtgatccggcggcggcgcctccggcggcggcgcctccggcggcggcgcctccggcggcggcgccaacccgttatt-3′(SEQ ID NO：35)
反义引物：5′-aataacgggttggcgccgccgccggaggcgccgccgccggaggcgccgccgccggaggcgccgccgccggatcactcgccga-3′(SEQ ID NO：36)
为了提高天然酵母CD蛋白的稳定性，将3个氨基酸取代工程改造到蛋白中。这些取代是单独使用或与人类密码子优化组合使用。
这3个氨基酸取代是：A23L、V108I、I140L。以下显示编码这些取代的序列。
ATGGTGACAGGGGGAATGGCAAGCAAGTGGGATCAGAAGGGTATGGACATTGCCTATGAGGAGGCG
Figure BPA00001374548000581
TTAGGTTACAAAGAGGGTGGTGTTCCTATTGGCGGATGTCTTATCAATAACAAAGACGGAAGTGTTCTCGGTCGTGGTCACAACATGAGATTTCAAAAGGGATCCGCCACACTACATGGTGAGATCTCCACTTTGGAAAACTGTGGGAGATTAGAGGGCAAAGTGTACAAAGATACCACTTTGTATACGACGCTGTCTCCATGCGACATGTGTACAGGTGCCATCATCATGTATGGTATTCCACGCTGTGTC
Figure BPA00001374548000582
GGTGAGAACGTTAATTTCAAAAGTAAGGGCGAGAAATATTTACAAACTAGAGGTCACGAGGTTGTTGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAAAAG
Figure BPA00001374548000583
ATGAAACAATTTATCGATGAAAGACCTCAGGATTGGTTTGAAGATATTGGTGAGTAG
Figure BPA00001374548000584
GCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGG(SEQ ID NO：3)
所编码的多肽包含以下序列(被取代氨基酸以下划线表示)：
1 MVTGGMASKWDQKGMDIAYEEA
Figure BPA00001374548000585
LGYKEGGVPIGGCLINNKDGSVLGRGHNMRFQKGSAT
61 LHGEISTLENCGRLEGKVYKDTTLYTTLSPCDMCTGAIIMYGIPRCVGENVNFKSKGEK
121 YLQTRGHEVVVVDDERCKKMKQFIDERPQDWFEDIGE-(SEQ ID NO：4)
当插入到编码具有IRES的RCR的质粒载体pAC3中时，利用优选密码子整合3个氨基酸取代A23L/V108I/I140L并对完整序列(所述基因称为CDopt+3pt[aka CD2](SEQ ID NO：37)和T5.0002)使用优选人类密码子最终构建体设计：
1 ATGGTGACCGGCGGCATGGCCTCCAAGTGGGATCAAAAGGGCATGGATATCGCTTACGAG
61 GAGGCCCTGCTGGGCTACAAGGAGGGCGGCGTGCCTATCGGCGGCTGTCTGATCAACAAC
121 AAGGACGGCAGTGTGCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGGTTCCAGAAGGGCTCCGCCACC
181 CTGCACGGCGAGATCTCCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTGTACAAG
241 GACACCACCCTGTACACCACCCTGTCCCCTTGTGACATGTGTACCGGCGCTATCATCATG
301 TACGGCATCCCTAGGTGTGTGATCGGCGAGAACGTGAACTTCAAGTCCAAGGGCGAGAAG
361 TACCTGCAAACCAGGGGCCACGAGGTGGTGGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAGAAGCTG
421 ATGAAGCAGTTCATCGACGAGAGGCCTCAGGACTGGTTCGAGGATATCGGCGAGTGATAA
加下划线的密码子表示氨基酸取代的优选密码子。
蛋白翻译序列比对表明优选密码子改变且氨基酸取代产生期望蛋白结构：
CD优化序列设计(人类密码子优选+3个氨基酸取代)
AACACGA
Figure BPA00001374548000591
ATGGTGACCGGCGGCATGGCCTCCAAGTGGGATCAAAAGGGCATGGATATCGCTTACGAGGAGGCCCTGCTGGGCTACAAGGAGGGCGGCGTGCCTATCGGCGGCTGTCTGATCAACAACAAGGACGGCAGTGTGCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGGTTCCAGAAGGGCTCCGCCACCCTGCACGGCGAGATCTCCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTGTACAAGGACACCACCCTGTACACCACCCTGTCCCCTTGTGACATGTGTACCGGCGCTATCATCATGTACGGCATCCCTAGGTGTGTGATCGGCGAGAACGTGAACTTCAAGTCCAAGGGCGAGAAGTACCTGCAAACCAGGGGCCACGAGGTGGTGGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAGAAGCTGATGAAGCAGTTCATCGACGAGAGGCCTCAGGACTGGTTCGAGGATATCGGCGAGTAA
Figure BPA00001374548000592
GCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGG(SEQ ID NO：38)
C.构建CD-UPRT融合基因(CDopt+3pt-UPRT，[aka CDopt-UPRT和 CD2-UPRT]，在pAC3质粒RCR载体中称作T5.0003)也使用如图10A所述的方案I形成融合构建体，其包含与UPRT多肽连接的上述CD多肽以产生优化CD-UPRT序列。使用以下引物缺失CD与UPRT之间的终止-起始序列。
引物序列：
Figure BPA00001374548000593
Figure BPA00001374548000601
所得融合多聚核苷酸包含1296bp和下文所述的序列：
AACACGA
Figure BPA00001374548000602
ATGGTGACCGGCGGCATGGCCTCCAAGTGGGATCAAAAGGGCATGGATATCGCTTACGAGGAGGCCCTGCTGGGCTACAAGGAGGGCGGCGTGCCTATCGGCGGCTGTCTGATCAACAACAAGGACGGCAGTGTGCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGGTTCCAGAAGGGCTCCGCCACCCTGCACGGCGAGATCTCCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTGTACAAGGACACCACCCTGTACACCACCCTGTCCCCTTGTGACATGTGTACCGGCGCTATCATCATGTACGGCATCCCTAGGTGTGTGATCGGCGAGAACGTGAACTTCAAGTCCAAGGGCGAGAAGTACCTGCAAACCAGGGGCCACGAGGTGGTGGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAGAAGCTGATGAAGCAGTTCATCGACGAGAGGCCTCAGGACTGGTTCGAGGATATCGGCGAGAACCCGTTATTCTTTTTGGCTTCTCCATTCTTGTACCTTACATATCTTATATATTATCCAAACAAAGGGTCTTTCGTTAGCAAACCTAGAAATCTGCAAAAAATGTCTTCGGAACCATTTAAGAACGTCTACTTGCTACCTCAAACAAACCAATTGCTGGGTTTGTACACCATCATCAGAAATAAGAATACAACTAGACCTGATTTCATTTTCTACTCCGATAGAATCATCAGATTGTTGGTTGAAGAAGGTTTGAACCATCTACCTGTGCAAAAGCAAATTGTGGAAACTGACACCAACGAAAACTTCGAAGGTGTCTCATTCATGGGTAAAATCTGTGGTGTTTCCATTGTCAGAGCTGGTGAATCGATGGAGCAAGGATTAAGAGACTGTTGTAGGTCTGTGCGTATCGGTAAAATTTTAATTCAAAGGGACGAGGAGACTGCTTTACCAAAGTTATTCTACGAAAAATTACCAGAGGATATATCTGAAAGGTATGTCTTCCTATTAGACCCAATGCTGGCCACCGGTGGTAGTGCTATCATGGCTACAGAAGTCTTGATTAAGAGAGGTGTTAAGCCAGAGAGAATTTACTTCTTAAACCTAATCTGTAGTAAGGAAGGGATTGAAAAATACCATGCCGCCTTCCCAGAGGTCAGAATTGTTACTGGTGCCCTCGACAGAGGTCTAGATGAAAACAAGTATCTAGTTCCAGGGTTGGGTGACTTTGGTGACAGATACTACTGTGTTTAAGCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGG
D.构建CD-连接子UPRT融合基因(CDopt+3pt-LINK-UPRT[aka  CDopt-LINKER-UPRT和CD2-L-UPRT])也通过利用如图10B所述的方案II克隆CD多肽与UPRT多肽之间和同框的连接子(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)4域以产生优化CD-连接子-UPRT序列来形成融合构建体。使用以下引物来插入连接子。
Figure BPA00001374548000612
所得构建体具有1356bp的尺寸和以下序列：
AACACGA
Figure BPA00001374548000613
ATGGTGACCGGCGGCATGGCCTCCAAGTGGGATCAAAAGGGCATGGATATCGCTTACGAGGAGGCCCTGCTGGGCTACAAGGAGGGCGGCGTGCCTATCGGCGGCTGTCTGATCAACAACAAGGACGGCAGTGTGCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGGTTCCAGAAGGGCTCCGCCACCCTGCACGGCGAGATCTCCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTGTACAAGGACACCACCCTGTACACCACCCTGTCCCCTTGTGACATGTGTACCGGCGCTATCATCATGTACGGCATCCCTAGGTGTGTGATCGGCGAGAACGTGAACTTCAAGTCCAAGGGCGAGAAGTACCTGCAAACCAGGGGCCACGAGGTGGTGGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAGAAGCTGATGAAGCAGTTCATCGACGAGAGGCCTCAGGACTGGTTCGAGGATATCGGCGAGTCCG GCGGCGGCGCCTCCGGCGGCGGCGCCTCCGGCGGCGGCGCCTCCGGCGG CGGCGCCAACCCGTTATTCTTTTTGGCTTCTCCATTCTTGTACCTTACATATCTTATATATTATCCAAACAAAGGGTCTTTCGTTAGCAAACCTAGAAATCTGCAAAAAATGTCTTCGGAACCATTTAAGAACGTCTACTTGCTACCTCAAACAAACCAATTGCTGGGTTTGTACACCATCATCAGAAATAAGAATACAACTAGACCTGATTTCATTTTCTACTCCGATAGAATCATCAGATTGTTGGTTGAAGAAGGTTTGAACCATCTACCTGTGCAAAAGCAAATTGTGGAAACTGACACCAACGAAAACTTCGAAGGTGTCTCATTCATGGGTAAAATCTGTGGTGTTTCCATTGTCAGAGCTGGTGAATCGATGGAGCAAGGATTAAGAGACTGTTGTAGGTCTGTGCGTATCGGTAAAATTTTAATTCAAAGGGACGAGGAGACTGCTTTACCAAAGTTATTCTACGAAAAATTACCAGAGGATATATCTGAAAGGTATGTCTTCCTATTAGACCCAATGCTGGCCACCGGTGGTAGTGCTATCATGGCTACAGAAGTCTTGATTAAGAGAGGTGTTAAGCCAGAGAGAATTTACTTCTTAAACCTAATCTGTAGTAAGGAAGGGATTGAAAAATACCATGCCGCCTTCCCAGAGGTCAGAATTGTTACTGGTGCCCTCGACAGAGGTCTAGATGAAAACAAGTATCTAGTTCCAGGGTTGGGTGACTTTGGTGACAGATACTACTGTGTTTAA
Figure BPA00001374548000621
GCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGG
E.构建CD-OPRT融合基因(CDopt+3pt-OPRT[aka CDopt-OPRT和 CD2-OPRT]，在插入pAC3质粒RCR载体中时称为T5.0004)也使用如图10C所示的方案III形成融合构建体，其包含与OPRT多肽连接上述CD多肽以产生优化CD-OPRTase(CD人源化+3pt突变+OPRTase人类功能域)。
所得构建体包含1269bp的尺寸和以下序列：
AACACGA
Figure BPA00001374548000622
ATGGTGACCGGCGGCATGGCCTCCAAGTGGGATCAAAAGGGCATGGATATCGCTTACGAGGAGGCCCTGCTGGGCTACAAGGAGGGCGGCGTGCCTATCGGCGGCTGTCTGATCAACAACAAGGACGGCAGTGTGCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGGTTCCAGAAGGGCTCCGCCACCCTGCACGGCGAGATCTCCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTGTACAAGGACACCACCCTGTACACCACCCTGTCCCCTTGTGACATGTGTACCGGCGCTATCATCATGTACGGCATCCCTAGGTGTGTGATCGGCGAGAACGTGAACTTCAAGTCCAAGGGCGAGAAGTACCTGCAAACCAGGGGCCACGAGGTGGTGGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAGAAGCTGATGAAGCAGTTCATCGACGAGAGGCCTCAGGACTGGTTCGAGGATATCGGCGAG
Figure BPA00001374548000631
Figure BPA00001374548000632
cagctttggggccattggtgacgggtctgtacgacgtgcaggctttcaagtttggggacttcgtgctgaagagcgggctttcctcccccatctacatcgatctgcggggcatcgtgtctcgaccgcgtcttctgagtcagggttgcagatattttattccaaactgcccaaaatgcaggcatcagttttgacaccgtgtgtggagtgccttatacagctttgccattggctacagttatctgttcaaccaatcaaattccaatgcttattagaaggaaagaaacaaaggattatggaactaagcgtcttgtagaaggaactattaatccaggagaaacctgtttaatcattgaagatgttgtcaccagtggatctagtgttttggaaactgttgaggttcttcagaaggagggcttgaaggtcactgatgccatagtgctgttggacagagagcagggaggcaaggacaagttgcaggcgcacgggatccgcctccactcagtgtgtacattgtccaaaatgctggagattctcgagcagcagaaaaaagttgatgctgagacagttgggagagtgaagagggtttattcaggagaatgtctttgtggcagcgaatcataatggttctcccctttctataaaggaagcacccaaagaactcaGCTTCGGTGCACGTGCAGAGCTGCCCAGGATCCACCCAGTTGCATCGAAGTAA
Figure BPA00001374548000633
GCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGG
F.构建CD-连接子-OPRT融合基因(CDopt+3pt-LINK-OPRT，[aka  CDopt-LINKER-OPRT和CD2-L-OPRT]，在pAC3质粒RCR载体中T5.0005)也通过利用如图10D所述的方案IV克隆CD多肽与OPRT多肽之间和同框的连接子(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)4域以产生优化CD-连接子-OPRT序列来形成融合构建体。
所得构建体包含1329bp的尺寸和以下序列：
AACACGA
Figure BPA00001374548000634
ATGGTGACCGGCGGCATGGCCTCCAAGTGGGATCAAAAGGGCATGGATATCGCTTACGAGGAGGCCCTGCTGGGCTACAAGGAGGGCGGCGTGCCTATCGGCGGCTGTCTGATCAACAACAAGGACGGCAGTGTGCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGGTTCCAGAAGGGCTCCGCCACCCTGCACGGCGAGATCTCCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTGTACAAGGACACCACCCTGTACACCACCCTGTCCCCTTGTGACATGTGTACCGGCGCTATCATCATGTACGGCATCCCTAGGTGTGTGATCGGCGAGAACGTGAACTTCAAGTCCAAGGGCGAGAAGTACCTGCAAACCAGGGGCCACGAGGTGGTGGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAGAAGCTGATGAAGCAGTTCATCGACGAGAGGCCTCAGGACTGGTTCGAGGATATCGGCGAGTCCG GCGGCGGCGCCTCCGGCGGCGGCGCCTCCGGCGGCGGCGCCTCCGGCGGCGGCGCCGCGGTCGCTCGTGcagctttggggccattggtgacgggtctgtacgacgtgcaggctttcaagtttggggacttcgtgctgaagagcgggctttcctcccccatctacatcgatctgcggggcatcgtgtctcgaccgcgtcttctgagtcaggttgcagatattttattccaaactgcccaaaatgcaggcatcagttttgacaccgtgtgtggagtgccttatacagctttgccattggctacagttatctgttcaaccaatcaaattccaatgcttattagaaggaaagaaacaaaggattatggaactaagcgtcttgtagaaggaactattaatccaggagaaacctgtttaatcattgaagatgttgtcaccagtggatctagtgttttggaaactgttgaggttcttcagaaggagggcttgaaggtcactgatgccatagtgctgttggacagagagcagggaggcaaggacaagttgcaggcgcacgggatccgcctccactcagtgtgtacattgtccaaaatgctggagattctcgagcagcagaaaaaagttgatgctgagacagttgggagagtgaagaggtttattcaggagaatgtctttgtggcagcgaatcataatggttctcccctttctataaaggaagcacccaaagaactcaGCTTCGGTGCACGTGCAGAGCTGCCCAGGATCCACCCAGTTGCATCGAAGTAAGCCATAGATAAAATAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGG
图4说明与被感染U-87细胞中的野生型yCD蛋白相比，具有较高稳定性的yCD蛋白中经3个突变优化的人类密码子的水平较高。
实施例3通过瞬时转染产生载体
载体可以许多方式产生，但第一步是将DNA载体引入细胞中以便产生感染粒子，然后从细胞上清液收集所述感染粒子。一旦产生了感染粒子，所属领域技术人员就可实施其它产生方法。通过瞬时转染293T细胞来产生载体粒子(Pear等人Proc Natl Acad Sci U S A.90：8392-83961993)。
将293T细胞解冻并放入培养物中，然后在含有15mL DMEM培养基的T-75烧瓶中传代两次，所述DMEM培养基是通过混合DMEM高葡萄糖培养基(Hyclone#30081，500mL)与FBS(Hyclone#SH30070，50mL)、L-谷氨酰胺(Cellgro#25-005-CI，5mL)、NEAA(Hyclone#SH30238，5mL)和青霉素-链霉素(Cellgro#30-002-CI，5mL)来制备。烧瓶在37℃和5％CO2下培养。在第3次传代后，将细胞接种于6个T-25中，每个T-25含有5mL培养基，细胞接种密度为1.8×106个细胞/T-25(或7.2×104个细胞/cm2)。在接种T-25后一天，使用购自Promega的磷酸钙转染试剂盒(目录号E1200)用表达病毒载体的T5.0002质粒转染细胞。在转染后18小时，用含有10mM NaB的新鲜培养基替换一组烧瓶(每组3个烧瓶)中的培养基。不替换第2组烧瓶中的培养基，其用作对照(无NaB)。在NaB处理后8小时，用不含NaB的新鲜培养基替换所有烧瓶中的培养基。继续两组烧瓶中的表达直到下一天(22小时持续时间)为止。收集两组烧瓶的上清液，并通过qPCR分析其滴度，表示为转导单位(TU)/毫升(参看实施例4)。
下表显示滴度结果。
Figure BPA00001374548000651
TU＝转导单位
以此方式，但不使用丁酸钠，制备后续载体制剂。已经用相同方式使用其它载体质粒(表2)来产生滴度在1E5 TU/ml与1E7 TU/ml之间的载体制剂。必要时，所述物质可如下文所述被进一步纯化和浓缩。也参看US 5792643；T.Rodriguez等人J Gene Med 9：2332007；美国申请61218063。
在本公开书的某些实施方案中，依据脑重量的克数计算剂量。在所述实施方案中，可用于治疗方法中的本公开书的可复制逆转录病毒载体的剂量可在每克脑重量104到106TU的范围内。
实施例4定量PCR滴定分析
使用基于定量PCR(qPCR)的方法测定功能载体浓度或滴度。在这种方法中，通过用标准体积的载体感染可转导宿主细胞系(例如PC-3人类前列腺癌细胞，ATCC Cat#CRL-1435)并测量在转导后于宿主细胞内存在的前病毒的所得量来滴定载体。细胞和载体在标准培养条件(37℃，5％CO2)下培养24小时以允许完全感染，随后添加抗逆转录病毒AZT以终止载体复制。接着从培养皿收集细胞，使用Invitrogen Purelink gDNA纯化试剂盒来纯化基因组DNA(gDNA)，并用无RNase-/DNase的无菌水将其从纯化柱洗脱。在分光光度计上测量A260/A280吸光率比以确定样品的浓度和相对纯度。用另外的无RNase-/DNase水将gDNA浓度标准化为任何指定组的gDNA制剂的最低浓度，使得qPCR的输入DNA对于分析的所有样品是恒定的。通过在经溴化乙锭染色的0.8％琼脂糖凝胶上电泳每个样品的等分试样来进一步分析基因组DNA纯度。如果样品具有1.8-2.0的A260/A280吸光率范围且显示单一gDNA带，那么样品可用于qPCR分析载体的前病毒拷贝数。使用查询前病毒LTR区(逆转录的载体DNA和整合到宿主gDNA中的载体DNA)的引物，进行qPCR以估算当使用已知体积的载体转导已知数目的细胞时所发生的转导事件的总数。从标准曲线计算每个反应的转导事件数目，所述标准曲线利用从107个拷贝连续稀释成10个拷贝并在相同qPCR条件下作为样品来测量的已知拷贝数的靶标携带质粒。通过知道每个qPCR反应使用多少基因组等效物(根据先前测定的浓度)以及每个反应中发生多少转导事件，我们可基于在转导时存在的细胞总数来确定所发生的转导事件总数。这个值是载体在初始转导期间稀释到含有细胞的培养基中之后的滴度。为了计算经校正的滴度值，稀释度通过乘以培养物体积并除以滴定体积来校正。这些实验在重复培养物中进行，并通过qPCR，对于每个条件使用三次测量来进行分析，以测定平均滴度和与其有关的标准偏差和变异系数。
实施例5载体测试
为了变得有效，载体构建体和由其衍生的感染粒子需要：1)通过瞬时转染而获得良好的病毒滴度(参看实施例3和4)；2)在多次传代后稳定；3)在5-FC的存在下有效地杀死细胞；和4)在感染靶细胞后表达酶活性。实施例3显示可从载体获得有用的滴度。
病毒载体的遗传稳定性 为了证明稳定性，进行以下实验。起初利用病毒载体以0.01的MOI感染约106个天然U-87细胞，且生长到被完全感染以完成单一感染周期。然后将上清液再转移到未被感染的细胞上并重复所述周期。在本实验中，已经在双重复试验中完成了12个周期(图5显示双重复试验中的一个，另一重复得到类似结果)。使用侧接转基因插入位点的MLV特异引物，通过从被感染细胞PCR扩增被整合的前病毒来分析yCD2或其它转基因序列的基因组稳定性。任何小于全长扩增子的带的出现将指示载体不稳定性。图5证明本公开书的载体(T5.0007，包含被修饰载体和CD异源多聚核苷酸)与pACE-CD相比，在传代更多的情况下仍保持稳定性。此外，T5.0003有点不太稳定，而T5.0004和T5差不多与pACE-CD同样稳定。pACE-CD已经用于小鼠肿瘤研究中并在小鼠模型中显示良好的抗肿瘤作用。然而，更稳定的病毒基因组在动物和人类治疗中将更为有效和更持久，特别是在需要多个5-FC治疗周期的时候。T5.0001和T5.0002甚至比T5.0007都要稳定得多，显示蛋白编码序列中的沉默改变或导致点突变的微小改变可产生意想不到的优越特性以及更稳定的载体基因组。
细胞杀死实验 细胞滴度96水性单溶液细胞增殖分析(MTS)是用于测定增殖分析中的活细胞数目的比色方法。我们已经利用了这种分析来测定细胞生长动力学，以及测定各种细胞系对5-氟胞嘧啶(5-FC)和5-氟尿嘧啶(5-FU)的剂量反应。
将经载体100％感染的细胞以1000个细胞/孔接种于96孔板中。在用各种浓度的5-FC处理(5-FU用作对照)后，历经8天监测所述细胞。利用细胞滴度96水性单溶液试剂(MTS)每两天分析其细胞生长。简言之，将20μl MTS与100μl培养基(根据制造商推荐)混合并添加到96孔板的样品中。样品在37℃/5％CO2培养箱中培养60分钟。然后在平板读取器上以490nm波长读取吸光率读数。然后丢弃平板。
图6A显示实验结果，所述实验通过对经AC3-yCD2(载体)或AC3-yCD(载体)感染的U-87细胞进行5-FC滴定，证明表达yCD2蛋白的细胞中的胞嘧啶脱氨酶至少与在表达野生型yCD蛋白的细胞中活性相同。简言之，在用AC3-yCD(野生型CD)载体或AC3-yCD2(热稳定化和密码子优化)载体以0.1的感染复数(即100％被感染)感染5天后，U-87细胞接触增加量的5-FC或作为阳性对照的0.1mM 5-FU，维持8天。在第8天，使用MTS分析(Promega细胞滴度96水性单溶液增殖分析)评定细胞培养物的活力。数据显示在增加剂量的5-FC处理下，两种逆转录病毒载体的杀死作用相当。
在使用RG2细胞(ATCC Cat# CRL-2433)的类似体外细胞培养实验中，用5种不同载体(pACE-CD、T5.0001、T5.0002、T5.0004和T5.0007)转导RG2细胞系。随后使其接触增加浓度的5-FC(5-FU用作对照)持续8天，并如上所述进行监测。结果展示于图2中。0.01mM的浓度足以在测试的所有载体中诱导完全杀死，但野生型胞嘧啶脱氨酶(pACE-yCD)除外。其不太敏感且需要1.0mM的5-FC才能实现完全杀死。
CD表达分析 以0.1的感染复数(MOI)转导U87细胞，培养5天以允许病毒传播，并收集转导5天后的细胞。然后通过在800x g下离心5分钟来收集细胞。从细胞团块中吸出上清液，用5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，并在800x g下再次离心5分钟。将所得细胞团块溶解于1.5mL PBS中，通过吸管尖来再悬浮，并置于-20℃的冷冻器中。用冷冻/解冻方法溶解细胞。使先前再悬浮的细胞在室温下解冻，通过吸管尖，与蛋白酶抑制剂混合液混合并在-20℃下再次冷冻。在酶分析之前，将样品在室温下再次解冻并在吸管尖中通过。悬浮液然后在台式离心机中以14,000rpm离心5分钟。从团块中轻轻倒出上清液，并置于新鲜eppendorf管中且置于冰上。
使用HPLC分析法来评定yCD酶活性。HPLC分析是在与光阵列检测器和自动进样器串联连接的Shimadzu LC20AT单元上进行。固相是Hypersil BDS C18HPLC柱，其具有5μm球体大小和4.0×250mm柱尺寸。流动相是50mM磷酸铵(pH 2.1)，其含有0.01％四丁基高氯酸铵和5％甲醇；所述系统在22℃下平衡。所有试剂是ACS级且溶剂是HPLC级。制备PBS中的最终浓度为0.125mg/mL 5FC(1mM)的800μL反应混合物，并置于1.5mL自动进样器小瓶中。然后通过添加200μL每种细胞裂解液来起始反应。将反应管/自动进样器管置于自动进样器中，并注入5μL反应混合物。通过从每个反应管获取5μL等分试样并在HPLC柱上分析来周期性地选取时间点。通过比较峰面积与来自先前产生的5FU标准曲线的已知量来计算5FC至5FU的转化速率。通过对所产生的5FU量(以nmol计)与其对应时间间隔作图来推导5FC至5FU的转化速率。推导细胞样品的蛋白浓度，并通过用转化速率(nmol/min)除以分析中的蛋白用量(mg)来计算细胞裂解液样品的比活性。图6B显示以0.1的MOI转导5天后各种载体的比活性。数据证明在组织培养细胞中的胞嘧啶脱氨酶的比活性方面，pACE-yCD(T5.0000)＜pAC3-yCD1(T5.0001)＜pAC3-CD2(T5.0002)。
实施例6载体纯化和浓缩
通过在293T细胞上瞬时转染(实施例3)，随后收集细胞上清液，过滤，用benzonase处理，透滤/浓缩和透析来制造本公开书的载体。可包含所属领域技术人员已知的另一个色谱柱步骤(参看例如US5792643；T.Rodriguez等人J Gene Med 9：233 2007；美国申请61218063)。已基于标准测试(例如无菌性、支原体和内毒素、plus产物特定效力、强度和同一性测试)公开临床材料。通过靶细胞中的整合病毒载体DNA的PCR定量来测定滴度，以转导单位(TU)表示(实施例4)。选定滴度高达109TU/ml的最终产物，其是在等张Tris缓冲蔗糖溶液中配制成无菌注射液。
一般来说，为了准确且精确地测定载体批次的强度，已经开发了基于定量PCR的滴度分析(如实施例4中概括地描述)。所述分析程序的细节由以下步骤组成：
转导.使用来源于PC-3细胞系的稳定人类前列腺腺癌，以12孔板型式进行转导。对于每个测试样品，使用三个未滴定的载体制剂的稀释液在一式三份的孔中转导PC-3细胞。在转导后24小时用叠氮胸苷(azidothymidine；AZT)终止病毒复制。在收集和基因组DNA纯化前另外维持细胞24-64小时。
基因组DNA纯化.根据制造商方案，使用Qiagen DNeasy DNA Minikits从收集的被转导细胞制备基因组DNA。通过直接吸光度测量，使用UV/vis分光光度测定法以测定A260和A260/A280比率，从而评定DNA浓度和质量。
实时定量PCR.使用BioRad CFX96实时PCR仪器或等效物进行定量PCR。通过使用特异性DNA寡聚核苷酸引物结合TaqMan探针(其经设计用于相对于CMV/Psi质粒启动子扩增被整合的或前逆转录病毒U3/Psi包装)，测量每个测试样品中所存在的前病毒拷贝数。相对于拷贝数标准曲线来表示载体滴度。为了产生载体拷贝数标准曲线，在来自PC-3细胞的基因组DNA中外加含有前逆转录病毒U3/Psi序列的唯一质粒。通过计算多个稀释液(每个稀释液使用多个反应)中被转导基因组的数目来获得载体测试样品滴度。
对于每个滴度评定，一式三份地执行非模板对照(含有除质粒或基因组DNA之外的所有组分的孔)和阴性对照(包含来自非转导PC-3细胞的等效基因组DNA的所有组分)。滴度值以转导单位/毫升(TU/mL)表示。
本公开书的载体的效能依赖于载体复制和在靶细胞中的所得胞嘧啶脱氨酶(CD)活性。因此，效能分析测量到随着载体感染在组织培养中的先前未感染的细胞系中传播，CD活性增加。所述分析通过使用反相HPLC分离以及UV检测来监控5-氟胞嘧啶(5-FC)至5-氟尿嘧啶(5-FU)的转化，从而测量在感染早期、中期和晚期所转移的yCD2蛋白在转导细胞中的酶活性。在感染过程中的CD活性增加是随着时间被感染的细胞百分比的函数，且表示TOCA 511载体复制的能力。在每个时间点测量基于5-FC至5-FU转化率的CD活性，以CD单位/毫克蛋白表示(比活性，SA)。然后随时间对SA增加作图，SA增加反映因为培养物中的病毒复制所导致的被转导细胞的百分比的增加，和所得CD活性转移。已经使用来自多个分析和载体批次的积累数据来确定CD的所述SA增加对于产物释放的适当规格。所述分析具有在以约0.1的MOI初始感染和未感染对照之后的1、3和5天时间点。
比较各批次之间的来自晚期感染细胞(5天时间点)的CD活性以评估所述活性用作同一性测试的用途。所述分析包含以下步骤：
转导.对于U87细胞以多孔板型式进行转导。对于每个转导，使用三个合适的稀释液且每个转导是一式三份地进行。在转导后0、1、3和5天收集细胞。
建立CD反应.裂解细胞并使用以BSA作为标准的BCA蛋白分析来测定总蛋白浓度。对于yCD2酶分析，将适量的细胞裂解液添加到含有5-FC的缓冲液中，使得F-FU形成速率在37℃下载1-2小时内保持线性。反应混合物的最终体积是100μL。2h后，通过添加三氯乙酸来终止酶反应，短暂涡旋并用于随后HPLC分析。将来自非转导细胞的细胞裂解液用作阴性对照，而使用100％感染细胞的样品的类似分析则用作阳性对照。
HPLC分析.将被终止的反应混合物在室温下在微离心管中以12,000rpm离心5分钟。然后从团块中轻轻倒出上清液，并使其通过0.2μ滤器以进一步去除颗粒物，随后注射到先前用含有磷酸盐缓冲液(pH约为4.0)的水性流动相平衡的反相HPLC柱上。在260nm和280nm下跟踪色谱图以监控底物消耗和产物形成。使用GraphPad的制图和分析能力，通过将底物或产物的浓度与从已知底物或产物浓度计算的先前产生的标准曲线比较来确定底物或产物的浓度。使用经1-2h产生的5-FU的量来确定CD活性单位(1个CD活性单位是定义为每分钟形成1nmol的5-FU)，且将此数字除以分析中的蛋白用量(来自细胞裂解液)以计算比活性。
实施例7构建和使用编码针对CTLA-4(CD 152)的单链抗体的载体。
单链抗体来源于具有期望作用的已知完整抗体序列。可获得所述序列(例如WO2006048749、US2006165706、US7034121、Genbank登记号DJ437648、CS441506、CS441500、CS441494、CS441488，其公开内容以引用的方式并入本文中)。通过所属领域技术人员已知的常用方法将所述常规抗体基因序列转化为单链抗体(scFv)序列(参看例如Gilliland等人“Rapid and reliable cloning of antibody variable regions and generation of recombinant single chain antibody fragments.”Tissue Antigens 47，1-20，1996)。也可从筛选噬菌体scFv文库直接获得针对CTLA-4的噬菌体单链抗体，并可将其直接用于插入到本发明的复制逆转录病毒载体中(Pistillo等人Tissue Antigens 55：229 2000)。无论序列的来源如何，scFv典型地是约700-900bp长且如先前所述由商业供应商(BioBasic)合成，其在5’端具有Psi1位点且在3’端具有相容的Not1位点。所述序列然后在去除yCD2序列后插入pAC3-yCD2的复制逆转录病毒骨架的Psi1-Not1位点。如上所述产生和滴定载体，且在必要时如上所述进行进一步纯化。人类和小鼠CTLA4的序列非常同源，且首先在所属领域技术人员众所周知的合适的同系免疫活性小鼠模型(例如CT26/Balb/c模型和s91小鼠黑素瘤模型)中测试本发明的复制逆转录病毒(参看例如Hodge等人J.Immunol.174：5994200)。结果是由一种或一种以上下列因素衡量：肿瘤生长的调节；细胞毒性的缺乏；抗肿瘤反应的产生；表明系统免疫性的远端病变收缩。小鼠中的剂量在103到107TU的范围内。在患者中，载体是通过病变部位内注射入肿瘤，或通过施用于循环中且然后由循环将病毒带入肿瘤中来施用。剂量在105到1011TU的范围内。
实施例8小鼠黑素瘤模型中的使用抗CD152单链抗体表达载体的抗黑素 瘤功效研究
目标
此项研究的目标在于评定当通过在具有皮下黑素瘤(Cloudman S91)的DBA/2小鼠中肿瘤内(IT)注射来递送时，携带基于针对细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4，也称为分化群(CD152)序列(pAC3-αCD152))的单链抗体的新颖MLV型可复制逆转录病毒载体对黑素瘤生长的影响。
小鼠
雌性DBA/2小鼠(～8周大)是从Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)购得。驯化小鼠7天，随后开始研究。
细胞
Cloudman S91细胞(ATCC，Manassas VA)是从DBA/2小鼠获得的自发出现的黑素瘤。将细胞在含有10％胎牛血清、丙酮酸钠和Glutamax(Hyclone，Logan UT和Invitrogen，San Diego CA)的杜贝卡改良伊格氏培养基(Dulbecco’s modified Eagles medium)中培养。将细胞再悬浮于PBS(Hyclone，Logan UT)中以用于植入。将S91细胞(1E6，100μL)注入DBA/2小鼠右肋。
载体
通过瞬时转染(或从HT1080细胞中的产病毒细胞系，参看美国申请)制备载体制剂，滴度为约7E6TU/ml。在初始研究中，没有进一步纯化或浓缩载体。在用于测定全剂量反应曲线的跟踪实验中，制备经纯化的高滴度材料，滴度预期为约10E8/ml。载体以50-100μL的体积肿瘤内施用并以100μL的体积静脉内施用，每只小鼠的总剂量为约7E5TU/小鼠。将表达αCD152的载体标示为TocaαCD152。
肿瘤植入和载体注射
对5组雌性DBA/2(55只小鼠，9-10周大)皮下植入S91黑素瘤细胞(第0天)，然后施用(第4-7天，取决于S91肿瘤的生长速率，约50-100mm3)运载体(第1组)、对照载体[AC3-GFP(V)](第2组)、肿瘤内(IT)TocaαCD152载体注射液(第3组)或静脉内TocaαCD152载体注射液(第4组)。第5组小鼠没有植入肿瘤，且只静脉内注射TocaαCD152。
数据分析
执行肿瘤生长分析直到2000mm3或第60天，这要依据哪种情况先发生。将来自每组的10只小鼠的肿瘤尺寸与时间作图。使用方差分析(ANOVA)来确定统计显著性。＜0.05的P值被视为在所有分析中具有统计显著性，所述分析是用Prism 5统计软件(GraphPad软件)或等效物执行。还采用生活观察以评定治疗期间αCD152表达的任何不利事件。
结果
与对照相比，通过复制性MLV肿瘤内递送αCD152可显示统计上显著的生长迟滞。与对照相比，通过复制性MLV静脉内递送αCD152显示统计上显著的生长迟滞，消除来自DBA/2-Cloudman S91小鼠黑素瘤模型的黑素瘤负担。
其它动物研究如下进行：
实施例9ACE-yCD2病毒载体在裸小鼠的颅内人类异种移植物(U87)中具 有治疗作用
建立使用U87人类神经胶质瘤细胞系的颅内异种移植物模型，以测试RCR载体传播和生物分布，以及RCR载体介导的胞嘧啶脱氨酶自杀基因疗法于裸小鼠宿主中的治疗功效。
在驯化之后，将小鼠随机分配给8个治疗组中的1组(参看下文组描述)。在第0天对7个组的右侧纹状体颅内施用1×105个U87细胞/小鼠。第8组小鼠未植入肿瘤。第5天，对小鼠只注射制剂缓冲液，或注射9×105/5μl、9×104/5μl或9×103/5μl的RCR载体。令不接受载体或接受9×105/5μl或9×103/5μl的载体的小鼠随机接受5-FC(500mg/kg/天)(通过单次腹腔注射施用，在第19天开始)，或不接受5-FC。接受中等剂量载体的小鼠都接受5-FC(即对于此剂量没有单独的对照)。5-FC施用每天一次，持续连续7天，随后15天不进行治疗。药物加测试的循环重复高达4个循环。将来自除第8组以外的每组的10只小鼠随机分配给存活分析类别。剩余的小鼠根据预定方案处死。
组分配和剂量水平
Figure BPA00001374548000741
Figure BPA00001374548000751
静脉内给药通过注射入尾部静脉来进行。腹腔给药通过小心注射入腹部同时避免注射入膀胱来进行。在颅内注射中，用异氟烷麻醉小鼠并将其安置于具有钝耳棒(blunt ear bar)的立体定位装置中。将皮肤剃毛并使用聚维酮碘(betadine)处理头皮以制备外科部位。将动物置于加热垫上并在无菌条件下使用手术刀在皮肤中制造中线切口。可以通过切口部位的皮肤回缩和筋膜反射来观察头骨。穿过头骨中的小钻孔插入具有3mm突出物的引导套管(其配备具有3.5mm突出物的盖子)，并用牙科粘固粉和3个小螺钉将所述套管与头骨连接。在粘固粉硬化后，用缝线缝合皮肤。映射的立体定位坐标是AP＝0.5-1.0mm，ML＝1.8-2.0mm，DV＝3.0mm。可通过注射染料并确定其位置，在预实验(2-3只动物)中确定所接受的动物组的精确立体定位坐标。将在麻醉恢复期间监控动物。在程序结束前皮下(SC)施用止痛剂丁丙诺啡(buprenorphine)，然后大约每12小时施用丁丙诺啡，持续长达3天。每天都监控动物。通过注射套管(具有穿过引导套管插入的3.5mm突出物)颅内输注细胞或载体。用配备Hamilton注射器和软管的注射泵控制速率。对于细胞注射，以0.2微升/分钟的流动速率(总共5分钟)递送1微升细胞。对于载体注射，以0.33微升/分钟的流动速率(总共15分钟)递送5微升载体。
将载体递送到小鼠，且以每克脑重量的转化单位(TU)来计算。使用所述计算，可计算其它哺乳动物(包括人)的剂量翻译。图8显示此小鼠模型中对于载体剂量的影响。
实施例10 AC3-yCD2(V)在同系小鼠脑癌模型中具有治疗作用
在同系动物模型中进行其它实验以证明本公开书的方法和组合物。
产生同系BALB/c小鼠中的使用CT26结肠直肠癌细胞系的颅内植入物模型，以测试RCR载体传播和生物分布，以及RCR载体介导的胞嘧啶脱氨酶自杀基因疗法的治疗功效和其免疫学影响。
此项研究包含129只动物，0雄性，119只雌性和10只偶然动物(10只雌性)。在驯化之后，将小鼠随机分配给8个治疗组中的1组(参看下文组描述)。在第0天对7个组的右侧纹状体颅内施用1×104个CT26细胞/小鼠。第8组小鼠未植入肿瘤。第4天，对小鼠只注射制剂缓冲液，或注射9×105/5μl、9×104/5μl或9×103/5μl的载体。令不接受载体或接受9×105/5μl或9×103/5μl的载体的小鼠随机接受5-FC(500mg/kg/BID)(通过单次腹腔注射施用，在第13天开始)，或不接受5-FC。接受中等剂量载体的小鼠都接受5-FC(即对于此剂量没有单独的对照)。5-FC施用每天一次，持续连续7天，随后10天不进行治疗。药物加测试的周期重复高达4个周期。将来自除第8组以外的每组的10只小鼠随机指派给存活分析类别。剩余的小鼠根据预定方案处死。
将监测稚小鼠和预定处死动物共同圈养，并在相同时间点取出以评定通过脱皮的载体传输。
组分配和剂量水平
Figure BPA00001374548000761
Figure BPA00001374548000771
静脉内给药通过注射入尾部静脉来进行。腹腔给药通过小心注射入腹部同时避免注射入膀胱来进行。在颅内施用中，使用具有引导套管的小鼠，所述套管具有植入右侧纹状体的3.2mm突出物且配备具有3.7mm突出物的盖子。映射的立体定位坐标是AP＝0.5-1.0mm，ML＝1.8-2.0mm，DV＝3.2mm(从前囟开始)。通过注射套管(具有穿过引导套管插入的3.7mm突出物)颅内输注细胞或载体。用配备Hamilton注射器和软管的注射泵控制速率。
对于细胞注射，以0.2微升/分钟的流动速率(总共5分钟)递送1微升细胞。对于载体注射，以0.33微升/分钟的流动速率(总共15分钟)递送5微升载体。
将载体递送到小鼠，且依据每克脑重量的转化单位(TU)来计算。使用所述计算，可计算其它哺乳动物(包括人)的剂量转化量。图9显示当颅内递送载体时，此小鼠模型中对于载体剂量的影响。
实施例11构建和测试表达miR-128-1和miR128-2的RCR载体
A.构建含有人类pri-miRNA-128-1的异源多聚核苷酸序列的重组可复制逆转录病毒载体
可复制逆转录病毒载体(表达miR-128-1的pAC3-miR-128-1)来源于一个实施方案中所述的pAC3-yCD2的骨架。通过用Mlu I和Not I对pAC3-yCD2质粒DNA进行核酸内切酶消化以去除IRES-yCD2多聚核苷酸序列来分离pAC3-miR-128-1载体的pAC3骨架。从pEP-mir-128-1表达载体(Cell BioLabs Inc.)(SEQ ID NO：31)的产品清单获得pri-miR-128-1的多聚核苷酸DNA序列。合成在双链DNA片段的5’端具有Mlu I限制酶位点且在3’端具有Not I限制酶位点的pri-miR-128-1的DNA序列，以用于随后在经Mlu I和Not I消化的上述pAC3-yCD2质粒DNA中的对应位点插入。所得构建体pAC3-miR-128-1编码3种基因gag、pol和env，以及非编码pri-miR-128-1序列(图11)。
通过使用磷酸钙方法将载体编码质粒DNA瞬时转染到293T细胞中来制备载体储液。在转染后18小时，用新鲜培养基更换培养物。在培养基更换后24小时，收集含有载体的上清液，将其滤过0.45μm滤器，并立即使用或作为等分试样储存在-80℃下以备随后使用。使用24微升所收集的载体储液来感染人类前列腺癌细胞PC3。在感染后24小时，向细胞中添加AZT以抑制病毒进一步复制。在感染后48小时，提取被感染PC3细胞的基因组DNA以用于滴定分析。利用已知拷贝数的标准物的包涵体，通过qPCR测定载体储液的滴度。
B.构建含有人类pri-miRNA-128-2的异源多聚核苷酸序列的重组可复制逆转录病毒载体
可复制逆转录病毒载体(表达miR-128-2的pAC3-miR-128-2)来源于一个实施方案中所述的pAC3-yCD2的骨架。通过用Mlu I和Not I对pAC3-yCD2质粒DNA进行核酸内切酶消化以去除IRES-yCD2多聚核苷酸序列来分离pAC3-miR-128-1载体的pAC3骨架。从表达pri-miR128-2的表达载体Lenti-miR-128-2(System Biosciences)(SEQ ID NO：32)的序列分析获得pri-miR-128-2的多聚核苷酸DNA序列。合成在双链DNA片段的5’端具有Mlu I限制酶位点且在3’端具有Not I限制酶位点的pri-miR128-2的DNA序列，以用于随后在经Mlu I和Not I消化的上述pAC3-yCD2质粒DNA中的对应位点插入。所得构建体pAC3-miR-128-1编码3种基因gag、pol和env，以及非编码pri-miR-128-2序列(图1)。
通过使用磷酸钙方法将载体编码质粒DNA瞬时转染到293T细胞中来制备载体储液。在转染后18小时，用新鲜培养基更换培养物。在培养基更换后24小时，收集含有载体的上清液，将其滤过0.45μm滤器，并立即使用或作为等分试样储存在-80℃下以备随后使用。使用24微升所收集的载体储液来感染人类前列腺癌细胞PC3。在感染后24小时，向细胞中添加AZT以抑制病毒进一步复制。在感染后48小时，提取被感染PC3细胞的基因组DNA以用于滴定分析。利用已知拷贝数的标准物的包涵体，通过qPCR测定载体储液的滴度。
C.构建含有人类H1启动子和人类pre-miRNA-128-的异源多聚核苷酸序列的重组可复制逆转录病毒载体
可复制逆转录病毒载体(表达miR-128-2的pAC3-miR-128-2)来源于一个实施方案中所述的pAC3-yCD2的骨架。通过用Mlu I和Not I对pAC3-yCD2质粒DNA进行核酸内切酶消化以去除IRES-yCD2多聚核苷酸序列来分离pAC3-miR-128-1载体的pAC3骨架。从pSilencer 3.1 H1 hygro表达载体(Ambion)的产品信息获得人类H1启动子的多聚核苷酸DNA序列，并从http://www.mirbase.org/获得短发夹结构pre-miR-128-1的多聚核苷酸DNA序列。合成在双链DNA片段的5’端具有Mlu I限制酶位点且在3’端具有Not I限制酶位点的与人类H1启动子连接的pri-miR128-1的DNA序列(SEQ ID NO：33)，以用于随后在经Mlu I和Not I消化的上述pAC3-yCD2质粒DNA中的对应位点插入。所得构建体pAC3-H1-shRNAmiR128编码3种基因gag、pol和env，以及非编码短发夹结构pre-miR-128-1序列(图11)。
通过使用磷酸钙方法将载体编码质粒DNA瞬时转染到293T细胞中来制备载体储液。在转染后18小时，用新鲜培养基更换培养物。在培养基更换后24小时，收集含有载体的上清液，将其滤过0.45μm滤器，并立即使用或作为等分试样储存在-80℃下以备随后使用。使用24微升所收集的载体储液来感染人类前列腺癌细胞PC3。在感染后24小时，向细胞中添加AZT以抑制病毒进一步复制。在感染后48小时，提取被感染PC3细胞的基因组DNA以用于滴定分析。利用已知拷贝数的标准物的包涵体，通过qPCR测定载体储液的滴度。
D.通过qPCR分析来分析重组可复制逆转录病毒载体的复制动力学
目前存在至少两种常用方式来获得重组可复制逆转录病毒载体的复制动力学：(1)通过流式细胞分析法来分析表达GFP蛋白的载体的GFP表达，和(2)通过测量从被转导细胞的培养基收集的载体储液的逆转录酶活性来分析逆转录酶。与通过RNA和转基因表达获得的滴度(其中滴度分别被高估和低估)相比，由被转导细胞的DNA分析所评定的滴度提供功能滴度的最可靠的评价(Sastry等人，2002 Gene Therapy 9，1155-1162)。病毒传播的复制动力学与所转导的细胞群体的百分比相关，其中可通过qPCR并利用对培养物中测试的病毒序列具有特异性的引物来检测病毒基因组的被整合前病毒DNA。如果测试复制动力学的比较结果，那么本分析需要在同一载体内和各种载体之间从所有时间点开始输入等量的基因组DNA。通过以C(t)值的倒数对时间点作图来产生复制动力学图表。图12A和图12B显示各种重组可复制逆转录病毒载体的复制动力学的比较结果。所述分析很容易揭露各种载体的复制动力学的细小差别。
E.测试含有miR-128的重组可复制逆转录病毒载体在培养物中的复制动力学
为了证实在本发明中分别并入的pri-miR-128-1、pri-miR-128-2和H1-pre-miR-128-1序列正常复制，使用从上述瞬时转染收集的经计算体积的每种载体储液以0.1的MOI分别感染新鲜人类纤维肉瘤细胞HT1080和人类神经胶质瘤细胞U87-MG。在感染后3、6和9天使被转导细胞传代。在每个时间点，收集一部分细胞进行基因组DNA提取，以便用于qPCR。制备基因组DNA的稀释液以产生在qPCR中的等量基因组输入中具有相同浓度的基因组DNA的等分试样。通过以C(t)值的倒数对时间点作图来产生每个载体的复制动力学。图12A和图12B显示测试的所有载体以与对照MLV病毒类似的动力学复制。
E.测试从用含有miR-128的重组可复制逆转录病毒载体转导的细胞的成熟miR-128表达
为了证实用含有重组可复制逆转录病毒载体的miR-128转导的细胞中的miR-128表达，使来自感染后9天的细胞(此时达到最大感染性)(图12A和图12B)繁殖，并进行收集以提取总RNA用于检测成熟miRNA表达。来自Taqman微小RNA分析的结果显示，与未转导的细胞相比，用pAC3-miR-128-1、pAC3-miR-128-2和pAC3-H1-shRNAmiR128载体转导的HT1080和U87-MG细胞中发生成熟miR-128的过度表达(图13)。在两种细胞系中，用pAC3-miR-128-1和pAC3-H1-shRNAmiR128载体转导的细胞中的成熟miR-128表达水平高于用pAC3-miR-128-2载体转导的细胞中的表达水平。
F.测试从用含有miR-128的重组可复制逆转录病毒载体转导的细胞中的Bmi-1表达以证明miR-12的靶标接合
已经观察到Bmi-1表达在包括胶质母细胞瘤在内的各种人类癌症中得到上调，且已经显示Bmi-1表达是miR-128的靶标。为了证实miR-128的靶标接合，通过qRT-PCR来检测分别用pAC3-miR-128-1、pAC3-miR-128-2和pAC3-H1-shRNAmiR128载体转导的细胞中的Bmi-1表达。图14显示分别用pAC3-miR-128-1、pAC3-miR-128-2和pAC3-H1-shRNAmiR128载体转导的U87-MG细胞中的Bmi-1表达水平低于未转导细胞，而在HT1080细胞中，被转导细胞与未转导细胞之间没有观察到显著差别。数据支持miR-128在中枢神经系统中扮演重要功能角色的观点。
实例12：构建和测试含有IRES、yCD2、人类H1启动子和人类pre-miR128-1 的异源多聚核苷酸序列的重组可复制逆转录病毒载体
A.构建
可复制逆转录病毒载体pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128来源于一个实施方案中所述的pAC3-yCD2的骨架。通过用Not I对pAC3-yCD2质粒DNA进行核酸内切酶消化来分离pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128载体中的pAC3-yCD2骨架。从pSilencer 3.1 H1 hygro表达载体(Ambion)的产品信息获得人类H1启动子的多聚核苷酸DNA序列，并从http://www.mirbase.org/获得短发夹结构pre-miR-128-1的多聚核苷酸DNA序列。合成在双链DNA片段的两端具有Not I限制酶位点的与人类H1启动子连接的pre-miR128-1的DNA序列(SEQ ID NO：34)，以用于随后插入经Not I消化的上述pAC3-yCD2质粒DNA中的对应位点。所得构建体pAC3-H1-shRNAmiR128编码4种基因gag、pol和env和yCD2，以及非编码短发夹结构pre-miR-128-1序列(图11)。
通过使用磷酸钙方法将载体编码质粒DNA瞬时转染到293T细胞中来制备载体储液。在转染后18小时，用新鲜培养基更换培养物。在培养基更换后24小时，收集含有载体的上清液，将其滤过0.45μm滤器，并立即使用或作为等分试样储存在-80℃下以备随后使用。使用24微升所收集的载体储液来感染人类前列腺癌细胞PC3。在感染后24小时，向细胞中添加AZT以抑制病毒进一步复制。在感染后48小时，提取被感染PC3细胞的基因组DNA以用于滴定分析。利用已知拷贝数的标准物的包涵体，通过qPCR测定载体储液的滴度。
B.测试pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128重组可复制逆转录病毒载体在培养物中的复制动力学
为了证实在本发明中并入的H1-pre-miR-128-1正常复制，使用从上述瞬时转染收集的经计算体积的每种载体储液以0.1的MOI分别感染新鲜人类纤维肉瘤细胞HT1080和人类神经胶质瘤细胞U87-MG。在感染后3、6和9天使被转导细胞传代。在每个时间点，收集一部分细胞进行基因组DNA提取，以便用于qPCR。制备基因组DNA的稀释液以产生用于qPCR的等量基因组输入的具有相同浓度的基因组DNA的等分试样。通过以C(t)值的倒数对时间点作图来产生每个载体的复制动力学。结果显示载体在与对照MLV病毒类似的动力学下复制。
C.测试用pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128重组可复制逆转录病毒载体转导的细胞中的成熟miR-128表达
为了证实用pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128重组可复制逆转录病毒载体转导的细胞中的miR-128表达，使来自感染后9天的细胞(此时达到最大感染性)繁殖，并进行收集以提取总RNA用于检测成熟miRNA表达。来自Taqman微小RNA分析的结果显示，与未转导的细胞相比，用pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128转导的HT1080和U87-MG细胞中发生成熟miR-128的过度表达
D.测试用pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128重组可复制逆转录病毒载体转导的细胞中的Bmi-1表达以证明miR-128的靶标接合
已经观察到Bmi-1表达在包括胶质母细胞瘤在内的各种人类癌症中得到上调，且已经显示Bmi-1表达是miR-128的靶标。为了证实miR-128的靶标接合，通过qRT-PCR检测用pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128转导的细胞中的Bmi-1表达。结果显示用pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128转导的U87-MG细胞中的Bmi-1表达水平低于未转导细胞，而在HT1080细胞中，被转导细胞与未转导细胞之间没有观察到显著差别。数据支持miR-128在中枢神经系统中扮演重要功能角色的观点。
E.通过免疫印迹测试用pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128转导的细胞中的yCD2表达
为了证实用pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128重组可复制逆转录病毒载体转导的细胞中的yCD2表达，使来自感染后9天的细胞(此时达到最大感染性)繁殖，并进行收集以提取总蛋白用于检测yCD2表达。免疫印迹结果显示与用pAC3-yCD2转导的细胞相比，用pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128转导的HT1080与U87-MG细胞中的yCD2正常表达。
实例13：测试含有miR-128的重组逆转录病毒载体在培养物中的载体稳定 性
测试含有miR-128的重组逆转录病毒载体(pAC3-miR-128-1、pAC3-miR-128-2、pAC3-H1-shRNAmiR128和pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128)的多重连续感染周期以评定载体稳定性。最初用载体以低MOI感染HT1080和U87-MG细胞，并使所述细胞在培养物中传播。收集每个感染周期的载体储液，过滤，稀释以用于感染新鲜细胞。在每个感染周期结束时，收集细胞并提取基因组DNA，以便通过标准PCR使用与env基因的3’和3’LTR上游的载体未翻译区的3’结合的引物来评定转基因稳定性。结果显示测试的所有载体在至少8-20个周期后仍保持稳定。
实例14：在小鼠/人类异种移植物模型中的利用miRNA表达载体的抗肿瘤功 效研究
目标
此项研究的目标在于评定当通过在具有人类神经胶质瘤异种移植物的裸小鼠中以3种Toca 511剂量水平颅内(IC)注射来递送时，携带miR128序列(AC3-miR128-1(V)；AC3-miR128-2(V)；AC3-miR128-3(V))的基于新颖MLV型可复制逆转录病毒载体对存活的影响。
小鼠
雌性无胸腺裸Foxn1^nu(裸)小鼠(约8周大)是从Harlan(Indianapolis IN)获得。小鼠在到达后驯化7天。通过外科手术将留置引导套管安置在小鼠中，所述引导套管具有植入右侧纹状体的3.0mm突出物且配备含有3.5mm突出物的盖子。立体定位坐标是AP＝+0.5mm，ML＝-1.8mm(从前囟开始)。
细胞
U-87MG细胞(ATCC，Manassas VA)来源于44岁高加索女性的恶性神经胶质瘤。将细胞在含有10％胎牛血清、丙酮酸钠和Glutamax(Hyclone，Logan UT和Invitrogen，San Diego CA)的杜贝卡改良伊格氏培养基(Dulbecco’s modified Eagles medium)中培养。将细胞再悬浮于PBS(Hyclone，Logan UT)中以用于植入。通过具有穿过注射套管插入的3.5mm突出物的注射套管以0.2μL/min(5分钟，随后保持5分钟)的速率颅内输注U-87MG细胞(1E5，1μL)。
通过瞬时转染(或从产病毒细胞系，参看临时申请)制备载体制剂，滴度均为约5E6TU/ml。在初始研究中，没有进一步纯化或浓缩载体。在用于测定全剂量反应曲线的跟踪实验中，制备经纯化的高滴度材料，滴度为约10E8/ml。以5μl或以下的体积颅内施用载体，每只小鼠的最小总剂量为约2.5E4TU/小鼠。
肿瘤植入和载体注射
对6组雌性无胸腺裸Foxn1^nu小鼠(65只小鼠，9-10周大)颅内植入U-87肿瘤细胞(第0天)，然后颅内施用(取决于U87细胞的生长速率，第4-7天)运载体(第1组)、施用对照载体(AC3-GFP(V)，第2组)或颅内施用AC3-miR128-1(V)、AC3-miR128-2(V)、AC3-miR128-3(V)(第3-5组)。第6组小鼠没有植入肿瘤或载体。
数据分析
对各自来自第1-6组的10只小鼠执行截止到第60天的存活分析，并绘制成Kaplan Meyer曲线。通过时序检验(log-rank test)来比较存活曲线。＜0.05的P值被视为在所有分析中具有统计显著性，所述分析是用Prism 5统计软件(GraphPad软件)或等效物执行。
来自载体治疗组的结果显示了，与用对照载体或仅用运载体治疗相比，此人类神经胶质瘤异种移植物模型中的统计上显著的存活优势。
实例15：在小鼠/人类异种移植物模型中的利用yCD2和miRNA表达载体的 抗肿瘤功效研究
此项研究的目标在于评定当通过在具有“干细胞”样的富集人类神经胶质瘤异种移植物的裸小鼠中以3种剂量水平颅内(IC)注射来递送时，表达yCD2和miR-128的新颖MLV型可复制逆转录病毒载体(命名为AC3-yCD2-H1-shRNAmiR128(V))对存活的影响。
雌性无胸腺裸Foxn1^nu(裸)小鼠(约8周大)是从Harlan(Indianapolis IN)获得。小鼠在到达后驯化7天。通过外科手术将留置引导套管安置在小鼠中，所述引导套管具有植入右侧纹状体的3.0mm突出物且配备含有3.5mm突出物的盖子。立体定位坐标是AP＝+0.5mm，ML＝-1.8mm(从前囟开始)。
在含有EGF，bFGF and B27培养物的无血清培养基中培养原代人类神经胶质瘤(Carol Kruse博士，Burnham Biomedical Res Inst，San Diego，CA)的早期传代物。将细胞再悬浮于PBS(Hyclone，Logan UT)中以用于植入。通过具有穿过注射套管插入的3.5mm突出物的注射套管以0.2μL/min(5分钟，随后保持5分钟)的速率颅内输注约1000个细胞(1μL)。
通过瞬时转染(或从产病毒细胞系，参看临时申请)制备载体制剂，滴度均为约5E6TU/ml。在初始研究中，没有进一步纯化或浓缩载体。在用于测定全剂量反应曲线的跟踪实验中，制备经纯化的高滴度材料，滴度为约10E8/ml。以5μl或以下的体积颅内施用载体，每只小鼠的最小总剂量为约2.5E4TU/小鼠。
肿瘤植入和载体注射
对6组雌性无胸腺裸Foxn1^nu小鼠(66只小鼠，9-10周大)颅内植入“干细胞样”细胞(第0天)，然后取决于细胞的生长速率，在肿瘤植入后7-14天如下颅内施用：第1组：运载体；第2组：对照载体AC3-GFP(V)；第3组：TOCA511；第4组：AC3-yH1-shRNAmiR128(V)；第5组：AC3-yCD2-H1-shRNAmiR128(V)；和第6组：没有植入肿瘤或载体的未处理小鼠。
数据分析
对各自来自第1-5组的10只小鼠执行截止到第60天的存活分析，并绘制成Kaplan Meyer曲线。通过时序检验来比较存活曲线。＜0.05的P值被视为在所有分析中具有统计显著性，所述分析是用Prism 5统计软件(GraphPad软件)或等效物执行。
结果
来自载体治疗组的结果显示，与用对照载体或仅用运载体治疗相比，此人类神经胶质瘤异种移植物模型中的统计上显著的存活优势。
实例16：构建具有miR靶序列的载体
A.构建表达GFP且含有142-3p靶序列的单拷贝的可复制逆转录病毒载体
编码GFP的可复制逆转录病毒载体pAC3-emd-142-3pT来源于上述(当前现有专利)pAC3-emd的骨架。通过用Not I对pAC3-emd质粒DNA进行核酸内切酶消化来分离pAC3-emd-142-3pT载体中的pAC3-emd骨架。从公开文献(Brown等人，2006 Nature Medicine 12：5585-591)获得miR142-3pT的完全互补靶序列。合成在双链DNA片段的每一端具有Not I限制酶位点的miR-142-3p的靶序列(SEQ ID NO：35)，以用于随后在pAC3-emd质粒DNA中的对应位点插入。通过测序分析来证实142-3pT插入物的定向。所得构建体pAC3-emd-142-3pT编码4种基因gag、pol、env和emd，以及非编码142-3pT序列(图15)。
通过使用磷酸钙方法将载体编码质粒DNA瞬时转染到293T细胞中来制备载体储液。在转染后18小时，用新鲜培养基更换培养物。在培养基更换后24小时，收集含有载体的上清液，将其滤过0.45μm滤器，并立即使用或作为等分试样储存在-80℃下以备随后使用。使用24微升所收集的载体储液来感染人类前列腺癌细胞PC3。在感染后24小时，向细胞中添加AZT以抑制病毒进一步复制。在感染后48小时，提取被感染PC3细胞的基因组DNA以用于滴定分析。利用已知拷贝数的标准物的包涵体，通过qPCR测定载体储液的滴度。
B.构建表达yCD2且含有142-3p靶序列的单拷贝的可复制逆转录病毒载体
编码yCD2基因的可复制逆转录病毒载体pAC3-yCD2-142-3pT来源于上述(当前现有专利)pAC3-yCD2的骨架。通过用Not I对pAC3-yCD2质粒DNA进行核酸内切酶消化来分离pAC3-yCD2-142-3pT载体中的pAC3-yCD2骨架。从公开文献(Brown等人，2006 Nature Medicine 12：5585-591)获得miR142-3pT的完全互补靶序列。合成在双链DNA片段的每一端具有Not I限制酶位点的miR-142-3p的靶序列(SEQ ID NO：35)，以用于随后在pAC3-yCD2质粒DNA中的对应位点插入。所得构建体pAC3-yCD2-142-3pT编码4种基因gag、pol、env和yCD2，以及非编码142-3pT序列(图16)。
通过使用磷酸钙方法将载体编码质粒DNA瞬时转染到293T细胞中来制备载体储液。在转染后18小时，用新鲜培养基更换培养物。在培养基更换后24小时，收集含有载体的上清液，将其滤过0.45μm滤器，并立即使用或作为等分试样储存在-80℃下以备随后使用。使用24微升所收集的载体储液来感染人类前列腺癌细胞PC3。在感染后24小时，向细胞中添加AZT以抑制病毒进一步复制。在感染后48小时，提取被感染PC3细胞的基因组DNA以用于滴定分析。利用已知拷贝数的标准物的包涵体，通过qPCR测定载体储液的滴度。
C.构建表达GFP且含有142-3p靶序列的4个拷贝的可复制逆转录病毒载体
编码GFP的可复制逆转录病毒载体pAC3-emd-142-3pT4X来源于上述(当前现有专利)pAC3-emd的骨架。通过用Not I对pAC3-emd质粒DNA进行核酸内切酶消化来分离pAC3-emd-142-3pT 4X载体中的pAC3-emd骨架。从公开文献(Brown等人，2006 Nature Medicine 12：5 585-591)获得miR142-3pT4X的完全互补靶序列的4个串联重复序列。合成在双链DNA片段的每一端具有Not I限制酶位点的miR-142-3p4X的靶序列(SEQ ID NO：36)，以用于随后在pAC3-emd质粒DNA中的对应位点插入。通过测序分析来确认142-3pT插入物的定向。所得构建体pAC3-emd-142-3pT4X编码4种基因gag、pol、env和emd，以及非编码142-3pT4X序列(图15)。
通过使用磷酸钙方法将载体编码质粒DNA瞬时转染到293T细胞中来制备载体储液。在转染后18小时，用新鲜培养基更换培养物。在培养基更换后24小时，收集含有载体的上清液，将其滤过0.45μm滤器，并立即使用或作为等分试样储存在-80℃下以备随后使用。使用24微升所收集的载体储液来感染人类前列腺癌细胞PC3。在感染后24小时，向细胞中添加AZT以抑制病毒进一步复制。在感染后48小时，提取被感染PC3细胞的基因组DNA以用于滴定分析。利用已知拷贝数的标准物的包涵体，通过qPCR测定载体储液的滴度。
D.构建表达yCD2且含有142-3p靶序列的4个拷贝的可复制逆转录病毒载体
编码GFP的可复制逆转录病毒载体pAC3-yCD2-142-3pT4X来源于上述pAC3-emd的骨架。通过用Not I对pAC3-yCD2质粒DNA进行核酸内切酶消化来分离pAC3-yCD2-142-3pT 4X载体中的pAC3-emd骨架。从公开文献(Brown等人，2006 Nature Medicine 12：5 585-591)获得miR142-3pT4X的完全互补靶序列的4个串联重复序列。合成在双链DNA片段的每一端具有Not I限制酶位点的miR-142-3pT4X的靶序列(SEQ ID NO：36)，以用于随后在pAC3-yCD2质粒DNA中的对应位点插入。通过测序分析来确认142-3pT4X插入物的定向。所得构建体pAC3-emd-142-3pT4X编码4种基因gag、pol、env和emd，以及非编码142-3pT4X序列(图16)。
通过使用磷酸钙方法将载体编码质粒DNA瞬时转染到293T细胞中来制备载体储液。在转染后18小时，用新鲜培养基更换培养物。在培养基更换后24小时，收集含有载体的上清液，将其滤过0.45μm滤器，并立即使用或作为等分试样储存在-80℃下以备随后使用。使用24微升所收集的载体储液来感染人类前列腺癌细胞PC3。在感染后24小时，向细胞中添加AZT以抑制病毒进一步复制。在感染后48小时，提取被感染PC3细胞的基因组DNA以用于滴定分析。利用已知拷贝数的标准物的包涵体，通过qPCR测定载体储液的滴度。
实例17：通过qPCR分析对重组逆转录病毒的复制动力学制图
目前存在至少两种常用方式来获得重组可复制逆转录病毒载体的复制动力学：(1)通过流式细胞分析法来分析表达GFP蛋白的载体的GFP表达，和(2)通过测量从被转导细胞的培养基收集的载体储液的逆转录酶活性来分析逆转录酶。与通过RNA和转基因表达获得的滴度(其中滴度分别被高估和低估)相比，由被转导细胞的DNA分析所评定的滴度提供功能滴度的最可靠的评价(Sastry等人，2002 Gene Therapy 9，1155-1162)。病毒传播的复制动力学与所转导的细胞群体的百分比相关，其中可通过qPCR并利用对培养物中测试的病毒序列具有特异性的引物来检测病毒基因组的被整合前病毒DNA。如果测试复制动力学的比较结果，那么本分析需要在同一载体内和各种载体之间从所有时间点开始输入等量的gDNA。通过以C(t)值的倒数对时间点作图来产生复制动力学图表。图17A和图17A显示各种重组可复制逆转录病毒载体的复制动力学的比较结果。所述分析很容易揭露各种载体的复制动力学的细小差别。
实例18：测试复制动力学
非造血人类细胞系中的含有142-3pT的重组逆转录病毒载体
为了证实在本发明中并入的142-3pT序列与其母体载体类似地复制，使用从上述瞬时转染收集的经计算体积的每种载体储液以0.1的MOI分别感染新鲜人类纤维肉瘤细胞HT1080和人类神经胶质瘤细胞U87-MG。在感染后3、6和9天使被转导细胞传代。在每个时间点，收集一部分细胞进行基因组DNA提取，以便用于qPCR。制备基因组DNA的稀释液以产生在qPCR中的等量基因组输入中具有相同浓度的基因组DNA的等分试样。
通过以C(t)值的倒数对时间点作图来产生每个载体的复制动力学。图17A和图18A显示测试的所有载体以与其母体载体(pAC3-emd和pAC3-yCD2)类似的动力学复制。也通过流式细胞分析法来评定表达GFP蛋白的载体(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT和pAC3-emd-142-3pT4X)的复制动力学。图3B和图4B显示pAC3-emd-142-3pT和pAC3-emd-142-3pT4X载体以与其母体载体pAC3-emd类似的动力学复制。
测试含有142-3pT的重组逆转录病毒载体在人类和小鼠造血细胞中的复制动力学
通过Taqman微小RNA分析，使用对小鼠和人类miR-142-3p具有特异性的引物组(因为这两种物种的成熟miR-142-3p的序列是相同的)，首先确定小鼠T淋巴细胞系EL4、人类T淋巴细胞系SUP-T1和人类单核细胞系U937中的成熟miR-142-3p表达。在以2的MOI初始感染的所有三种细胞系中测试表达GFP的重组逆转录病毒载体的复制动力学。图19显示pAC3-emd载体在人类T淋巴细胞和单核细胞(SUP-T1和U937)中有效地复制，因为病毒传播截止到感染后28天分别达到细胞群体的65％和95％。EL4细胞中的载体传播在所测试的时间范围期间保持小于5％。
实例18：测试含有142-3pT的重组逆转录病毒载体在人类和小鼠造血细胞 中的载体传播
通过流式细胞分析法测试在表达GFP的重组逆转录病毒载体中miR-142-3p对于抑制GFP表达的功能作用。使用从上述瞬时转染收集的经计算体积的pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT和pAC3-emd-142-3pT4X载体储液以2的MOI感染新鲜EL4、SUP-T1和U937细胞。在感染后第6、12和18天收集一部分细胞，以用于通过流式细胞分析法分析GFP表达。图20A显示与母体载体pAC3-emd相比，用pAC3-emd-142-3pT和pAC3-emd-142-3pT4X载体转导的EL4细胞中的GFP表达被抑制到背景水平。GFP抑制作用在所测试的时间范围内持久保持。图20B和图20C显示与母体载体pAC3-emd相比，分别用pAC3-emd-142-3pT和pAC3-emd-142-3pT4X载体转导的SUP-T1和U937细胞中的GFP表达被显著抑制。结果证实小鼠和人类造血细胞中的miR-142-3p表达有效地抑制被含有142-3pT序列的重组逆转录病毒载体转导的细胞中的GFP表达。在U937细胞中，结果表明含有4个142-3pT拷贝的载体(pAC3-emd-142-3pT4X)可比含有单个142-3pT拷贝的载体(pAC3-emd-142-3pT4X)更有效地抑制GFP表达。
实例19：测试病毒RNA基因组
尚不清楚miR-142-3pT抑制上述GFP表达的功能作用是因为在翻译水平直接抑制GFP表达还是因为在转录后水平降解病毒基因组。在实验时间点最后收集一部分细胞，以便使用标准分子生物学方法提取总RNA。使用对来源于逆转录病毒RNAd的cDNA具有特异性的引物(例如pol引物组和env2引物组)进行qRT-PCR以评定被转导细胞的病毒负荷。结果显示分别用pAC3-emd-142-3pT和pAC3-emd-142-3pT4X转导的细胞的病毒负荷显著低于用pAC3-emd载体转导的细胞。结果支持以下观点：小鼠和人类造血细胞中的miR-142-3p在转录后水平有效地降解病毒RNA基因组，从而限制小鼠和人类造血细胞中的载体传播。
实20：通过qPCR测试整合的前病毒DNA
尚不清楚miR-142-3pT抑制上述GFP表达的功能作用是因为在翻译水平直接抑制GFP表达还是因为降解病毒基因组和因此整合前病毒DNA。在实验时间点最后收集一部分细胞，以便使用标准分子生物学方法提取基因组DNA。使用对整合的前病毒DNA具有特异性的引物进行qPCR以评定每个细胞中整合的前病毒DNA的拷贝数。结果显示分别用pAC3-emd-142-3pT和pAC3-emd-142-3pT4X转导的细胞的每个细胞的拷贝数显著低于用pAC3-emd载体转导的细胞。结果支持以下观点：小鼠和人类造血细胞中的miR-142-3p在转录后水平有效地降解病毒RNA基因组，从而限制小鼠和人类造血细胞中的载体传播。
实例21：测试含有142-3pT的重组逆转录病毒载体在培养物中的载体稳定 性
测试含有142-3pT的重组逆转录病毒载体的多重连续感染周期以评定载体稳定性。最初用载体以低MOI感染HT1080和U87-MG细胞，并使所述细胞在培养物中传播。收集每个感染周期的载体储液，过滤，稀释以用于感染新鲜细胞。在每个感染周期结束时，收集细胞并提取基因组DNA，以便通过标准PCR使用与env基因的3’和的载体中连接于IRES的异源多聚核苷酸序列下游的未翻译区的3’结合的引物来评定转基因稳定性。结果显示含有142-3pT单拷贝的载体(pAC3-emd-142-3pT和pAC3-yCD2-142-3pT)在至少10-20个周期后仍保持稳定，而含有142-3pT的4个串联重复序列的载体(pAC3-emd-142-3pT4X和pAC3-yCD2-142-3pT4X)显示在早期感染周期中142-3pT序列的缺失。
实例22：测试含有142-3pT的重组逆转录病毒载体在体内的受控载体传播
此实验是用与以下实施例27相同的设计来进行。通过在植入有U87异种移植物的8周大的裸Balb/C小鼠中静脉内注射重组逆转录病毒载体(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT和pAC3-emd-142-3pT4X)来体内测试miR-142-3p限制病毒经由造血细胞传播的功能作用。每种载体存在3组小鼠，各自代表1个时间点(例如在病毒载体施用后30天、60天和90天)。通过静脉内注射对所有动物施用1E4到1E7TU剂量的每种载体储液。处死来自每个时间点的动物以收集脾、淋巴结和骨髓和肿瘤。收集细胞子群(例如CD4+、CD8+等)的GFP表达并通过流式细胞分析法进行分析。在双重复实验中，处死来自每个时间点的动物并收集组织(例如肝、肾、脾、肿瘤等)以用于基因组DNA提取。进行qPCR以评定所收集的组织中被整合的前病毒DNA的存在情况。结果显示含有142-3pT的载体的载体传播在造血组织中显著减少，从而证明载体复制在这些组织中减少。同时，在肿瘤仍然观察到GFP和PCR信号，显示miR靶序列在淋巴样组织中的传播减少，但仍显示在肿瘤组织中的传播。
实施例23.具有自发复发恶性神经胶质瘤并用T5.0002载体加5-FC处理的 病患狗中的延长存活
用T5.0002病毒(经纯化且在与甘露醇和蔗糖等张的等张Tris/NaCl pH7.2、1mg/ml HSA、0.1mg/ml抗坏血酸盐中配制(参看US 5792643；T.Rodriugez等人J Gene Med 9：2332007；美国申请61218063))结合5-FC处理在完全外科切除后3个月出现复发性间变性少突胶质细胞瘤的雄性35kg拳师犬(Boxer dog)。肿瘤为约13cm3，且引起严重侧脑室挤压和显著的中线偏移(参看图1)。由于肿瘤尺寸较大，通过2个独立导管(400μL和480μL)使用增强对流递送(Convection Enhanced Delivery；CED)来输注Toca 511。施用的总Toca 511剂量为每克脑约4.1×106TU。在注射前将ProHance
Figure BPA00001374548000931
(钆特醇(gadoteridol))添加到Toca 511中以允许通过MRI来可视化递送。载体的分布体积据估计为肿瘤体积的约10-12％。
图21A和图21B是在肿瘤内CED输注Toca 511和钆期间从病患狗获得的MRI影像的静止帧。应注意影像左侧的大肿瘤挤压脑的两侧并使中线结构向右位移。白色区域是钆-Toca 511输注物。图21B显示在肿瘤中安置两个导管。
使Toca 511传播8天。以130mg/kg/天的分剂量(每天三次，和食物一起，)用5-FC经口处理狗持续5天。在接下来的2天将剂量增加到160mg/kg/天(5-FC总共持续7天)。跟踪MRI显示肿瘤尺寸无变化且肿瘤内部区域有一些可能的变化。在病毒传播21天后，用160mg/kg/天的较高剂量(分剂量，每天三次，和食物一起)开始5-FC的第二个周期。由于在施用第5天出现了皮疹，停止给药。
在5-FC的第一疗程后第2周和5-FC的第二疗程后第2周(在治疗开始后第7周)进行的MRI显示肿瘤体积达到稳定水平，而肿瘤生长速率则下降。患者变得更为警惕和活跃，且在载体注射后13周仍保持临床稳定。直到记录时狗仍然存活。狗的估计寿命从初次注射载体算起不超过3-4周。根据存活期是主治兽医最初估计的3到4倍，显示了Toca 511/5-FC组合在所述病患狗中的功效。
实施例24.构建γ干扰素载体
构建和测试编码人类IFN-γ基因的可复制逆转录病毒载体
编码人类IFN-γ基因的可复制逆转录病毒载体pAC3-hIFNg来源于上述pAC3-yCD2的骨架。通过用Psi I和Not I对pAC3-yCD2质粒DNA进行核酸内切酶消化来分离pAC3-hIFNg载体中的pAC3骨架。在从不同登记号(AM903379、BC070256和NM000619)获得的三种序列中鉴别和确定人类IFN-γ基因的cDNA序列。序列比对显示这三种序列中的相同序列。合成在DNA片段的每一端具有Psi I和Not I限制酶位点的人类IFN-γ的开放阅读框(SEQ ID NO：38)，以用于随后在pAC3骨架中的对应位点插入。所得构建体pAC3-hIFNg编码4种基因：gag、pol、env和人类IFN-γ(图22)。
通过使用FUGENE HD转染试剂将载体编码质粒DNA瞬时转染到HT1080细胞中来制备载体储液。在转染后48小时，收集含有载体的上清液，将其滤过0.45μm滤器，并立即使用或作为等分试样储存在-80℃下以备随后使用。使用特定体积的未稀释载体储液来感染新鲜的75％融合HT1080。在感染后第4天和第5天，收集含有载体的上清液，将其滤过0.45μm滤器，并立即使用或作为等分试样储存在-80℃下以备随后使用。使用24微升所收集的载体储液来感染人类前列腺癌细胞PC3。在感染后24小时，向细胞中添加AZT以抑制病毒进一步复制。在感染后48小时，提取被感染PC3细胞的基因组DNA以用于滴定分析。利用已知拷贝数的标准物的包涵体，通过qPCR测定载体储液的滴度。
首先测试RNA水平上的人类IFN-γ表达。在感染后第5天，在第二次感染中，使用标准RNA提取方法从被转导HT1080细胞中提取总RNA。进行RT-PCR以检测人类IFN-γ表达。在RT反应中使用50ng总RNA来产生cDNA。随后将1/10体积的RT反应物用于PCR，所述PCR使用对人类IFN-γ具有特异性的PCR引物组。RT-PCR结果显示人类IFN-γ在用pAC3-hIFNg载体感染的HT1080细胞中发生表达。
通过标准ELISA测试分泌的人类IFN-γ蛋白的表达。在ELISA分析中连续稀释从感染后第4天和第5天收集的载体储液，以便获得蛋白浓度与稀释因子之间的线性范围。结果显示感染后第5天HT1080细胞所分泌的人类IFN-γ蛋白的浓度高于感染后第4天细胞所分泌的蛋白浓度(图24)。感染后第5天细胞分泌约325-355pg/mL人类IFN-γ蛋白。
构建和测试编码小鼠IFN-γ基因的可复制逆转录病毒载体
编码小鼠IFN-γ基因的可复制逆转录病毒载体pAC3-mIFNg来源于上述pAC3-yCD2的骨架。通过用Psi I和Not I对pAC3-yCD2质粒DNA进行核酸内切酶消化来分离pAC3-mIFNg载体中的pAC3骨架。在从不同登记号(BC119063、BC119065和NM008337)获得的三种序列中鉴别和确定小鼠IFN-γ基因的cDNA序列。序列比对显示这三种序列中的相同序列。合成在DNA片段的每一端具有Psi I和Not I限制酶位点的小鼠IFN-γ的开放阅读框(SEQ ID NO：39)，以用于随后在pAC3骨架中的对应位点插入。所得构建体pAC3-mIFNg编码4种基因：gag、pol、env和小鼠IFN-γ(图22)。
通过使用FUGENE HD转染试剂将载体编码质粒DNA瞬时转染到HT1080细胞中来制备载体储液。在转染后48小时，收集含有载体的上清液，将其滤过0.45微米滤器，并立即使用或作为等分试样储存在-80℃下以备随后使用。使用特定体积的未稀释载体储液来感染新鲜的75％融合HT1080。在感染后第4天和第5天，收集含有载体的上清液，将其滤过0.45微米滤器，并立即使用或作为等分试样储存在-80℃下以备随后使用。使用24微升所收集的载体储液来感染人类前列腺癌细胞PC3。在感染后24小时，向细胞中添加AZT以抑制病毒进一步复制。在感染后48小时，提取被感染PC3细胞的基因组DNA以用于滴定分析。利用已知拷贝数的标准物的包涵体，通过qPCR测定载体储液的滴度。
首先测试RNA水平上的小鼠IFN-γ表达。在感染后第5天，在第二次感染中，使用标准RNA提取方法从被转导HT1080细胞中提取总RNA。进行RT-PCR以检测小鼠IFN-γ表达。在RT反应中使用50ng总RNA来产生cDNA。随后将1/10体积的RT反应物用于PCR，所述PCR使用对小鼠IFN-γ具有特异性的PCR引物组(图23)。RT-PCR结果显示小鼠IFN-γ在用pAC3-mIFNg载体感染的HT1080细胞中发生表达。
通过标准ELISA测试分泌的人类IFN-γ蛋白的表达。在ELISA分析中连续稀释从感染后第4天和第5天收集的载体储液，以便获得蛋白浓度与稀释因子之间的线性范围。结果显示感染后第5天HT1080细胞所分泌的小鼠IFN-γ蛋白的浓度高于感染后第4天细胞所分泌的蛋白浓度(图25)。感染后第5天细胞分泌约33-42ng/mL小鼠IFN-γ蛋白。
实施例25实施例D：在小鼠皮下肿瘤模型中的利用γ干扰素表达载体的抗 肿瘤功效研究
目标
此项研究的目标在于评定当通过在具有皮下结肠癌(CT26.WT)的BALB/c小鼠中经由肿瘤内(IT)注射来递送时，携带鼠类γ干扰素序列(pAC3-mIFNg)的基于新颖MLV的可复制逆转录病毒载体对肿瘤生长的影响。
小鼠
雌性BALB/c小鼠(～8周大)是从Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)购得。小鼠在到达后驯化7天，随后开始研究。
细胞
CT26.WT细胞(ATCC，Manassas VA)是经N-亚硝基-N-甲基氨基甲酸乙酯(NNMU)诱导的未分化结肠癌细胞系。将细胞在含有10％胎牛血清、丙酮酸钠和Glutamax(Hyclone，Logan UT和Invitrogen，San Diego CA)的杜贝卡改良伊格氏培养基中培养。将细胞再悬浮于PBS(Hyclone，Logan UT)中以用于植入。将CT26.WT细胞(2E5，100μL)注入BALB/c小鼠的右肋。
载体
通过瞬时转染(或来自用来自初始转染的感染病毒感染另一种细胞系后的生产细胞系)制备载体制剂，滴度为约3E6TU/ml。在初始研究中，没有进一步纯化或浓缩载体。在用于测定全剂量反应曲线的跟踪实验中，制备经纯化的高滴度材料，滴度预期为约10E8/ml。为了获得高滴度物质，选择犬细胞系CF2用于制备，因为γ干扰素的跨物种反应性很低，且使用异种细胞系可预防γ干扰素对生产细胞的抑制作用。如本说明书中所述对载体进行纯化和浓缩。载体以100μL体积肿瘤内施用，每只小鼠的总剂量为约3E3、3E4和3E5TU/小鼠。将表达γ干扰素的载体标示为Toca 621。
肿瘤植入和载体注射
对9组雌性BALB/c(99只小鼠，9-10周大)皮下植入CT26.WT肿瘤细胞(第0天)，然后施用(第4-7天，取决于CT26肿瘤的生长速率，约50-100mm3)运载体(第1组)、对照载体[AC3-GFP(V)](第2组)、肿瘤内Toca 621载体注射液(第3-5组)或静脉内Toca 621载体注射液(第6-8组)。第9组小鼠没有植入肿瘤，且只静脉内注射载体。
数据分析
执行肿瘤生长分析直到2000mm3或第60天，这要依据哪种情况先发生。将来自每组的10只小鼠的肿瘤尺寸与时间作图。使用方差分析(ANOVA)来确定统计显著性。＜0.05的P值被视为在所有分析中具有统计显著性，所述分析是用Prism 5统计软件(GraphPad软件)或等效物执行。还采用生活观察以评定Toca 621施用的任何不利事件。
结果
随时间的肿瘤尺寸测量结果显示用表达γIFN的载体处理的肿瘤的生长与接受对照载体或运载体的动物体内的肿瘤的生长存在统计上显著的差异。
实施例26实施例D：在小鼠皮下肿瘤模型中的利用γ干扰素表达载体的抗肿瘤功效研究
目标
此项研究的目标在于评定当通过在具有皮下结肠癌(CT26.WT)的BALB/c小鼠中经由肿瘤内(IT)注射来递送时，携带鼠类γ干扰素序列(pAC3-mIFNg)的新颖MLV型可复制逆转录病毒载体对肿瘤生长的影响。
小鼠
雌性BALB/c小鼠(～8周大)是从Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)购得。小鼠在到达后驯化7天，随后开始研究。
细胞
CT26.WT细胞(ATCC，Manassas VA)是经N-亚硝基-N-甲基氨基甲酸乙酯(NNMU)诱导的未分化结肠癌细胞系。将细胞在含有10％胎牛血清、丙酮酸钠和Glutamax(Hyclone，Logan UT和Invitrogen，San Diego CA)的杜贝卡改良伊格氏培养基中培养。将细胞再悬浮于PBS(Hyclone，Logan UT)中以用于植入。将CT26.WT细胞(2E5，100μL)注入BALB/c小鼠的右肋。
载体
通过瞬时转染(或从经具有来自初始转染的感染病毒的另一种细胞系感染的产病毒细胞系)制备载体制剂，滴度为约3E6TU/ml。在初始研究中，没有进一步纯化或浓缩载体。在用于测定全剂量反应曲线的跟踪实验中，制备经纯化的高滴度材料，滴度预期为约10E8/ml。为了获得高滴度物质，选择犬细胞系CF2用于制备，因为γ干扰素的跨物种反应性很低，且使用异种细胞系可预防γ干扰素对产生细胞的抑制作用。如本说明书中所述对载体进行纯化和浓缩。载体以100μL体积肿瘤内施用，每只小鼠的总剂量为约3E3、3E4和3E5TU/小鼠。将表达γ干扰素的载体标示为Toca 621。
肿瘤植入和载体注射
对9组雌性BALB/c(99只小鼠，9-10周大)皮下植入CT26.WT肿瘤细胞(第0天)，然后施用(第4-7天，取决于CT26肿瘤的生长速率，约50-100mm3)运载体(第1组)、对照载体[AC3-GFP(V)](第2组)、肿瘤内Toca 621载体注射液(第3-5组)或静脉内Toca 621载体注射液(第6-8组)。第9组小鼠没有植入肿瘤，且只静脉内注射载体。
数据分析
执行肿瘤生长分析直到2000mm3或第60天，这要依据哪种情况先发生。将来自每组的10只小鼠的肿瘤尺寸与时间作图。使用方差分析(ANOVA)来确定统计显著性。＜0.05的P值被视为在所有分析中具有统计显著性，所述分析是用Prism 5统计软件(GraphPad软件)或等效物执行。还采用生活观察以评定Toca 621施用的任何不利事件。
结果
随时间的肿瘤尺寸测量结果显示用表达γIFN的载体处理的肿瘤的生长与接受对照载体或运载体的动物体内的肿瘤的生长存在统计上显著的差异。
实施例27使用复制性逆转录病毒载体的静脉内基因递送
目标
此项研究的目标在于评定静脉内递送携带标志绿色荧光蛋白(AC3-GFP(V))的新颖MLV型可复制逆转录病毒载体对植入裸小鼠脑内的U87神经胶质瘤的作用。
小鼠
雌性无胸腺裸Foxn1^nu(裸)小鼠(约8周大)是从Harlan(Indianapolis IN)获得。小鼠在到达后驯化7天。通过外科手术将留置引导套管安置在小鼠中，所述引导套管具有植入右侧纹状体的3.0mm突出物且配备含有3.5mm突出物的盖子。立体定位坐标是AP＝+0.5mm，ML＝-1.8mm(从前囟开始)。
细胞
U-87MG细胞(ATCC，Manassas VA)来源于44岁高加索女性的恶性神经胶质瘤。将细胞在含有10％胎牛血清、丙酮酸钠和Glutamax(Hyclone，Logan UT和Invitrogen，San Diego CA)的杜贝卡改良伊格氏培养基(Dulbecco’s modified Eagles medium)中培养。将细胞再悬浮于PBS(Hyclone，Logan UT)中以用于植入。通过具有穿过注射套管插入的3.5mm突出物的注射套管以0.2μL/min(5分钟，随后保持5分钟)的速率颅内(IC)输注U-87MG细胞(1E5，1μL)。
载体
通过瞬时转染制备载体制剂，其滴度均为约2.8E7TU/ml。以5μl或以下的体积肿瘤内(IT)施用载体，每只小鼠的最小总剂量为约1.4E45TU/小鼠。通过尾部静脉来静脉内注射2.8E6/100μL。
肿瘤植入和载体注射
对5组雌性无胸腺裸Foxn1^nu小鼠(16只小鼠，9-10周大)颅内植入U-87肿瘤细胞(第0天)，然后肿瘤内或静脉内施用以下物质(第4-7天，取决于U87肿瘤的生长速率)：运载体(静脉内)(第1组)、载体(静脉内)(第2组)、血脑屏障破坏物伐地那非(Vardenafil)和载体(肿瘤内)(第3组)、伐地那非和载体(肿瘤内)(第4组)或载体(肿瘤内)(第5组)。在载体注射后14天处死小鼠并分离肿瘤，且分析肿瘤中的GFP表达。
数据分析
通过流式细胞术分析从第2-5组小鼠分离的被破坏肿瘤的U87细胞的GFP阳性百分比(图26)。也对第1、3和5组进行直方图分析以测量所分离的U87细胞中的GFP信号分布(图27)。
结果
静脉内递送GFP与在颅内植入裸小鼠中的U87神经胶质瘤细胞中肿瘤内注射同样有效。
实施例28构建编码人类IL-2基因的可复制逆转录病毒载体
编码人类IL2基因的可复制逆转录病毒载体pAC3-hIL2来源于上述pAC3-yCD2的骨架。通过用Psi I和Not I对pAC3-yCD2质粒DNA进行核酸内切酶消化来分离pAC3-hIL2载体编码质粒DNA中的pAC3骨架。使用从不同登记号(BC066255和BC066257)获得的序列鉴别和确定人类IFN-γ基因的cDNA序列。这两种序列的序列比对揭露相同序列。合成在DNA片段的每一端具有Psi I和Not I限制酶位点的人类IFN-γ的开放阅读框(SEQ ID NO：40)，以用于随后在pAC3骨架中的对应位点插入。所得构建体pAC3-hIL2编码4种基因：gag、pol、env和人类IL2(图28)。
通过使用磷酸钙方法将载体编码质粒DNA瞬时转染到293T细胞中来产生载体储液。在转染后18小时，用新鲜培养基更换培养物。在培养基更换后24小时，收集含有载体的上清液，将其滤过0.45μm滤器，并立即使用或作为等分试样储存在-80℃下以备随后使用。使用24微升所收集的载体储液来感染人类前列腺癌细胞PC3。在感染后24小时，向细胞中添加AZT以抑制病毒进一步复制。在感染后48小时，提取被感染PC3细胞的基因组DNA以用于滴定分析。利用已知拷贝数的标准物的包涵体，通过qPCR测定载体储液的滴度。
首先测试RNA水平上的人类IL-2表达。在感染后第5天，使用标准RNA提取方法从被转导的CF2TH和HT1080细胞提取总RNA。进行RT-PCR以检测人类IL-2表达。在RT反应中使用50ng总RNA来产生cDNA。随后将1/10体积的RT反应物用于PCR，所述PCR使用对人类IL-2具有特异性的PCR引物组。RT-PCR结果显示人类IL-2在用pAC3-hIL2载体转导的HT1080细胞中发生表达。
通过标准ELISA测试分泌的人类IL-2蛋白的表达。在ELISA分析中连续稀释从感染后第5天收集的载体储液，以便获得蛋白浓度与稀释因子之间的线性范围。结果显示在感染后第5天CF2TH细胞所分泌的人类IL-2蛋白的浓度高于HT1080。
实施例29在小鼠皮下肿瘤模型中的利用白细胞介素2表达载体的抗肿瘤 功效研究
目标
此项研究的目标在于评定当通过在具有皮下结肠癌(CT26.WT)的BALB/c小鼠中经由肿瘤内(IT)注射来递送时，携带鼠类白细胞营养激素白细胞介素2(IL-2)序列(pAC3-mIL2)的新颖MLV型可复制逆转录病毒载体对肿瘤生长的影响。
小鼠
雌性BALB/c小鼠(～8周大)是从Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)购得。小鼠在到达后驯化7天，随后开始研究。
细胞
CT26.WT细胞(ATCC，Manassas VA)是经N-亚硝基-N-甲基氨基甲酸乙酯(NNMU)诱导的未分化结肠癌细胞系。将细胞在含有10％胎牛血清、丙酮酸钠和Glutamax(Hyclone，Logan UT和Invitrogen，San Diego CA)的杜贝卡改良伊格氏培养基中培养。将细胞再悬浮于PBS(Hyclone，Logan UT)中以用于植入。将CT26.WT细胞(2E5，100μL)注入BALB/c小鼠的右肋。
载体
通过瞬时转染(或从产病毒细胞系，参看临时申请)制备载体制剂，滴度为约6E6TU/ml。在初始研究中，没有进一步纯化或浓缩载体。在用于测定全剂量反应曲线的跟踪实验中，制备经纯化的高滴度材料，滴度预期为约10E8/ml。载体以100μL体积肿瘤内施用，每只小鼠的总剂量为约6E5TU/小鼠。将表达γ干扰素的载体标示为Toca IL2。
肿瘤植入和载体注射
对5组雌性BALB/c(55只小鼠，9-10周大)皮下植入CT26.WT肿瘤细胞(第0天)，然后施用(第4-7天，取决于CT26肿瘤的生长速率，约50-100mm3)运载体(第1组)、对照载体[AC3-GFP(V)](第2组)、肿瘤内Toca IL2载体注射液(第3组)或静脉内Toca IL2载体注射液(第4组)。第5组小鼠没有植入肿瘤，且只静脉内注射载体。
数据分析
执行肿瘤生长分析直到2000mm3或第60天，这要依据哪种情况先发生。将来自每组的10只小鼠的肿瘤尺寸与时间作图。使用方差分析(ANOVA)来确定统计显著性。＜0.05的P值被视为在所有分析中具有统计显著性，所述分析是用Prism 5统计软件(GraphPad软件)或等效物执行。还采用生活观察以评定治疗期间IL-2表达的任何不利事件。
结果
通过复制MLV递送IL-2会减少且在一些情况下清除BALB/c CT26小鼠模型的肿瘤负荷。
已经描述了许多本公开书的实施方案。然而，应了解可在不偏离本公开书的精神和范围的情况下进行各种修改。因此，其它实施方案属于以下权利要求书的范围内。
Figure IPA00001374547400011
Figure IPA00001374547400021
Figure IPA00001374547400031
Figure IPA00001374547400041
Figure IPA00001374547400051
Figure IPA00001374547400061
Figure IPA00001374547400071
Figure IPA00001374547400081
Figure IPA00001374547400091
Figure IPA00001374547400121
Figure IPA00001374547400151
Figure IPA00001374547400161
Figure IPA00001374547400171
Figure IPA00001374547400181
Figure IPA00001374547400191
Figure IPA00001374547400201
Figure IPA00001374547400211
Figure IPA00001374547400221
Figure IPA00001374547400231
Figure IPA00001374547400241
Figure IPA00001374547400271
Figure IPA00001374547400301
Figure IPA00001374547400311
Figure IPA00001374547400341
Figure IPA00001374547400351
Figure IPA00001374547400371
Figure IPA00001374547400381
Figure IPA00001374547400391
Figure IPA00001374547400401
Figure IPA00001374547400411
Figure IPA00001374547400421
Figure IPA00001374547400431
Figure IPA00001374547400451
Figure IPA00001374547400461
Figure IPA00001374547400471
Figure IPA00001374547400481
Figure IPA00001374547400491
Figure IPA00001374547400501
Figure IPA00001374547400511
Figure IPA00001374547400521
Figure IPA00001374547400531
Figure IPA00001374547400541
Figure IPA00001374547400551
Figure IPA00001374547400571
Figure IPA00001374547400581
Figure IPA00001374547400591
Figure IPA00001374547400601
Figure IPA00001374547400621
Figure IPA00001374547400631
Figure IPA00001374547400651
Figure IPA00001374547400661
Figure IPA00001374547400671
Figure IPA00001374547400691
Figure IPA00001374547400701
Figure IPA00001374547400711

Claims (79)

1.一种重组可复制逆转录病毒(RCR)，其包含：
逆转录病毒GAG蛋白；
逆转录病毒POL蛋白；
逆转录病毒包膜；
逆转录病毒多聚核苷酸，其包含：在所述逆转录病毒多聚核苷酸序列的3’端的长末端重复(LTR)序列、在所述逆转录病毒多聚核苷酸的5’端的启动子序列、gag核酸域、pol核酸域和env核酸域，所述启动子适合在哺乳动物细胞中表达；
包含可操作地连接于异源多聚核苷酸的内部核糖体进入位点(IRES)的盒，其中所述盒位于所述3’LTR的5’和编码所述逆转录病毒包膜的所述env核酸域的3’；和
在靶细胞中逆转录、包装和整合所必需的顺式作用序列，
其中与包含SEQ ID NO：21的载体(pACE)相比，所述RCR在6次传代后保持较高的复制能力。
2.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述逆转录病毒多聚核苷酸序列来源于鼠白血病病毒(MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、猫白血病病毒(FeLV)或长臂猿白血病病毒(GALV)。
3.根据权利要求1或2所述的逆转录病毒，其中所述MLV是双嗜性MLV。
4.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述逆转录病毒是γ逆转录病毒。
5.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述靶细胞是具有细胞增殖失调的细胞。
6.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述靶细胞是赘生性细胞。
7.根据权利要求5所述的逆转录病毒，其中所述细胞增殖失调选自由肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、黑素瘤、胃癌和卵巢癌、类风湿性关节炎或其它自身免疫疾病组成的组。
8.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述启动子序列与生长调节基因关联。
9.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述启动子序列包括组织特异性启动子序列。
10.根据权利要求9所述的逆转录病毒，其中所述组织特异性启动子序列包含至少一个雄激素反应元件(ARE)。
11.根据权利要求10所述的逆转录病毒，其中所述雄激素反应元件来源于前列腺碱性蛋白(probasin)启动子。
12.根据权利要求9所述的逆转录病毒，其中所述组织特异性启动子序列包括前列腺碱性蛋白启动子。
13.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述启动子包括具有如SEQ ID NO：19、20或22的核苷酸1到约核苷酸582所述的序列的CMV启动子，且可包含对一个或多个核酸碱基的修饰，所述启动子能引导和起始转录。
14.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述启动子包括如SEQ ID NO：19、20或22的核苷酸1到约核苷酸582所述的序列。
15.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述启动子包括CMV-R-U5域多聚核苷酸。
16.根据权利要求15所述的逆转录病毒，其中所述CMV-R-U5域包括与MLV R-U5区域连接的来自人类巨细胞病毒的立即早期启动子。
17.根据权利要求16所述的逆转录病毒，其中所述CMV-R-U5域多聚核苷酸包括如SEQ ID NO：19、20或22的约核苷酸1到约核苷酸1202所述的序列，或与如SEQ ID NO：19、20或22所述的序列具有至少95％同一性的序列，其中所述多聚核苷酸促进与其可操作地连接的核酸分子的转录。
18.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述gag多聚核苷酸来源于γ逆转录病毒。
19.根据权利要求18所述的逆转录病毒，其中所述gag核酸域包括SEQ ID NO：19或22的约核苷酸编号1203到约核苷酸2819的序列，或与其具有至少95％、98％、99％或99.8％同一性的序列。
20.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述多聚核苷酸的pol域来源于γ逆转录病毒。
21.根据权利要求20所述的逆转录病毒，其中所述pol域包括SEQ ID NO：19或22的约核苷酸编号2820到约核苷酸6358的序列，或与其具有至少95％、98％、99％或99.9％同一性的序列。
22.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述env域包括SEQ ID NO：19或22的约核苷酸编号6359到约核苷酸8323的序列，或与其具有至少95％、98％、99％或99.8％同一性的序列。
23.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述IRES来源于脑心肌炎病毒。
24.根据权利要求23所述的逆转录病毒，其中所述IRES包括SEQ ID NO：19或22的约核苷酸编号8327到约核苷酸8876的序列，或与其具有至少95％、98％或99％同一性的序列。
25.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述异源核酸包括具有如SEQ ID NO：3、5、11、13、15或17所述的序列的多聚核苷酸。
26.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述异源核酸编码包括如SEQ ID NO：4所述的序列的多肽。
27.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述异源核酸是经人类密码子优化的且编码如SEQ ID NO：4所述的多肽。
28.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述异源核酸包括如SEQ ID NO：19或22的约核苷酸编号8877到约9353所述的序列。
29.根据权利要求28所述的逆转录病毒，其中所述3’LTR来源于γ逆转录病毒。
30.根据权利要求29所述的逆转录病毒，其中所述3’LTR包括U3-R-U5域。
31.根据权利要求29所述的逆转录病毒，其中所述3’LTR包括如SEQ ID NO：19或22的约核苷酸9405到约9998所述的序列，或与其具有至少95％、98％或99.5％同一性的序列。
32.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述逆转录病毒多聚核苷酸包括如SEQ ID NO：19、20或22所述的序列。
33.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述异源核酸序列编码生物反应调节剂。
34.根据权利要求33所述的逆转录病毒，其中所述生物反应调节剂包括免疫增强细胞因子。
35.根据权利要求34所述的逆转录病毒，其中所述免疫增强细胞因子选自由白细胞介素1到15、干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)组成的组。
36.根据权利要求34所述的逆转录病毒，其中所述免疫增强细胞因子是干扰素。
37.根据权利要求36所述的逆转录病毒，其中所述干扰素是γ干扰素。
38.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述异源核酸编码将非毒性前药转化为毒性药物的多肽。
39.根据权利要求38所述的逆转录病毒，其中将非毒性前药转化为毒性药物的所述多肽是胸苷激酶、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)或胞嘧啶脱氨酶。
40.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述异源核酸序列编码靶向部分。
41.根据权利要求40所述的逆转录病毒，其中所述靶向部分包括癌抗原。
42.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述异源核酸序列编码结合域。
43.根据权利要求42所述的逆转录病毒，其中所述结合域包括受体域、抗体或抗体片段。
44.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述异源核酸序列包括抑制性多聚核苷酸。
45.根据权利要求44所述的逆转录病毒，其中所述抑制性多聚核苷酸包括RNAi或siRNA序列。
46.一种分离的多聚核苷酸，其从5’到3’包含：
人类巨细胞病毒的立即早期启动子与MLV R-U5区的CMV-R-U5融合体；
PBS，即逆转录酶的引物结合位点；
5’剪接位点；
Ψ包装信号；
MLV群特异性抗原的gag编码序列；
MLV聚合酶多聚蛋白的pol编码序列；
3’剪接位点；
MLV品系4070A的包膜蛋白的4070A env编码序列；
脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(IRES)；
其中所述4070A env编码序列和所述IRES包括SEQ ID NO：19或22的约核苷酸编号6359到约核苷酸8876的序列，或与其具有至少95％、98％或99％同一性的序列；
异源核酸序列；
聚嘌呤束；和
U3-R-U5 MLV长末端重复。
47.根据权利要求46所述的多聚核苷酸，其中所述逆转录病毒多聚核苷酸包括如SEQ ID NO：19、20或22所述的序列。
48.根据权利要求46所述的多聚核苷酸，其中所述逆转录病毒多聚核苷酸序列来源于鼠白血病病毒(MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、猫白血病病毒(FeLV)或长臂猿白血病病毒(GALV)。
49.根据权利要求48所述的多聚核苷酸，其中所述MoMLV是双嗜性MoMLV。
50.一种治疗患有细胞增殖失调的受试对象的方法，其包括使所述受试对象与根据权利要求1或46所述的多聚核苷酸在允许所述多聚核苷酸表达的条件下接触，和使所述受试对象与5-氟胞嘧啶接触。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述多聚核苷酸整合到所述受试对象的细胞中。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述多聚核苷酸通过逆转录病毒载体递送。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述逆转录病毒载体包含如SEQ ID NO：19、20或22所述的序列。
54.根据权利要求50所述的方法，其中所述细胞增殖失调是多形性胶质母细胞瘤。
55.根据权利要求50所述的方法，其中所述细胞增殖失调选自由肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、黑素瘤、胃癌和卵巢癌组成的组。
56.一种治疗受试对象的细胞增殖失调的方法，其包括使所述受试对象与根据权利要求1所述的逆转录病毒接触，其中所述异源核酸序列编码抑制赘生性细胞增殖的治疗性蛋白。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述治疗性蛋白包括将非细胞毒性药物转化为细胞毒性药物的多肽。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述多肽具有胞嘧啶脱氨酶活性。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述多肽包括如SEQ ID NO：4、12、14、16或18所述的序列。
60.根据权利要求57所述的方法，其中所述非细胞毒性药物是5-氟胞嘧啶。
61.根据权利要求56所述的方法，其中所述逆转录病毒多聚核苷酸包括如SEQ ID NO：19、20或22所述的序列。
62.一种治疗细胞增殖失调的方法，其包括在允许包含根据权利要求46所述的多聚核苷酸的逆转录病毒感染具有细胞增殖失调的细胞的条件下，对患有所述失调的受试对象施用所述逆转录病毒，和使所述受试对象与抗癌剂或化学治疗剂接触。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述抗癌剂选自由贝伐单抗(bevacizumab)、派加他尼(pegaptanib)、兰尼单抗(ranibizumab)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、AE-941、VEGF Trap、帕唑帕尼(pazopanib)、凡德他尼(vandetanib)、瓦他拉尼(vatalanib)、西地尼布(cediranib)、芬维A胺(fenretinide)、角鲨胺(squalamine)、INGN-241、口服四硫钼酸盐(oral tetrathiomolybdate)、四硫钼酸盐(tetrathiomolybdate)、Panzem NCD、2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol)、AEE-788、AG-013958、贝伐西尼钠(bevasiranib sodium)、AMG-706、阿西替尼(axitinib)、BIBF-1120、CDP-791、CP-547632、PI-88、SU-14813、SU-6668、XL-647、XL-999、IMC-1121B、ABT-869、BAY-57-9352、BAY-73-4506、BMS-582664、CEP-7055、CHIR-265、CT-322、CX-3542、E-7080、ENMD-1198、OSI-930、PTC-299、Sirna-027、TKI-258、Veglin、XL-184或ZK-304709组成的组。
64.一种治疗受试对象的细胞增殖失调的方法，其包括施用根据权利要求40-43中任一权利要求所述的逆转录病毒，和使所述受试对象与包含细胞毒性剂的同源物接触。
65.一种分离的多聚核苷酸，其包含：
编码包含HER2的胞外(ECD)和跨膜(TM)域的多肽的序列，所述序列与SEQ ID NO：4的经优化胞嘧啶脱氨酶的编码序列连接。
66.一种分离的多聚核苷酸，其编码包含HER2的胞外(ECDIV)和跨膜(TM)域的赫赛汀(Herceptin)结合域IV的多肽，所述多肽与包括SEQ ID NO：4的经优化胞嘧啶脱氨酶连接。
67.一种分离的多聚核苷酸，其编码包含HER2的信号肽(S)的多肽，所述信号肽与HER2的胞外(ECDIV)和跨膜(TM)域的赫赛汀结合域IV可操作地融合，所述多肽与包括SEQ ID NO：4的经优化胞嘧啶脱氨酶连接。
68.一种重组可复制逆转录病毒，其包含与IRES和所述ENV序列的3’可操作地连接的根据权利要求65、66或67所述的多聚核苷酸。
69.根据权利要求1所述的重组逆转录病毒，其中所述异源多肽是HER2或截短HER2(HER2 ECDTM)或HER2 SECDIVTM。
70.根据权利要求1所述的重组逆转录病毒，其以每克脑重量10-3到10-7TU的剂量施用。
71.根据权利要求50到54中任一权利要求所述的方法，其中所述逆转录病毒以每克脑重量约10-3到10-7TU施用。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述逆转录病毒以每克脑重量约10-4到10-6TU施用。
73.一种重组可复制逆转录病毒(RCR)，其包含：
逆转录病毒GAG蛋白；
逆转录病毒POL蛋白；
逆转录病毒包膜；
逆转录病毒多聚核苷酸，其包含：在所述逆转录病毒多聚核苷酸序列的3’端的长末端重复(LTR)序列、在所述逆转录病毒多聚核苷酸的5’端的启动子序列、gag核酸域、pol核酸域和env核酸域，所述启动子适合在哺乳动物细胞中表达；
包含miRNA或siRNA序列的初级前体miRNA(pri-miRNA)的盒；
在靶细胞中逆转录、包装和整合所必需的顺式作用序列。
74.一种重组可复制逆转录病毒(RCR)，其包含：
逆转录病毒GAG蛋白；
逆转录病毒POL蛋白；
逆转录病毒包膜；
逆转录病毒多聚核苷酸，其包含：在所述逆转录病毒多聚核苷酸序列的3’端的长末端重复(LTR)序列、在所述逆转录病毒多聚核苷酸的5’端的启动子序列、gag核酸域、pol核酸域和env核酸域，所述启动子适合在哺乳动物细胞中表达；
包含miRNA或siRNA序列的前体miRNA(pre-miRNA)的盒；
在靶细胞中逆转录、包装和整合所必需的顺式作用序列。
75.一种重组可复制逆转录病毒(RCR)，其包含：
逆转录病毒GAG蛋白；
逆转录病毒POL蛋白；
逆转录病毒包膜；
逆转录病毒多聚核苷酸，其包含：在所述逆转录病毒多聚核苷酸序列的3’端的长末端重复(LTR)序列、在所述逆转录病毒多聚核苷酸的5’端的启动子序列、gag核酸域、pol核酸域和env核酸域，所述启动子适合在哺乳动物细胞中表达；
包含polIII启动子和siRNA或shRNA的盒，
在靶细胞中逆转录、包装和整合所必需的顺式作用序列，
其中所述载体至少90％稳定地在细胞中至少6次传代。
76.根据权利要求73、74或75中任一权利要求所述的载体，其中miR 128-1和miR 128-2的从属权利要求。
77.根据权利要求73、74或75中任一权利要求所述的载体，其中所述载体进一步包含与异源多聚核苷酸可操作地连接的IRES盒。
78.根据权利要求77所述的载体，其中所述IRES盒位于所述env基因的3’紧邻位置。
79.一种重组可复制逆转录病毒(RCR)，其包含：
逆转录病毒GAG蛋白；
逆转录病毒POL蛋白；
逆转录病毒包膜；
逆转录病毒多聚核苷酸，其包含：在所述逆转录病毒多聚核苷酸序列的3’端的长末端重复(LTR)序列、在所述逆转录病毒多聚核苷酸的5’端的启动子序列、gag核酸域、pol核酸域和env核酸域，所述启动子适合在哺乳动物细胞中表达；
包含天然存在的miRNA的靶序列的盒；和
在靶细胞中逆转录、包装和整合所必需的顺式作用序列。
CN200980147515.1A 2008-09-26 2009-09-26 重组载体 Active CN102227503B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510624987.9A CN105624193B (zh) 2008-09-26 2009-09-26 重组载体

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10066608P 2008-09-26 2008-09-26
US61/100,666 2008-09-26
US12061808P 2008-12-08 2008-12-08
US61/120,618 2008-12-08
US18682309P 2009-06-13 2009-06-13
US61/186,823 2009-06-13
PCT/US2009/058512 WO2010036986A2 (en) 2008-09-26 2009-09-26 Recombinant vectors

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510624987.9A Division CN105624193B (zh) 2008-09-26 2009-09-26 重组载体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102227503A true CN102227503A (zh) 2011-10-26
CN102227503B CN102227503B (zh) 2015-10-21

Family

ID=42060421

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980147515.1A Active CN102227503B (zh) 2008-09-26 2009-09-26 重组载体
CN200980147509.6A Active CN102227501B (zh) 2008-09-26 2009-09-26 基因治疗载体和胞嘧啶脱氨酶
CN201510624987.9A Active CN105624193B (zh) 2008-09-26 2009-09-26 重组载体
CN201510505943.4A Pending CN105274125A (zh) 2008-09-26 2009-09-26 基因治疗载体和胞嘧啶脱氨酶

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980147509.6A Active CN102227501B (zh) 2008-09-26 2009-09-26 基因治疗载体和胞嘧啶脱氨酶
CN201510624987.9A Active CN105624193B (zh) 2008-09-26 2009-09-26 重组载体
CN201510505943.4A Pending CN105274125A (zh) 2008-09-26 2009-09-26 基因治疗载体和胞嘧啶脱氨酶

Country Status (18)

Country Link
US (3) US8722867B2 (zh)
EP (4) EP3502256A3 (zh)
JP (6) JP5771147B2 (zh)
KR (3) KR101870056B1 (zh)
CN (4) CN102227503B (zh)
AU (1) AU2009303690B2 (zh)
BR (1) BRPI0919113A2 (zh)
CA (1) CA2738472A1 (zh)
CO (1) CO6362050A2 (zh)
DK (1) DK2346995T3 (zh)
EA (2) EA201790824A3 (zh)
ES (2) ES2709481T3 (zh)
IL (3) IL211847A (zh)
MX (3) MX357418B (zh)
MY (1) MY156333A (zh)
NZ (1) NZ592070A (zh)
WO (2) WO2010036986A2 (zh)
ZA (1) ZA201102115B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103966260A (zh) * 2014-03-07 2014-08-06 山东农业大学 一种基于J亚群禽白血病病毒pol基因保守序列的siRNA重组干扰载体及其制备方法和应用
CN104557602A (zh) * 2015-01-07 2015-04-29 华东师范大学 三环二萜衍生物及其制备方法、及其在制备抗肿瘤药物中的应用
CN105579581A (zh) * 2013-08-05 2016-05-11 托卡根公司 具有优化的a凸出物的重组载体
CN106536558A (zh) * 2014-04-10 2017-03-22 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 转基因遗传标签和使用的方法
US11123369B2 (en) 2015-08-07 2021-09-21 Seattle Children's Hospital Bispecific CAR T-cells for solid tumor targeting
US11408005B2 (en) 2016-12-12 2022-08-09 Seattle Children's Hospital Chimeric transcription factor variants with augmented sensitivity to drug ligand induction of transgene expression in mammalian cells

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE424114T1 (de) 1998-10-01 2009-03-15 Univ Southern California Retrovirales genübertragungssystem und entsprechendes verwendungverfahren
CA2724740C (en) 2008-06-30 2017-02-21 Tocagen Inc. Formulations of 5-fluorocytosine and uses thereof
EP3502256A3 (en) * 2008-09-26 2019-09-25 Tocagen Inc. Recombinant vectors
US8829173B2 (en) * 2008-09-26 2014-09-09 Tocagen Inc. Recombinant vectors
ES2718546T3 (es) * 2009-06-17 2019-07-02 Tocagen Inc Células productoras para vectores retrovirales de replicación competente
WO2011156273A1 (en) * 2010-06-06 2011-12-15 Mount Sinai School Of Medicine Recombinant rna viruses and uses thereof
ES2655500T3 (es) 2010-07-16 2018-02-20 Tocagen Inc. Detección de retrovirus
EP2633321B1 (en) 2010-10-31 2017-12-06 Tocagen Inc. Antisera assays for mlv related viruses in humans and other mammals
EP2632491A4 (en) 2010-10-31 2014-10-01 Tocagen Inc ENHANCED TREATMENT AND MONITORING OF CANCER USING RECOMBINANT VECTORS
CN107488233A (zh) * 2011-06-02 2017-12-19 台北荣民总医院 治疗感染性与恶性疾病的标靶化学治疗药物的形成方法
KR101554678B1 (ko) * 2012-10-19 2015-09-21 영남대학교 산학협력단 식물 바이러스를 이용한 식물체 형질전환을 위한 유전자 전달 시스템 및 이의 용도
CN104884627A (zh) 2012-10-25 2015-09-02 托卡根公司 具有小型启动子盒的逆转录病毒载体
CA2910311A1 (en) * 2012-11-15 2014-05-22 Esperance Pharmaceuticals, Inc. Follicle-stimulating hormone (fsh)/lytic domain fusion constructs and methods of making and using same
US9642921B2 (en) 2012-12-20 2017-05-09 Tocagen Inc. Cancer combination therapy and recombinant vectors
JP6640717B2 (ja) 2013-06-15 2020-02-05 トカジェン インコーポレーテッド レトロウイルス複製ベクターと関連する免疫抑制成分
JP6894236B2 (ja) * 2014-03-26 2021-06-30 デノボ バイオファーマ エルエルシー 免疫刺激活性を有するレトロウイルスベクター
WO2015168102A2 (en) * 2014-04-28 2015-11-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Prolonged protein stabilization by resveratrol
US11279949B2 (en) * 2015-09-04 2022-03-22 Denovo Biopharma Llc Recombinant vectors comprising 2A peptide
US11293021B1 (en) 2016-06-23 2022-04-05 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
US10253316B2 (en) 2017-06-30 2019-04-09 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
WO2018101498A1 (ko) 2016-11-29 2018-06-07 충남대학교 산학협력단 유전자치료 벡터시스템 및 전구약물 유전자
CN107058314B (zh) * 2016-11-30 2020-09-04 暨南大学 一种启动子及其应用
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
GB201710973D0 (en) 2017-07-07 2017-08-23 Avacta Life Sciences Ltd Scaffold proteins
BR112020000839A2 (pt) * 2017-07-14 2020-07-21 Oncorus, Inc. polinucleotídeos encapsulados e métodos de uso
BR112020012594A2 (pt) * 2017-12-27 2020-11-24 Ethicon Llc imageamento hiperespectral em um ambiente com deficiência de luz
EP3758755A1 (en) * 2018-02-26 2021-01-06 Ablynx N.V. Improved nucleotide sequences encoding peptide linkers
US10557216B2 (en) 2018-04-24 2020-02-11 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of T-cell receptor peptide libraries
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
CN110396504A (zh) * 2018-04-25 2019-11-01 江苏省原子医学研究所 一种具有肿瘤靶向性的重组痘苗病毒及其制备方法、用途
CA3108767A1 (en) 2018-06-30 2020-01-02 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US11142740B2 (en) 2018-08-14 2021-10-12 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
US11214781B2 (en) 2018-10-22 2022-01-04 Inscripta, Inc. Engineered enzyme
EP3653716A1 (en) * 2018-11-19 2020-05-20 HSF Pharmaceuticals Replication-competent controlled alpha-herpesvirus virus vectors and uses therefore
US11001831B2 (en) 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
AU2020247900A1 (en) 2019-03-25 2021-11-04 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
AU2020288623A1 (en) 2019-06-06 2022-01-06 Inscripta, Inc. Curing for recursive nucleic acid-guided cell editing
US11012599B2 (en) 2019-06-20 2021-05-18 Ethicon Llc Hyperspectral imaging in a light deficient environment
US12013496B2 (en) 2019-06-20 2024-06-18 Cilag Gmbh International Noise aware edge enhancement in a pulsed laser mapping imaging system
US11589819B2 (en) 2019-06-20 2023-02-28 Cilag Gmbh International Offset illumination of a scene using multiple emitters in a laser mapping imaging system
US11266304B2 (en) 2019-06-20 2022-03-08 Cilag Gmbh International Minimizing image sensor input/output in a pulsed hyperspectral imaging system
US11924535B2 (en) 2019-06-20 2024-03-05 Cila GmbH International Controlling integral energy of a laser pulse in a laser mapping imaging system
US11096565B2 (en) 2019-06-20 2021-08-24 Cilag Gmbh International Driving light emissions according to a jitter specification in a hyperspectral, fluorescence, and laser mapping imaging system
US11389066B2 (en) 2019-06-20 2022-07-19 Cilag Gmbh International Noise aware edge enhancement in a pulsed hyperspectral, fluorescence, and laser mapping imaging system
CA3149494A1 (en) 2019-08-12 2021-02-18 Purinomia Biotech, Inc. Methods and compositions for promoting and potentiating t-cell mediated immune responses through adcc targeting of cd39 expressing cells
KR102281858B1 (ko) * 2019-09-11 2021-07-26 주식회사 쎌바이오텍 유산균 유래 p8 단백질의 발현 컨스트럭트를 포함하는 대장 질환의 치료 또는 예방용 조성물
WO2021074695A1 (en) 2019-10-16 2021-04-22 Avacta Life Sciences Limited PD-L1 INHIBITOR - TGFβ INHIBITOR BISPECIFIC DRUG MOIETIES.
WO2021102059A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
US11008557B1 (en) 2019-12-18 2021-05-18 Inscripta, Inc. Cascade/dCas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells
CA3157061A1 (en) 2020-01-27 2021-08-05 Christian SILTANEN Electroporation modules and instrumentation
US20210332388A1 (en) * 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
GB202101299D0 (en) 2020-06-09 2021-03-17 Avacta Life Sciences Ltd Diagnostic polypetides and methods
CN111944810B (zh) * 2020-07-29 2022-05-27 中国农业大学 靶向敲除TNFα基因的sgRNA和敲除TNFα基因的猪胚胎成纤维细胞系及其应用
EP4214314A4 (en) 2020-09-15 2024-10-16 Inscripta Inc CRISPR EDITING TO EMBED NUCLEIC ACID LANDING PADS INTO LIVING CELL GENOMES
US11512297B2 (en) 2020-11-09 2022-11-29 Inscripta, Inc. Affinity tag for recombination protein recruitment
EP4271802A1 (en) 2021-01-04 2023-11-08 Inscripta, Inc. Mad nucleases
US11332742B1 (en) 2021-01-07 2022-05-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
WO2022234003A1 (en) 2021-05-07 2022-11-10 Avacta Life Sciences Limited Cd33 binding polypeptides with stefin a protein
EP4413038A1 (en) 2021-10-07 2024-08-14 Avacta Life Sciences Limited Pd-l1 binding affimers
EP4412711A1 (en) 2021-10-07 2024-08-14 Avacta Life Sciences Limited Serum half-life extended pd-l1 binding polypeptides
LT7046B (lt) 2022-04-15 2024-02-12 Vilniaus Universitetas Hidrolazės ir jų panaudojimas

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6410313B1 (en) * 1998-10-01 2002-06-25 University Of Southern California Gene delivery system and methods of use

Family Cites Families (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4405712A (en) 1981-07-01 1983-09-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services LTR-Vectors
US4650764A (en) 1983-04-12 1987-03-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Helper cell
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
CA2018273C (en) 1989-06-09 1999-04-06 Peter D. Senter Thermally stable cytosine deaminase
US5358866A (en) 1991-07-03 1994-10-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cytosine deaminase negative selection system for gene transfer techniques and therapies
US5770428A (en) * 1993-02-17 1998-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Chimeric retrovial expression vectors and particles containing a simple retroviral long terminal repeat, BLV or HIV coding regions and cis-acting regulatory sequences, and an RNA translational enhancer with internal ribsome entry site
DE69420033T2 (de) 1993-04-06 1999-12-23 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Bethesda Gibbon leukemia virus retrovirale vektoren
US5426039A (en) 1993-09-08 1995-06-20 Bio-Rad Laboratories, Inc. Direct molecular cloning of primer extended DNA containing an alkane diol
AU7971194A (en) 1993-10-12 1995-05-04 Chiron Corporation Methods for preserving recombinant viruses
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
DE69434988T2 (de) 1994-11-07 2008-03-06 Human Genome Sciences, Inc. Tumornekrose-faktor-gamma
US20030157070A1 (en) 1994-12-30 2003-08-21 Jolly Douglas J. High efficiency ex vivo transduction of cells by high titer recombinant retroviral preparations
US6117681A (en) 1995-03-29 2000-09-12 Bavarian Nordic Research Inst. A/S Pseudotyped retroviral particles
EP0822984A4 (en) 1995-04-27 2000-05-03 Human Genome Sciences Inc TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTORS IN MEN
US20030026789A1 (en) 1995-05-03 2003-02-06 Richard J. Gregory Gene therapy using replication competent targeted adenoviral vectors
WO1997033904A1 (en) 1996-03-12 1997-09-18 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptors
AU5711196A (en) 1996-03-14 1997-10-01 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
ATE412740T1 (de) 1996-08-16 2008-11-15 Human Genome Sciences Inc Menschliches alpha-endokin
EP1947183B1 (en) 1996-08-16 2013-07-17 Merck Sharp & Dohme Corp. Mammalian cell surface antigens; related reagents
CA2266423A1 (en) 1996-09-27 1998-04-02 Maxygen, Inc. Methods for optimization of gene therapy by recursive sequence shuffling and selection
JP2001503263A (ja) 1996-10-25 2001-03-13 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド ニュートロカインα
ATE321855T1 (de) 1997-01-14 2006-04-15 Human Genome Sciences Inc Tumor-nekrose-faktor rezeptor 5
US6326204B1 (en) 1997-01-17 2001-12-04 Maxygen, Inc. Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
DK1717322T3 (da) 1997-01-17 2012-10-22 Codexis Mayflower Holdings Llc Udvikling af hele celler og organismer ved rekursiv sekvensrekombination
DE69837806T3 (de) 1997-01-28 2012-01-05 Human Genome Sciences, Inc. "death-domain"-enthaltender rezeptor 4 (dr4), ein mitglied der tnf-rezeptor superfamilie, welcher an trail (apo-2l) bindet
ATE418608T1 (de) 1997-03-18 2009-01-15 Novozymes As Methode zur herstellung einer bibliothek mittels dna-shuffling
BR9808368A (pt) 1997-03-18 2000-05-23 Novo Nordisk As Processos para a construção de uma biblioteca de polinucleotideos homólogos recombinados, para a identificação um polipeptìdeo de interesse, e, para a produção de um polipeptìdeo de interesse.
US5948653A (en) 1997-03-21 1999-09-07 Pati; Sushma Sequence alterations using homologous recombination
US6153410A (en) 1997-03-25 2000-11-28 California Institute Of Technology Recombination of polynucleotide sequences using random or defined primers
US6214580B1 (en) 1997-05-30 2001-04-10 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor tr10
AU7830398A (en) 1997-06-11 1998-12-30 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor tr9
AU1334999A (en) 1997-10-20 1999-05-10 Universita Degli Studi Di Padova A packaging cell line producing siv-pseudotyped mlv
WO1999021979A1 (en) 1997-10-28 1999-05-06 Maxygen, Inc. Human papillomavirus vectors
EP1030861A4 (en) 1997-10-31 2001-09-05 Maxygen Inc MODIFICATION OF VIRAL TROPISM AND THE DIVERSITY OF HOST SPECIES BY RECOMBINATION OF THE VIRAL GENOME
EP1036198B1 (en) 1997-12-08 2012-09-26 California Institute Of Technology Method for creating polynucleotide and polypeptide sequences
FR2773561A1 (fr) 1998-01-15 1999-07-16 Centre Nat Rech Scient Utilisation d'une sequence riche en proline pour augmenter le caractere fusogenique d'enveloppes de retrovirus
EP1054973A1 (en) 1998-02-11 2000-11-29 Maxygen, Inc. Antigen library immunization
EP1053343A2 (en) 1998-02-11 2000-11-22 Maxygen, Inc. Targeting of genetic vaccine vectors
US6451304B1 (en) 1998-03-09 2002-09-17 The Regents Of The University Of California Method for retrovirus vector production by separated gag and pol expression
WO1999055894A1 (en) 1998-04-29 1999-11-04 Oklahoma Medical Research Foundation Construction of retroviral producer cells from adenoviral and retroviral vectors
US7001733B1 (en) 1998-05-12 2006-02-21 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for screening for modulations of IgE synthesis, secretion and switch rearrangement
GB9810752D0 (en) 1998-05-19 1998-07-15 Glaxo Group Ltd Cystosine deaminase gene
US6448390B1 (en) 1998-05-20 2002-09-10 The University Of Tennessee Research Corporation Stable envelope proteins for retroviral, viral and liposome vectors and use in gene drug therapy
CN1308683A (zh) 1998-06-29 2001-08-15 菲洛斯公司 用于产生高多样性文库的方法
US6264940B1 (en) 1998-08-05 2001-07-24 The Research Foundation Of State University Of New York Recombinant poliovirus for the treatment of cancer
FR2782323B1 (fr) 1998-08-12 2002-01-11 Proteus Procede de production in vitro de sequences polynucleotidiques recombinees, banques de sequences et sequences ainsi obtenues
JP2002537758A (ja) 1998-09-29 2002-11-12 マキシジェン， インコーポレイテッド コドン変更された遺伝子のシャッフリング
US6899871B2 (en) * 1998-10-01 2005-05-31 University Of Southern California Gene delivery system and methods of use
US6576463B1 (en) 1999-01-15 2003-06-10 The Regents Of The University Of California Hybrid vectors for gene therapy
EP1151409A1 (en) 1999-01-18 2001-11-07 Maxygen, Inc. Methods of populating data stuctures for use in evolutionary simulations
US6436675B1 (en) 1999-09-28 2002-08-20 Maxygen, Inc. Use of codon-varied oligonucleotide synthesis for synthetic shuffling
AU3210100A (en) 1999-01-19 2000-08-01 Maxygen, Inc. Methods for making character strings, polynucleotides and polypeptides having desired characteristics
JP2002542834A (ja) 1999-04-29 2002-12-17 アールフス・ユニバーシティー レトロウイルスベクターでのｉｒｅｓ転写カセットからの異種遺伝子群の発現
WO2001004266A1 (en) 1999-07-08 2001-01-18 The Regents Of The Universty Of California A lung cancer associated retrovirus, gene delivery vector and methods of use thereof
US8163893B2 (en) 2006-02-15 2012-04-24 The Regents Of The University Of Caifornia Pseudotyped retroviral vectors and methods of use thereof
AU7521500A (en) 1999-11-30 2001-06-12 Novartis Ag Increased transgene expression in retroviral vectors having scaffold attachment region
JP2003520828A (ja) 2000-01-27 2003-07-08 ジェネティクス インスティテュート，エルエルシー Ｃｔｌａ４（ｃｄ１５２）に対する抗体、これを含む結合体、およびその使用
WO2001064864A2 (en) 2000-02-28 2001-09-07 Maxygen, Inc. Single-stranded nucleic acid template-mediated recombination and nucleic acid fragment isolation
US6692736B2 (en) 2000-03-24 2004-02-17 Cell Genesys, Inc. Cell-specific adenovirus vectors comprising an internal ribosome entry site
WO2002022663A2 (en) 2000-09-18 2002-03-21 Maxygen, Inc. Stress resistant retroviruses
WO2002042482A2 (en) * 2000-11-27 2002-05-30 Chiron Corporation Functional lentiviral vector from an mlv-based backbone
WO2002061104A2 (en) 2001-01-30 2002-08-08 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Hybrid adenoviral vector
DE10111433A1 (de) 2001-03-09 2002-09-19 Bundesrepublik Deutschland Let Replikationskompetente molekulare Klone von porcinem endogenem Retrovirus der Klasse A und Klasse B,abgeleitet von Schweine- und humanen Zellen
JP2002335965A (ja) 2001-05-14 2002-11-26 Japan Science & Technology Corp 細胞特異的発現複製ベクター
DE10143237A1 (de) 2001-09-04 2003-03-20 Icon Genetics Ag Herstellung künstlicher interner ribosomaler Eingangsstellenelemente (Ires-Elemente)
AU2002326906C1 (en) * 2001-09-13 2009-01-29 California Institute Of Technology Method for expression of small antiviral RNA molecules within a cell
FR2832424B1 (fr) 2001-11-20 2004-09-24 Genethon Iii Plasmide chimere comprenant un genome retroviral replicatif et utilisations
US20030121068A1 (en) * 2001-11-30 2003-06-26 Paul Orchard Vector encoding suicide and marker constructs
CA2474777A1 (en) 2002-02-01 2003-08-07 Transgene S.A. Adenoviral vectors for modulating the cellular activities associated with pods
WO2004007753A2 (en) 2002-07-17 2004-01-22 Bristol-Myers Squibb Company Transgenic non-human mammals expressing a reporter nucleic acid under the regulation of androgen response elements
JP4992032B2 (ja) * 2002-09-03 2012-08-08 オックスフォード バイオメディカ（ユーケー）リミテッド レトロウイルスベクター
DE602004031341D1 (de) * 2003-07-21 2011-03-24 Transgene Sa Multifunktionelle cytokine
PL1649023T3 (pl) 2003-07-21 2009-01-30 Transgene Sa Polipeptyd o podwyższonej aktywności deaminazy cytozyny
WO2005086922A2 (en) * 2004-03-10 2005-09-22 Board Of Regents, University Of Texas System Oncolytic adenovirus armed with therapeutic genes
US20080227736A1 (en) 2004-06-03 2008-09-18 Regents Of The University Of California, Targeting Pseudotyped Retroviral Vectors
US20070003522A1 (en) 2004-07-08 2007-01-04 Albritton Lorraine M Methods and compositions for improved retroviral gene and drug delivery
JP2008518902A (ja) 2004-11-04 2008-06-05 ファイザー・プロダクツ・インク 乳癌のためのｃｔｌａ４抗体とアロマターゼ阻害剤の併用治療
AU2005309485A1 (en) 2004-11-24 2006-06-01 Nanovector Limited Viral vectors
US20060147429A1 (en) * 2004-12-30 2006-07-06 Paul Diamond Facilitated cellular reconstitution of organs and tissues
US7968698B2 (en) 2005-05-25 2011-06-28 The Regents Of The University Of California Optimized core promoters and uses thereof
JP2007054069A (ja) * 2005-08-24 2007-03-08 Medizinische Hochschule Hannover 自己不活性化レトロウイルスベクター
EP1928902A2 (en) * 2005-09-30 2008-06-11 ZGene A/S Dekkera/brettanomyces cytosine deaminases and their use
EP2386564B1 (en) * 2005-10-01 2014-07-16 Charles Stout Regulatable fusion promoters
US8034355B2 (en) 2005-10-07 2011-10-11 Presidents And Fellows Of Harvard College Attenuated nonsegmented negative-sense RNA viruses with reduced mRNA cap methyltransferase activity comprising mutations within conserved domain VI of the large polymerase
EP1795596A1 (en) * 2005-12-08 2007-06-13 Ganymed Pharmaceuticals AG Composition and methods for therapy and diagnosis of cancer
EP2479285B1 (en) * 2006-01-05 2014-05-14 The Ohio State University Research Foundation MicroRNA-based methods and compositions for the diagnosis and treatment of solid cancers
EP2004677A2 (en) 2006-03-17 2008-12-24 Aarhus Universitet Chimeric viral envelopes
US9868961B2 (en) * 2006-03-30 2018-01-16 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for localized secretion of anti-CTLA-4 antibodies
DK2048955T3 (da) * 2006-07-21 2013-09-02 California Inst Of Techn Målrettet gen-tilførsel til dendrit-cellevaccination
WO2008151633A2 (en) 2007-06-15 2008-12-18 Skau Aps Vectors for vaccines against lentivirus infections
CA2724740C (en) 2008-06-30 2017-02-21 Tocagen Inc. Formulations of 5-fluorocytosine and uses thereof
EP3502256A3 (en) * 2008-09-26 2019-09-25 Tocagen Inc. Recombinant vectors
US8829173B2 (en) 2008-09-26 2014-09-09 Tocagen Inc. Recombinant vectors
ES2718546T3 (es) * 2009-06-17 2019-07-02 Tocagen Inc Células productoras para vectores retrovirales de replicación competente
WO2012021785A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods comprising sequences having hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (hppd) activity

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6410313B1 (en) * 1998-10-01 2002-06-25 University Of Southern California Gene delivery system and methods of use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHIEN-KUO TAI等: "Single-Shot,Multicycle Suicide Gene Therapy by Replication-Competent Retrovirus Vectors Achieves Long-Term Survival Benefit in Experimental Glioma", 《MOLECULAR THERAPY》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105579581A (zh) * 2013-08-05 2016-05-11 托卡根公司 具有优化的a凸出物的重组载体
CN103966260A (zh) * 2014-03-07 2014-08-06 山东农业大学 一种基于J亚群禽白血病病毒pol基因保守序列的siRNA重组干扰载体及其制备方法和应用
CN106536558A (zh) * 2014-04-10 2017-03-22 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 转基因遗传标签和使用的方法
US10865242B2 (en) 2014-04-10 2020-12-15 Seattle Children's Hospital Method and compositions for cellular immunotherapy
US11155616B2 (en) 2014-04-10 2021-10-26 Seattle Children's Hospital Drug regulated transgene expression
US11414486B2 (en) 2014-04-10 2022-08-16 Seattle Children's Hospital Transgene genetic tags and methods of use
CN104557602A (zh) * 2015-01-07 2015-04-29 华东师范大学 三环二萜衍生物及其制备方法、及其在制备抗肿瘤药物中的应用
US11123369B2 (en) 2015-08-07 2021-09-21 Seattle Children's Hospital Bispecific CAR T-cells for solid tumor targeting
US11458167B2 (en) 2015-08-07 2022-10-04 Seattle Children's Hospital Bispecific CAR T-cells for solid tumor targeting
US11408005B2 (en) 2016-12-12 2022-08-09 Seattle Children's Hospital Chimeric transcription factor variants with augmented sensitivity to drug ligand induction of transgene expression in mammalian cells

Also Published As

Publication number Publication date
IL264214B (en) 2020-01-30
IL211847A (en) 2016-11-30
CA2738472A1 (en) 2010-04-22
CN102227503B (zh) 2015-10-21
JP2019141088A (ja) 2019-08-29
EA201790824A2 (ru) 2017-08-31
EP3460061A1 (en) 2019-03-27
JP5771147B2 (ja) 2015-08-26
ES2706899T3 (es) 2019-04-01
EP2346995A2 (en) 2011-07-27
WO2010036986A2 (en) 2010-04-01
US10035983B2 (en) 2018-07-31
CN105624193A (zh) 2016-06-01
EP3502256A3 (en) 2019-09-25
JP6062485B2 (ja) 2017-01-18
JP2015186479A (ja) 2015-10-29
NZ592070A (en) 2012-07-27
MX2011003039A (es) 2011-08-15
JP2015119712A (ja) 2015-07-02
AU2009303690B2 (en) 2014-06-19
KR20180069131A (ko) 2018-06-22
KR102025502B1 (ko) 2019-09-25
CN105624193B (zh) 2021-07-13
KR101724162B1 (ko) 2017-04-07
ES2709481T3 (es) 2019-04-16
JP2017018121A (ja) 2017-01-26
EP3502256A2 (en) 2019-06-26
EA027693B1 (ru) 2017-08-31
BRPI0919113A2 (pt) 2016-08-09
JP6523224B2 (ja) 2019-05-29
IL264214A (en) 2019-02-28
DK2346995T3 (en) 2019-02-11
ZA201102115B (en) 2012-07-25
IL248833B (en) 2019-01-31
US20190185821A1 (en) 2019-06-20
JP2012503987A (ja) 2012-02-16
CN105274125A (zh) 2016-01-27
EP2344648A2 (en) 2011-07-20
CO6362050A2 (es) 2012-01-20
US20110217267A1 (en) 2011-09-08
MY156333A (en) 2016-02-15
EP2344648A4 (en) 2012-03-14
EP2344648B1 (en) 2018-11-14
WO2010036986A3 (en) 2010-07-01
WO2010045002A2 (en) 2010-04-22
IL211847A0 (en) 2011-06-30
CN102227501A (zh) 2011-10-26
JP2012503986A (ja) 2012-02-16
JP5684130B2 (ja) 2015-03-11
AU2009303690A1 (en) 2010-04-22
JP5992548B2 (ja) 2016-09-14
EP2346995A4 (en) 2011-12-07
IL248833A0 (en) 2017-01-31
MX357418B (es) 2018-07-09
US8722867B2 (en) 2014-05-13
EA201790824A3 (ru) 2017-12-29
MX2018008440A (es) 2021-06-15
US20140242033A1 (en) 2014-08-28
WO2010045002A3 (en) 2010-08-26
KR20160079149A (ko) 2016-07-05
EA201170492A1 (ru) 2011-10-31
EP2346995B1 (en) 2018-11-07
CN102227501B (zh) 2016-11-16
KR101870056B1 (ko) 2018-07-23
KR20110063673A (ko) 2011-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102227503B (zh) 重组载体
US10407666B2 (en) Recombinant vectors
JP6609663B2 (ja) 複製可能レトロウイルスベクターの産生細胞
US20220195460A1 (en) Retroviral vector having immune-stimulating activity
US11279949B2 (en) Recombinant vectors comprising 2A peptide
US20130323301A1 (en) Enhanced cancer treatment and monitoring using recombinant vectors
CN105579581A (zh) 具有优化的a凸出物的重组载体

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210721

Address after: California, USA

Patentee after: Suoyuan biomedical (USA) Co.,Ltd.

Address before: California, USA

Patentee before: Tocagen Inc.

TR01 Transfer of patent right