本发明要求以下美国临时申请的权益:系列号61/125,916,于2008年4月30日递交,以及系列号61/125,923,于2008年4月30日递交,其各个在此以全文形式结合作为参考。
附图简述
图1A、1B、1C及1D显示了根据一个实施方案的荚膜异多糖酸降解酶的核苷酸及氨基酸序列。
图2显示了凝胶,其中几种不同的DNA质粒样品以该凝胶电泳方法检测多糖可视化及定量。
图3-8显示了SEQIDNOS:1-6的多肽序列。
图9-10显示了SEQIDNO:7及SEQIDNO:8的多核苷酸序列。
图11显示了SEQIDNO:9-17的多肽序列。
图12-14显示了表格,为从120只小鼠的高剂量DNA-BIV脂质体复合物静脉注射之后的结果,所述脂质体复合物根据在此描述的方法纯化。
缩写及定义
除非另外地定义,所有在此使用的工艺、符号及其他科学术语或者专门用语意为具有本发明所属领域的技术人员一般理解的意义。在一些情况下,为了清楚和/或便于引用,本文对具有广泛理解的意义的术语进行定义,并且该定义在此包含不应该必然地解释为描述与本领域通常理解地基本上不同。在此描述或引用的多种技术和步骤被本领域技术人员使用常规的方法学而充分理解并广泛采用,例如广泛地使用的分子克隆方法学,其描述于Sambrook等人的MolecularCloning:ALaboratoryManual2nd.edition(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.中。视情况而定,涉及商业上可得的试剂盒及试剂的使用的步骤通常地根据生产商所规定的步骤和/或参数进行,除非另外指出。
术语“类似物”指与另一个分子在结构上相似或者具有相似的或者对应的属性(如CAE相关蛋白)的分子。例如,CAE蛋白的类似物可能被特异结合CAE的抗体或者T细胞特异地结合。
术语“抗体”以最广泛的含义使用。因此“抗体”可能为天然地产生的或人造的,如单克隆抗体,其由常规的杂交瘤技术制备。抗-CAE抗体包括单克隆及多克隆的抗体,以及含有所述抗原结合结构域和/或这些抗体的一个或者多个互补性决定区域的片段。“抗体片段”定义为免疫球蛋白分子可变区域的至少一部分,所述部分结合于其靶点,即抗原结合区域。在一个实施方案中,其特别地涵盖单一的抗-CAE抗体及其克隆(包括激动剂,拮抗剂及中和抗体)及具有多表位特异性的抗-CAE抗体组合物。
术语“同系物”指显示与另一个分子的同源性的分子,例如,通过在对应的位置上具有相同或者类似的序列或者化学残基。
术语“杂交”、“杂交(hybridizing)”,“杂交(hybridizes)”等等,用于核酸的环境下,意为指常规的杂交条件,优选地如在50%甲酰胺/6xSSC/0.1%SDS/100μg/mlssDNA中杂交,其中用于杂交的温度高于37°C以及用于在0.1xSSC/0.1%SDS中洗涤的温度高于55°C。
短语“分离的”或者“生物纯的”指这样的物质,其基本上或本质上不含在物质见于天然状态下与其正常地共存的组分。因此,根据本发明的分离的肽优选地不含有在肽的原位环境下通常与其结合的物质。例如,核酸或多核苷酸被称为“分离的”是这样一种情况:核酸或多核苷酸基本上与污染物多核苷酸分离,所述污染物多核苷酸对应于或互补于靶基因之外的基因,或者编码靶基因产物或其片段之外的多肽。技术人员能够容易地使用核酸分离步骤来获得分离的多核苷酸。例如当采用物理、机械或者化学方法将目标蛋白或者多肽从正常地与所述蛋白结合的细胞组分中去除时,该蛋白被称为是“分离的”。技术人员能够容易地使用标准纯化方法获得纯化的蛋白质。可选地,分离的蛋白质可以通过化学的方式制备。
术语“哺乳动物”指分类为哺乳类的任意生物体,其包括小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、牛、马和人类。在本发明的一个实施方案中,所述哺乳动物为小鼠。在本发明的另一个实施方案中,所述哺乳动物为人类。
术语“单克隆抗体”指由相同的核酸分子编码的抗体的集合,所述核酸分子可选地由单一的杂交瘤或者其他细胞系产生,或者由转基因哺乳动物产生,从而各个单克隆抗体典型地识别抗原上的相同表位。术语“单克隆”不限于任意特定用于产生抗体的方法,该术语也不限制于在特定的物种中所产生的抗体,所述物种如小鼠、大鼠等等。术语“多克隆抗体”指抗体的异种混合物,其识别并结合于相同抗原上的不同表位。多克隆抗体可以从例如粗血清制备物获得,或者可以使用例如抗原亲和层析或者蛋白A/蛋白G亲和层析纯化。
本文关于多肽序列所说明的术语“氨基酸序列同一性百分比(%)”,定义为在候选序列中氨基酸残基与特定的多肽序列中氨基酸残基相同的百分比,如必要,在比对序列和引入缺口之后进行以达到最大百分比的序列同一性,而并不考虑作为序列同一性的部分的任何保守替换。为了确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的多种方式实现,例如,使用公众可用的电脑软件如BLAST,BLAST-2,ALIGN,ALIGN-2或者Megalign(DNASTAR)软件。本领域普通人员能够确定测量比对的合适参数,包括任何为了在所比较的序列的全长上达到最大比对所需要的算法。例如,氨基酸序列同一性百分比可以使用序列比较程序NCBI-BLAST2(Altschul等人,NucleicAcidsRes.25:33893402(1997))确定。所述NCBI-BLAST2序列比较程序可以得自位于Bethesda,Md的NationalInstituteofHealth。NCBI-BLAST2使用几个搜索参数,其中所有那些搜索参数设定为默认值,包括例如unmask=yes,strand=all,expectedoccurrences=10,minimumlowcomplexitylength=15/5,multi-passe-value=0.01,constantformulti-pass=25,dropoffforfinalgappedalignment=25以及scoringmatrix=BLOSUM62。
本文关于编码多肽的核酸序列说明的术语“核酸序列同一性百分比(%)”定义为在候选序列中与目标多肽核酸序列中的核苷酸一致的核苷酸的百分比,如必要,在比对序列和引入缺口之后进行以达到最大百分比的序列同一性。为了确定核酸序列同一性百分比的比对可以以在本领域技术范围内的多种方式实现,例如,使用公众可用的电脑软件如BLAST,BLAST-2,ALIGN,ALIGN-2或者Megalign(DNASTAR)软件。本领域普通人员能够确定测量比对的合适参数,包括任何为了在所比较的序列的全长上达到最大比对所需要的算法。例如,核酸序列同一性百分比也可以使用序列对比程序NCBI-BLAST2(Altschul等人,NucleicAcidsRes.25:33893402(1997))来确定。所述NCBI-BLAST2序列比较程序可能得自位于Bethesda,Md的NationalInstituteofHealth。NCBI-BLAST2使用几个搜索参数,其中所有那些搜索参数设定为默认值,包括例如unmask=yes,strand=all,expectedoccurrences=10,minimumlowcomplexitylength=15/5,multi-passe-value=0.01,constantformulti-pass=25,dropoffforfinalgappedalignment=25以及scoringmatrix=BLOSUM62。
术语“多核苷酸”意为聚合物形式的核苷酸,其长度为至少10个碱基或者碱基对,其为核糖核苷酸或者脱氧核苷酸,或者核苷酸任意一种类型的修饰形式,并意图包含单链或者双链形式的DNA和/或RNA。在本领域中,该术语通常与“寡核苷酸”可交换地使用。多核苷酸可以包括本文公开的核苷酸序列,其中胸腺嘧啶(T)也可以为尿嘧啶(U);该定义属于DNA与RNA的化学结构之间的差别,具体地观察到RNA中的四种主要碱基中之一为尿嘧啶(U)而非胸腺嘧啶(T)。
术语“多肽”意为至少约4,5,6,7或8个氨基酸的聚合物。在本说明书中,使用标准的三字母或者单字母的氨基酸名字。在本领域中,该术语通常与“肽”或者“蛋白质”可交换地使用。
“重组”的多核苷酸(如DNA或者RNA分子)或者“重组”的多肽为在体外进行分子操作的多核苷酸或者多肽。
具有本领域普通技术人员能容易地确定杂交反应的“严格性”,该严格性是通常地凭经验计算的,其取决于探针长度,洗涤温度以及盐浓度。通常地,为了适当的变性,较长的探针要求较高的温度,而较短的探针需要较低的温度。杂交通常地取决于当互补链存在于低于其解链温度的环境下时,变性的核酸序列再退火的能力。探针与可杂交序列的想要的同源性程度越高,则能使用越高的相对温度。结果是,随后更高的相对温度将倾向于使反应条件更严格,而更低的温度较不如此。杂交反应严格性的额外细节以及解释参见Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers,(1995)。
以下可以确定为本文定义的“严格的条件”或者“高严格性的条件”,而其不限于此:(1)洗涤采用低离子强度及高温度,例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1%十二烷基硫酸钠在50°C下;(2)在杂交中采用变性剂,如甲酰胺,例如具有下列成分的50%(v/v)甲酰胺:0.1%胎牛血清白蛋白/0.1%聚蔗糖/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/pH为6.5的具有750mM的氯化钠、75mM柠檬酸钠的42℃的50mM磷酸钠缓冲液;或者(3)42°C采用50%甲酰胺,5XSSC(0.75MNaCl,0.075M柠檬酸钠),50mM磷酸钠(pH6.8),0.1%焦磷酸钠,5xDenhardt溶液,超声的鲑鱼精子DNA(50μg/ml),0.1%SDS以及10%硫酸葡聚糖,并且在42°C的0.2xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)以及55°C的50%甲酰胺中洗涤,随后通过含EDTA的0.1xSSC在55°C下进行高严格性洗涤。"“中等严格的条件”描述为,然而不限于Sambrook等人MolecularCloning:ALaboratoryManual,NewYork:ColdSpringHarborPress,1989中的那些条件,并包括不如上述严格的洗涤溶液以及杂交的条件(例如温度,离子强度以及%SDS)的使用。中等严格条件的实例为在溶液中,37°C下过夜孵育,所述溶液包含:20%甲酰胺,5XSSC(150mMNaCl,15mM柠檬酸三钠),50mM磷酸钠(pH7.6),5XDenhardt溶液,10%硫酸葡聚糖以及20mg/ml的经变性剪切的鲑鱼精子DNA,随后使用约37-50°C的1xSSC洗涤滤器。技术人员能认识到如何在必要时调节温度,离子强度等等,从而适应如探针长度等等因素。
术语“变体”指显示描述的类型或者标准的变化的分子,如与具体描述的蛋白质(如示于图1或者图2的CAE-蛋白)在相应的位置(或者多个位置)具有一个或者多个不同的氨基酸残基的蛋白质。类似物是变体蛋白的实例。剪接同等型及单核苷酸多态性(SNP)是变体的其它实例。
本发明的具有荚膜异多糖酸降解(CAE)活性的多肽包括在此具体指出的那些,以及等位基因的变体,保守的替换变体,类似物以及同源物,其可以在本文列出或者在本领域中容易获得的的方法之后,在经过度实验分离/产生及表征。也包括组合了不同CAE蛋白或其片段的部分的融合蛋白,以及CAE蛋白与异种多肽的融合蛋白。该CAE蛋白共同地指CAE相关的蛋白,本发明的蛋白或CAE。术语“CAE相关蛋白”指至少10,15,25,50,100,150,200,250,300,350,400,450,500,550,600,650,700或者多于700个氨基酸的多肽片段或者CAE蛋白质序列。
详述
本发明总的来说涉及“超洁净”的质粒DNA制备物,其制备方法及在这些方法中有用的酶。经报导地,发现多糖特别是荚膜异多糖酸污染“洁净”的质粒DNA制备物,当使用时,例如用于基因治疗时,其在人类和哺乳动物中诱导毒性作用。据信诱导这些毒性作用的组合物尚未在文献中确定。可能被DNA制备物中的多糖污染的存在不利地影响的其他应用包括临床诊断,法医学及其他生物技术方法,如其上包括核酸的芯片及微阵列,以及在分子研究(如建立染色体,转录起始位点的分析,X-射线晶体学以及DNA结构研究等)中。存在从DNA制备物中去除此类污染分子的急需。
除了别的之外,因此,本发明提供了分离的,纯化的以及重组的多肽及涉及其应用的方法,所述多肽具有荚膜异多糖酸降解活性。本发明还提供了编码该多肽的分离的多核苷酸。本文描述的多肽具有一系列的应用,并使得在生物材料中消化荚膜异多糖酸的方法,以及在从包括生物大分子的组合物中去除内毒素的方法成为可能。值得注意的是,所述多肽也使得质粒DNA制备物的制备成为可能,优选地为革兰氏阴性细菌质粒DNA,其包含少于约0.1mg每毫克的质粒DNA的荚膜异多糖酸,以及更优选地少于约0.05mg每毫克的质粒DNA的荚膜异多糖酸。在特定的优选实施方案中,在由本文描述的方法制备的质粒组合物中找不到可检测的荚膜异多糖酸。所述质粒组合物可能还具有非常低水平的,或者不可检测水平的其他多糖污染物,例如糖醛酸及岩藻糖。
本发明部分涉及这一发现:本发明的多肽化合物能够消化荚膜异多糖酸(也称作M-抗原),其为由一系列的肠细菌产生的胞外多糖,所述肠细菌包括大多数大肠杆菌株。取决于细菌,例如,荚膜异多糖酸可以包括多种比例的岩藻糖、葡萄糖、半乳糖及葡萄糖醛酸以及乙酸盐和丙酮酸盐(参见例如Sutherland,Biochem.J.115,935-945(1969)。如前文所记录的,发现了内毒素及多糖,特别是荚膜异多糖酸污染核酸的制备物,所述制备物例如用于治疗用途,同时使用现有的标准纯化步骤很难将内毒素及多糖如荚膜异多糖酸从核酸中分离出来。
相应地,本文描述的多肽可以通常地用于材料中荚膜异多糖酸的消化。通常地,含有荚膜异多糖酸的任意材料可以使用本文描述的多肽处理,典型地,所述材料为生物材料。所述生物材料可以得自微生物,人类或者动物的组织以及环境样品的部分,所述环境样品如考古学上的残留物、堆肥或者其他分解物质、泥炭沼、植物物质、沉淀物、污泥、泥土以及废水,废水例如其从来源上为地面上或者地面下的。在特定的实施方案中,所述生物材料为生物粘液。根据这些实施方案,例如,所述荚膜异多糖酸可以存在于完整细菌的细胞膜中。在其他的实施方案中,所述生物材料可以为粗细菌裂解液,部分地纯化的细菌裂解液以及包括提取的细菌核酸的含水溶液。在另一个实施方案中,所述生物材料可以为生物膜。在另一个实施方案中,所述生物材料可以为浆粕或者浆粕衍生物(例如,如那些机械地或者化学地由木头或者纤维来源制备的)。如前文所记载的,根据本发明的其他方面,本文描述的多肽可以用于从包含细菌大分子(例如,质粒DNA)的含水组合物中去除内毒素的方法中。在特定的优选方面,所述多肽用于纯化质粒DNA的方法中,所述质粒DNA典型地为革兰氏阴性细菌质粒DNA。
质粒DNA组合物
本发明的一个关键的方面是高度纯化的质粒组合物及药物级别的质粒DNA组合物。这些组合物,例如,可以通常由本文描述的荚膜异多糖酸酶促消化方法制备,其可以与或者可以不与常规的纯化技术组合,常规的纯化技术如一种或多种层析或者过滤步骤的组合。因此,本发明包括,或者进一步地包括制备及分离高度纯化的质粒组合物的方法,所述质粒组合物基本上不含多糖,所述多糖包括荚膜异多糖酸,岩藻糖以及糖醛酸,以及其他的污染物,并因此为药物级别的DNA。除了具有非常低的,优选地不可检测水平的荚膜异多糖酸和其他多糖之外,由本文描述的方法制备及分离的所述质粒DNA通常包括非常低水平的内毒素,所述内毒素包括一种或者多种污染性的染色体DNA、RNA、蛋白质及内毒素,并优选地含有绝大多数闭环形式的质粒DNA。根据本文描述的方法制备的所述质粒DNA具有足够的纯度用于研究及基于质粒的疗法。
本发明的质粒组合物可以包括任意类型具有任意尺寸的载体。例如,可以由本文描述的方法纯化的质粒DNA的尺寸范围可以为从约0.3kbp(小环或者最小的转录单位)到约50kbp,典型地3kbp到20kbp,或者更大(例如5到100kbp,或者更大,如得自噬菌体的穿梭载体、HAC、YAC、MAC及得自EBV或者其他的非整合病毒的游离体)。在某些实施方案中,所述DNA包括约0.3kbp、0.5kbp、0.75kbp、1kbp、3kbp、5kbp、10kbp、15kbp或者20kbp的载体骨架,治疗性的基因以及相关的调节序列。这可以应用于单链DNA(即0.3kb到50kb等等,如得自M13的那些)。因此例如,载体骨架可以能够携带约1-50kbp或者更大(例如3-20kbp)或者约1-50kb,或者更大(例如3-20kbp)的插入物。该插入物通常地取决于该质体组合物将用于的应用。对于基因疗法或者基于疫苗的应用,例如,该插入物可以包括来自任何生物体的DNA,然而典型地为哺乳动物来源的,并除了编码治疗蛋白的基因之外,可以包括调节序列(如启动子)、聚腺苷酸化序列、增强子、基因座控制区等等。编码治疗蛋白的基因可以为基因组来源的,并从而含有如在其基因组组织中所反映的外显子及内含子,或者其可以得自互补的DNA。该载体可以包括,例如能以高拷贝数量复制的载体骨架,所述骨架对于治疗基因的插入具有多聚接头,编码可选择标记物的基因(例如四环素或者卡那霉素抗性基因),并且其在物理上是小的及稳定的。所述质粒的载体骨架有利地允许哺乳动物片段、其他真核的、原核的或者病毒DNA的插入,并且所得的质粒可以按照本文描述地纯化,并用于体内或者离体的基于质粒的疗法或者其他应用。所述质粒组合物可以还包含其他药学上可接受的组分,缓冲剂、稳定剂或者用于改进基因转移以及特别是质粒DNA转移进入细胞或者生物体的化合物。
通常,本文提供“超净”质粒DNA组合物。典型地,所述质粒DNA组合物为革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物。如本文所描述的,开发了有效的基于酶促的方法,其使得荚膜异多糖酸污染从多种细菌材料中去除,所述细菌材料如质粒DNA样品。在不同的实施方案中,所述方法的第一步可以涉及检测作为污染源(如质粒DNA污染)的荚膜异多糖酸。这可以直接或者间接地实现,例如,通过测试样品中岩藻糖的存在(如下所述),这是由于已知岩藻糖占荚膜异多糖酸的约22%。
在一个实施方案中,所述质粒DNA组合物为革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物,其包含革兰氏阴性细菌质粒DNA以及少于约0.1mg每毫克的革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸。在该实施方案中更优选地,所述组合物包含少于约0.05mg每毫克的革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸。在一个尤其优选的实施方案中,所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物不包含可检测的荚膜异多糖酸。
如本文另外记载的,本发明的所述质粒DNA组合物也优选地包括低水平的或者不可检测的水平的其他多糖污染物,如糖醛酸或者岩藻糖。因此,在一个实施方案中,所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物包含少于约0.1mg每毫克的革兰氏阴性细菌质粒DNA的糖醛酸。在该实施方案中更优选地,所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物包含少于约0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的糖醛酸。优选地,在所述的质粒DNA组合物中不能发现可检测的糖醛酸。
在这些和其他实施方案中,所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物优选包含少于约0.1mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的岩藻糖。在该实施方案中更优选地,所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物包含少于约0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的岩藻糖。优选地,在所述的质粒DNA组合物中不能发现可检测的岩藻糖。
组合来说,所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物可以包含少于约0.1mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸,以及少于约0.1mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的糖醛酸。例如,所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物可以包含0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸,以及少于约0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的糖醛酸。优选地,在所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物中不存在可检测的荚膜异多糖酸以及可检测的糖醛酸。
按照另一种组合,所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物可以包含少于约0.1mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸,以及少于约0.1mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的岩藻糖。例如,所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物可以包含每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的0.05mg的荚膜异多糖酸,以及少于约0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的岩藻糖。优选地,所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物中不存在可检测的荚膜异多糖酸以及可检测的岩藻糖。
在再另一个组合中,所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物可以包含少于约0.1mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸,少于约0.1mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的糖醛酸,以及少于约0.1mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的岩藻糖。例如,所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物可以包含0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸,少于约0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的糖醛酸,以及少于约0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的岩藻糖。优选地,在所述革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物中不存在可检测的荚膜异多糖酸、可检测的糖醛酸以及可检测的岩藻糖。
除了前述的荚膜异多糖酸、糖醛酸和/或岩藻糖的减少的水平,本文描述的质粒组合物可以也包括,例如,少于0.01mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的染色体DNA或者基因组DNA、RNA、蛋白质和/或内毒素污染物;更优选地,所述组合物包括每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的少于0.001mg,少于0.0001mg或者少于0.00001mg的染色体DNA或者基因组DNA、RNA、蛋白质和/或内毒素污染物。在一个实施方案中,例如,所述质粒组合物可以包含少于0.1mg(更优选地少于0.05mg,再更优选地无可检测的量)每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸,以及少于0.01mg(更优选地少于0.001mg,再更优选地0.0001mg)每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的宿主细胞染色体DNA或者基因组DNA污染物。所述质粒组合物可以还包含每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA组合物的少于0.1mg(更优选地少于0.05mg,再更优选地无可检测的量)的荚膜异多糖酸,以及每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的少于0.01mg(更优选地少于0.001mg,再更优选地0.0001mg)的宿主细胞蛋白污染物。
用于检测荚膜异多糖酸、糖醛酸、岩藻糖以及其他多糖的水平的测试在本领域内为公知(或者本文所描述);检测可能存在于质粒组合物中的染色体DNA或者基因组DNA、RNA、蛋白质和/或内毒素的方法也是本领域公知的。
在一个实施方案中,例如,本发明的质粒组合物可已包括每mg的革兰氏阴性细质粒DNA的少于0.1mg,优选地少于0.05mg的荚膜异多糖酸(例如,0.04、0.03、0.02或者0.01mg),更优选地不含有可检测的荚膜异多糖酸,其按照二喹啉甲酸(BCA)测试进行测量。适用的BCA测试描述于例如Meeuwsen等人的Biosci.Bioeng.89,107-109(2000);以及Verhoef等人的Carbohyd.Res.340(11),1780-1788(2005)中。示例性的用于测量荚膜异多糖酸水平的BCA测试见于实施例16。
在另一个实施方案中,所述质粒组合物可以包括荚膜异多糖酸,其水平列举于前段中,以及进一步地包含每mg的革兰氏阴性质粒DNA的少于约0.1mg的,优选地少于约0.05mg的糖醛酸(如0.04、0.03、0.02或者0.01mg),以及更优选地按照糖醛酸测试没有可检测的糖醛酸。通常地,质粒DNA样品的糖醛酸含量使用标准曲线进行测量,所述标准曲线由硫酸肝素或者葡萄糖醛酸作为标准获得。例如,硫酸肝素类似于来自E.Coli的多糖污染物,这是由于糖醛酸包含约25%的硫酸肝素总重。硫酸肝素按重量50%由糖组成。这些糖的半数为葡萄糖胺,糖的另外一半为艾杜糖醛酸以及葡萄糖醛酸,剩下的硫酸肝素由糖的修饰提供,所述修饰包括硫酸酯以及乙酰胺。可选地,葡萄糖醛酸可以用于产生用于直接测量糖醛酸的标准曲线。标准溶液置于玻璃试管中,所述玻璃试管具有硼酸盐/硫酸溶液(例如0.025M四硼酸钠十水合物,其溶解于具有1.84的比度的硫酸中)并进行混合。将咔唑的纯乙醇溶液加入混合物中,所述整个混合物进行涡旋震荡并浸没于沸水中。将试管冷却,并在分光光度计中读出所述溶液在530nm的吸收。将获得的标准的吸收值对标准的浓度进行作图。当DNA样品经历相同的反应时,质粒DNA样品的糖醛酸含量可以从其在530nm处的吸收值进行推断。质粒DNA样品的多糖含量可以随后通过将糖醛酸的量加倍进行推断,所述加倍的倍数从3.3到9.1(取决于样品中荚膜异多糖酸、ECA以及O-和K-抗原的普遍性)。示例性的用于测量糖醛酸水平的糖醛酸测试见于实施例16。
在另一个实施方案中,所述质粒组合物可以包括前述段落中所列举水平的荚膜异多糖酸和/或糖醛酸,并进一步包含每mg的革兰氏阴性质粒DNA的少于约0.1mg,优选地少于约0.05mg的岩藻糖(例如0.04、0.03、0.02或者0.01mg),以及更优选地没有可检测的岩藻糖,其按照岩藻糖测试进行测量。用于样品中的岩藻糖含量的测试的基本步骤可见于Morris,Anal.Biochem.121,129-134(1982)。溶液制备及溶液储存条件以及用于此测试的样品的详细描述也已经公开(Passonneau,J.V.和O.H.Lowry.1974.In:MethodsofEnzymaticAnalysis,U.H.Bergmeyer(ed.),2ndedition,AcademicPress:NewYork,volume4,pp.2059-2072)。使用这种方法,测定了所述质粒DNA样品的岩藻糖水平,并计算了荚膜异多糖酸水平的浓度。如本文别处描述的,发现荚膜异多糖酸是多种来源的质粒DNA中的首要污染物,所述质粒DNA甚至是GMP级别的质粒DNA。示例性的用于测量岩藻糖水平的岩藻糖测试见于实施例16。
在这些以及其他的实施方案中,所述革兰氏阴性质粒组合物当与多糖选择性标记试剂组合时,优选地不包含可视觉检测的多糖。通常地,多糖可视化测试涉及将多糖使用荧光试剂标记,然后检测其存在,例如,在电泳介质中。优选地,该试剂与本文描述的质粒组合物组合时没有可检测的多糖。在一个实施方案中,所述多糖选择性标记试剂为(4,6-二氯三嗪基)-氨基荧光素(DTAF)。其他的多糖选择性标记试剂是已知的,或者对于本领域技术人员是明显的。示例性的利用多糖选择性标记试剂的测试见于实施例16。
此外,本文描述的荚膜异多糖酸降解方法导致质粒DNA组合物的粘度降低。相应地,通过将与处理的质粒DNA组合物的粘度与未处理的质粒DNA样品的粘度相比,可以检测荚膜异多糖酸的存在。示例性的利用质粒DNA的粘度水平的测试见于实施例16。
通常地,随着存在于质粒组合物中的荚膜异多糖酸的水平(和/或糖醛酸、岩藻糖或者其他多糖或者其他污染物的水平)降低,该质粒组合物的LD50(对于50%的试验种群致死的剂量)上升。例如,通过减少荚膜异多糖酸的水平到每mg革兰氏阴性细菌质粒DNA的少于0.1mg,在一个实施方案中,质粒组合物的相应的LD50上升至少25%;更优选地,在本实施方案中,至少50%。通过进一步地降低荚膜异多糖酸(以及其他多糖)的水平,并且可选地类似地减少其他污染物的水平,所述污染物如染色体DNA或者基因组DNA、RNA、蛋白质和/或内毒素,所述质粒组合物的相应的LD50可能上升至少50%,至少75%或者至少100%。作为另一个实例,通过降低荚膜异多糖酸的水平到每mg的革兰氏阴性细菌质粒DNA的少于0.5mg,以及将染色体DNA或者基因组DNA、RNA、蛋白质和/或内毒素污染物的水平降低到每mg的革兰氏阴性细菌质粒DNA的少于0.01mg,所述质粒组合物的相应LD50上升至少50%,更优选地在本实施方案中为至少100%。
一般而言,本发明的质粒组合物可能用于广泛的应用中,举几个例子来说,包括以下的那些领域:生物恐怖(试剂检测和分析)、环境科学(如农业、园艺学以及林学),食品科学、法医学、分子生物学、健康及医学(例如基因疗法、诊断、重组蛋白表达)以及空间科学。本文描述的高纯质粒组合物可以用于体内或者离体,例如用于基因疗法和基于疫苗的应用(即所述质粒组合物可以给予哺乳动物,包括人类)。除此之外地,或者可选地,所述质粒组合物可以用于常规的诊断以及法医技术中,例如,用于改进此类方法学的稳定性、特异性、可再现性和/或灵敏性。这可以包括例如得自环境的样品的分析、检测或者检查,例如来自公共供水系统,来自食品的样品以及来自其他生物学或者临床的样品,所述样品如血、唾液、痰、精液、颊部涂片、尿或者粪便废物,细胞及组织的活组织检查以及微解剖,羊水或者植物、动物或者人类患者的组织匀浆,等等。本文描述的质粒组合物的应用的其他实例包括微生物基因分型,植物及动物的DNA指纹图谱,泥土、水、植物及动物中病原体及有益微生物的检测,被不同的生物实体污染的生物样品及环境样品的法医鉴定,以及分子学研究,如,例如建立染色体、转录信息的分析、X-射线晶体学以及DNA结构研究。所述的质粒组合物也可以用于与固体基质芯片连接或者组合使用的形式,除其他之外,其检测基因、突变或者mRNA表达水平,如核酸微阵列以及分子检测芯片,其采用如荧光、放射能力、光学干涉测量法、拉曼光谱、半导体或者其他的电子学(参见如美国专利No.7,098,286;美国专利No.6,924,094以及美国专利No.6,824,866(其各个在此结合作为参考))。
方法
如本文别处描述的,本发明的多肽可以在广泛范围的方法中应用,尤其是涉及、要求或者受益于荚膜异多糖酸的消化或者降解的那些方法,所述荚膜异多糖酸典型地为生物材料中的,如细菌样品或者包含细菌大分子的组合物(如含水的组合物)。一般来说,含有不期待的荚膜异多糖酸的生物材料可以使用本文描述的多肽处理,所述生物材料包括生物膜(即包裹在自行产生的聚合物基质中的微生物的构造的群体,其或者粘附于活的或者无生命的表面,或者其独自存在)、细菌裂解物、质粒DNA等等。
本文描述的方法通常涉及生物材料中或者在包含生物材料的组合物中的荚膜异多糖酸的降解。通常地,所述方法使用本文描述的多肽,用于消化或者降解可能存在于材料中的荚膜异多糖酸。本文描述的方法的一个实施方案涉及,例如来自生物材料的荚膜异多糖酸的消化。可选地,该方法可以涉及含水组合物中荚膜异多糖酸的消化,所述含水组合物含有细菌大分子。作为另外可选的,所述方法可以涉及使用多肽处理含水的组合物以消化荚膜异多糖酸,所述组合物包含质粒DNA。
使用多肽来消化存在于样品中的荚膜异多糖酸;因此,所述多核苷酸具有荚膜异多糖酸降解活性,或者为荚膜异多糖酸降解酶。在一个特定的实施方案中,该方法涉及在生物材料中消化,以及该方法包括使生物材料与多肽接触,所述多肽能够消化荚膜异多糖酸。所述生物材料可以为例如粗细菌裂解液,部分地纯化的细菌裂解液以及含有提取的细菌核酸(如革兰氏阴性质粒DNA)的含水溶液。可选地,所述生物材料可以为细菌粘液。作为另外可选的,所述生物材料可以为生物膜,所述生物膜包含革兰氏阴性细菌。在另一个可选的实施方案中,所述细菌材料可以存在于浆粕(例如木或者纤维浆粕)组合物、溶液或者混合物中。在另一个实施方案中,该方法涉及从含水组合物中去除内毒素,所述组合物含有细菌大分子,并且该方法包括消化该含水组合物中的荚膜异多糖酸,以及随后将该含水组合物与层析材料组合,以从细菌大分子中分离内毒素。在一个优选的实施方案中,所述方法涉及纯化质粒DNA,如革兰氏阴性细菌质粒DNA,并且所述方法包括使用多肽处理含有质粒DNA的含水组合物以消化荚膜异多糖酸,并将质粒DNA从处理的含水组合物中分离,例如使用常规的层析技术。在下文描述的一系列的工业方法中也可以采用所述多肽。
在特定的方面,已经开发了用于从质粒DNA样品中去除污染性多糖的方法,其使得多糖的去除成为可能,包括从质粒DNA样品中去除包括LPS之外的那些。除此之外,RNA及LPS也从所述质粒DNA样品中去除。因此,本发明的方法导致了纯化的质粒DNA,如下所述,其含有极低的以及在多个情况下不可检测水平的多糖。不像前述的方法无法确定污染性多糖的水平,可以进行特定步骤来对DNA样品中的多糖水平定量,从而使得研究者能够确信多糖从DNA样品的去除。
总的来说,可以采用本文描述的任意多肽。例如,所述多肽可以包含与SEQIDNO:1具有至少90%同源性的氨基酸序列,或者所述多肽可以包含与SEQIDNO:2具有至少90%同源性的氨基酸序列。在一个特定实施方案中,所述多肽具有SEQIDNO:1的氨基酸序列。在另一个特定实施方案中,所述多肽具有SEQIDNO:2的氨基酸序列。
对于本文描述的特定方法的起始物料为大量的细菌材料,或者含水组合物,其包含该生物材料,如细菌细胞或者其他细菌物质,其通过例如发酵或者细胞培养、从环境中分离或者得自组织或者其他生物体(如真菌、细菌等等)制备。在一个实施方案中,所述生物材料包括得自肠细菌的细菌细胞,所述肠细菌如E.Coli。在另一个实施方案中,所述生物材料为细菌粘液,根据此实施方案中,例如,荚膜异多糖酸存在于细菌的细胞膜中。在一个优选的实施方案中,所述生物材料为革兰氏阴性细菌质粒DNA材料。
多种细胞类型可以用作本文描述的方法的原料,如细菌(例如革兰氏(-)、革兰氏(+)以及古细菌)、酵母以及其他的原核及真核细胞,包括哺乳动物细胞和重组细胞。在这些以及其他的细胞类型中,细菌细胞,以及尤其优选革兰氏阳性(+)以及革兰氏阴性(-)细菌细胞,如E.coli、沙门氏菌或杆菌,而革兰氏阴性(-)细菌细胞为最优选的。在特定的实施方案中,所述细菌为革兰氏阴性(-)细菌,在本实施方案中更优选的细菌为E.Coli.根据本文描述的方法,E.Coli宿主株是有用的,所述宿主株具有广泛选择的并是广泛接受的,同时所述宿主株除了其他商业来源,可得自Stratagene(LaJolla,CA),Qiagen(Valencia,CA),NewEnglandBioLabs(Ipswich,MA)以及Promega(Madison,WI)。
典型地,所述生物材料为细菌裂解液,或者其衍生物。因此,细菌的起始物料(如细菌细胞等等)必须裂解或者瓦解以形成裂解物。总而言之,细菌裂解步骤涉及用于打开细菌细胞的任意常规方法,从而将核酸及其他细胞组分从中释放出来。所述裂解步骤可能涉及机械方法、裂解试剂或溶液,或其组合的使用。
对于得自发酵或者细胞培养的生物材料,所述细胞使用如下所述的化学的或者机械的技术瓦解,从而形成粗裂解液。例如,采用细菌培养时,将细菌细胞裂解,从而形成粗细菌裂解液。通过这些操作,细胞组分从细胞中释放,所述细胞组分包括DNA、RNA、蛋白质、荚膜异多糖酸以及其他多糖。在特定的实施方案中,所述裂解液可能经历预处理的步骤,如纯化步骤,以去除细胞污染物以及内毒素,从而形成部分纯化的(如细菌的)裂解液。
当使用裂解试剂时,裂解试剂用于破坏细胞膜,从而使DNA、RNA以及蛋白质从细胞中释放。一种优选的裂解试剂包括碱性溶液。在常规碱性裂解步骤中可以采用多种碱,包括,例如,氢氧化盐,如氢氧化钾(KOH)、氢氧化锂(LiOH)或者氢氧化钠(NaOH)。典型地,所述碱为氢氧化钠。通常,在裂解溶液中采用去污剂,其单独使用或者与碱性溶液组合使用。一般而言,以及取决于其应用,所述去污剂可以为阳离子的、阴离子的、非离子的或者两性离子的去污剂或者其组合。一种示例性的阴离子去污剂为十二烷基硫酸钠(SDS)。一种示例性的两性离子的或者非离子的去污剂为Tween20。
用于裂解细菌细胞的机械方法包括搅拌,超声,离心,冷冻/解冻,弗氏细胞压碎器等等,其单独使用或者与裂解溶液及试剂组合使用。
用于裂解细菌细胞并释放和提取蛋白质及核酸的碱性裂解以及机械技术通常是公知的,并且描述于如前文的Sambrook等人的。
在一些实施方案中,可能期待形成澄清的裂解液制备物,其中宿主细胞的染色体DNA、蛋白质以及膜部分已经至少部分地去除了,如通过裂解液的化学处理或者离心,从而留下含有质粒DNA的溶液。可选地可以在步骤中不同的点加入RNA酶,以产生澄清的、基本上不含RNA的裂解液。如本文另外地记载的,开始多种细胞的和核酸污染物的去除可以改进荚膜异多糖酸的消化和/或质粒DNA使用常规层析技术的进一步的纯化。产生澄清的裂解液的方法在本领域内公知。例如,可以通过使用氢氧化钠或者其等价物(0.2N)以及十二烷基硫酸钠(SDS)(1%)来处理宿主细胞,离心并丢弃上清液。产生澄清的裂解液的此方法通常描述于,例如Burnboim等人的Nucl.AcidsRes.,7,1513(1979);以及Horowicz等人的Nucl.AcidsRes.,9,2989(1981)。
对于许多用途,例如治疗用途如用于基因疗法或者疫苗的形成,可能期待在样品与荚膜异多糖酸降解多肽接触之前或之后,进一步纯化得自细菌或者其他裂解液的核酸。
在如前所述形成细菌裂解液之后,在使用所述多肽尝试消化荚膜异多糖酸之前,通常优选地使粗裂解液经过分离技术,以消除至少部分的存在的其他核酸、蛋白质以及细胞污染物。因此,在一个实施方案中,例如,在使用多肽处理之前,将含有生物物质的材料或者组合物与离子交换层析材料组合。典型地,所述层析材料为阴离子交换层析树脂。在优选的实施方案中,所述阴离子交换层析树脂包括二乙基氨基乙基纤维素(DEAE)。一般来说,常规的DNA,包括质粒DNA,可以采用清除技术。
生物材料也可以在使用多肽处理后与层析材料组合。这通常地涉及亲和层析和/或疏水相互作用层析。在特定的实施方案中,生物材料或者含水组合物与阴离子交换层析树脂组合,使用多肽处理,与亲和层析树脂组合,与疏水相互作用层析树脂组合,并经历过滤,以该顺序。
一旦所述生物材料经过裂解或者制备,该材料使用本文描述的多肽处理。典型地,处理涉及使多肽与生物材料接触或者混合,从而该多肽到达该材料或者组合物中存在的荚膜异多糖酸底物。优选地,将所述生物材料及所述多肽孵育,以使所述酶以及荚膜异多糖酸底物之间能够充分地相互作用。典型地,该孵育可以持续1到6个小时,6到12个小时,12到24个小时,或者更长,其取决于所消化的样品的尺寸,所使用的多肽的量,以及环境因素,所述环境因素如温度、气氛等等。该孵育通常在0°C至100°C的温度下进行,更优选地在25°C至75°C(例如30°C至50°C)。在一些实施方案中,可以期待在孵育过程中改变温度,例如在较冷的温度下开始该孵育,并随后在剩余的孵育循环中升高温度,或者反过来。
如前文所记载的,通常期待在使用本发明的多肽处理之前或者之后,纯化所述生物材料或者含有生物材料的含水组合物。一般来说,这可能涉及使所述材料或者组合物经历一个或者多个层析方法或者进行过滤。在一个实施方案中,采用层析分离的组合。因此例如,可以在该方法中的不同时间将所述生物材料或者组合物与层析材料组合。适用的层析材料包括,例如,除了一系列其他的之外,离子交换层析树脂(例如阴离子交换层析树脂以及阳离子交换层析树脂)、疏水相互作用层析树脂以及亲和层析树脂。在一个实施方案中,所述层析材料选自阴离子交换层析树脂,阳离子交换层析树脂,疏水相互作用层析树脂及亲和层析树脂。
如前文所记载的,所述生物材料或者组合物可以在使用多肽处理之前或之后,或者处理之前以及之后与层析材料(或者多种层析材料)组合,其采用单次的或者多次层析分离。例如,所述样品可以与层析材料组合,使用本文描述的多肽处理,然后经历第二次(或者第三次、第四次、第五次等等)层析步骤。除此之外,所述样品可以经历常规的过滤技术,从而进一步地纯化或者从所述样品中去除污染物。所述过滤步骤可以在所述方法中相对早地进行,例如在使用酶处理之前,或者在所述方法中更晚地进行,例如作为最终产品的储存或者使用之前的最终过滤步骤。
在另一个方面,因此,本发明的方法包括能够降解存在于细菌裂解样品中的荚膜异多糖酸的多肽的用途,所述用途为至少一个额外的层析技术之前或者之后。所述额外的层析步骤可以可选地存在,或者典型地作为一个或多个最终的纯化步骤存在,或者至少在样品或者质粒纯化方案的结尾或者接近结尾存在,或者在荚膜异多糖酸消化步骤之前。因此,优选一次或者多次离子交换层析、亲和层析(如硼酸盐亲和层析)、疏水相互作用层析以及过滤与所述荚膜异多糖酸降解步骤结合。其他的技术可以包括凝胶渗透或者尺寸排阻层析、羟磷灰石(I型和II型)层析以及反相层析。一般来说,任意可用的涉及核酸分离的层析步骤以能改变以应用。除此之外,任一个或者多个步骤或者技术中可以采用高效层析技术或者系统。因此,本发明的方法包括荚膜异多糖酸消化步骤,所述步骤具有一个或者多个离子交换层析步骤,并可以进一步包括亲和层析、疏水相互作用层析或者凝胶渗透层析和/或过滤(如切向流过滤(TFF)或者尺寸排阻过滤)。离子交换层析的步骤,例如可以用于流化床离子交换层析以及轴向和/或径向高分辨率阴离子交换层析中。在一个优选的实施方案中,在荚膜异多糖酸降解步骤之前进行离子交换层析,从而去除可能妨碍酶与底物相互作用的颗粒。
本发明在此描述的方法,例如用于纯化质粒DNA的方法,是可扩展的,并因此可以修改放大到大规模生产。
在本发明的一些实施方案中,荚膜异多糖酸降解步骤可以与额外的纯化步骤组合,以产生含质粒DNA的高纯度产品。其可以例如,与至少一种絮凝物去除(如裂解液过滤、沉降或者离心)、离子交换层析(如阳离子或者阴离子交换)以及疏水相互作用层析组合。在一个实施方案中,所述荚膜异多糖酸降解步骤在离子交换层析之后。在这些以及其他的实施方案中,所述荚膜异多糖酸降解步骤在疏水相互作用层析之前。在优选的实施方案中,细菌裂解之后为离子交换层析,离子交换层析之后为亲和层析(例如,使用硼酸盐或者其他的连二醇或者顺式二醇特异的化合物),其随后为疏水相互作用层析。在一个或者多个这些步骤之后或者之间,可以使样品经历过滤,例如切向流过滤。这些步骤使得可真实地扩展的质粒生产方法成为可能,该方法能够产生大量的具有高纯度水平的质粒DNA。宿主细胞DNA及RNA、蛋白质、内毒素及荚膜异多糖酸污染物优选地为不可检测的。
如前文所记载的,本发明的方法也可以使用进一步的步骤,所述步骤为尺寸排阻层析(SEC)、反相层析、羟磷灰石层析和/或其他可用的层析技术、方法或者系统,根据本申请,以上与本文描述的步骤相组合。
可以采取絮凝物去除步骤,从而为所得到的质粒DNA产物带来更高的纯度。该步骤可以用于去除一大部分的沉淀材料(絮凝物)。一种实施絮凝物去除的机理是通过裂解液过滤步骤,如通过1到5mm,优选地3.5mm的栅格过滤器,随后以深层过滤作为精制过滤步骤。实施絮凝物去除的其他方法为通过离心或者沉降。可选地,所述絮凝物可以通过离子交换层析去除。
因此,在内毒素去除和/或质粒DNA纯化过程中的不同时间,可以使样品经历一次或者多次离子交换层析(如阴离子或者阳离子交换层析)、亲和层析、疏水相互作用层析以及过滤(如通过0.2μm和/或0.45μm的滤器过滤)以及可选地,过滤或者经历层析方法第二次、第三次或者第四次或者更多次。
因此,例如,可以使所述样品经受第一次层析材料,使用多肽处理,经受第二次层析材料,然后经受第三次层析材料。该样品也可以在该顺序的不同时间进行过滤,例如在第一次层析分离之后,或者在第三次层析分离之后。应当认识到,使所述样品经受第一次层析材料也涉及将想要的样品的部分(例如含有纯化的质粒DNA的部分)从层析材料上洗脱,并丢弃样品不想要的部分。取决于所述层析材料的性质,想要的部分可能留在层析材料中并在不同的步骤中洗脱,而不想要的材料在该材料上流过,或者不想要的材料可能留在层析材料中而想要的部分在该层析材料上流过。
在上述过程的不同位置,有利地对核酸产量和纯度进行分析测定。典型地,该测试在各个纯化步骤之前和之后对例如来自制备型离子交换层析或者过滤的各个含有核酸的组分进行。进行这些分析测定的代表性方式包括纯度的HPLC分析、产量的分光光度法测定,用于蛋白质分析的银染以及SDS-PAGE以及用于DNA分析的琼脂糖凝胶电泳以及DNA印迹。在特定的实施方案中,本文描述的方法产生纯化的浓度,其中质粒DNA浓度(包括例如主要为超螺旋的或者其他的质粒DNA)为大约70%,75%,80%,85%,90%,95%以及优选地99%,或更大。
除此之外,通常也期待分析测定中间产物以及最终产物中多糖的存在,所述多糖如荚膜异多糖酸、糖醛酸和/或岩藻糖。对于荚膜异多糖酸及其他的多糖适用的测试本文另外描述(例如在实施例16中)。
下文中进一步地详细描述了特定的层析以及过滤技术。
离子交换层析。
如前文所记载的,离子交换层析可以用于在使用多肽处理之前或者之后纯化所述生物样品。该方法通常地在生物裂解液中或者裂解液衍生物中,将核酸例如质粒DNA从污染性内毒素、痕量蛋白质及残留的细胞污染物中分离。阳离子或者阴离子交换可以选用,其取决于污染物的性质以及溶液的pH。例如,阴离子交换层析通过将负电性的(或者酸性的)分子结合于正电性的支持物上起作用。离子交换层析的应用,随后,使得分子能够基于其电荷而被分离。分子的各种类(酸性、碱性以及中性)可以容易地通过该技术分离。可以采用分步的洗脱方案,其中多种污染物在早期组分中洗脱,而所述质粒DNA在随后的组分中洗脱。离子交换层析对于从质粒DNA制备物中去除蛋白质以及内毒素是相对地常见的方法。使用的所述离子交换层析或者任意一种或者更多种其他层析步骤或者技术可以采取固定相、置换层析法方法、模拟移动床技术和/或连续床柱或系统。
能够用于本发明的方法中的离子交换柱包括阳离子以及阴离子离子交换柱。在更优选的实施方式中,所述离子交换层析材料为阴离子交换层析树脂。例如,所述阴离子交换层析材料树脂可以包括二乙基氨基乙基纤维素(DEAE)、三甲基氨基乙基(TMAE)、季氨基乙基(QAE)或者聚乙基亚胺基(PEI)树脂。在一个实施方案中,所述阴离子交换层析树脂包括DEAE。在另一个实施方案中,所述阴离子交换层析树脂包括季铵树脂。例如,可以使用一种或者多种本文描述阴离子交换层析树脂填充层析柱。柱的最优容量按照经验,基于所使用的树脂以及纯化的核酸的大小决定。对于多种质粒DNA,优选的树脂为没有孔的或者具有大的孔尺寸的(例如大于优选地约到),具有中等的珠子尺寸的(例如,约20到500μm的直径),其不浸出基质组分的那些。理想地,该树脂是可洗涤的,如使用氢氧化钠洗涤,从而允许重复的使用。
也可以使用相对弱的阳离子及强的阳离子交换柱。相对强的阳离子交换柱典型地具有聚羟基化的聚合物涂布的、并通过丙磺酸基、由丙磺酸基功能化的葡聚糖基质功能化的表面,或者具有聚羟基化的聚合物涂布的表面,所述聚羟基化聚合物由乙磺酸基功能化。使用各个的这些材料的强阳离子交换柱的实例除了别的之外,分别包括POROSHSTM、POROSSTM以及SP-SephadexTM柱。相对弱的阳离子交换柱典型地具有葡聚糖基质,该基质由羧甲基或者由羟基功能化的丙烯酸基质功能化。使用各个的这些材料的弱阳离子交换柱的实例除了别的之外,分别包括CM-SephadexTM以及Bio-Rex70TM。
在本发明的方法中,也可以使用相对弱的阴离子及强的阴离子交换柱。弱的阴离子交换柱典型地具有聚乙烯亚胺(所述聚乙烯亚胺能够表面离子化到pH为约9)、含有磺酸基团的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物或者葡聚糖基质(其由二乙基氨基功能化)涂布的表面。使用各个的这些材料的弱阴离子交换柱的实例除了别的之外,分别包括POROSPITM柱、Dowex50TM柱以及DEAE-SephadexTM。相对强的阴离子交换柱典型地具有季铵化的聚乙烯亚胺涂布的表面,其具有离子化的表面,pH为约1到约14。该强阴离子交换柱的实例为POROSHQTM柱或者SOURCETM柱。用于前文列出的柱的树脂可得自Amersham/Pharmacia(Piscataway,N.J.),PerSeptiveBiosystems(FosterCity,Calif.),TosoHaas(Montgomeryville,Pa.),GEHealthcare(Piscataway,NJ),以及其他供应商。
典型地,所述样品与存在于柱中的离子交换层析树脂组合。所述柱可以为0.5ml的柱,1.5ml的柱,10ml的柱,20ml的柱,30ml的柱,50ml的柱,100ml的柱,200ml的柱,30ml的柱,400ml的柱,500ml的柱,600ml的柱,700ml的柱,800ml的柱,900ml的柱,1000ml(1L)的柱,2000ml(2L)的柱,20L的柱,30L的柱,40L的柱,50L的柱,60L的柱,70L的柱,80L的柱,90L的柱,100L的柱,或者具有大于100L的体积的柱,以及任意其他具有前面列出的体积之间的容量的柱。
典型地,所述离子交换层析材料在使用前平衡,所述平衡在pH从约6.0到约7.2,以及盐浓度为从约100mM到200mM进行。因此,所述柱可以在pH为约6.0,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9,7.0,7.1,7.2或者任意其他这些pH值之间的pH下,以及在100mM,125mM,150mM,175mM,200mM或其他位于前面列出的盐浓度数值之间的任意浓度下进行。能用于平衡所述层析材料的通常使用的盐包括NaCl,KCl或者其他任意的能够调节到与KCl的离子强度匹配的盐。
对于离子交换层析而言,填充材料以及用于制备该材料的方法,以及制备的过程,聚合及使阴离子及阳离子交换层析功能化,以及从中洗脱及分离质粒DNA在本领域中为公知的。
除此之外,可以使用二价金属离子的螯合剂,如,例如乙二胺四乙酸(EDTA),用于抑制质粒由于DNA降解酶的降解,所述降解酶在大肠杆菌的裂解液中。对于二价金属离子的螯合试剂的浓度优选地为0.1到100mM。
当将目标蛋白质施用到阴离子交换基质上,可以采用任意合适的基质,所述基质包括但不限于氨基乙基、二乙基氨基乙基、四级氨甲基、四级氨乙基、二乙基-(2-羟丙基)氨基乙基、三乙基氨基甲基、三乙基氨基丙基以及聚乙烯亚胺交换剂,从而达到目标蛋白质的过滤。商业上可得的阴离子交换剂的实例包括,纤维素离子交换剂如DE32及DE52(WHATMAN,FlorhamPark,N.J.),葡聚糖离子交换剂如DEAE-SEPHADEXC-25,QAE-SEPHADEXC-25,DEAE-SEPHADEXC-50以及QAE-SEPHADEXC-50(Pharmacia,Piscataway,N.J.),琼脂糖或者交联的琼脂糖如DEAEBIO-GELA(BIO-RAD,Hercules,Calif.),DEAE-SEPHAROSECL-6B以及Q-SEPHAROSEFastFlow(Pharmacia),合成的有机聚合物如MONOQ(Pharmacia),DEAE-5-PW以及HRLCMA7P(BIO-RAD)以及涂布的二氧化硅基质如DEAESi5500及TEAPSi100。期待地,所述阴离子交换基质在非常低的盐浓度下平衡,并在碱性pH(例如pH8.0到11.5)下使用,从而促进酸性和弱碱性的污染物的结合。
当将目标蛋白质施用于阳离子交换基质时,预期可以采用使用羧甲基、磺酸盐、磺乙基或者磺丙基基团功能化的任意基质。期待地,所述阳离子交换基质在酸性的pH(例如pH3.0到6.5)平衡和使用以促进碱性和弱酸性的污染物的结合。商业上可得的阳离子交换剂的实例为,基于纤维素的CM23,CM32以及CM52(WHATMAN);基于葡聚糖的CM-SEPHADEXC-25,SP-SEPHADEXC-25,CM-SEPHADEXC-50以及SP-SEPHADEXC-50(Pharmacia);基于琼脂糖或者交联琼脂糖的CMBIO-GELA(BIO-RAD),CM-SEPHAROSEFastFlowandS-SEPHAROSEFastFlow(Pharmacia);基于合成的有机聚合物的MONOS(Pharmacia),SP-5-PW和HRLCMA7C(BIO-RAD),以及涂布的二氧化硅基质,如CMSi300及SPSi100。
所述样品(例如裂解液或者其衍生物,包括核酸)典型地在加载缓冲液中加载到柱上,所述缓冲液包含比核酸从柱上洗脱的浓度更低的盐浓度。一般地说,在特定的实施方案中,所述盐浓度为从约10到50mS,其取决于所使用的树脂。一般地说,对于较弱的阴离子交换树脂,使用较低电导率的溶液,然而对于较强的阴离子交换树脂,使用较高电导率的溶液。所述柱随后使用几个柱容量的缓冲液洗涤,以去除与树脂弱结合的物质。随后,使用根据常规方法,使用平缓连续的盐水梯度从柱上洗脱各组分,所述方法例如使用Tris-HCl缓冲溶液中高达1.5MNaCl。从柱上收集样品组分。对于中等规模的制备而言(例如从约100mg到约3克核酸),组分典型地为至少50ml到2升,其中预期有核酸峰,在预期的峰后的组分中体积增加。核酸产量及纯度的分析测定对一种或者多种组分施行。除此之外,鲎变形细胞溶解物(LAL)测试(例如检测内毒素的脂类A部分)可以对于各个组分施行,从而测定残留的内毒素和/或其他本文描述的测试可以对各个组分实施,从而测定剩余的多糖污染物水平,例如在各个组分中的荚膜异多糖酸或者相关的多糖(如下文所述)。含有高水平的核酸以及低的内毒素或者低的荚膜异多糖酸的组分可以积累或者保持为分开的组分。如下所述,所得到的核酸样品可以再次过滤(例如,通过0.2μm的滤器)或者经历进一步的层析技术,其取决于内毒素及多糖的水平及期待的纯度。
本文公开的离子交换层析材料的支持基质不是严格的,然而,基于葡聚糖、纤维素、交联葡聚糖、合成的有机聚合物、涂布的二氧化硅或者琼脂糖的支持物基质在本领域中是常规的并适于在此的用途。
亲和层析
如前文所记录的,亲和层析能够额外地或者可选地采用,以纯化所述的生物样品。本发明的一个特别的方面涉及使用本文描述的多肽的荚膜异多糖酸降解方法,以及使所消化的材料与亲和层析材料组合,以选择性地去除消化的多糖,如荚膜异多糖酸。尤其优选的亲和层析材料对连二醇或者顺式二醇具有亲和性。在一个特别的实施方案中,所述亲和层析材料为硼酸盐层析树脂,如基于硼酸或者基于硼酸盐的树脂。
在基本的方面,所述亲和层析涉及选择性的吸附剂的制备,所述制备通过使分子共价地固定化在适用的不溶的支持物上,所述分子含有可识别的区域,对于进行分离的靶样品,该区域是特异的。所述固定化的化合物通常指配体,以及公认地所述配体与支持物的偶联必须以不影响其被目标识别的能力的方式完成。在配体及要纯化的目标分子之间的亲和性可以通过使含有样品的样品通过含有选择性吸附剂的柱完成,后者样品包括目标分子。随后通过使用缓冲液洗涤柱完成纯化,所述缓冲液用于将不需要的材料从吸收性基质中释放,随后将吸收的目标分子洗脱。通过将一定体积的生理缓冲溶液,例如pH约7.2的磷酸盐缓冲液通过该柱完成洗涤。在洗涤步骤中所使用的缓冲液的体积不应该大到使目标分子损失的地步,然而从另一方面来说,也不应该有限到不去除杂质的地步。洗脱是将目标分子从柱上去除的步骤,其通过溶剂进行,所述溶剂减少目标分子与配体的亲和性或者配体-靶分子复合物的分子与固体支持物的亲和性。与抗原偶联的抗体的洗脱可以通过盐梯度以改变pH;缓冲的步骤梯度以改变离子强度;或者其他方法完成。
理想的固体支持物或者基质应该具有几个性质,包括大孔性、机械稳定性、容易活化、疏水性以及惰性,也即低的特异性吸收。在这些全部的方面中,没有基质是理想的;基质通常按照经验确定。本领域技术人员通常使用的亲和层析基质包括交联葡聚糖,琼脂糖,聚丙烯酰胺,纤维素,二氧化硅以及聚(甲基丙烯酸羟乙酯)。对于免疫吸附而言,珠状的琼脂糖由于其高的蛋白质吸收能力、高孔性、亲水性、化学稳定性、缺少电荷以及对于非特异性吸收的相对惰性,通常地为本领域技术人员优选的固体支持物。
配体可以物理地吸附到基质上,或者共价地与含有羟基或者氨基的聚合物基质通过双官能的试剂连接。连接通常需要两步:基质的活化和配体与活化的基质的偶联。活化的基质是商业上可得的。将配体偶联到基质上的选择性方法部分地由基质的选择决定,部分地由配体的选择决定。
在用于样品施用的制备中,用于平衡亲和柱的特异性的缓冲条件应该反应所使用的作用体系的特异性质。所使用的缓冲液的性质,包括其pH及离子强度,应该对于所述配体-靶分子体系是最优的。应用于柱的目标样品应该优选地包含于与用于平衡柱一样的缓冲液中。在样品施用以及吸附之后,柱可以使用开始的缓冲液洗涤以去除任何未结合的样品及任何杂质。随后将柱用与开始的缓冲液不同的缓冲液洗涤也是常见的,其用于去除非特异性吸附的物质。
靶分子的洗脱可以通过多种方法完成,其包括但不限于在此所列出的这些。典型地,缓冲液的条件可以变化,从而结合复合物的亲和充分地下降,从而破坏彼此或者与固体支持物的有效结合。这通过改变缓冲液的pH或者离子强度,或者两者,或者通过离液序列高的离子,例如氰酸盐来实现。可以通过梯度洗脱获得增强的分离。适用的洗脱方法包括使用:离液序列高的试剂如KSCN;有机溶剂如乙二醇、DMSO或者乙腈;变性剂,如8M尿素或者6M鸟嘌呤;电泳洗脱;压力引发的洗脱以及金属离子洗脱。不完全的洗脱导致产品的损失以及柱容量的损失。理想地,洗脱条件应该在一个或者两个柱体积通过柱之后,实现产品的完全洗脱。
亲和层析的详细讨论可以见于HandbookofAffinityChromatography,DavidS.Hage(ed.)CRCPress(2006)和AffinityChromatography:APracticalApproach,编辑为DeanP.D.G.,Johnson,W.S.,Middle,F.A.,AffinityChromatography,PrinciplesandMethods,由Pharmacia出版,(PharmaciaLKBBiotechnology,Uppsala,Sweden),以及ImmunoaffinityPurification:BasicPrinciplesandOperationalConsiderations,Yarmush,M.L,等人,(1992)BiotechAdv.,10:412-446。
用于亲和层析的配体在结构上及生物学上与所要纯化的靶分子紧密联系。出于本发明的目的,可以采用任何适用的亲和层析材料及其配体,从而将目标样品(如质粒DNA)结合并洗脱。一般地说,这进行对每个情况特异的配体的选择。
优选地,用于亲和层析材料的配体对于二醇复合物具有特异性,其优选地为连二醇或者顺式二醇。多糖,例如,如荚膜异多糖酸含有连二醇复合物。在特别地优选的实施方案中,所述亲和层析材料为硼酸盐亲和层析材料。硼酸盐亲和柱首先被Weith等人,Biochemistry9,4396-4401,1970用于糖和核酸组分的分离;此后,该技术用于广泛范围的顺式二醇化合物的分离,所述化合物包括核苷、核苷酸、碳水化合物、糖蛋白以及酶。
一般来说,硼酸与顺式二醇之间的作用机理涉及硼酸盐在碱性条件下的羟基化;所述硼酸盐从三角形共面形式变为四面体硼酸盐阴离子,其随后能够与顺式二醇形成酯。所得到的酯可以在酸性条件下水解,从而将此反应逆转。其他的用于制备连二醇的方法描述于Barry等人的,AustralianJ.Chem.37,(1984);Gable,Organometallics13(6),248688(1994);Liu,J.MicrobialMethods29,85-95(1997)Kinrade等人,DaltonTrans.3713-3716(2003);以及Zhao等人的,AnalyticalSciences,22(5),747(2006)中。
用于本方法中的亲和层析材料的适用的硼酸盐配体包括,例如3-氨基苯基硼酸(3aPBA),2-(((4-二羟硼基苯基)-甲基)乙基氨基)乙基,2-(((4-二羟硼基苯基)-甲基)二乙基氨基)乙基,p-(ω-氨基乙基)苯基-硼酸盐,聚(对乙烯基苄基硼酸),N-(4-硝基-3-二羟基硼基苯基)琥珀酸,4-(N-甲基)羧酰胺-苄基硼酸),3-硝基-4-羧酰基苄基硼酸,2-硝基-3-琥珀酰胺基-苄基硼酸以及3-琥珀酰胺基-4-硝基苄基硼酸等等。一种优选的硼酸盐配体为3-氨基苯基硼酸(3aPBA).
本文公开的用于亲和层析材料的一类支持物基质包括硼酸盐亲和层析材料,这不是严格的,然而基于葡聚糖、纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺、二氧化硅、聚苯乙烯以及聚甲基丙烯酸酯的支持基质在本领域中是常规的,并适用于本文应用。硼酸盐亲和基质在多个商家处可以商业上得到,包括例如Sigma-AldrichInc.(硼酸凝胶;聚甲基丙烯酸酯支持物)(间氨基苯基硼酸-丙烯酸酯;丙烯酸珠支持物);Bio-Rad(Affi-Gel601;聚丙烯酰胺支持物);Pierce(免疫的硼酸凝胶;聚丙烯酰胺支持物);以及Tosoh(间氨基苯基硼酸-琼脂糖;琼脂糖支持物)(TSKgel硼酸盐-5PW柱;聚甲基丙烯酸酯支持物)。其他提供硼酸及其衍生物的公司包括Denisco(Hyderabad,India)以及SynthonixCorporation(WakeForest,NC)。
描述于美国专利No.5,969,129(在此以其全文结合作为参考)中的含有硼酸盐基团的聚合物凝胶也可以使用。
用于硼酸盐亲和层析的原理、理论及设备也描述于BoronateAffinityChromatography,Chapter8,pages215-230,HandbookofAffinityChromatography,DavidS.Hage(ed.)CRCPress(2006)。
疏水相互作用层析法
在采用了疏水相互作用层析(HIC)材料和方法的实施方案中,这些层析方法通常地采用基质上的疏水部分吸引用于纯化的样品中分子的疏水区域。一般来说,HIC支持物要通过聚集效果起效,典型地,当这些分子结合的时候,,没有共价键或者离子键形成或者共享。疏水相互所用层析是有利的,这是由于其至少部分地去除开环的质粒形式以及其他污染物,如基因组DNA、RNA以及内毒素。
出于本发明的目的,可以采用任何适用的疏水相互作用基质,用于目标样品(如质粒DNA)结合并洗脱。该疏水相互作用基质包括,但不限于天然的或者人工的表面,所述表面含有无电荷的基团,如甲基、乙基或者其他烷基基团。这些基团与蛋白质形成疏水键,所述蛋白质通过基质,并导致多核苷酸和/或多肽的分离,该分离基于所述多核苷酸和/或多肽与基质基团之间的相互作用的强度。树脂材料的疏水性程度可以根据培养基中的盐浓度或者洗脱液中的盐浓度而变化。疏水相互作用柱通常地包括基础基质(例如交联的琼脂糖或者合成的共聚物材料),疏水性的配体(如烷基或者芳基)偶联于其上。优选的疏水相互作用层析树脂通常地包括2到20个碳原子长的烷基部分(如4到18个碳原子或者6到15个碳原子),其典型地是未取代的。
用于疏水相互作用层析的基体材料的孔直径通常在500到然而其可以在所述的范围内,根据要分离的样品及其组分的分子尺寸进行适当的选择。一般来说,由于核酸在填充材料上的保留以及吸附能力可能根据孔直径变化,优选地对于具有相对地大的分子尺寸的核酸使用具有相对地大的孔直径的基体材料,而对于具有相对地小的分子尺寸的核酸使用具有相对地小的孔直径的基体材料。
疏水相互作用层析可以在低压或者高压下进行,其中所述柱在含水缓冲液的存在下使用相对高的盐浓度(如1.2到1.7M硫酸铵)平衡,并在含水缓冲液的存在下使用相对低的盐浓度(如从1.2M到0.5M降低的硫酸铵梯度)洗脱。因此,多核苷酸以及多肽根据与基质上的疏水基团之间疏水相互作用的不同强度洗脱,也即按照蛋白质疏水性提高的顺序。用于相对低压的应用的商业上可得的疏水相互作用基质的例子包括phenylSEPHAROSE(Pharmacia)以及丁基、苯基以及醚TOYOPEARL650系列树脂(TosoHaas)。其他的商业上可得的疏水相互作用层析树脂包括PhenylSEPHAROSE6FASTFLOWTM柱,其具有低度或者高度的修饰(PharmaciaLKBBiotechnology,AB,Sweden);PhenylSEPHAROSETMHighPerformancecolumn(PharmaciaLKBBiotechnology,AB,Sweden);OctylSEPHAROSETMHighPerformancecolumn(PharmaciaLKBBiotechnology,AB,Sweden);FRACTOGELTMEMDPropyl或FRACTOGELTMEMDPhenylcolumns(E.Merck,Germany);MACRO-PREPTMMethyl或MACRO-PREPTMt-ButylSupports(Bio-Rad,California);以及WPHI-Propyl(C3)TMcolumn(J.T.Baker,NewJersey).再其他的商业上可得的疏水相互作用层析树脂为可得自Sigma-Aldrich,Inc(St.Louis,MO)的(例如,Butyl-NPR;Ether-5PW;Phenyl-5PW;其各个及其他可能具有多种颗粒尺寸),GEHealthcare(Piscataway,NJ)(例如,HiScreenPhenylFF(highorlowsub);HiScreenButylFF;HiScreenButyl-SFF;HiScreenOctylFF)。
从疏水相互作用基质的洗脱可以按照分步的或者线性梯度来进行。适用的洗脱缓冲液在现有技术中是公知的。适用的柱的尺寸与离子交换层析材料一起描述于前文。类似地,本文公开的疏水相互作用层析材料的支持物基质不是严格的,然而,基于葡聚糖、纤维素、交联琼脂糖、合成的有机聚合物、涂布的二氧化硅或者琼脂糖的支持物基质在本领域中是常规的并适于在此的用途。
用于疏水相互作用层析的基体材料的合成以及用于制备、聚合及功能化疏水相互作用层析及洗脱和分离如质粒DNA样品的方法在现有技术中是公知的,并尤其描述于美国专利No.6,441,160以及美国专利No.7,169,917中(其各自在此以其全文结合作为参考)。
过滤
根据特定的优选实施方案,也可以进行一次或者多次过滤、超过滤或者渗滤步骤,包括切向流过滤。通过尺寸排阻滤器的过滤可以用于至少部分地去除内毒素及其他污染物,而导致最小程度上的核酸损失。对于多种应用,例如可能期待进一步地纯化样品(如质粒DNA),降低所得的样品的盐浓度,将所述样品浓缩,和/或将缓冲液换为更适宜的缓冲液用于随后应用。对于治疗上的应用,如在基因疗法中的应用,可以期待将得自切向流过滤或者其他步骤的核酸进一步地纯化。
可以进行一次或者多次(开始或最后)的过滤、超过滤或者渗滤,从而通常地获得该结果(或者多种结果)。如果期待,可以将更小的MWCO超过滤膜用于随后的或者最终的渗滤步骤,而不是此前用于开始的纯化,由于核酸典型地在稍后的阶段是高度纯化的,以及主要地小的溶解质分子通过膜进入滤液中。对于多种质粒DNA中,例如,可以使用10,000到100,000MWCO或者更大的膜。具有约100,000MWCO的膜的空纤维设备是常用的,尤其当处理浓缩的核酸溶液时,这是由于更小的滞留容量,增加的流量,更高的产量以及更短的处理时间。根据本领域已知的标准技术,标准的,商业上可得的过滤及渗滤材料适用于此方法中。
细微颗粒尺寸的污染物从流体中的过滤已经通过使用不同的多孔滤器介质完成,污染的组合物通过所述介质,从而滤器留下污染物。污染物的滞留可以通过机械过滤或者电动的颗粒捕获及吸附发生。在机械过滤中,颗粒当其试图通过小于其的孔时,被物理捕获而截留。在电动的捕获机制中,所述颗粒与多孔滤器中的表面碰撞,并通过短程吸引力留在表面上。为了实现电动捕获,可以使用电荷修饰的系统以改变滤器的表面电荷特征(参见例如WO90/11814)。例如,要去除的污染物为阴离子的时,可以使用阳离子的电荷改性剂来改变滤器的电荷特征,从而使得污染物被滤器截留。
在特定的实施方案中,在过滤之前或者之后,样品使用含有两性离子去污剂的含水溶液进行处理。适用的两性离子剂包括例如EMPIGEN(正十二烷基-N,N-二甲基甘氨酸),3-08,3-10,3-12,3-14,3-16,CHAPS,CHAPSO以及其他。
在一个优选的实施方案中,所述样品使用切向流过滤进行过滤。用于切向流过滤的原理、理论以及设备描述于Michaels,S.L.等人的,"TangentialFlowFiltration"inSeparationsTechnology,PharmaceuticalandBiotechnologyApplications,W.P.Olson,ed.,InterpharmPress,Inc.,BuffaloGrove,Ill.(1995).为了将样品通过切向流过滤进行过滤及浓缩,例如,通常选择膜,所述膜具有的分子量截留值(MWCO)基本上低于要保留的分子的分子量。一般的规律是选择的膜具有比要保留的分子的分子量低3到6倍的分子量截留值。装载所述膜,将切向流过滤系统初始化(通常地使用水冲洗并测试水过滤的流速及完整性),将样品加入,建立切向流,设置进料及保留压强,并收集滤液。当达到期待的浓度或者体积时,停止该过程并回收样品。
一个优选的过滤方法为使用超过滤膜的渗滤,所述膜具有30,000到500,000MWCO的分子量截留值,这取决于质粒的尺寸。该渗滤步骤使得在浓缩之前可以进行缓冲液交换。如前所述地,典型地使用切向流过滤将洗脱液浓缩3到4倍至目标浓度,其中使用例如30kD的膜截留值,该浓度通过渗滤在恒定的体积下进行缓冲液交换,并调节到到目标质粒浓度。所得的质粒DNA溶液可以随后进一步过滤,例如,通过0.2μm滤器,并典型地分为几个等份,其储存于相对冷的温度(如~0°C)下的容器中,直至进行进一步的处理。
附加地或者可选地,所述滤器可以为结合核酸的,同时允许内毒素及其他的污染物通过所述滤器。一旦不想要的材料通过所述滤器,可以将核酸从滤器上洗脱并收集。
适用的尺寸排阻滤器可得自多个商业来源,其包括例如Ambion(Austin,TX),GEHealthcare(Piscataway,NJ),Gelman(AnnArbor,Mich.),Pall-Filtron(EastHills,N.Y.),Roche(Basel,Switzerland),Sartorius(Edgewood,N.Y.),以及ThermoScientificPierce(Rockford,IL)。所使用的滤器是这样的一种:其结合内毒素及其他污染物而允许核酸通过。已经发现了Pall滤器去除几乎全部内毒素而核酸产率高。在一次或者更多次本文描述的层析或者过滤步骤之前,含有核酸的裂解液溶液或者裂解液衍生物也可以预先过滤(如使用0.45μm滤器)。
根据前述的规程纯化的DNA要与脂质载体复合以用于基因疗法时,例如,将DNA交换进入低电导率的缓冲液中可能是期待的,其优选地通过渗滤进行。低电导率的缓冲液意味着包括低于10mS的任意缓冲液,其优选地低于约1mS。
除了前文所述的过滤技术外,也可以采用常规的过滤方法(也即尺寸排阻层析材料)。参见,例如GelFiltrationPrinciplesandMethods,EditionAI,AmershamBiosciences,2002。
本文描述的多肽可以额外地或者可选地用于多种工业上的过程中,所述过程要求或者受益于荚膜异多糖酸或者其他多糖的消化。一般而言,这可能涉及处理机器、产品和/或洗脱管线及产品、中间产物或者带有本文描述的多肽的流出物,从而例如去除或者防止这些工业过程中导致的腐蚀,污垢或者其他的累积。一个特别的实例是生物膜的去除或者预防(例如,那些含有细菌如革兰氏阴性细菌的),所述生物膜可能在过程中或者随着时间形成;生物膜及类似的材料可以使通道及导管变窄或者堵塞,或者增加机器部件或者系统的磨损。可以从本文描述的多肽使用中受益的代表性工业上的过程包括,例如,纸及纤维素制造过程,膜重建以及清洁,循环,水-水处理(如需氧固体及泥渣的消化),石油化学精制及废物修复,高纯度的水过滤及系统,水冷却系统/热交换器,以及食物处理。对于纸或者纤维素处理操作,例如,生物膜可能在中间产物处理液流中形成,其可能不利地影响下游处理和/或影响最终产品的质量。本文描述的多肽可以通过去除、最小化或者预防此类生物膜使该过程受益。
多肽
如前文所记载地,本发明涉及能够降解荚膜异多糖酸的多肽,所述荚膜异多糖酸可在如生物材料中发现。这可以包括如得自细菌的生物膜或者细菌核酸制备物,所述细菌如大肠杆菌,沙门氏菌或者其他的肠细菌,所述制备物如得自大肠杆菌的质粒DNA。本文描述的多肽也有益地使得高纯革兰氏阴性细菌质粒DNA制备物的制备成为可能。
在特定的实施方案中,所述多肽包括大致地对应于SEQIDNO:1及其保守的氨基酸替换的氨基酸序列。该多肽通常地对应于全长的荚膜异多糖酸降解多肽,所述多肽具有约84,354道尔顿的分子量。一般而言,所述多肽为分离的多肽。在特定的实施方案中,所述多肽分离自细菌来源的生物体,并经过纯化。典型地,多肽具有至少70%的纯度,该纯度更优选地为至少80%,更优选地为至少90%,更优选地为至少95%,更优选地为至少98%,更优选地为至少99%。
本文提供多肽片段。该片段例如当与全长蛋白比较时,可以是在N-端或者C-端截断的,或者可以缺少内部残基。例如,特定片段缺少对于多肽所期待的活性(例如生物的或其他)并非必需的氨基酸残基。在一个特定的实施方案中,所述多肽包含大致地对应于SEQIDNO:2及其保守氨基酸替换的氨基酸序列。该多肽大致地对应于全长多肽的截短的形式,其中缺少全长多肽(SEQIDNO:1)的开头的106个氨基酸。
除了本文描述的全长的及截短的多肽,还考虑了可以制备多肽变体,例如通过向多肽DNA中引入合适的核苷酸变化,和/或通过期待的多肽的合成,或者通过分离和纯化具有荚膜异多糖酸降解活性的变体多肽。本领域技术人员应意识到氨基酸的变化可能改变该多肽特定的翻译后加工,如改变糖基化位点的数量或位置或者改变膜锚定的性质。
本文描述的多肽全长和/或截短序列中的或者在各种结构域中的变化可以使用例如任意的技术和准则制造,所述技术及准则用于保守的和非保守的突变,其于文献中列出(例如美国专利No.5,364,934(以其全文在此结合作为参考))。变化可以为替换,删除或者插入一个或多个用于编码多肽的密码子,与天然序列多肽相比,其导致多肽氨基酸序列的变化。可选地,所述变化通过将一个或者多个功能域中至少一个氨基酸替换为任意其他的氨基酸。确定哪个氨基酸残基可以插入、替换或者删除而不会不利地影响期待的活性的指导能通过比较同源蛋白分子的序列与所述多肽的序列,并最小化高同源性的区域内氨基酸序列变化的数量来建立。氨基酸替换可以通过将一个氨基酸用另一个具有类似结构和/或化学性质的氨基酸替换来实现,例如将亮氨酸替换成丝氨酸,即保守的氨基酸替代。插入或者删除可以可选地在约1到5个氨基酸的范围,5到10个氨基酸的范围,10到25个氨基酸的范围,25到50个氨基酸的范围,或者更多,如100个氨基酸或者更多。所允许的变化可以通过以下确定:系统地在序列中产生氨基酸的插入、删除或者替换,然后通过全长的或者成熟的天然序列测试所得到的变体所体现的活性。
如前文所记载的,多肽可以为本文描述的全长的或者截短的多肽的变体。通常,多肽变体与本文公开的全长多肽序列(如SEQIDNO:1)具有至少约80%的氨基酸序列同一性,可选地至少约81%的氨基酸序列同一性,可选地至少约82%的氨基酸序列同一性,可选地至少约83%的氨基酸序列同一性,可选地至少约84%的氨基酸序列同一性,可选地至少约85%的氨基酸序列同一性,可选地至少约86%的氨基酸序列同一性,可选地至少约87%的氨基酸序列同一性,可选地至少约88%的氨基酸序列同一性,可选地至少约89%的氨基酸序列同一性,可选地至少约90%的氨基酸序列同一性,可选地至少约91%的氨基酸序列同一性,可选地至少约92%的氨基酸序列同一性,可选地至少约93%的氨基酸序列同一性,可选地至少约94%的氨基酸序列同一性,可选地至少约95%的氨基酸序列同一性,可选地至少约96%的氨基酸序列同一性,可选地至少约97%的氨基酸序列同一性,可选地至少约98%的氨基酸序列同一性,以及可选地至少约99%的氨基酸序列同一性。
对于截短的多肽变体而言,所述多肽变体与本文公开的截短的多肽序列(如SEQIDNO:2)具有至少约80%的氨基酸序列同一性,可选地至少约81%的氨基酸序列同一性,可选地至少约82%的氨基酸序列同一性,可选地至少约83%的氨基酸序列同一性,可选地至少约84%的氨基酸序列同一性,可选地至少约85%的氨基酸序列同一性,可选地至少约86%的氨基酸序列同一性,可选地至少约87%的氨基酸序列同一性,可选地至少约88%的氨基酸序列同一性,可选地至少约89%的氨基酸序列同一性,可选地至少约90%的氨基酸序列同一性,可选地至少约91%的氨基酸序列同一性,可选地至少约92%的氨基酸序列同一性,可选地至少约93%的氨基酸序列同一性,可选地至少约94%的氨基酸序列同一性,可选地至少约95%的氨基酸序列同一性,可选地至少约96%的氨基酸序列同一性,可选地至少约97%的氨基酸序列同一性,可选地至少约98%的氨基酸序列同一性,以及可选地至少约99%的氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中,所述多肽包含与SEQIDNO:1及其保守的氨基酸替换具有至少约90%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中,所述多肽包含与SEQIDNO:1及其保守的氨基酸替换具有至少约95%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中,所述多肽包含与SEQIDNO:1及其保守的氨基酸替换具有至少约98%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中,所述多肽包含与SEQIDNO:1及其保守的氨基酸替换具有至少99%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中,所述多肽包含与SEQIDNO:2及其保守的氨基酸替换具有至少约90%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中,所述多肽包含与SEQIDNO:2及其保守的氨基酸替换具有至少约95%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中,所述多肽包含与SEQIDNO:2及其保守的氨基酸替换具有至少约98%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中,所述多肽包含与SEQIDNO:2及其保守的氨基酸替换具有至少约99%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在特定的实施方案中,示例性的目标保守替换列于表1中。如果该替换导致了生物活性的变化,或者期待的活性的变化,可以引入更多其它的变化,如描述于下文作为氨基酸类别参考的,并对产品进行筛选。不言而喻的,能够编码该保守替换的密码子在本领域内已知的。
表1
原始的残基 |
保守替换 |
Ala(A) |
Ser;Val;Leu;Ile |
Arg(R) |
Lys;Gln;Asn |
Asn(N) |
Gln;His;Lys;Arg |
Asp(D) |
Glu |
Cys(C) |
Ser;Ala |
Gln(Q) |
Asn |
Glu(E) |
Asp |
Gly(G) |
Pro;Ala |
His(H) |
Asn;Gln;Lys;Arg |
Ile(I) |
Leu;Val;Met;Ala;Phe;正亮氨酸 |
Leu(L) |
Ile;Val;Met;Ala;Phe;正亮氨酸 |
Lys(K) |
Arg;Gln;Glu;Asn |
Met(M) |
Leu;Ile;Phe |
Phe(F) |
Leu;Val;Ile;Ala;Met;Tyr |
Pro(P) |
Ala |
Ser(S) |
Thr |
Thr(T) |
Ser |
Trp(W) |
Tyr;Phe |
Tyr(Y) |
Trp;Phe;Thr;Ser |
Val(V) |
Ile;Leu;Met;Phe;Ala;正亮氨酸 |
在本发明的范围之内,通过氨基酸替换达到本发明的多肽类似物,所述替换基于氨基酸侧链取代基的相对类似性,如其疏水性,亲水性,电荷,尺寸等等。在进行氨基酸替换中,可以考虑的一个因素是氨基酸的亲水指数。Kyte和Doolittle讨论了氨基酸亲水指数在赋予蛋白质相互作用的生物功能中的重要性(J.Mol.Biol.,157:105-132,1982)。公认的是,氨基酸的相对亲水性质对所产生的蛋白质的二级结构有贡献。这因此影响了蛋白质与分子的相互作用,所述分子如酶,底物,受体,DNA,抗体,抗原等等。
基于其亲水性及电荷特征,为各个氨基酸指定了如下的亲水指数:异亮氨酸(+4.5);缬氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);苏氨酸(-0.7);丝氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);组氨酸(-3.2);谷氨酸/谷氨酰胺/天冬氨酸/天冬酰胺(-3.5);赖氨酸(-3.9);以及精氨酸(-4.5)。
在现有技术中已知在肽或者蛋白质中,特定的氨基酸可以替换具有类似的亲水指数或者分数的其他氨基酸,并因而产生具有类似的生物活性的肽或者蛋白质,也即其仍保持生物功能。在进行这种变化时,优选地具有±2以内的亲水指数的氨基酸互相替换。更优选的替换为其中氨基酸具有±1以内的亲水指数的那些替换。最优选的替换为其中氨基酸具有±0.5内的亲水指数的那些替换。
相似的氨基酸也可以按照亲水性进行替换。美国专利No.4,554,101公开了蛋白质的最大局部平均亲水性与蛋白质的生物性质有关,所述亲水性由其相邻的氨基酸的亲水性支配。为氨基酸分配了随后的亲水性数值:精氨酸/赖氨酸(+3.0);天冬氨酸/谷氨酸(+3.0±1);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺/谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);苏氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5±1);丙氨酸/组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸/异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);以及色氨酸(-3.4)。因此在肽、多肽或者蛋白质中的一个氨基酸可以由另一个具有类似的亲水性分数的氨基酸替换,而仍然产生具有类似的生物活性的得到的蛋白质,也即仍然保持正确的生物功能。在进行该变化中,具有±2以内的亲水指数的氨基酸优选地互相替换,具有±1以内的更为优选,以及具有±0.5以内的最为优选。
本发明的多肽在功能中或者生物学或其他特征中的实质上或者小的改变也通过选择在其效果上显著区别的替换完成,所述效果为在保持下列的效果(除了别的之外):(a)多肽骨架在替换区域内的结构,例如,折叠或者螺旋构型;(b)在目标位点上的分子的电荷或者亲水性;或者(c)侧链的大小。天然产生的残基按照其一般的侧链性质划分成组:(1)疏水的:正亮氨酸,met,ala,val,leu,ile;(2)中性亲水的:cys,ser,thr;(3)酸性的:asp,glu;(4)碱性的:asn,gln,his,lys,arg;(5)影响链的定向的残基:gly,pro;以及(6)芳香性的:trp,tyr,phe。
非保守的替换通常地需要将这些种类之一的一个成员换为另一种类。该替换的残基也可以被引入保守的替换位点中,或者更优选地,引入到剩余的(非保守)位点中。
在一个实施方案中,例如在描述于SEQIDNO:1,2,3,4,5和/或6的氨基酸序列中,氨基酸亮氨酸(L)可以可选地为亮氨酸(L)或者异亮氨酸(I),氨基酸天冬氨酸(D)可以可选地为天冬氨酸(D)或者天冬酰胺(N),氨基酸谷氨酰胺(Q)可以可选地为谷氨酰胺(Q)或者赖氨酸(K),以及氨基酸苯丙氨酸(F)可以可选地为苯丙氨酸(F)或者氧化的甲硫氨酸。
可以使用现有技术中已知的方法进行改变,除了其他的已知技术,如丙氨酸扫描,寡核苷酸介导的(定点的)诱变以及PCR诱变。定点诱变,例如(参见例如Carter等人,Nucl.AcidsRes.,13:4331(1986);Zoller等人,Nucl.AcidsRes.,10:6487(1987)),盒诱变(参见例如Wells等人,Gene,34:315(1985)),限制性选择诱变(参见例如Wells等人,Philos.Trans.R.Soc.LondonSerA,317:415(1986))或者其他能在克隆的DNA上进行以产生CAE变体DNA的已知技术。也可以采用扫描氨基酸分析鉴定连续序列上的一个或者多个氨基酸。优选的扫描氨基酸为相对小的、中性的氨基酸。该氨基酸包括丙氨酸,甘氨酸,丝氨酸以及半胱氨酸。在该组中,丙氨酸是典型地优选的扫描氨基酸,这是由于其消除了β-碳上的侧链并较不可能改变变体的主链构型(参见例如Cunningham和Wells,Science,244:10811085(1989))。丙氨酸也由于其是最常见的氨基酸,所以是典型地优选的。进一步地,经常发现其在包埋以及暴露的位置中(参见Creighton,TheProteins,(W.H.Freeman&Co.,N.Y.);Chothia,J.Mol.Biol.,150:1(1976))。如果丙氨酸替换得不到足够量的变体,或者所得的多肽的荚膜异多糖酸降解能力减少或者不存在,可以使用另一个氨基酸。
本文描述的多肽的共价修饰也包括于本发明的范围内。一种类型的共价修饰,例如包括将多肽的目标的氨基酸残基与有机衍生化试剂反应,所述试剂能够与多肽的选择的侧链或者N-或者C-末端残基反应。使用双功能试剂的衍生化是有用的,例如用于将多肽(或者多个多肽)交联至水不溶性支持物基质,用于纯化抗CAE的抗体的方法中,反之亦可。常用的交联试剂包括,例如1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷,戊二醛,N-羟基琥珀酰亚胺酯,例如,和4-叠氮水杨酸的酯、双同官能团的亚氨酸酯,包括二琥珀酰亚胺酯如3,3'-二巯基双(琥珀酰亚胺丙酯),双官能团的马来酰亚胺如双-N-马来酰亚胺-1,8-辛烷以及如甲基-3[(对叠氮苯基)二硫代]propioimidate等试剂。在一个特定的实施方案中,本文描述的特定多肽的C-末端异亮氨酸可以去除或者删除,从而将末端的酪氨酸暴露,所述酪氨酸可以用于例如将多肽与不可溶的基质交联,该交联为直接的或者通过间隔区,从而形成亲和树脂或者固定化的树脂。
其他的修饰包括,例如谷氨酰胺酰基残基及天冬酰胺酰基残基分别地脱酰胺成为相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基,脯氨酸和赖氨酸的羟基化,丝氨酰或者苏氨酰残基的羟基的磷酸化,赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(参见例如T.E.Creighton,Proteins:StructureandMolecularProperties,W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,pp.7986(1983)),N-末端氨基的乙酰化,以及任何C-末端羧基的酰胺化。
本文描述的并在本发明的范围内的多肽的另一种共价修饰包括改变多肽天然的糖基化形式。通常,改变天然的糖基化形式涉及将多肽(例如全长的)序列中发现的一个或者多个糖类部分删除(通过去除下面的糖基化位点或者通过化学的和/或酶的手段删除糖基化);和/或加入一个或者多个糖基化位点,所述位点在多肽序列中是不存在的。除此之外,其可以包括天然的蛋白质中糖基化的定量变化,所述变化涉及各种可能存在的糖类部分的性质和组成的相应变化。
将糖基化位点加到本发明的多肽上可以通过改变氨基酸序列完成。所述变化可以,例如通过一个或者多个丝氨酸或者苏氨酸残基加入或者替换到多肽序列中(用于O-连接的糖基化位点)形成。本文描述的氨基酸序列(例如SEQIDNO.1,SEQIDNO.2,等等)可以可选地通过在DNA水平上的改变而变化,尤其通过将编码该多肽的DNA在预先选择的碱基上突变,从而产生能够翻译为期待的氨基酸的密码子。
另一种在多肽上增加糖类部分的方式是通过将配糖物通过化学的或者酶的偶联到多肽上。该方法一般描述于现有技术中,例如在PCT国际公开No.WO87/05330中,以及Aplin和Wriston,CRCCrit.Rev.Biochem.,pp.259306(1981)中。
存在于本文描述的多肽上的糖类部分的去除可以化学地或者酶促地完成,或者通过密码子的突变替换完成,所述密码子编码作为糖基化靶点的氨基酸残基。化学去糖基化技术在本领域中已知,并由例如Hakimuddin等人,Arch.Biochem.Biophys.,259:52(1987)以及Edge等人,Anal.Biochem.,118:131(1981)描述。多肽上的糖类部分的酶促切割可以通过使用多种内切及外切糖苷酶实现,如Thotakura等人,Meth.Enzymol.,138:350(1987)中所描述的。
另一种共价修饰包括将本文描述的多肽与多种非蛋白质的聚合物连接,所述聚合物如聚乙二醇(PEG),聚丙二醇或者聚氧化烯,其以美国专利No.4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192或者4,179,337中指出的方式(其各个在此结合作为参考)。
额外地或者可选地,本发明的多肽也可以以形成嵌合分子的形式修饰,所述嵌合分子包含与另一个异种多肽或者氨基酸序列融合的多肽。多肽也可以使用方便其检测的试剂标记。例如,所述试剂可以与荧光标签结合(例如,Prober等人,Science238:336-340(1987);Albarella等人,EP0144914);化学标记(例如,Sheldon等人,美国专利No.4,582,789;Albarella等人,美国专利No.4,563,417);和/或修饰的碱基(例如Miyoshi等人,EP0119448)(其各个在此以其全文结合作为参考)。
在一个实施方案中,该嵌合分子包括多肽与标签多肽的融合,所述标签多肽提供抗-标签的抗体能够选择性地结合的表位。所述表位标签通常位于所述多肽氨基酸序列的氨基末端或者羧基末端。该表位标签形式的多肽能够使用针对该标签多肽的抗体检测。该表位标签的提供也使得多肽能容易地通过亲和纯化进行纯化,所述纯化使用抗标签的抗体或者其他类型的与该表位标签结合的亲和基质。在本领域中,不同的标签多肽及其相应的抗体是公知的。实例包括c-myc标签及其抗体8F9,3C7,6E10,G4,B7和9E10(参见例如Evan等人,MolecularandCellularBiology,5:36103616(1985)),流感HA标签多肽及其抗体12CA5(参见例如Field等人,Mol.Cell.Biol.,8:21592165(1988));单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(参见例如Paborsky等人,ProteinEngineering,3(6):547553(1990));和聚-组氨酸(poly-his)或者聚-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签。其他的标签多肽包括α-微管蛋白表位肽(参见例如Skinner等人,J.Biol.Chem.,266:1516315166(1991));-肽(Sigma-Aldrich,Inc.(St.Louis,MO);也参见Hopp等人,BioTechnology,6:12041210(1988));KT3表位多肽(参见例如Martin等人,Science,255:192194(1992));以及T7基因10蛋白质肽标签(Lutz-Freyermuth等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:63936397(1990))。
为了便于分离和/或纯化,例如,可以使用本领域技术人员熟知的基因工程技术,将氨基酸标签加到本文描述的多肽上。在特定的实施方案中,例如,多肽(或多个多肽)可以在蛋白质氨基或者羧基末端包括一个或多个,以及更优选地6个连续的组氨酸残基。该连续的组氨酸残基通常称作组氨酸标签。末端的连续组氨酸残基可以便于表达的重组蛋白的检测和/或纯化,并通常不妨碍蛋白质的功能/活性/结构。所述连续的组氨酸残基可以通过带有三个的5'-CAT-3'的引物而加入到编码蛋白质的基因中。在任一末端的连续组氨酸残基对于使用固定化的金属亲和层析纯化蛋白质而言,是方便的辅助方式,所述层析利用氨基酸组氨酸结合螯合的过渡金属离子的能力,所述金属离子例如镍(Ni2+),锌(Zn2+)以及铜(Cu2+)。如前文所记载的,其他的技术包括,但不限于用于多克隆或者单克隆抗体的标位,所述表位包括但不限于T7表位,myc表位以及V5a表位;以及将本文描述的多肽与适用的蛋白质配偶体融合,所述配偶体包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶或者麦芽糖结合蛋白。在特定的实施方案中,所述氨基酸序列包括亲和标签,使得可以分离及纯化该蛋白质,所述标签例如为GST标签,His标签,标签或者XPRESSTM签;在特定的优选实施方案中,所述亲和标签包括His标签(也即一个或者多个,优选地六个组氨酸残基)(参见例如SEQIDNO:3或者SEQIDNO:4),一个或多个拷贝的八肽(DYKDDDDK)(参见例如SEQIDNO:5),或者XPRESSTM八肽(DLYDDDK)。这些额外的氨基酸序列可以加到所述多肽的C-末端,以及N-末端,或者在多肽中干预位置。
在一个可选的实施方案中,所述嵌合分子可以包括多肽与免疫球蛋白或者免疫球蛋白特定区域的融合体。对于所述嵌合分子的二价形式(也称作“免疫吸附”),该融合可能发生在IgG分子的Gc区域。所述Ig融合体优选地包括可溶(跨膜域删除的或者失活的)形式的多肽替换Ig分子中至少一个可变的区域。在一个特别的实施方案中,所述免疫球蛋白融合体包括IgG1分子的铰合部(hinge),CH2及CH3,或者铰合部,CH1、CH2以及CH3区域。免疫球蛋白融合体的产生,也见于美国专利No.5,428,130;美国专利No.6,165,476;美国专利No.6,444,792;美国专利No.7,442,778;以及美国专利No.7,465,447(其各个在此以其全文结合作为参考)。
多肽的制备
全长的多肽(包括,例如包含对应于SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽)以及多肽片段(包括例如包括对应于SEQIDNO:2的氨基酸序列的截短的多肽)可以通过多种传统技术的任一种制备。本发明的多肽通常可以通过培养宿主细胞制备,所述宿主细胞转化了或者转染了含有编码所期待的多肽的多核苷酸的载体。在特定的实施方案中,所述载体选自质粒,病毒以及噬菌体;在本实施方案中更优选地,所述载体为噬菌体(参见例如实施例2)。用于多肽制备的制备载体的制备方法,以及尤其噬菌体的制备方法在本领域中是公知的。
一般,宿主细胞如细菌被本文描述用于多肽产生的表达载体或者克隆载体转染或者转化,并在常规的营养培养基中培养,所述培养基经改变而对于引入增强子、选择转化体或者扩增编码期待的序列的基因是适合的。培养条件,如培养基,温度,pH等等,可以由有经验的技术人员在无过度的实验下选择。通常,用于使细胞培养物产量最大化的原理、规程及实用技术可见于MammalianCellBiotechnology:aPracticalApproach,M.Butler,ed.(IRLPress,1991)以及上述Sambrook等人。
真核细胞转染或原核细胞转化的方法对于普通技术人员是已知的,如CaCl2、CaPO4、脂质体介导的以及电穿孔。取决于所使用的宿主细胞,转化使用相对于该细胞合适的标准的技术进行。钙处理采用氯化钙,如前述Sambrook等人所描述的,或者例如电穿孔,其通常用于原核细胞。将使用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefacien)的感染用于特定植物细胞的转化,其为按照Shaw等人,Gene,23:315(1983)以及PCT国际公开No.WO89/05859所述的。对于不具备该细胞壁的哺乳动物细胞,可以采用Graham和vanderEb,Virology,52:456457(1978)中的磷酸钙沉淀方法。哺乳动物细胞宿主系统转染的一般方面类似地描述于美国专利No.4,399,216中(在此以其全文结合作为参考)。进入酵母的转化通常地根据VanSolingen等人,J.Bact.,130:946(1977)以及Hsiao等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),76:3829(1979)中的方法进行。然而,其他用于将DNA引入细胞中的方法也可以使用,如通过核微注射,电穿孔,细菌原生质体与完整细胞的融合,或者多聚阳离子,例如聚凝胺、多鸟氨酸。对于转化哺乳动物细胞的多种技术,参见Keown等人,MethodsinEnzymology,185:527537(1990)以及Mansour等人,Nature,336:348352(1988)。
对于克隆或者表达载体中的DNA适用的宿主细胞包括原核细胞,酵母或者更高等的真核细胞。适用的原核细胞包括但不限于肠细菌,如埃希氏菌属(如大肠杆菌),肠杆菌,欧文氏菌,克雷白杆菌,变形杆菌,沙门氏菌(例如伤寒沙门氏菌),沙雷氏菌属(例如灵杆菌),和志贺氏菌属,以及杆菌(如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(例如公开于DD266710中的地衣芽孢杆菌41P)),假单胞菌(如绿脓杆菌)以及链霉菌。优选地,所述宿主细胞分泌少量的蛋白水解酶。例如,可能修改该株以在编码宿主内源蛋白的基因中产生基因变异(参见例如美国专利No.4,946,783)。可选地,体外的克隆方法,例如PCR或者其他的核酸聚合酶反应,是适用的。
用于产生本发明的多肽的优选的宿主细胞为原核细胞,以及更优选地为细菌,其包括真细菌以及古细菌。这些优选为真细菌,其包括革兰氏阳性的以及革兰氏阴性的细菌,更优选的为革兰氏阴性的细菌。细菌的一种优选种类为肠细菌。属于肠细菌的细菌的实例包括埃希氏菌属,肠杆菌属,欧文氏菌,克雷白杆菌,变形杆菌,沙门氏菌,沙雷氏菌属和志贺氏菌。其他类型的适用的细菌包括固氮菌,假单胞菌属,根瘤菌,明颤细菌(Vitreoscilla)和副球菌。大肠杆菌在此是特别优选的。
用于产生本发明的多肽的原核细胞在本领域中已知的并适合用于培养所选宿主细胞的培养基中培育,其包括一般由前文中Sambrook等人所描述的培养基。适用于细菌的培养基包括,但不限于AP5培养基,营养肉汤,Luria-Bertani(LB)肉汤,Neidhardt最低限度培养基以及C.R.A.P最低限度的或者完全培养基(参见例如美国专利No.6,828,121)并添加必要的营养物添加剂。所述培养基也可以含有选择试剂,其根据表达载体的构建进行选择,以选择性地允许含有表达载体的原核细胞生长。例如,氨苄青霉素添加到培养基中用于培养表达氨苄青霉素耐受基因的细胞。除了碳、氮及无机磷酸盐源,任何必要的添加剂也可以包括,其以合适的浓度,单独地或者作为与另一种添加剂或者培养基的混合物加入,如复合物氮源。培养基也可以可选地含有一种或者多种还原剂,所述还原剂选自谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸、二硫赤藓糖醇以及二硫苏糖醇。所述原核宿主细胞在适宜的温度下培养。对于大肠杆菌的培养,例如,优选的温度范围为从约20°C到约39°C,更优选地从约25°C到约37°C,再更优选地在约30°C。可以以合适的浓度包括任何必要的添加剂,所述添加剂对于本领域技术人员是已知的,其单独地加入或者作为与另一种添加剂或者培养基的混合物加入,如复合物氮源。培养基的pH可能为从约5.9的任意pH,其主要地取决于宿主生物体。对于大肠杆菌,pH优选地从约6.8到约7.4,以及更优选地约7.0。
除了原核生物,真核微生物如丝状真菌或者酵母对于编码多肽的载体而言是适用的克隆或者表达载体。酿酒酵母是常用的低等真核宿主微生物。其他的常规宿主微生物包括丝状真菌,如链孢菌、青霉、弯颈霉(WO91/00357)以及曲霉属宿主,如构巢曲霉(Ballance等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,112:284289(1983);Tilburn等人,Gene,26:205221(1983);Yelton等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:14701474(1984))以及黑曲霉(Kelly和Hynes,EMBOJ.,4:475479(1985));克鲁维酵母宿主(美国专利No.4,943,529;Fleer等人,Bio/Technology,9:968975(1991)),如,例如乳酸克鲁维酵母(MW98-8C,CBS683,CBS4574;Louvencourt等人,J.Bacteriol.,154(2):737742(1983)),脆壁克鲁维酵母(ATCC12,424),K.bulgaricus(ATCC16,045),K.wickeramii(ATCC24,178),K.waltii(ATCC56,500),K.drosophilarum(ATCC36,906;VandenBerg等人,Bio/Technology,8:135(1990)),K.thermotolerans以及马克斯克鲁维酵母;耶氏酵母(EP0402226);巴斯德毕赤酵母(EP0183070;Sreekrishna等人,J.BasicMicrobiol.,28:265278(1988));Candida;Trichodermareesia(EP0244234);Neurosporacrassa(Case等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:52595263(1979));粟酒裂殖酵母(Beach及Nurse,Nature,290:140(1981);EP0139383);以及Schwanniomyces如许旺酵母(EP0394538)。
甲醇酵母(Methylotropicyeast)也是适用的,其包括但不限于能够依靠甲醇生长的酵母,其选自汉森酵母,假丝酵母,克勒克酵母,毕赤酵母,酿酒酵母,球拟酵母及红酵母。该类酵母中典型的代表性种类可见于C.Anthony,TheBiochemistryofMethylotrophs,269(1982)。
对于糖基化多肽表达适用的宿主细胞通常得自多细胞生物体。无脊椎动物的细胞的实例包括昆虫细胞,如果蝇S2以及菜夜蛾Sf9,以及植物细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)以及COS细胞。更特定的实例包括中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980));人类胚胎肾细胞系(亚克隆的293或者293细胞,用于在悬浮培养基中培养,Graham等人,J.GenVirol.,36:59(1977));人类肝脏细胞(HepG2,HB8065);人类肺细胞(W138,ATCCCCL75);SV40转化的猴肾CV1系(COS-7,ATCCCRL1651);小鼠塞尔托利细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243251(1980));以及小鼠乳腺瘤(MMT060562,ATCCCCL51)以及其他。认为合适的宿主细胞的选择在本领域的技能范围内。
一旦确定,可以将编码目标多肽的核酸(如cDNA或者基因组DNA)插入可复制的用于克隆(DNA的扩增)或者用于表达的可复制载体中,并且多种载体是公众可得的。所述载体可以,例如为粘粒、质粒、噬菌体或者病毒颗粒的形式。多种载体对于此目的是可用的,并且合适的载体的选择主要地取决于要插入到载体中的核酸的尺寸,以及将使用该载体转化的特定宿主细胞。适当的核酸序列(如描述于下文的)可以通过多种步骤插入到载体中。一般而言使用本领域已知的技术,将DNA插入适当的限制性内切酶位点(或者多个位点)中。载体组分通常包括,但不限于一个或者多个信号序列、复制的起点、一个或者多个标记基因、增强子元件、启动子以及转录终止序列。含有一个或者多个这些组分的适用载体的构建采用标准的连接技术,所述连接技术对于技术人员是已知的。
多肽不仅可以直接重组地产生,也可以作为融合多肽产生,所述融合多肽带有异源多肽,该多肽可以为信号序列或者在成熟蛋白或多肽的N端具有特异性切割位点的其他多肽。一般而言,信号序列可以为载体的组分,或者其可以为插入载体中的编码多肽的DNA的部分。该信号序列可以为原核的信号序列,其选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或者热稳定的肠毒素II先导序列。对于酵母分泌,例如,所述信号序列可以为例如酵母转化酶先导序列,alpha因子先导序列(包括酵母属和克鲁维酵母属的α因子先导序列,后者描述于美国专利No.5,010,182中)或者酸性磷酸酶先导序列,白色念珠菌葡糖淀粉酶先导序列(EP0362179)或者描述于PCT国际公开No.WO90/13646中的信号。在哺乳动物细胞表达中,哺乳动物信号序列可以用于导向蛋白的分泌,如相同或者相关的物种中来自分泌多肽的信号序列,以及病毒分泌先导序列。
表达载体和克隆载体均含有核酸序列,该序列使得所述载体能在一个或者多个选定的宿主细胞中复制。该序列在多种细菌、酵母及病毒中公知。来自质粒pBR322的复制起点对于绝大多数革兰氏阴性细菌是适用的,2μ质粒起点对于酵母是适用的,以及不同的病毒起点(SV40,多瘤病毒,腺病毒,VSV或者BPV)对于哺乳动物细胞中的克隆载体是有用的。
表达载体及克隆载体也可以含有选择基因,其在本领域也称作选择性标记物。典型的选择基因编码的蛋白质(a)补充营养缺陷型的不足;(b)赋予针对抗体或者其他药物或者毒素的抗性,如对氨苄青霉素、G418、潮霉素、新霉素、甲胺蝶呤或者四环素的抗性;或者(c)提供不可得自复合培养基的关键营养物质,例如为细菌提供编码D-丙氨酸消旋酶的基因。
对于哺乳动物细胞适用的可选择标记物的一个实例为使细胞鉴定成为可能的,所述细胞能够接受编码降解荚膜异多糖酸的多肽的核酸,该标记物如DHFR或者胸苷激酶。当采用野生型DHFR时,适当的宿主细胞为缺乏DHFR活性的CHO细胞系,其按照Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980)中描述的进行制备和繁殖。用于酵母中的适用的选择基因为存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(参见例如Stinchcomb等人,Nature,282:39(1979);Kingsman等人,Gene,7:141(1979);Tschemper等人,Gene,10:157(1980)。该trp1基因为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株提供选择性标记物,例如ATCCNo.44076或PEP4-1(参见例如Jones,Genetics,85:12(1977))。
表达载体及克隆载体通常含有启动子,所述启动子可操作地连接于编码多肽的核酸序列,从而引导mRNA的合成。由多个潜在的宿主细胞识别的启动子是公知的。适用于原核生物宿主的启动子包括碱性磷酸酯酶,色氨酸(trp)启动子系统(例如Goeddel,NucleicAcidsRes.,8:4057(1980);EP0036776);β内酰胺酶及乳糖启动子系统(例如Chang等人,Nature,275:615(1978);Goeddel等人,Nature,281:544(1979));以及杂合启动子如tac启动子(参见例如deBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:2125(1983))。用于细菌系统中的启动子也可以含有Shine-Dalgarno(S.D.)序列,该序列可操作地连接于编码目标多肽的DNA上。
对于酵母宿主中的应用而言适用的启动序列的实例包括用于3-磷酸甘油激酶的启动子(Hitzeman等人,J.Biol.Chem.,255:2073(1980))或者其他的糖分解的酶的启动子(Hess等人,J.Adv.EnzymeReg.,7:149(1968);Holland,Biochemistry,17:4900(1978)),如烯醇酶,己糖激酶,葡萄糖激酶,葡萄糖-6-磷酸酯异构酶,甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶,磷酸果糖激酶,磷酸葡萄糖异构酶,3-磷酸甘油酯变位酶,丙酮酸脱羧酶,丙酮酸激酶和磷酸丙糖异构酶。其他的酵母启动子为酸性磷酸酶、醇脱氢酶2、与氮代谢相关的降解酶、负责利用麦芽糖及半乳糖的酶、甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶、异细胞色素c以及金属硫蛋白的启动子区域,所述启动子为可诱导的启动子,其具有转录由生长条件控制的额外的优点。对于酵母表达的应用而言适用的载体及启动子进一步地描述于EP0073657中。
从哺乳动物宿主细胞中的载体的目标多肽转录通过下述启动子控制:例如得自病毒基因组的启动子,所述病毒如腺病毒(如腺病毒2)、鸟肉瘤病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒、禽痘病毒(参见例如UK2,211,504)、乙型肝炎病毒、多瘤病毒、逆转录病毒以及猿猴病毒40(SV40),或者得自异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或者免疫球蛋白启动子)和/或来自热激启动子的启动子,前提是该启动子与宿主细胞系统是相容的。
通过将增强子序列插入到载体中,在多个情况下可以增加DNA的转录,所述DNA由高等真核生物编码目标多肽。增强子是DNA的顺式作用元件,其典型地约10到300bp,其作用于启动子以增加其转录。在哺乳动物基因(白蛋白,α甲胎蛋白,弹性蛋白酶,球蛋白以及胰岛素)中,已知多种增强子序列。典型地使用来自真核细胞病毒的增强子。非限制性的实例包括SV40增强子(其位于复制起点的后部(bp100270)),巨细胞病毒早期启动子增强子,多瘤病毒增强子(其位于复制起点的后部)以及腺病毒增强子。所述增强子可以在多肽编码序列的5’或者3’位置连接到载体中,典型地位于启动子的5’位点上。
用于原核生物(例如细菌)和/或真核宿主细胞(酵母,真菌,昆虫,植物,动物或者来自其他的多细胞生物体的有核细胞)的表达载体也含有对于转录的终止以及使mRNA稳定而必须的序列。该序列一般可得自原核生物的、真核生物的或者病毒的DNA或者cDNA的5’以及偶尔地3’的不翻译区域。这些区域含有转录为聚腺苷酰化片段的核苷酸区段,所述聚腺苷酰化的片段位于编码目标多肽的mRNA的不翻译部分中。适合在重组脊椎动物细胞培养中的多肽合成的再其他的方法、载体以及宿主细胞描述于Gething等人,Nature,293:620625(1981);Mantei等人,Nature,281:4046(1979);EP0117060;以及EP0117058。
基因扩增和/或表达可以在一个样品中直接测量,例如通过常规的DNA印迹法,RNA印迹法,来测定mRNA的转录(参见例如Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:52015205(1980)),斑点印迹法(DNA分析),或者原位杂交,其使用恰当地标记的探针,所述探针基于在此提供的序列。可选地,可以采用能够识别特定双螺旋的抗体,所述双螺旋包括DNA双螺旋、RNA双螺旋以及DNA-RNA杂交双螺旋或者DNA-蛋白质双螺旋。该抗体相应地也能够被标记,从而能够在所述双螺旋连接于表面上的情况下进行检测,从而当表面上的双螺旋形成时,能够检测到连接于双螺旋的抗体的存在。
基因表达,可选地可以通过免疫学方法测量,所述方法例如细胞或者组织切片的免疫组化染色,以及细胞培养物的或者体液的测试,以直接测定基因产物的表达。对于免疫组化染色和/或样品流体的测试有用的抗体可以为单克隆的或者多克隆的,并可以在任意的哺乳动物中制备。基于本文提供的DNA序列,可以制备抗全长序列多肽的抗体,或者抗截短或片段肽的抗体,或者能制备抗外源序列的抗体,该外源序列融合于CAEDNA并编码特异的抗体表位。
能从培养基或者从宿主细胞裂解液中回收形成的多肽。如果是膜结合的,可以使用适合的去污剂溶液(例如Triton-X100),或者通过酶促切割使其从膜上释放。可以由不同的物理的或者化学的方式将多肽表达中采用的细胞破坏,所述方式如冻融循环,超声,机械破坏或者细胞裂解试剂。可以期待从重组细胞蛋白或者多肽中纯化所述多肽(或者多种多肽)。典型的适用的纯化步骤为硫酸铵沉淀;层析聚焦;二氧化硅或者阳离子交换树脂上的层析,所述阳离子交换树脂如DEAE;乙醇沉淀;离子交换柱上的分离;凝胶过滤,其使用例如SephadexG-75;金属螯合柱,以结合多肽的表位标签的形式;蛋白质A琼脂糖柱,以去除如IgG的污染物;反相HPLC;以及SDS-PAGE。可以采用不同方法的蛋白质纯化,所述方法在现有技术中是已知的,并描述于例如Deutscher,MethodsinEnzymology,182(1990);Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice,Springer-Verlag,NewYork(1982)。一般来说,所进行的纯化步骤(或者多个步骤)依赖于,例如制备方法的性质,所产生的具体多肽以及所述多肽的下游应用(或多种应用)。
可选地,例如,期待的肽及其片段可以是化学合成的,或者可能提取自天然来源的生物体(或多种生物体)。另一种可选的方式涉及通过酶促消化产生多肽及其片段,例如通过将蛋白质用酶处理,所述酶已知在特定的氨基酸残基所限定的位点处切割蛋白质,或者通过使用适合的限制性酶消化DNA并分离想要的组分。再另一种适用的技术涉及通过聚合酶链式反应(PCR)分离和扩增DNA序列或者片段,所述序列或者片段编码想要的多肽或者多肽片段。在PCR中,在5’及3’引物中采用限定DNA期待的末端的寡核苷酸。当多肽为多肽片段时,该多肽片段优选地与本文公开的天然(也即全长)多肽共享至少一个生物的和/或免疫的活性。在特定的情况下,多肽片段可以具有比全长的多肽更高的活性,或者其可以相对于全长的多肽是优化的或者改进的。
也可以采用其他可选的方法制备本文描述的多肽,所述方法在本领域中是公知的。例如,多肽序列或者其部分可以通过直接的肽合成产生,所述合成使用固相技术(参见例如Stewart等人,Solid-PhasePeptideSynthesis,W.H.FreemanCo.,SanFrancisco,Calif.(1969);Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:21492154(1963))。体外的蛋白质合成可以使用自动化或者通过人工技术进行。自动合成可以,例如利用AppliedBiosystems肽合成仪(FosterCity,Calif.),根据生产商的说明完成。本文描述的多肽的不同部分可以分别地化学合成并使用化学的或者酶的方法组合,以产生全长的、截短的或者其他的变体多肽。
多核苷酸
本发明的另一个方面提供了多核苷酸及其片段,以及其部分或者完整的互补序列,mRNA和/或编码序列,优选地以分离的形式,包括编码具有荚膜异多糖酸降解(CAE)活性的多肽或酶和/或CAE相关蛋白及其片段(如前所述)的多核苷酸、DNA、RNA、DNA/RNA杂交体及相关的分子,与本文描述的多核苷酸或者mRNA序列或者其部分互补的多核苷酸或者寡核苷酸,以及与编码CAE的多核苷酸或者其mRNA杂交的多核苷酸或者寡核苷酸。
在特定的实施方案中,所述多核苷酸包含一般来说对应于SEQIDNO:7的核酸序列以及其互补序列。在特定的其他实施方案中,所述多核苷酸包含一般来说对应于SEQIDNO:8的核酸序列。优选地,所述多核苷酸为分离的多核苷酸。在其他的实施方案中,所述多核苷酸为重组的多核苷酸。
本文也提供了多核苷酸变体。如前所述,多核苷酸变体可以含有一个或者多个取代、添加、删除和/或插入,从而所述多核苷酸的活性基本上不减少。其对多核苷酸的活性的效果一般地可以如本文描述地评估,或者使用常规的方法进行。一般来说,多核苷酸变体与编码全长的或者截短的具有荚膜异多糖酸降解活性的多肽的核苷酸序列具有至少约80%的核酸序列同一性,所述多肽是本文公开的,或者是本文公开的全长的或者截短的多肽序列的任意其他片段。优选地,变体与编码具有内毒素降解能力的多肽的多核苷酸序列的一部分显示出至少约85%,87%,88%或者89%的同一性,以及更优选地至少约90%,92%,95%,96%或者97%的同一性。该同一性百分比能够容易地通过比较多核苷酸与目标多核苷酸的相应部分确定,其使用任意的方法,包括使用本领域普通技术人员已知的计算机算法,如Align或者BLAST算法(参见例如Altschul,J.Mol.Biol.219:555-565,1991;Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919,1992),其可得自NCBI网站,而且其在本文别处描述。可以使用默认的参数。
典型地,变体多核苷酸与编码本文公开的全长多肽序列(如SEQIDNO:7)的核酸序列具有至少约80%的核酸序列同一性,可选地至少约81%的核酸序列同一性,可选地至少约82%的核酸序列同一性,可选地至少约83%的核酸序列同一性,可选地至少约84%的核酸序列同一性,可选地至少约85%的核酸序列同一性,可选地至少约86%的核酸序列同一性,可选地至少约87%的核酸序列同一性,可选地至少约88%的核酸序列同一性,可选地至少约89%的核酸序列同一性,可选地至少约90%的核酸序列同一性,可选地至少约91%的核酸序列同一性,可选地至少约92%的核酸序列同一性,可选地至少约93%的核酸序列同一性,可选地至少约94%的核酸序列同一性,可选地至少约95%的核酸序列同一性,可选地至少约96%的核酸序列同一性,可选地至少约97%的核酸序列同一性,可选地至少约98%的核酸序列同一性,可选地至少约99%的核酸序列同一性。
对于编码截短的多肽的多核苷酸,该多核苷酸变体典型地与编码本文公开的截短的多肽序列(如SEQIDNO:7)的核酸序列具有至少约80%的核酸序列同一性,可选地具有至少约81%的核酸序列同一性,可选地至少约82%的核酸序列同一性,可选地至少约83%的核酸序列同一性,可选地至少约84%的核酸序列同一性,可选地至少约85%的核酸序列同一性,可选地至少约86%的核酸序列同一性,可选地至少约87%的核酸序列同一性,可选地至少约88%的核酸序列同一性,可选地至少约89%的核酸序列同一性,可选地至少约90%的核酸序列同一性,可选地至少约91%的核酸序列同一性,可选地至少约92%的核酸序列同一性,可选地至少约93%的核酸序列同一性,可选地至少约94%的核酸序列同一性,可选地至少约95%的核酸序列同一性,可选地至少约96%的核酸序列同一性,可选地至少约97%的核酸序列同一性,可选地至少约98%的核酸序列同一性,可选地至少约99%的核酸序列同一性。
在一个实施方案中,核酸分子与在SEQIDNO:7中列出的核酸序列具有至少90%的序列同一性。例如,核酸分子可以与在SEQIDNO:7中列出的核酸序列具有至少95%的序列同一性,或者可以与在SEQIDNO:7中列出的核酸序列具有至少98%的序列同一性。在一个具体实施方案中,核酸分子具有在SEQIDNO:7中列出的序列,也即该核酸分子与在SEQIDNO:7中列出的核酸序列表现100%的序列同一性。
在另一个实施方案中,核酸分子与在SEQIDNO:8中列出的核酸序列具有至少90%的序列同一性。例如,核酸分子与在SEQIDNO:8中列出的核酸序列可以具有至少95%的序列同一性;或者与在SEQIDNO:8中列出的核酸序列具有至少98%的序列同一性。在一个具体实施方案中,核酸分子具有在SEQIDNO:8中指出的核酸序列,也即该核酸分子与在SEQIDNO:8中列出的核酸序列表现100%的序列同一性。
特定的多核苷酸及其变体对于一部分天然基因基本上是同源的,所述基因编码期待的目标多肽。得自(例如通过热变性)该多核苷酸以及变体的单链核酸能够在适度严格的条件下与天然产生的DNA或者RNA序列杂交,所述DNA或者RNA序列编码天然的目标多肽。在适度严格的条件下可检测地杂交的多核苷酸可以具有包括至少10个保守核苷酸的核苷酸序列,例如,至少50个,至少100个,至少150个,至少200个,至少250个,至少300个,至少350个,至少400个,至少450个,至少500个或者更多个保守核苷酸,所述保守核苷酸与特定的目标多核苷酸互补。在特定优选地实施方案中,该序列(或者其互补序列)对于期待其表达干扰的单个特定的多肽是独特的,以及在特定的其他实施方案中,所述序列(或者其互补序列)可以由两个或者更多个期待多肽表达干扰的相关的目标多肽共享。
本发明的序列上特异的多核苷酸可以使用一种或多种的几个准则进行设计。例如,为了设计具有10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,200,300,400,500,600或者更多个保守的与编码目标多肽(例如具有荚膜异多糖酸降解活性的多肽,如在此描述的那些)序列相同核苷酸的多核苷酸,可以从多核苷酸序列的可读框中扫描具有一种或多种以下性质的序列:(1)约1:1然而不大于2:1或1:2的A+T/G+C比例;(2)在5'末端的AA二核苷酸或者CA二核苷酸;(3)内部的发夹环,其解链温度少于55°C.;(4)解链温度少于37°C(解链温度按照如(3)和(4)中描述地,可以使用本领域技术人员已知的计算机软件确定)的同型二聚体;(5)至少10-20个保守核苷酸的序列,所述序列为未鉴定存在于任意其他已知多核苷酸序列中(该评估可以容易地使用对技术人员可得的计算机程序,如BLAST搜索公众可得的数据库确定)。可选地,多核苷酸序列可以使用计算机软件设计及选择,所述软件商业地可得自多个卖方(例如OligoEngineTM(Seattle,Wash.);Dharmacon,Inc.(Lafayette,Colo.);AmbionInc.(Austin,Tex.);以及QIAGEN,Inc.(Valencia,Calif.))。还可参见Elbashir等人,Genes&Development15:188-200(2000);Elbashir等人,Nature411:494-98(2001)。根据现有技术中已知的方法,可以随后测试目标多核苷酸编码目标多肽的能力,与其他的目标多核苷酸杂交的能力,或者影响目标多核苷酸的表达的能力,以及基于这些试验,特定的多核苷酸的效力的确定对于本领域技术人员是显而易见的。
具有本领域常规技术的人员也能够容易地认识到由于遗传密码的简并,多种核苷酸序列可以编码在此描述的多肽。也即一个氨基酸可能由几种不同的密码子之一编码,以及本领域技术人员能够容易地确定:尽管一种特定的核苷酸序列可能彼此不同(其可以通过在此公开的,以及本领域已知的比对方法进行确定),所述序列可能编码具有相同的氨基酸序列的多肽。作为实例,多肽中的氨基酸亮氨酸可以由六中不同的密码子(TTA,TTG,CTT,CTC,CTA以及CTG)之一编码,丝氨酸也能如此(TCT,TCC,TCA,TCG,AGT以及AGC)。其他的氨基酸,如脯氨酸、丙氨酸以及缬氨酸,可以由四种不同密码子(对于脯氨酸为CCT,CCC,CCA,CCG;对于丙氨酸为GCT,GCC,GCA,GCG;以及对于丙氨酸为GTT,GTC,GTA,GTG)的任一编码。这些多核苷酸中的一些与任意天然基因的核苷酸序列具有最少的同源性。然而,由于密码子使用的不同而变化的多核苷酸在本发明中特别地被涵盖。
所述多核苷酸还可以包括密码子最优化的序列,也即,已经为了特定的宿主种类进行了优化,通过将使用频率少于约20%的任意密码子替换进行。为了在给定的宿主种类中表达而优化的核苷酸序列(通过消除假的聚腺苷酸化序列,消除外显子/内含子剪接信号,消除转座子样重复和/或除了密码子优化之外的GC含量的优化)可以通常地称作现有技术中的表达增强序列。
多核苷酸也可以用使其检测容易的试剂标记。例如,该试剂可以与下述组合:荧光标记(例如Prober等人,Science238:336-340(1987);Albarella等人,EP144914);化学标记(例如,Sheldon等人,美国专利No.4,582,789;Albarella等人,美国专利No.4,563,417);和/或修饰的碱基(例如,Miyoshi等人,EP0119448)(其各自以其全文在此结合作为参考)。
本发明的多核苷酸或者其片段也通常能够特异性地与其他的核酸分子在一定的环境下杂交。例如,如果两个分子能够形成反平行、双链的核酸分子结构,将这两种核酸分子称为能够特异性地与彼此杂交。核酸分子或者多核苷酸如果与另一个核酸分子或者多核苷酸显示完全的互补性,则称它们为是互补的。当分子之一的各个核苷酸与另一个分子的核苷酸互补,则称这些分子显示完全的互补性。如果两个分子能够彼此杂交,所述杂交具有允许它们在至少常规的低严格条件下保持彼此退火的充分的稳定性,则称这两个分子是最小互补的。类似地,如果该分子能够彼此杂交,所述杂交具有允许它们其在常规的高严格条件下保持彼此退火的充分的稳定性,则称该分子是互补的。常规的严格条件在本文别处描述,并由Sambrook等人,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndEd.,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)以及由Haymes等人,NucleicAcidHybridization,APracticalApproach,IRLPress,Washington,D.C.(1985)中描述,其各个在此结合作为参考。从完全互补的偏离是因此可以允许的,只要该偏离不完全地阻止所述分子形成双链结构的能力。因此,为了使核酸分子作为引物或者探针,其仅需要在序列中的充分的互补性,从而在所采用的特定的溶剂和盐浓度下能够形成稳定的双链结构。
在特定的实施方案中,本发明的多核苷酸特异地与SEQIDNO:7和SEQIDNO:8或者其互补序列的一个或多个在适度严格的条件下杂交
多核苷酸的制备
多核苷酸,包括编码具有荚膜异多糖酸降解活性的多肽的多核苷酸,可以使用多种技术制备,所述技术对于特定期待的多核苷酸的制备以及期待的用于多核苷酸的序列的鉴定和选择是有用的。例如,多核苷酸可以从cDNA扩增而来,所述cDNA由适用的细菌、细胞或者组织类型制备。该多核苷酸可以通过聚合酶链式反应(PCR)扩增。对于此方法,序列特异的引物可以是基于本文提供的序列设计,也可以购买或者合成。扩增的部分可以用于从适用的文库中使用公知的技术分离全长的基因或者其期待的部分。在该技术中,使用适合扩增的一种或多种多核苷酸探针或者引物筛选文库(cDNA或者基因组的)。优选地,选择文库的尺寸,以包括更大的分子。为了鉴定基因的5’及上游区域,随机引物文库也可以是优选的。对于获得内含子以及延伸5’序列,基因组文库是优选的。对于本发明所预期的多核苷酸,适用的序列也可以选自多核苷酸序列的文库。
对于杂交技术,可以使用公知的技术标记部分序列(例如通过缺口易位或者末端标记32P)。可以随后通过使含有变性细菌菌落的过滤物(或者含有病毒斑的菌苔)与标记的探针杂交来筛选细菌或者噬菌体的文库(参见例如Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratories,ColdSpringHarbor,N.Y.,2001)。选择并扩增杂交的菌落或者斑,将DNA分离用于进一步的分析。可以分析克隆以确定额外的序列的量,例如通过PCR,所述PCR使用来自部分序列的引物及来自载体的引物。可以产生限制性图谱及部分序列,以确定一个或者多个的重叠克隆。可以使用公知的技术,通过连接适宜的片段产生全长的cDNA分子。
可选地,用于从部分的cDNA序列获得全长的编码序列的多种扩增技术在本领域中是已知的。在该技术内,扩增一般地通过PCR进行。一种该技术被称作cDNA末端的快速扩增,或者RACE。该技术涉及内部引物及外部引物的使用,其杂交到多聚A区域或者载体序列上,从而确定为已知序列的5’和3’的序列。多种商业上可得的试剂盒的任一种都能用于进行该扩增步骤。可以使用例如在本领域中公知的软件来设计引物。引物(或者用于本文预期的其他的用途的寡核苷酸,其包括例如,探针及反义的寡核苷酸)优选地长度为15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31或者32个核苷酸,其具有至少40%的GC含量,并与目标序列在约54°C到72°C的温度下退火。扩增的区域可以为前文所述的序列,以及连接于邻近序列的重叠序列。本发明所预期的特定寡核苷酸对于一些优选的实施方案具有10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33-35,35-40,41-45,46-50,56-60,61-70,71-80,81-90或者更多的核苷酸的长度。
本文描述的核苷酸序列可以与多种其他的核苷酸序列连接,所述连接使用成熟的重组DNA技术。例如,可以将多核苷酸克隆到多种克隆载体的任一中,所述载体包括质粒,噬菌粒,λ噬菌体衍生物和黏粒。特定目标载体包括表达载体,复制载体,探针发生载体以及测序载体。一般来说,适用的载体包含在至少一种生物体中的复制功能的起点,常规限制性内切酶位点以及一个或者多个可选择的标记。(参见,例如PCT国际公开No.WO01/96584;PCT国际公开No.WO01/29058;美国专利No.6,326,193;美国公开申请No.2002/0007051,其各个在此以其全文结合作为参考)。其他的因素取决于期待的用途,并对于在本领域普通技术人员而言是显而易见的。例如,本发明涵盖多核苷酸序列在重组核酸构建体的制备中的应用,所述重组核酸构建体包括表达期待的目标多肽如CAE多肽的载体;本发明还涵盖转基因动物及细胞的产生(例如细胞,细胞克隆,细胞系或者细胞世系,或者使得一种或多种期待的多肽(例如目标多肽)的表达便利的生物体)。在特定的实施方案中,可以将多核苷酸制剂,从而允许进入哺乳动物的细胞并在那里表达。如下文所述的,该制剂尤其对于治疗用途有用。本领域普通技术人员知道,有多种实现多核苷酸和/或多肽在目标细胞中的表达的途径,并且可以采用任意适用的方法。例如,可以使用公知的技术将多核苷酸包括于病毒载体中(也见于例如美国申请公开No.2003/0068821(在此以其全文结合作为参考))。病毒载体可以额外地将基因转移或者合并为选择性的标记物(以辅助识别或者选择经转导的细胞)和/或靶向部分,如编码在特定目标细胞上的受体的配体从而使载体成为靶向特异性的基因。靶向可以使用抗体完成,其通过本领域普通技术人员所知道的方法。
在其他的实施方案中,可以使用标准的技术将一种或者多种启动子鉴定、分离和/或包括于本发明的重组核酸构建体中。本发明提供了核酸分子,所述核酸分子包含这种启动子序列,或者一种或多种其顺式或反式作用元件。这样的调节元件可以增强本文描述的多核苷酸或者多肽的表达。5’侧翼区域可以基于本文提供的基因组序列使用标准技术产生。如果必要,可以使用基于PCR的或者其他标准方法产生额外的5’序列。可以将5’区域使用标准方法亚克隆并测序。可以将引物延伸和/或RNA酶保护分析用于证实从cDNA推断的转录起始位点。
为了界定启动子区域的分界线,可以将不同大小的推定的启动子插入物亚克隆进入异源的表达系统中,所述系统含有适宜的报告基因,而没有启动子或者增强子。适用的报告基因可以包括编码β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、荧光素酶,分泌的碱性磷酸酶或者绿色荧光蛋白(GFP)基因(参见例如Ui-Tei等人,FEBSLett.479:79-82(2000))。适用的表达系统是公知的,并可以适用公知的技术制备或者商业上获得。内部缺失构建体可以使用特有的内部限制性位点或者通过非特有的限制性位点的部分消化产生。构建体可以随后转染到细胞中,所述细胞显示高水平的多核苷酸和/或多肽的表达。一般而言,将显示最高水平的报告基因表达的且具有最小的5’侧翼区域的构建体鉴别为启动子。该启动子区域可以连接于报告基因,并用于评估试剂调控启动子驱动的转录的能力。
一旦鉴别了功能启动子,就能够定位顺式及反式作用元件。顺式作用序列可以基于与此前表征的转录基序的同源性进行鉴别。随后在鉴别的序列中产生点突变,以评估该序列的调节功能。该突变可以使用位点特异的诱变技术或者基于PCR的策略产生。如前所述,将所改变的启动子随后克隆到报告基因表达载体中,并评估突变对报告基因表达的影响。
抗体
本发明的一个方面涉及抗体、单链的抗原结合分子或者特异性地与本发明的一种或者多种多肽及其同源物、融合物或者片段结合的其他蛋白质。该抗体可以用于定量地或者定性地检测本发明的多肽。一般来讲,如果和本发明的蛋白质或者多肽分子的结合不被非相关分子的存在竞争性地抑制,则称抗体或多肽特异地结合于本发明的蛋白质或者多肽分子。
编码本发明的多肽的全部或者部分的多核苷酸,可以通过重组的方式表达,以产生能相应用于引发抗体的蛋白质或者多肽,所述抗体能够结合所表达的蛋白质或者多肽。该抗体可以用于例如蛋白质的免疫分析中。该蛋白质编码分子,或者其片段可以为融合分子(也即更大的核酸分子的部分),从而经表达产生融合蛋白·。一言而喻,本发明的任意核酸分子能够通过重组方式表达,以产生由这些核酸分子编码的蛋白质或者肽。
特异地结合多肽及其片段的抗体可以为多克隆或者单克隆的,并可以包括完整的免疫球蛋白,或者免疫球蛋白片段(如(F(ab'),F(ab')亚基2)的抗原结合区,或者单链的免疫球蛋白,其可以通过例如重组的方式产生。一言而喻,从业者熟悉标准来源的材料,所述材料描述了用于构建、操纵以及分离抗体的具体条件及步骤(参见例如,Harlow和Lane,In:Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1988),其全文在此结合作为参考)。
如本文中别处所讨论的,该抗体分子或者其片段可以用于诊断用途。当抗体打算用于诊断用途时,将其衍生化可以是期待的,例如使用配体基团(如生物素)或者可检测的标记基团(如荧光基团,放射性同位素或者酶)。产生结合本发明的蛋白质或者肽分子的抗体的能力使得这些分子的模拟化合物的鉴定是可能的。一般来讲,模拟化合物是并非特定目标化合物或者该化合物的片段的化合物,然而其表现特异地结合于针对该化合物的抗体的能力。在一个实施方案中,所述抗体为兔的多克隆抗体。
试剂盒
本发明的其他方面涉及在实施本文描述的方法中有用的试剂盒。一般来说,用于本发明方法的实践的试剂盒根据其期待的用途,优选地具有一定程度上不同的形式。
所述试剂盒典型地是被包装的,并包括含有试剂的容器,其溶液的体积基于本试剂盒额定的制备物的量而变化。该容器一般包括一种或者多种在实施本文描述的方法中有用的试剂。在特定的实施方案中,所述试剂盒是划分成不同隔室的试剂盒;也即所述试剂盒包括包含于相同的或者分开的容器中的试剂。容器的实例包括,但不限于小玻璃容器、塑料容器或者塑料或纸的条。这些和其他类似的容器使试剂从一个隔室有效转移到另一个,或者到一些其他的容器,从而各种样品及试剂不交叉污染,并且各个容器的试剂或者溶液能够以定量的方式从一个隔室添加到另一个。该容器可以包括接受试样的容器、含有本发明的多肽或者多核苷酸的容器、含有宿主细胞或者用于产生本文描述的多肽的其他材料(例如载体,病毒或者噬菌体)的容器,含有层析材料(如前述的一种或者多种离子交换、亲和以及疏水相互作用层析树脂)的容器、含有洗涤试剂(例如磷酸盐缓冲溶液、Tris缓冲溶液等等)的容器和/或含有在多糖检测中有用的试剂的容器,所述的多糖如荚膜异多糖酸(如在下文实施例16中详细描述的检测中的那些)。所述试剂盒可以包括本文描述的CAE多肽的来源和浓聚物。对于更大规模的应用,所述试剂盒通常地包括类似的试剂和溶液,然而以更大的量。
例如,所述试剂盒可以包括适用于克隆本文描述的CAE多核苷酸的细菌表达载体。可选地,所述试剂盒可以包括多核苷酸和/或多肽本身。所述试剂盒还可以包括细胞,如能胜任将重组克隆转化到表达载体中的细胞。所述试剂盒还可以包括培养基(例如肉汤),所述培养基用于本发明的多肽的细菌表达。所述试剂盒也可以包括一套三个的普通的碱性裂解缓冲液,其描述于Qiagen产品目录中,并被Sambrook等人称作溶液I、II及III(也即分别为pH为8.0的25mMTrisHCl和10mMEDTA,1%SDS和0.2NNaOH,及pH为5.5的3M乙酸钾)和/或再悬浮溶液(例如10mMTrisHCl,其pH为8.0)
在一些实施方案中,包括例如基于离心的旋转滤器或者盘状滤器。一种用于此应用的模型旋转滤器为MilliporeDurapore离心滤器(MilliporeCorporation,Billerica,MA)。除此之外,或者通过可选的方式,也可以包括在离心或其他滤器机制(例如盘)中具有填压的钢丝绒、纤维素和/或聚合物/塑料材料的滤器。还可以包括陶的滤器。也可以包括滤器辅助物,其如硅藻土或者类似的化合物。对于更大规模的应用,可以提供切向流滤器。
在一个具体实施方案中,所述试剂盒包括本文描述的一种或者多种多肽。例如,包括于试剂盒中的多肽可以为纯化的多肽,其与SEQIDNO:1以及其保守的氨基酸取代具有至少90%,98%,99%或者100%的同源性。在一个具体实施方案中,所述多肽可以具有SEQIDNO:1的氨基酸序列。除此之外或者可选地,包括于试剂盒中的多肽可以为纯化的多肽,该多肽包含与SEQIDNO:12及其保守的氨基酸取代具有至少90%,98%,99%或者100%的同源性的氨基酸序列。在一个实施方案中,所述多肽具有SEQIDNO:2的氨基酸序列。包括于试剂盒中的多肽也可以包括用于分离或者纯化的标签(例如组氨酸标签或者);因此,包括于试剂盒中的多肽对应于SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5或SEQIDNO:6。可选地,与SEQIDNO:1或者SEQIDNO:2或者其变体的多肽一起,所述试剂盒可以包括可以用于形成所述带标签的多肽的试剂和组合物。
该试剂盒也典型地包括使用说明。所述说明通常对于使得最终用户能够进行想要的制备或者分析是合适的。该说明通常为确定性的表达,例如,描述用于至少一种制备或者分析的试剂浓度,参数,如要混合的试剂和样品的相对量、试剂/样品混合物的保持或者孵育时间长度,温度的需求或者偏好,等等。该说明可以印刷在试剂盒的外或者内包装上,在小册子、卡片或者试剂盒中的其他的纸上,和/或在试剂盒中包括的容器或者器皿的外表面上。
通过将本说明详细描述,很清楚在不悖离所附权利要求中所限定的本发明的范围的前提下,修改和变化是可能的。进一步地,应该认识到本发明中的全部实施例以非限制性实施例提供。