ES2589314T3 - Bacterias Gram-negativas viables no tóxicas - Google Patents

Abstract

Una cepa mutante bacteriana Gram-negativa no condicional viable que puede crecer y dividirse con una ruta biosintética de KDO2-Lípido IVA mutada que da lugar a alteración de dicha ruta y a deficiencia en lipopolisacáridos en la membrana externa, donde dicha cepa mutante bacteriana carece de KDO y exhibe Lípido IVA en la membrana externa.

Description

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cerdos, y pollos, así como anfibios, reptiles, etc. Los animales no humanos preferidos son seleccionados entre la familia de los primates o la familia de los roedores (v.g., rata y ratón).

El término "ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos u oligonucleótidos, tales como el ácido desoxirribonucleico (ADN), y, cuando resulte apropiado, el ácido ribonucleico (ARN). También habría que entender que el término incluye, como equivalentes, análogos de ARN o de ADN preparados a partir de análogos nucleotídicos, y, según sea aplicable para la realización que se esté describiendo, polinucleótidos de una sola hebra (sentido o antisentido) y de doble hebra.

El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material que no es no deseable biológicamente o de algún otro modo, es decir, que el material puede ser administrado a un individuo junto con el compuesto seleccionado sin causar ningún efecto biológico indeseable o interaccionar de un modo perjudicial con cualquiera de los otros compuestos de la composición farmacéutica en la que está contenido.

El término "pirogénico" o "pirogenicidad" se refiere a la capacidad de un compuesto para inducir fiebre o una respuesta febril cuando se administra a un sujeto. Dichas respuestas febriles están generalmente mediadas por las citoquinas proinflamatorias del huésped IL-1, IL-6 y/o TNF-, cuya secreción es inducida, v.g., por LPS.

Una substancia que tiene "pirogenicidad reducida" o un "derivado con pirogenicidad reducida" se refiere a una substancia que tiene menos actividad pirogénica que la substancia de contrapartida, v.g., que es menos de aproximadamente un 80% pirogénica en relación a una substancia de contrapartida, preferiblemente menos de aproximadamente un 70% pirogénica, más preferiblemente menos de aproximadamente un 60% pirogénica, más preferiblemente menos de aproximadamente un 50% pirogénica, más preferiblemente menos de aproximadamente un 40% pirogénica, e incluso más preferiblemente menos de aproximadamente un 30% pirogénica. En otros términos, una substancia que tiene pirogenicidad reducida es al menos aproximadamente un 20%, 30%, 40%, 50%, 60% o 70% menos pirogénica que la correspondiente substancia, según se determina mediante cualquiera de los ensayos aquí descritos o conocidos en la técnica.

"Pirogenicidad substancialmente reducida" o "derivado con pirogenicidad substancialmente reducida" se refieren a una substancia (v.g., producida por bacterias Gram-negativas viables no tóxicas) que ha sido alterada de tal forma que tiene menos de un 20% de pirogenicidad en relación a la substancia de tipo salvaje, preferiblemente menos de un 10% de pirogenicidad, preferiblemente menos de un 1% de pirogenicidad, preferiblemente menos de un 10-1% de pirogenicidad, preferiblemente menos de un 10-2% de pirogenicidad, preferiblemente menos de un 10-3% de pirogenicidad, preferiblemente menos de un 10-4% de pirogenicidad, preferiblemente menos de un 10-5% de pirogenicidad y más preferiblemente menos de un 10-6% de pirogenicidad en relación a la substancia de tipo salvaje. En otros términos, una substancia que tiene pirogenicidad substancialmente reducida es al menos aproximadamente un 90%, un 99%, 10 veces, aproximadamente 10-2 veces, aproximadamente 10-3 veces, al menos aproximadamente 10-4 veces, al menos aproximadamente 10-5 veces, al menos aproximadamente 10-6 veces, menos pirogénica en relación a la correspondiente substancia inalterada, según se determina por cualquiera de los ensayos aquí descritos o conocidos en la técnica.

Tal como se usa aquí, el término "transfección" significa la introducción de un ácido nucleico (v.g., mediante un vector de expresión) en una célula receptora por transferencia génica mediada por ácidos nucleicos. "Transformación", tal como se usa aquí, se refiere a un proceso en el cual el genotipo de una célula cambia como resultado de la captación celular de ADN o ARN exógeno. En una realización ilustrativa, una célula transformada es una que expresa una forma mutante de uno o más de los genes kdsD y gutQ. Una célula transformada puede ser también una que exprese un ácido nucleico que interfiere con la expresión de un gen gutQ, kdsD, kdsA, kdsB, waaA, msbA, ynjD o cualquier otro gen biosintético, de procesamiento o de circulación.

Tal como se usa aquí, el término "transgén" significa un ácido nucleico (v.g., un gen kdsD, gutQ, kdsA, kdsB, waaA, msbA, ynjD mutante o cualquier otro gen biosintético, de procesamiento o de circulación, o un transcripto antisentido de éstos) que ha sido introducido en una célula. Un transgén podría ser parcial o totalmente heterólogo, es decir, extraño, para el animal o célula transgénicos en los que se introduce, o puede ser homólogo a un gen endógeno del organismo o célula en los que se introduce, pero que ha sido diseñado para ser insertado, o que es insertado, en el genoma del animal o célula de tal forma que se altere el genoma de la célula en la que se inserta. Un transgén también puede estar presente en una célula en forma de episoma.

El término "tratar" a un sujeto para una afección o enfermedad, tal como se utiliza aquí, pretende incluir la curación, así como el mejoramiento, de al menos un síntoma de la afección o enfermedad.

El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que es capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Se hace aquí referencia a vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los que están operativamente unidos como "vectores de expresión". El término "sistema de expresión", tal como se utiliza aquí, se refiere a un vector de expresión en condiciones mediante las cuales un ARNm puede transcribirse y/o un ARNm puede traducirse a proteína, ARN estructural u otro componente celular. El sistema de expresión puede ser un

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sistema de expresión in vitro, de disponibilidad comercial o fácilmente preparado según técnicas conocidas en este campo, o puede ser un sistema de expresión in vivo, tal como una célula eucariótica o procariótica que contiene el vector de expresión. En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas del ADN recombinante están con frecuencia en forma de "plásmidos", que hacen referencia, en general, a bucles de ADN de doble hebra circulares que, en su forma de vector, no se unen al cromosoma. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" son usados indistintamente, ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente utilizada. Sin embargo, la invención pretende incluir aquellas otras formas de vectores de expresión que sirven para funciones equivalentes y son bien conocidas en la técnica o que se conocerán en la técnica a partir de ahora (v.g., vectores cósmidos, fagémidos y bacteriófagos).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona Gram-negativas no tóxicas según se define en las reivindicaciones adjuntas. En particular, la presente invención proporciona bacterias Gram-negativas viables (v.g., E. coli) substancialmente carentes de lipopolisacárido (LPS, endotoxina) en la membrana externa. La presente divulgación proporciona métodos de generación de bacterias Gram-negativas viables no tóxicas y usos de los mismos. La presente invención también proporciona composiciones y desvela métodos para inducir respuestas inmunes y para investigar y desarrollar agentes terapéuticos.

Las bacterias Gram-negativas poseen una bicapa lipídica asimétrica que rodea el peptidoglicano, la membrana externa (ME). La lámina interna de la ME está primariamente compuesta por diversos glicerofosfolípidos, mientras que la lámina externa contiene predominantemente la macromolécula anfifílica única, el lipopolisacárido (LPS). En Escherichia coli y otras bacterias entéricas estrechamente relacionadas, existen 106 moléculas de LPS por célula, que cubren prácticamente el 75% del área superficial celular total, lo que representa -30% del peso bruto de la ME (véanse, v.g., S. M. Galloway, C. R. Raetz, J. Biol. Chem. 265, 6394 (1990); L. Leive, Ann. N. Y. Acad. Sci. 235, 109 (1974); H. Nikaido, en Escherichia coli and Salmonella typhimurium : cellular and molecular biology, F. C. Neidhardt, Ed. (American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1987), vol. 1, pp. 29-47). La localización expuesta en la interfaz entre la célula bacteriana y el medio ambiente acuoso presenta LPS como antígeno de superficie asociado a ME principal. El LPS está implicado en un espectro diverso de actividades patológicas y fisiológicas asociadas a la respuesta inmune del huésped (véanse, v.g., A. Wiese, et al., Biol. Chem. 380, 767 (1999); H. Heine, et al., Mol. Biotechnol. 19, 279 (2001)). El LPS es una molécula inmunoestimuladora/inflamatoria reconocida como mediador en la patogenia Gram-negativa y la inflamación generalizada, y como tal el término endotoxina es frecuentemente utilizado indistintamente con LPS. La capa de LPS es esencial tanto para la forma como para la función de la ME de las bacterias Gram-negativas. Por lo tanto, además de ser un jugador clave en la patogenia Gram-negativa, el LPS es también un determinante crítico de la supervivencia de la bacteria.

El LPS de diversas bacterias Gram-negativas se conforma a una arquitectura estructural común conceptualmente dividida en tres regiones: el lípido A embebido en la ME, un núcleo de oligosacárido y una cadena de polisacárido hidrofílica específica de O consistente en unidades de n-repeticiones en Enterobacteriaceae u oligosacáridos ramificados cortos en ciertas bacterias, que comprenden patógenos de mucosas humanos, tales como Neisseria meningitis, N. gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis y Chlamydia spp. El lípido A es el dominio de LPS más conservado entre los géneros de bacterias Gram-negativas, y al ser el componente estructural responsable de las actividades biológicas en el huésped, representa un principio endotóxico del LPS. En las bacterias entéricas, el lípido A consiste en un esqueleto de disacárido de D-glucosamina -1,6-unido que se acila con cuatro ácidos (R)-3-hidroximirísticos en uniones éster-(3,3’) o amida-(2,2’). Las moléculas de lípido A maduro de las cepas de tipo salvaje de E. coli contienen típicamente dos cadenas de acilo adicionales, primariamente laurato y miristato, unidas al grupo (R)-3-hidroximiristoílo de la glucosamina no reductora para formar las unidades de aciloxiacilo características del lípido A. El núcleo de oligosacárido conecta el lípido A a la cadena de polisacárido hipervariable, y se divide aún en las regiones interna y externa del núcleo de oligosacárido. Aunque el núcleo externo no está tan bien conservado, variando tanto en composición de sacáridos como en uniones glicosídicas, la mayoría de las bacterias Gram-negativas elaboran un núcleo interno que contiene al menos una molécula de 2-ceto3-desoxi-D-mano-octulosonato (KDO).

KDO es un componente esencial del LPS, y es un residuo conservado que se encuentra en prácticamente todas las estructuras de LPS (véase, v.g., O. Holst, Trends Glycosci. Glycotechnol. 14, 87 (2002)). La estructura mínima del LPS requerida para el crecimiento de E. coli son dos residuos de KDO unidos al lípido A (KDO2-lípido A o Re endotoxina) (véanse, v.g., C. R. Raetz, C. Whitfield, Annu. Rev. Biochem. 71, 635 (2002); S. Gronow, H. Brade, J. Endotoxin Res. 7, 3 (2001)), lo que resalta la importancia de KDO en el mantenimiento de la integridad y de la viabilidad de la célula bacteriana. La L-API está codificada por el gen kdsD en E. coli K-12 (véase, v.g., Meredith, T.

C. & Woodard, R. W. (2003) J Biol Chem 278, 32771-7).

La naturaleza ubicua de KDO en las estructuras de LPS ha impulsado la investigación sobre su biosíntesis. La ruta se inicia por la enzima d-arabinosa 5-fosfato (A5P) isomerasa (API), que convierte el intermediario de la ruta de las pentosas D-ribulosa 5-fosfato en A5P. A continuación, el A5P se condensa con fosfoenolpiruvato, para formar Kdo 8

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fosfato (Kdo8P) (KdsA), se hidroliza a Kdo (KdsC) y se activa como el nucleótido de azúcar CMP-Kdo (KdsB), antes de ser transferido finalmente de CMP-Kdo al lípido IVA aceptor (WaaA) (Figura 11). Las aciltransferasas tardías LpxL y LpxM transfieren a continuación los ácidos grasos laurato y miristato, respectivamente, al Kdo2-lípido IVA para formar las unidades de aciloxiacilo características del Kdo-lípido A hexaacilado. En E. coli K-12, hay dos genes API (kdsD y gutQ).

Se especuló que pueden existir otras API en E. coli en base a búsquedas de homología. En particular, la lectura abierta final del operón del glucitol gutQ tiene una homología significativa (45% de identidad) con kdsD (anteriormente yrbH). G-API es el último producto génico del operón gutAEBDMRQ, que contiene siete genes transcritos convergentemente (Figura 10). Como se muestra en la Tabla 1, gutQ y kdsD comparten propiedades bioquímicas similares.

Tabla 1

Propiedades bioquímicas de kdsD y gutQ

Propiedad kdsDa gutQ

Km (A5P) 0,61  0,06 mM 1,20,1 mM

Km (Ru5P) 0,350,08 mM 0,640,08 mM

kcat (A5P a Ru5P) 1574 seg-1 2184 seg-1

kcat (Ru5P a A5P) 25516 seg-1 24211 seg-1

Keq (calc.)b 0,47 (0,35) 0,47 (0,48)

pH óptimo 8,4 8,25

Específico para A5P/Ru5Pc Sí Sí

Equiv. de Zn2+/subunidadd 1,00,1 1,40,2

Inhibición por Zn2+ 10 mMe Sí Sí

Activación por EDTAf Sí Sí

Subunidad PM 35104 Da 33909 Da

(cacl.)g (35196 Da) (34031 Da)

PM nativoh 1225 kDa (tetrámero)

1334 kDa (tetrámero) a Datos de Yamada, M., Yamada, Y. & Saier, M. H., Jr. (1990) DNA Seq 1, 141-5 b Medida por RMN 31P; calculada a partir de la relación de Haldane (Ru5P/A5P) c Véanse los procedimientos experimentales para los substratos

d Zn2+

estudiados Equivalentes de por monómero determinados por espectrometría de plasma-masas inductivamente acoplada de alta resolución e Queda menos de un 5% de actividad f Como enzima aislada con 10 M EDTA g Determinado por espectrometría de masas con ionización por electronebulización; calculado a partir de la secuencia proteica h Determinado por filtración por gel

El operón del glucitol expresa un sistema de fosfoenolpiruvato:azúcar fosfotransferasa (PTS) que es responsable de la captación y el catabolismo coordinados del D-glucitol desde el ambiente (véase, v.g., T. C. Meredith, R. W. Woodard, J. Biol. Chem. 278, 32771 (2003)). El operón fue originalmente estudiado por Lengeler (véanse, v.g., C. Galanos, et al., Eur. J. Biochem. 9, 245 (1969); S. Müller-Loennies, et al., J. Biol. Chem. 278, 34090 (2003)) y posteriormente por Saier (véanse, v.g., K. A. Brozek, C. R. Raetz, J. Biol. Chem. 265, 15410 (1990); H. Nikaido, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 593 (2003)), y se sabe que consiste en siete genes convergentemente transcritos, gutAEBDMRQ. El complejo EIIGut está formado por gutA (dominio EIIC1), gutE (dominios EIIBC2) y gutB (dominio EIIA), y transporta el D-glucitol a través de la membrana interna y hacia el interior de la célula como D-glucitol 6fosfato. El D-glucitol 6-fosfato es entonces metabolizado por gutD, una deshidrogenasa dependiente de NADH, al intermediario glicolítico D-fructosa 6-fosfato. La expresión del operón gut está estrechamente controlada por un sistema regulador de múltiples componentes complejo, consistente en un represor transcripcional (gutR) y un activador transcripcional (gutM) además de la regulación mediada por AMPc-CAP (monofosfato de adenosina cíclico-proteína activadora de catabolitos) (véase, v.g., C. J. Belunis, et al., J. Biol. Chem. 270, 27646 (1995)). Sin embargo, la función de gutQ sigue siendo desconocida (véase, v.g., R. C. Goldman, W. E. Kohlbrenner, J. Bacteriol. 163, 256 (1985)).

En experimentos realizados durante el desarrollo de las realizaciones de la presente invención, se construyeron bacterias Gram-negativas viables substancialmente carentes de expresión de LPS en la membrana externa a pesar de elaborar de manera exclusiva el precursor de LPS endotóxicamente inactivo lípido IVa, un antagonista conocido de la sepsis inducida por LPS en humanos. La presente invención no se limita a métodos particulares de construcción de bacterias Gram-negativas viables substancialmente carentes de expresión de LPS en la membrana externa (v.g., a través de la supresión de la expresión de API; a través de mutación de los genes gutQ y/o kdsD; a través de la supresión de la expresión de KDO; a través de la inhibición de las asociaciones entre KDO y el Lípido IVA; a través de mutaciones de los genes kdsA y/o kdsB y/o waaA y/o msbA y/o yhjD, u otros genes biosintéticos, de procesamiento o de circulación; a través de la supresión de la expresión del lípido IVA; a través de mutaciones del gen lpxM, u otros genes biosintéticos, de procesamiento o de circulación para el lípido IVA).

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Gorfinkiel, et al., 1993, J. Biol. Chem., 268:23376) o gcv (véase, v.g., Stauffer, et al., 1994, J. Bact, 176:6159). La selección de un promotor apropiado dependerá de la cepa bacteriana huésped y será obvia para los expertos en la técnica.

La presente divulgación proporciona bacterias Gram-negativas viables (v.g., E. coli) que carecen de expresión de API. La presente divulgación no se limita a un método particular de inhibición de la expresión de API. En algunos ejemplos, se inhibe la expresión de API por supresión de la expresión de la proteína KDO. La presente invención no se limita a un método particular de supresión de la expresión de la proteína KDO. En algunas realizaciones, se suprime la expresión de la proteína KDO a través de, por ejemplo, mutación del gen gutQ, del gen kdsD, del gen kdsA o del gen kdsB, o mutaciones en cualquier otro gen biosintético de KDO.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona bacterias Gram-negativas viables no tóxicas (v.g., libres de endotoxina) (v.g., E. coli). La presente invención no se limita a un método particular de obtención de bacterias Gram-negativas viables no tóxicas. Se pueden obtener bacterias Gram-negativas viables no tóxicas por supresión de la expresión de LPS en la membrana externa. La presente invención no se limita a un método particular de supresión de la expresión de LPS en la membrana externa. En algunos ejemplos, se suprime la expresión de LPS por supresión de la expresión de la proteína API. La presente divulgación no se limita a un método particular de supresión de la expresión de API. En algunos ejemplos, se suprime la expresión de API por supresión de la expresión de la proteína KDO. La presente invención no se limita a un método particular de supresión de la expresión de la proteína KDO. En algunas realizaciones, se suprime la expresión de la proteína KDO a través de, por ejemplo, mutación del gen gutQ y del gen kdsD. En algunas realizaciones, no se produce expresión de la proteína KDO en la membrana externa debido a que la proteína KDO no se asocia al Lípido IVA, de tal forma que sólo el Lípido IVA es transportado a la membrana externa. Por ejemplo, mutaciones en los genes gutQ, kdsD, kdsA, kdsB, waaA msbA y/o yhjD o mutaciones de cualquier otro gen biosintético, de procesamiento o de circulación eliminan la formación o la presentación en la membrana del complejo KDO2-Lípido IVA, para dar como resultado, por ejemplo, que sólo se transporte la molécula de Lípido IVA a la membrana externa y que no haya posterior formación de LPS.

En algunas realizaciones, las bacterias Gram-negativas viables no tóxicas pueden ser sometidas a ingeniería genética por métodos de clonación conocidos para los expertos en la técnica (véase Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) para que expresen, produzcan y exhiban proteínas y péptidos no nativos, tales como, aunque sin limitación, LPS de otros organismos bacterianos, derivados lipídicos únicos, producción de proteínas o péptidos humanos, producción de proteínas o péptidos no humanos, producción de vacunas y similares. Dichos productos producidos hallan utilidad en una variedad de aplicaciones, incluyendo, aunque sin limitación, la terapéutica clínica y los trabajos de investigación básica.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona bacterias Gram-negativas viables (v.g., E. coli) que tienen una membrana externa que expresa lípido IVa. La presente invención no se limita a un método particular de obtención de bacterias Gram-negativas viables que tienen una membrana externa que expresa lípido IVa. En algunos ejemplos, se obtienen bacterias Gram-negativas viables que tienen una membrana externa que expresa lípido IVa por supresión de la expresión de la proteína API. La presente divulgación no se limita a un método particular de supresión de la expresión de la proteína API. En algunos ejemplos, se suprime la expresión de API por supresión de la expresión de la proteína KDO. La presente invención no se limita a un método particular de supresión de la expresión de la proteína BCDO. En algunas realizaciones, se suprime la expresión de la proteína KDO a través de, por ejemplo, mutación del gen gutQ, kdsD, kdsA, kdsB, waaA, msbA y/o yhjD o mutaciones de cualquier otro gen biosintético, de procesamiento o de circulación. En algunas realizaciones, se obtienen bacterias Gram-negativas viables libres de LPS que tienen una membrana externa que expresa Lípido IVA por inhibición de la asociación entre KDO y el Lípido IVA, de tal forma que sólo se transporta Lípido IVA a la membrana externa (v.g., sin KDO). La presente invención no se limita a un método particular de inhibición de la asociación entre KDO y el Lípido IVA. En algunas realizaciones, se inhibe la asociación de KDO y el Lípido IVA mediante, por ejemplo, mutaciones en los genes gutQ, kdsD, kdsA, kdsB, waaA, msbA y/o yhjD, o mutaciones de cualquier otro gen biosintético, de procesamiento o de circulación. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona lípido IVa aislado de bacterias Gram-negativas viables no tóxicas (v.g., E. coli). Se usa el lípido IVa, por ejemplo, en el estudio de las rutas de señalización del shock séptico de mamíferos, y como bloque de construcción en la síntesis de moléculas de tipo LPS. Los métodos actuales para aislar el lípido IVa conllevan síntesis orgánica total tradicional, degradación del LPS maduro o purificación a partir de mutantes condicionados que elaboran una capa de LPS heterogénea que contiene una fracción del lípido IVa deseado. Como inconvenientes de dichos métodos, se incluyen un bajo rendimiento en lípido IVa y grandes cantidades de trabajo. El aislamiento de lípido IVa a partir de las bacterias Gram-negativas viables no tóxicas de la presente invención representa una mejora significativa con respecto a dichos métodos, debido a la presencia en la membrana externa de lípido IVa.

La presente divulgación proporciona vesículas de membrana externa aisladas de bacterias Gram-negativas viables no tóxicas (v.g., E. coli). El lípido IVa es un antagonista de las rutas de señalización del shock séptico, y un enfoque viable para el tratamiento de pacientes con sepsis aguda es bloquear la ruta de señalización en la que está implicado el LPS. En algunos ejemplos, se usan vesículas aisladas de la membrana externa de bacterias Gram

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negativas viables que tienen una membrana externa que expresa lípido IVa para tratar, o prevenir profilácticamente, trastornos relacionados con la sepsis. Las vesículas de la membrana externa preparadas a partir de las bacterias Gram-negativas viables no tóxicas de la presente divulgación (v.g., la cepa API) contienen lípido IVa como antagonista de LPS.

En algunos ejemplos, se usan vesículas de la membrana externa aisladas de bacterias Gram-negativas viables (v.g.,

E. coli) con fines de obtención de vacunas mejoradas basadas en vesículas de membrana externa. Las vacunas basadas en VME son con frecuencia "detoxicadas" por eliminación del LPS mediante tratamientos químicos severos. Los métodos de eliminación, sin embargo, tienen un efecto perjudicial sobre los componentes proteicos de la vacuna de VME, que puede ser una buena candidata para dirigir anticuerpos contra, en particular, proteínas de la membrana externa clonadas de otros patógenos Gram-negativos. La detoxicación no sería necesaria con la cepa mutante API como hospedador, proporcionando un nivel adicional de seguridad.

La presente divulgación proporciona bacterias Gram-negativas que tienen una membrana externa tanto con lípido IVa como con expresión de LPS. La separación de la toxicidad del LPS y de las propiedades inmunoestimulantes es un reto importante en el desarrollo de adyuvantes basados en LPS o vacunas basadas en LPS. Dado que el bloqueo en la cepa API es precoz en la ruta del LPS, se pueden usar enzimas de otras bacterias (que modifiquen el LPS con grupos fosfato, etanolamina, L-4-desoxiarabinosa, diferentes longitudes de las cadenas de acilo, etc.) y enzimas mutadas con actividades alteradas para generar una serie de moléculas de LPS con actividades biológicas únicas en el interior de la célula. Ya existen muchos métodos para dichas manipulaciones genéticas en Escherichia coli. Además, se puede restaurar la síntesis del LPS maduro por inclusión de D-arabinosa 5-fosfato en el medio de crecimiento, lo que permite controlar y optimizar la cantidad y la proporción entre derivados de LPS y LPS maduro. Dichas "mezclas" de LPS pueden alcanzar el equilibrio deseado entre actividad inmunoestimulante y retención de niveles bajos aceptables de toxicidad potencial.

En algunos ejemplos, se usan bacterias Gram-negativas viables no tóxicas como hospedadores para la producción de moléculas terapéuticas libres de endotoxina. La presente divulgación no se limita a moléculas terapéuticas particulares. Tradicionalmente, la producción de moléculas terapéuticas en bacterias Gram-negativas, ya sean vesículas de ME para vacunas, moléculas de tipo LPS (tales como monofosforil-lípido A (MPLA)) para uso como adyuvantes, proteínas farmacéuticas recombinantes, macromoléculas o ADN para transfección con células de mamífero/terapia génica, se encuentra obstaculizada por la presencia de endotoxina procedente del huésped bacteriano. La contaminación de la molécula terapéutica con endotoxina es un problema, ya que el potencial inmunogénico del LPS está bien documentado. Las estrategias de producción actuales para aliviar la contaminación con endotoxina incluyen diversas técnicas de purificación, tales como los kits comercializados para la purificación de plásmidos de ADN libres de endotoxina, seguido de ensayos para medir los niveles de endotoxina. Como la cepa API no produce endotoxina, no se requieren dichas etapas de purificación. Como tales, las cepas de bacterias Gram-negativas viables no tóxicas de la presente invención (v.g., la cepa API) proporcionan métodos mejorados de aislamiento de moléculas terapéuticas libres de endotoxina (v.g., lípido IVa). Por ejemplo, se contempla la cepa API como un hospedador para la producción de moléculas terapéuticas comercialmente importantes en un ambiente libre de endotoxina usando las bien estudiadas bacterias Gram-negativas. Adicionalmente, se contemplan cepas que tienen una mutación en los genes gutQ, kdsD, kdsA, kdsB, waaA msbA yhjD, o mutaciones en cualquier otro gen bacteriano biosintético, de procesamiento o de circulación, como hospedadores para la producción de moléculas terapéuticas comercialmente importantes en un ambiente libre de endotoxina usando bacterias Gram-negativas.

En algunos ejemplos, se pueden usar las bacterias Gram-negativas viables no tóxicas para la producción de vacunas u otras composiciones que estimulen la respuesta inmune. Por ejemplo, se produce una vacuna menos tóxica contra la fiebre tifoidea usando las bacterias Gram-negativas aquí descritas. Las vacunas actuales para la fiebre tifoidea causan efectos colaterales debido a las endotoxinas presentes en la preparación vacunal. Se contempla que la utilización de las bacterias Gram-negativas viables no tóxicas o porciones de las mismas como aquí se describe, donde no hay presencia de LPS (v.g., endotoxina) sobre la membrana externa, obviará los efectos colaterales causados por las preparaciones de vacunas impregnadas de endotoxina. La presente invención halla utilidad en cualquier preparación vacunal u otra composición donde típicamente se encuentra contaminación con endotoxina. También se contempla que las bacterias Gram-negativas viables no tóxicas de la presente invención encuentren utilidad como vacunas atenuadas vivas debido a su fenotipo deficiente en LPS.

Como tal, la presente invención encuentra un uso en el desarrollo de vacunas de ME y otras composiciones para inducir respuestas inmunes que estén libres de contaminación con endotoxina y que puedan ser administradas a sujetos con fines de inmunización e investigación. Por ejemplo, se pueden preparar vacunas atenuadas o de ME usando procedimientos como los descritos en la Solicitud de Patente Estadounidense 2005/0013831 o en la Patente Estadounidense 6.558.677. Por ejemplo, dicha vacuna halla utilidad en la inmunización de sujetos en riesgo de adquirir shock séptico (v.g., por E. coli), tales como pacientes de cirugía. Además, se pueden desarrollar vacunas atenuadas o de ME libres de endotoxina para inmunización contra, por ejemplo, la tos ferina (v.g., Bordetella sp.), la brucellosis o el shock endotóxico (v.g., Brucella sp.), las infecciones pulmonares y respiratorias (v.g., Pseudomonas sp., Haemophilus sp., Moraxella sp.), el cólera (v.g., Vibrio sp.), la neumonía (v.g., Klebsiella sp., Haemophilus sp.), las úlceras gástricas (v.g., Helicobacter sp.), la meningitis (v.g., Neisseria sp., Haemophilus sp.), la otitis media (v.g.,

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Para verificar la naturaleza no esencial de KDO en KPM22, se alteraron los genes codificantes de la primera etapa realizada (kdsA) y de la última etapa (waaA) en la biosíntesis de KDO. Contrariamente a KPM22/KPM25 (Figura IB, calles 8,9), ni el A5P exógeno ni la API llevada por plásmidos restauraban la síntesis de LPS maduro en KPM31/KPM40 (calles 12, 15) o KPM34/KPM42 (calles 11, 14), respectivamente, lo que es consistente con la capacidad de KPM22 para sobrevivir sin la totalidad de la ruta del KDO.

Se examinó la morfología celular de KPM22 por microscopía electrónica de transmisión (TEM). En general, la estructura de KPM22 era bastante similar a la cepa parental (Figura 4). No se observaron defectos obvios de división por TEM y las células mantenían la forma normal de bacilo. Se discernían dos membranas claramente distintas para KPM22 (Figura 4D), así como una región entre las dos membranas que representaba el periplasma. El volumen periplásmico estaba uniformemente comprimido en comparación con el tipo salvaje. La inestabilidad de la ME venía sugerida por las pequeñas vesículas de membrana que aparecían en la superficie de KPM22 (Figura 4C). La formación de vesículas en la membrana externa (VME) puede haber estado causada por repulsión electrostática entre los fosfatos de 1,4’-GlcN de las moléculas próximas de lípido IVa que no resultan compensadas por interacciones estabilizadoras del núcleo de sacárido, aumentando la curvatura de la membrana y dando lugar a extrusión de vesículas desde la superficie bacteriana. La repulsión de cargas era particularmente relevante para KPM22 considerando que el análisis ESI-MS no detectó 4-amino-4-desoxi-L-arabinosa y sólo detectó mínimas modificaciones de fosfoetanolamina, sirviendo ambas cosas para reducir la cantidad de carga negativa neta (véase, v.g., C. R. Raetz, C. Whitfield, Annu. Rev. Biochem. 71 , 635 (2002)).

Los mecanismos compensatorios en KPM22 para acomodar la pérdida en la integridad de la ME debido a la truncación extrema del LPS invocaban la estabilización con otros glicolípidos unidos a la ME. En un mutante deficiente en LPS de N. meningitidis, se reportó que la síntesis de polisacáridos capsulares se hizo absolutamente necesaria para la viabilidad (véase, v.g., P. van der Ley, L. Steeghs, J. Endotoxin. Res. 9, 124 (2003)). E. coli K-12 no sintetizaba un polisacárido capsular, pero hay otros dos polisacáridos en la superficie celular además del LPS, a saber, el exopolisacárido del limo inducido por estrés ácido colónico (antígeno M) (véase, v.g., A. Markovitz, en Surface carbohydrates of the prokaryotic cell I. W. Sutherland, Ed. (Academic Press, Inc., New York, N. Y., 1977), vol. I, pp. 415-462)) y el antígeno común enterobacteriano (ECA) unido a fosfoglicérido (véase, v.g., H. M. Kuhn, et al., FEMS Microbiol. Rev. 4, 195 (1988)). No había diferencia en el nivel de metilpentosa no dializable (Figura 5A), un carbohidrato marcador constituyente del ácido colánico (véase, v.g., S. Gottesman, et al., J. Bacterid. 162, 1111 (1985)). El análisis de inmunotransferencia de lisados celulares reveló que la cantidad de ECA unido a glicerofosfatidilo estaba realmente disminuida en KPM22 (Figura 5B), lo cual es consistente con la desaparición del ECA cíclico que contiene cuatro unidades repetitivas de trisacárido (2429,89 u) del espectro de KPM22 del extracto de fenol (Figura 6). Por lo tanto, además de lípido IVa, la ME de KPM22 contenía niveles traza de ECA y niveles de tipo salvaje comparativamente bajos de ácido colánico. De manera colectiva, la envuelta de KPM22 representa el contenido en glicolípidos de la ME más mínimo reportado en E. coli capaz de mantener la viabilidad.

Una función principal de la capa de LPS es actuar como barrera de permeabilidad hacia la difusión tanto de grandes moléculas hidrofóbicas como de defensinas (péptidos policatiónicos) hacia el interior de la célula, así como retener los contenidos del compartimento periplásmico. Las fuertes interacciones laterales entre moléculas de LPS adyacentes en la ME hacen que la capa de LPS esté particularmente bien adaptada para dicha función, además de proporcionar una medida de defensa inespecífica contra las respuestas del huésped. Se consigue la permeación selectiva de pequeñas moléculas hidrofílicas, nutrientes y antibióticos a través de los canales proteicos de las porinas de la membrana externa (PME). Se cribó un panel de antibióticos y detergentes frente a KPM22 para calibrar la efectividad del lípido IVa como barrera de permeabilidad (véase la Tabla 4).

Tabla 4. Propiedades de barrera de permeabilidad de KPM22 Concentración mínima inhibitoria (g/ml) 5

Compuesto

PM (g.mol-1) XlogP BW30270 (mg ml-1) KPM22 (mg ml-1) Número de veces de diferencia

Rifampina

822,9 3,72 16 0,03 512

Ácido fusídico

516,7 3,7 512 2 256

Novobiocina

612,6 2,74 256 1 256

Eritromicina

733,9 1,98 128 1 128

Bacitracina a

1.422,7 -1,03 4.096 512 8

Vancomicina

1.449,3 -0,47 256 32 8

Kanamicina

16 1 16

Cloranfenicol

323,1 1.476 8 2 4

Ampicilina

349,4 0,255 4 2 2

Cefaloridina

416,5 1,73 4 4 1

Dodecilsulfato de sodio (SDS)

>32.000 8 >4.000

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15

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25

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35

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Sales biliares b

16.000 128 125

Polimixina E c

0,25 0,06 4

a. 74.000 unidades/g. mezcla de colato y desoxicolato de sodio.c. Colistina; 20.261 unidades/mg

KPM22 era supersusceptible a una serie de grandes antibióticos hidrofóbicos que típicamente tienen una eficacia razonable sólo contra bacterias Gram-positivas. Teniendo normalmente denegado el acceso a sus sitios de acción por la ME, estos compuestos accedían a las dianas intracelulares en KPM22. El acceso a la superficie de la membrana no era impedido por el núcleo de sacárido, facilitándose aún más el reparto y la posterior permeación a través de la bicapa lipídica comprometida. Sin embargo, la concentración mínima inhibitoria (CMI) de pequeños (< 600 Da) compuestos relativamente hidrofílicos que ganan paso a través de la ME primariamente mediante las PME estaba en el mejor de los casos sólo modestamente reducida. Una notable excepción era el aminoglicósido de carga positiva kanamicina. Se ha sugerido que los aminoglicósidos consiguen entrar primariamente gracias a un mecanismo autopromovido de captación que conlleva interacciones de emparejamiento de carga inicial con LPS independiente de las PME (véase, v.g., R. E. Hancock, et al., Antimicrob. Agents. Chemother. 35, 1309 (1991)). KPM22 era particularmente sensible a los detergentes, con una disminución mayor de 4.000 veces en la CMI para el dodecilsulfato de sodio. Dado que la concentración de sales biliares (metabolitos del colesterol) en el tracto intestinal humano varía de 4 a 16 mM (1650-6650 g/ml) (véase, v.g., B. Borgstrom, Acta Med. Scand. 196, 1 (1974)), la ME comprometida de KPM22 ya no sería adecuada para proteger a la célula de su ambiente hospedador. Sorprendentemente, la CMI de la polimixina E (colistina), un péptdio catiónico con un mecanismo de acción de tipo detergente, estaba deprimida sólo 4 veces en KPM22. La acumulación de polimixinas en la superficie de la membrana hasta la concentración crítica de agregados es pertinente para formar lesiones micelares en la bicapa lamelar, que posteriormente actúan como canales para el transporte autopromovido a través de la ME (véase, v.g.,

A. Wiese et al., J. Membr. Biol. 162, 127 (1998)). El lípido IVa tiene una razón reducida de carga a área superficial en comparación con el LPS, lo que resalta el papel de los residuos del núcleo interno de carga negativa en la unión de la polimixina. Como los antibióticos seleccionados tienen diversos mecanismos de acción, los cambios en las CMI entre compuestos hidrofóbicos son probablemente una consecuencia de cambios en la permeabilidad en lugar de un reflejo de la adecuación general o de los mecanismos de eflujo del fármaco. Las propiedades de permeabilidad de KPM22 demuestran el potencial de la inhibición de la biosíntesis de KDO como medio para ampliar el espectro de actividad de antibióticos que ya existen mediante reducción de la resistencia intrínseca de la barrera de la ME.

Las endotoxinas bacterianas son potentes moléculas proinflamatorias que provocan una respuesta inmune innata en humanos incluso cuando están presentes sólo en cantidades traza (véase, v.g., E. S. Van Amersfoort, et al., Clin. Microbiol. Rev. 16, 379 (2003)). El shock séptico inducido por bacterias Gram-negativas se produce como resultado de una respuesta inmune desequilibrada y mal regulada. En parte, esta cascada fisiopatológica se dispara por la activación de macrófagos por el LPS, los cuales a su vez segregan una serie de mediadores inflamatorios. Una de las primeras citoquinas liberadas por los macrófagos es la citoquina pleiotrópica TNF-(factor de necrosis tumoral). El potencial endotóxico de las preparaciones de LPS fue medido usando un ensayo basado en ELISA para la secreción de hTNF- por células mononucleares humanas estimuladas (Figura 7). Las preparaciones procedentes de KPM22 eran endotóxicamente inactivas a concentraciones de hasta 1 g/ml, lo cual es consistente con estudios anteriores que utilizaban lípido IVa cromatográficamente purificado (véase, v.g., D. T. Golenbock, et al., J. Biol. Chem. 266, 19490 (1991)). En E. coli y bacterias relacionadas, la inhibición de KDO no sólo aumentaba la susceptibilidad de las bacterias tanto a las respuestas del huésped como a los antibióticos, sino que también tiene el potencial de reducir el riesgo de sepsis al disminuir la carga de endotoxina.

El transportador de ABC de la membrana interna (cassette de unión de ATP) que voltea el LPS del citoplasma a la cara periplásmica de la MI es altamente selectivo para substratos de LPS/lípido A hexaacilados in vitro (véanse, v.g., Zhou Zhou, Z., et al., J. Biol. Chem. 273, 12466-12475 (1998); Doerrler, W. T., et al., J. Biol. Chem. 277, 3669736705 (2002)). MsbA fue originalmente identificado como un supresor multicopia de fenotipos sensibles a la temperatura LpxL (HtrB) (véase, v.g., Polissi, A., y Georgopoulos, C. Mol. Microbiol. 20, 1221-1233 (1998)). La complementación de la cepa auxotrófica TCM15 con una colección de cósmidos de ADN genómico de KPM22 reveló que MsbA era un supresor multicopia del fenotipo Kdo. Se aislaron diecisiete clones de cósmidos independientes que contenían el locus msbA. Un subclón de cósmido (pMMW52), que contenía una inserción de 3,5 kb con sólo una secuencia msbA de tipo salvaje intacta idéntica al tipo salvaje era capaz de rescatar directamente TCM15 sin necesidad de desarrollar la(s) mutación(es) supresora(s) supuesta(s), como indican la pérdida de auxotrofia A5P y la restauración de la capacidad de formación de colonias en agar sólido (Tabla 5). El índice de crecimiento de TCM15(pMMW52) es similar a KPM22 (Tablas 2 y 5). Estos resultados indican que, aunque el lípido IVA es un substrato pobre in vitro (véase Doerrler, W. T. y Raetz, C. R., J. Biol. Chem. 277, 36697-36705 (2002)), el lípido IVa se convierte en un substrato para MsbA in vivo cuando está presente en grandes concentraciones por simple acción de masa.

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MWG Biotech

a. Las regiones de homología están subrayadas.

Todas las cepas fueron cultivadas en medio Luria-Bertani estándar (10 g Triptona, 5 g Extracto de levadura, 10 g NaCl) o medio mínimo MOPS (véase, v.g., F. C. Neidhardt, P. L. Bloch, D. F. Smith, J. Bacteriol. 119, 736 (1974)) con un 0,2% de glicerol como única fuente de carbono. La cepa de E. coli KPM22 fue usada como huésped para las alteraciones de los genes kdsA y waaA cromosómicos empleando el sistema de recombinasa Red del fago  según el procedimiento de Datsenko y Wanner (véase, v.g., K. A. Datsenko, B. L. Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 6640 (2000)). Se utilizaron kanamicina y ampicilina a 15 g/ml y 100 g/ml, respectivamente. Se usaron los pares de cebadores P1/P2 con pKD13 (kan) o P3/P4 con pKD4 (kan) como plantillas para construir cassettes de inserción para KPM31 y KPM40, respectivamente. Se cortaron marcadores de resistencia a los antibióticos usando el sistema de recombinasa FLP como se ha descrito (véase, v.g., K. A. Datsenko, B. L. Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 6640 (2000)), excepto por curar todos los plásmidos a 37°C.

Ejemplo III

Este ejemplo describe el crecimiento de KPM22. El crecimiento de KPM22 conllevaba la división exponencial de los cultivos de TCM 15 en medio mínimo MOPS suplementado con 10 M de D-glucosa 6-fosfato y 15 M de Darabinosa 5-fosfato a 37°C se diluyeron (1:200 v/v) en el mismo medio carente de los suplementos de azúcar fosfato. Tras un lapso inicial de 24-32 horas, se reanudó el crecimiento y se purificaron las colonias de los cultivos en placas de agar LB.

Ejemplo IV

Este ejemplo describe las determinaciones del índice de crecimiento para experimentos que incluían KPM22. Se cultivaron cultivos de una noche a 30°C y se usaron para inocular medio LB precalentado fresco (30°C, 37°C o 42°C) a una DO600 nm igual a 0,05-0,1. Se monitorizó el crecimiento midiendo el cambio en la DO600 nm y se diluyeron los cultivos a medida que la DO se aproximaba a 0,7 para mantener el crecimiento exponencial. En la Tabla 7 se indican los tiempos de duplicación.

Tabla 7. Tiempos de generación en medio LB a diversas temperaturas

Cepa

30°C (min.) 37°C (min.) 42°C (min.)

BW30270

39 24 22

KPM22

55 38 N/A a

KPM25

40 25 23

a, Tras 2-3 generaciones, el índice de crecimiento era no exponencial.

Ejemplo V

Este ejemplo describe la purificación de LPS para experimentos que implican a KPM22 y TCM15. Se prepararon muestras rutinariamente cultivando 500 ml de cada cepa en medio LB a 37°C con aireación constante a 250 rpm. Se recogieron las células de cultivos en fase estacionaria por centrifugación (10 min., 8.000xg, 4°C), se lavaron en agua destilada y se volvieron a centrifugar. Se deshidrató la biomasa por tratamiento con etanol (95%), acetona y éter dietílico como se ha descrito previamente (véase, v.g., U. Zähringer et al., J. Biol. Chem. 279, 21046 (2004)). Se realizó el aislamiento del LPS por extracción de las células desecadas según el procedimiento de fenol-cloroformoéter de petróleo (véase, v.g., C. Galanos, O. Lüderitz, O. Westphal, Eur. J. Biochem. 9, 245 (1969)). Se dializaron extensamente alícuotas del extracto fenólico bruto que había de ser analizado en cuanto a la composición de carbohidratos (Figura IA) frente a agua destilada (PMCO=1.000 Da) y se recogieron por liofilización. Se purificaron las muestras de LPS para el análisis de espectrometría de masas y la medición de la liberación de la citoquina TNF humano a partir de la fase fenólica bruta por precipitación mediante adición gota a gota de agua. Se formó un precipitado floculento sólo para BW30270 y KPM25, el cual fue recogido por centrifugación y lavado sucesivamente con fenol al 80% y luego acetona. Se disolvieron los precipitados en agua y se dializaron por separado de su respectivo licor madre de la fase fenólica. Tras la liofilización, se resuspendieron las muestras en tampón (20 mM Tris-HCl, pH=7,5, 10 mM NaCl, 10 mM MgCl2) y se trataron con ADNasa I (20 g/ml) y ARNasa A (20 g/ml) durante 8 horas a 37°C, seguido de proteinasa K (100 g/ml) durante 16 horas. Se recogieron las muestras de LPS por ultracentrifugación (SW 41 Ti rotor oscilante, 200.000xg, 2 horas, 15°C), se lavaron tres veces con agua destilada y se dializaron extensamente frente a agua antes de la liofilización. En la Tabla 8 se indican los rendimientos representativos de la purificación del LPS.

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Tabla 8. Resumen de purificación del LPS

Cepa DO600 nm Masa de Masa de Ppt. a Soluble Ppt. LPS Rendimiento % final la célula la célula observado en fenol (mg) purificado b Rendimiento húmeda desecada (mg) (mg)

c

(g)

(g) BW30270 5,27 2,50 0,56 + 7,0 13,5 12,1 2,1 KPM22 3,61 1,88 0,43 -13,3 N/A 7,2 1,7 KPM25 5,75 2,58 0,65 + 9,1 15,7 13,0 2,0

Ppt.-precipitado. b. Tras tratamiento con ADNasa I/ARNasa A/proteinasa K. c. En base a la masa celular seca.

a.

Ejemplo VI

Este ejemplo describe el análisis de la composición de carbohidratos para experimentos que implican a KPM22 y TCM15. El contenido en D-glucosamina (GlcN), 2-ceto-3-desoxi-D-mano-octulosonato (KDO) y L-glicero-D-manoheptosa (heptosa) de muestras de LPS del extracto fenólico bruto fue determinado usando ensayos químicos colorimétricos. Se determinó el contenido en GlcN por hidrólisis de las muestras de LPS (1 mg) en 500 l de HCl 4 M a 100°C durante 18 horas. Se cuantificó la GlcN liberada usando el ensayo de acetilaminoazúcares (véase, v.g., J.

L. Strominger, J. T. Park, R. E. Thompson, J. Biol. Chem.234, 3263 (1959)). Se midió el contenido en KDO usando el ensayo de ácido tiobarbitúrico adaptado para LPS (véase, v.g., Y. D. Karkhanis, J. Y. Zeltner, J. J. Jackson, D.J. Carlo, Anal. Biochem. 85, 595 (1978)), mientras que la cantidad de heptosa fue estimada usando el ensayo de cisteína-ácido sulfúrico modificado (véase, v.g., M. J. Osborn, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 50. 499 (1963)).

Ejemplo VII

Este ejemplo describe la electroforesis SDS-PAGE y las inmunotransferencias Lípido A/ECA para experimentos que implican a KPM22 y TCM15. Se analizaron los perfiles de LPS de lisados de células enteras por SDS-PAGE según el método de Hitchcock y Brown (véase, v.g., P. J. Hitchcock, T. M. Brown, J. Bacteriol. 154, 269 (1983)). Resumiendo, se rasparon colonias de cada muestra de placas de agar LB y se suspendieron a turbideces iguales en solución salina tamponada con fosfatos de Dulbecco. Se recogieron las pellas celulares lavadas por centrifugación, se añadió tampón de lisis (50 l de Tris-HCl 62,5 mM, pH 6,8, 2% de SDS, 5% de 2-mercaptoetanol, 10% de glicerol, 0,002% de azul de bromofenol) y se calentaron las muestras en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos. Se añadió proteinasa K (25 g, 10 l de 2,5 mg/ml) a cada lisado de células enteras y se incubó durante 1 hora a 56°C. Se cargaron volúmenes idénticos en geles de SDS-PAGE al 13% y se trabajaron entonces a corriente constante (15 mA). Se tiñeron los geles con plata para el análisis de LPS (véase, v.g., P. J. Hitchcock, T. M. Brown, J. Bacteriol. 154, 269 (1983)), o se electrotransfirieron a voltaje constante (26 V) de los geles a membranas de difluoruro de polivinilideno usando tampón Tris-glicina (20 mM Tris, 150 mM glicina, pH 8,3, 20% metanol) como se ha descrito (véase, v.g., H. Towbin, T. Staehelin, J. Gordon, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 76, 4350 (1979)). Antes de la incubación de las transferencias con mAb A6, que reconoce el esqueleto de disacárido de GlcN -1,6-unido 1,4’bisfosforilado no glicosilado del lípido A (véase, v.g., L. Brade, O. Hoist, H. Brade, Infect. Immun. 61, 4514 (1993)), se hirvieron las membranas durante 1 hora en ácido acético al 1% para escindir la unión -2,6-KDO-GlcN antes de revelar por el procedimiento inmunológico habitual (véase, v.g., R. Pantophlet, L. Brade, H. Brade, J. Endotoxin Res. 4, 89 (1997)). Se usó lípido IVa sintético auténtico (compuesto 406) como patrón (véase, v.g., M. Imoto et al., Bull. Chem. Soc. Japan 60, 2197 (1987)). Se sondeó la inmunotransferencia del antígeno común enterobacteriano (ECA) usando mAb 898 (véase, v.g., H. Peters et al., Infect. Immun. 50, 459 (1985)). Se incubaron las inmunotransferencias con IgG de cabra antirratón conjugada a fosfatasa alcalina (H+L) y se revelaron en presencia de nitroazul tetrazolio y substrato 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato.

Ejemplo VIII

Este ejemplo describe la Espectrometría de Masas de Ciclotrón de Iones con Transformación de Fourier e Ionización por Electronebulización (ESI FT-ICR MS) usada en experimentos realizados en el curso de la presente invención. Se realizó la ESI FT-ICR MS en el modo de iones negativos utilizando un instrumento APEX II (Bruker Daltonics, Billerica, USA) equipado con un imán activamente blindado de 7 Teslas y una fuente de iones Apollo. Se adquirieron los espectros de masas usando secuencias experimentales estándar proporcionadas por el fabricante. Se disolvieron las muestras a una concentración de 10 ng/l en una mezcla 50:50:0.001 (v/v/v) de 2-propanol, agua y trietilamina y se pulverizaron a una velocidad de flujo de 2 l/min. Se fijó el voltaje de la entrada capilar a 3,8 kV y la temperatura del gas seco a 150°C. Se realizó la deconvolución de carga de los espectros y los números de masa dados hacen referencia a masas monoisotópicas neutras. Se interpretaron las asignaciones de picos en base al análisis estructural detallado previamente publicado del LPS de E. coli K-12 cepa W3100 (véase, v.g., S. Müller-Loennies, B. Lindner, H. Brade, J. Biol. Chem. 278, 34090 (2003)). Sólo se resumen los iones más abundantes en la Tabla 9, ya que había algunas especies moleculares con picos isotópicos solapantes que no pudieron ser identificadas de manera inequívoca.

Tabla 9. Lista de picos ESI FT-ICR MS

Masa obs. a,b

Masa calc. a Composición química c Marcaje c

703,52

703,517 fosfolípido, PE (33:1) (c.g.1* 16:0 + 1*17: 1) PE

1178,67

1178,661 2*GlcN, 2*P, 3* (OH)-14:0 LAtri

1360,83

1360,828 2*GlcN, 2*P, 3* (OH)-14:0, 1* 12:0 LAtetra

1404,86

1404,854 2*GlcN, 2*P, 4* (OH)-14:0 Lípido IVa

1527,87

1527,863 2*GlcN, 2*P, 4* (OH)-14:0, 1* P-EtN

1587,02

1587,021 2*GlcN, 2*P, 4* (OH)-14:0, 1* 12:0 LApenta

1797,22

1797,219 2*GlcN, 2*P, 4* (OH)-14:0, 1* 12:0, 1* 14:0 LAhexa

3813,75

3813,734 LAhexa + 1*Gal, 3*Glc, 4*Hep, 2*KDO, 2*P Glicoformo I

3893,72

3893,700 LAhexa + 1*Gal, 3*Glc, 4*Hep, 2*KDO, 3*P Glicoformo I

3915,71

3915,699 LAhexa + 1*Gal, 3*Glc, 4*Hep, 2*KDO, 3*P, + 1*Na Glicoformo I

3995,63

3995,653 LAhexa + 1*Gal, 3*Glc, 4*Hep, 2*KDO, 4*P, + 1*Na Glicoformo I

4017,66

4017,645 LAhexa + 1*Gal, 3*Glc, 4*Hep, 2*KDO, 4*P, + 2*Na Glicoformo I

4038,69

4038,697 LAhexa + 1*Gal, 3*Glc, 4*Hep, 2*KDO, 5*P, 1*P-EtN + 1*Na Glicoformo I

3927,68

3927,689 LAhexa + 1*Gal, 2*Glc, 3*Hep, 1*Rha, 3*KDO, 3*P + 1*Na Glicoformo IV

4007,67

4007,655 LAhexa + 1*Gal, 2*Glc, 3*Hep, 1*Rha, 3*KDO, 4*P + 1*Na Glicoformo IV

4029,64

4029,654 LAhexa 1*Gal, 2*Glc, 3*Hep, 1*Rha, 3*KDO, 4*P + 2*Na Glicoformo IV

4050,70

4050,698 LAhexa + 1*Gal, 2*Glc, 3*Hep, 1*Rha, 3*KDO, 3P + 1*P-EtN, + 1*Na Glicoformo IV

4140,67

4140,722 LAhexa + 1*GlcNAc, 1*Gal, 3*Glc, 4*Hep, 2*KDO, 3*P,+2*Na Glicoformo II

4198,74

4198,735 LAhexa + 1*GlcNAc, 1*Gal, 3*Glc, 4*Hep, 2*KDO, 4*P, + 1*Na Glicoformo II

4220,73

4220,724 LAhexa + 1*GlcNAc, 1*Gal, 3*Glc, 4*Hep, 2*KDO, 4*P, + 2*Na Glicoformo II

4300,68

4300,698 LAhexa 1*GlcNAc, 1*Gal, 3*Glc, 4*Hep, 2*KDO, 5*P, + 2*Na Glicoformo II

4241,81

4241,778 LAhexa + 1*GlcNAc, 1*Gal, 3*Glc, 4*Hep, 2*KDO, 3*P, 1*P-EtN + 1*Na Glicoformo II

4321,73

4321,745 LAhexa + 1*GlcNAc, 1*Gal, 3*Glc, 4*Hep, 2*KDO, 4*P, 1*P-EtN + 1*Na Glicoformo II

4343,74

4343,734 LAhexa + 1*GlcNAc, 1*Gal, 3*Glc, 4*Hep, 2*KDO, 4*P, 1*P-EtN + 2*Na Glicoformo II

a. Los números de masa dados hacen referencia a las masas monoisotópicas de las moléculas neutras que se dedujeron de los espectros de masas ESI FT-ICR de iones negativos de la fracción de LPS tras la deconvolución de carga. b. Los picos de tipo negrita están marcados en la Figura 4 en texto. c. Abreviaturas: PE-fosfatidiletanolamina; GlcN-D-glucosamina; P-fosfato; P-EtNfosfoetanolamina; Gal-D-galactosa; GIc-D-glucosa; Hep-L-glicero-Dmano-heptosa; KDO-2-ceto-3-desoxi-D-mano-octulosonato; Rha-ramnosa; GlcNAc-N-acetil-D-glucosamina; LAtri, tetra, penta, hexa -estado de acilación del lípido A.

Ejemplo IX

5 Este ejemplo describe la cuantificación de ácido colónico en experimentos que implican a KPM22 y TCM15. Se estimó el ácido colánico por medio de una modificación del método descrito por Kang y Markovitz (véase, v.g., S. Kang, A. Markovitz, J. Bacteriol. 93, 584 (1967)). Se rasparon colonias de placas de agar LB y se resuspendieron en 10 ml de agua destilada a turbideces idénticas (DO600 nm), se sumergieron en un baño de agua hirviendo durante 15

10 minutos para liberar los polisacáridos extracelulares y se aclararon por centrifugación (10 min., 8.000xg). Se estudió el sobrenadante en cuanto a metilpentosa (L-fucosa), un constituyente del ácido colánico, mediante una reacción colorimétrica específica usando L-fucosa auténtica como patrón (véase, v.g., Z. Dische, L. B. Shettles, J. Biol. Chem. 175, 595 (1948)). Se incluyó un aislado mucoide de BW30270 como control positivo.

15 Ejemplo X

Este ejemplo describe la Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) empleada en experimentos realizados en el curso de la presente invención. Se fijaron cultivos de células que crecían en fase log inicial en medio LB a 37°C en tetraóxido de osmio al 2% durante 90 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron las células 3 veces con agua 20 destilada antes de incubarlas con una solución de contraste de acetato de uranilo al 2% durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron de nuevo las células 3 veces con agua destilada y se deshidrataron después con una serie de lavados con etanol a concentraciones crecientes (30%, 50%, 70%, 90% y etanol abs. durante 15 min. cada uno a temperatura ambiente). Se bañaron dos veces las células deshidratadas en óxido de propileno durante 15 min. cada una a temperatura ambiente, seguido de impregnación en una mezcla de óxido de propileno/Epon (1:1,

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Claims (1)

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