CN101091797B - 去除初纯质粒或蛋白质溶液中内毒素的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明者建立了一种去除初纯质粒或蛋白质中内毒素的方法:包括单独应用PMXB,或联用PMXB和TritonX-114,加有机溶剂混合后进行分相;或先应用PMXB和TritonX-114加有机溶剂进行分相,再与PMXB凝胶混合法和/或PMXB凝胶层析法相结合的方法去除质粒或蛋白质中的内毒素。本发明操作简便快速、成本低,可将质粒液或蛋白液中的内毒素量降低至10EU/mg以下,符合临床用药标准,而且不影响去除内毒素后质粒或蛋白液的浓度。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体涉及基因疫苗、基因治疗所用质粒的纯化工艺及蛋白质的纯化工艺,更具体说,涉及去除初步纯化的质粒或蛋白质(初纯质粒或蛋白质)溶液中内毒素的方法。
背景技术
采用“裸工程质粒”的核酸疫苗是近十年出现的、目前正在研发的最新一代或第三代疫苗,研究显示其对第一、第二代疫苗基本无效的传染病如龋病、艾滋病、结核病、疟疾等的预防和乙型肝炎的治疗具有独特的优势和应用前景。核酸疫苗诱导机体细胞免疫应答能力的独特优点弥补了第一、第二代疫苗的不足,而且这些显著优点正是防治上述疾病所必须的,对此国际上已获得共识。另外,肿瘤的免疫治疗也主要依赖细胞免疫力,其核酸疫苗的研制也是当今热点之一。除了作为核酸疫苗外,质粒也可用于基因治疗和(表达)抗体治疗。因而质粒纯化技术的研究目前已从实验室阶段向实用产业化阶段发展。
质粒是大肠杆菌细胞内能独立于染色体进行复制和表达的环形DNA。工程质粒是将大肠杆菌质粒经基因工程改造,在其中插入了编码病原体的保护性抗原蛋白的基因,和优选的免疫增强性细胞因子。将纯化的工程质粒注射入人体肌肉等部位,能在相关抗原加工处理细胞(Antigen Present Cell,APC)或肌肉细胞中表达所编码的抗原,诱导机体产生体液和细胞免疫应答反应来抵御病原体。
目前研制的针对不同人类病原体的精心制备的工程质粒,基本上都采用美国FDA推荐的可用于人体的卡那霉素抗性大肠杆菌质粒pVAX1改造而成,其中除病原体基因和细胞因子不同外,整个结构大同小异。从培养的工程大肠杆菌中抽提质粒首先要破裂细菌使质粒释放出来,但是在释放质粒的同时还释放出大量大肠杆菌自身的RNA、基因组DNA、细菌蛋白质、脂类、细胞壁成分和内毒素等杂质,而质粒只占其中的千分之一左右,因此需要采用适当的技术提取质粒去除杂质。大规模破裂细菌的方法有机械和化学方法,而目前多采用化学方法即碱裂解法,其质粒破坏少回收率高(见卢圣栋主编“现代分子生物学实验技术”,第二版,中国协和医科大 学出版社,1999年12月,北京;和J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔著,黄培堂等译:“分子克隆实验指南”,第三版,2002年8月,科学出版社出版,北京,中有关章节)。
本发明者在2004年12月21日提交的发明专利申请“改进的碱裂解法提取基本纯质粒的方法及多层层析装置”(申请号20041093322.1)已就初纯质粒制备过程中的牛胰腺RNA酶替代物、离子交换层析和浓缩生产工艺进行了实用性改进,获得了优良结果,但初纯质粒中所含高度污染的内毒素必须去除才能适合人体应用。
另外,利用基因工程技术生产各种细胞因子、生长因子、白细胞介素、干扰素、激素、抗体等蛋白质已有二、三十年,其中不少采用大肠杆菌作为宿主菌,或利用噬菌体加宿主菌生产,因而也存在内毒素污染问题。但由于内毒素与蛋白质性质相差较大,蛋白污染的内毒素不多,含量为数千至数万EU/mg,而这些蛋白生产工艺中采用的沉淀、多步凝胶层析、亲和层析、超滤等多个步骤已足够逐渐去除内毒素,故一般不需再次去除内毒素。然而实验室小量制备蛋白时,有时需要去除其中的内毒素,以利于细胞培养、动物实验等用途。
内毒素是热源物质,注入动物体内可引起动物发热等毒性作用,并大大降低质粒转化及细胞表达抗原的效率。内毒素(endotoxin)是革兰阴性菌(GNB)细胞壁外膜上的特有结构,其本质是脂多糖(LPS)。在化学结构上主要由两大部分组成,即多糖(polysaccharide)和类脂A(lipid A),多糖又可分为0-特异性多糖链(0-spcificpolysaccharide chain)和核心寡聚糖(core oligosaccharide)两部分,结构见附图1,图1中A为光滑型LPS结构,由三部分组成,0—特异性侧链(m)、核心(外核+内核)(II)和类脂A(I);B为粗糙型LPS结构,由两部分组成,核心(外核+内核)(II)和类脂A(I)。不同的革兰氏阴性细菌,其LPS的化学组成又有一定的差别,但都含有类脂A部分。类脂A是LPS的活性中心,也是其毒性的基础,主要由氨基葡萄糖、磷酸10、18碳的长脂肪酸组成,在生理条件下,具有疏水性和电负性。鲎试剂和内毒素的反应主要是与脂质A结合。内毒素在高温、强酸、强碱下都颇稳定。对于可用于人体的质粒,要求极高,即每毫克质粒中内毒素含量小于100EU,甚至小于10EU。
由于不同核酸疫苗的质粒结构大同小异,又同样采用大肠杆菌作为工程菌进行培育增殖,其生产和提纯方法也基本相同,这与蛋白质疫苗的制备和纯化条件各异不同相比,具有很大的优点,即建立的提取纯化方法将具有通用性。
传统的去除内毒素的方法有加热、蒸馏、过滤、反相渗透、活性碳粉、各种柱 层析方法,这些方法能去除或灭活部分内毒素,但都很难将内毒素一次性彻底去除,甚至经过多个步骤后,最终仍达不到临床试验级的要求。
目前通常采用的去除生物制品中内毒素的方法有TritonX-114雾点法和层析法。其中,雾点法可用于去除蛋白及质粒中污染的内毒素(Clement Bordier,JBiological Chemistry,256:1604-07,1981;Aida Y&Pabst MJ,J Immunol Methods,132:191-195,1990;Cotten M,Baker A,Sallik M等:Gene Therapy,1:239-46,1994),然而这些文献披露的方法在操作过程中需要转换温度,操作难于控制,且它们均未报导可去除内毒素至何种水平。本发明者经实验后发觉此法只能将内毒素降至10万EU/mg(质粒)左右。一些公司开发的质粒纯化试剂盒采用了有机溶剂离心分相法代替上述雾点温度转换分相离心法,即利用Triton X-114的两性性能,采用能溶解TritonX-114(及其与内毒素形成的复合物)但与水混合时不能互溶的有机溶剂,经离心分相去除Triton X-114与内毒素形成的复合物的方法。其内毒素去除率略高,能使质粒中内毒素残余量降低至1000EU/mg左右,但所得质粒的浓度下降一倍以上,需要浓缩,而且所得超螺旋质粒的含量明显减少,变成二聚体、三聚体,这是人用生物制品所不允许的。本发明者应用Qiagen提供的质粒超纯试剂盒进行实验,发现内毒素也只能去除到1000EU/mg左右。因此这类试剂盒采用的方法仍难达到临床用核酸疫苗内毒素含量小于100EU/mg的标准。
层析法可分为非特异性层析法和亲和层析法。非特异性层析法虽然能去除质粒中的内毒素达到临床级要求,但步骤较多,需要购买专用的填料和设备,生产成本高,同时因步骤过多导致质粒回收得率降低,这类方法不是专门去除内毒素的方法。
亲和层析法是采用对内毒素有选择性结合能力的多粘菌素B(Polymyxin B,PMXB)亲和凝胶填料使内毒素结合在凝胶上,此法可去除蛋白制品中的内毒素,且PMXB凝胶用后可用1%脱氧胆酸钠再生而重复使用。然而,此PMXB凝胶填料用于去除质粒中内毒素的效果不是令人非常满意而应用不多。
多粘菌素B硫酸盐,是一种从杆状多粘细菌的发酵产物中分离出来的阳离子环状多肽抗生素,其分子式为C55H96N16O13,其结构式见附图2,可见也具有两性(亲水性和亲脂性)基团。多粘菌素B是B1和B2突变体的混合物(其中占主导地位的是B1),低于50mg/ml的多粘菌素B硫酸盐水溶液澄清、色微黄。多粘菌素B硫酸盐在有机溶液里是微溶的,在2-8℃可保存活性至少2个月,在室温下可保存活性至少三星期,但在强酸溶液中迅速失活。多粘菌素B作用于革兰氏阴性菌细胞壁脂多糖 的脂质A部分,多粘菌素B的氨基端能与脂质A-kdo区的羧基端之间发生离子相互作用力、双方巯基之间可产生疏水作用力,因而能选择性结合内毒素(脂多糖),二者是一对一结合。根据ISP国际计量单位(1969年),每毫克多粘菌素B硫酸盐含8403个单位。
将多粘菌素B通过化学偶联固定在凝胶上后可用于去除蛋白制品溶液中的内毒素。Sigman和BioRad公司有相应的多粘菌素B亲和凝胶产品出售。Cotten M等人也试用了BioRad的多粘菌素B凝胶来去除质粒污染的内毒素,他们用TritonX-114雾点分相离心法或PMXB凝胶法去除内毒素后的质粒DNA成功转染了细胞而没有毒性,但他们没有具体测定去除内毒素到什么程度(Cotten M,Baker A,SallikM,et al:Gene Therapy,1:239-46,1994)。据我们的常规质粒细胞转染实验,只要去除内毒素到1万EU左右/mg(质粒)对细胞就没有毒性了。由于质粒污染的内毒素量很高,Sigman和BioRad公司并不推荐他们的多粘菌素B亲和凝胶用于去除质粒中污染的内毒素。本发明者购买了Sigma的多粘菌素凝胶进行柱层析,发觉最多可将质粒中内毒素含量降至1000EU/mg左右,而不能降到100EU/mg以下。而且这种凝胶层析法或混合法不可避免地会稀释质粒液,即使去除内毒素达到要求,但至少要增加一浓缩步骤,这也会影响得率。目前北京卓冠科技公司生产了去内毒素用琼脂糖凝胶FF(共价偶联了多粘菌素的琼脂糖凝胶),但是由于其吸附内毒素量低于1万/ml,而粗提质粒中内毒素的含量很高,故去除质粒内毒素效果不佳,达不到100EU/mg以下的要求。
在关于采用PMXB去除内毒素的文献中均提到PMXB凝胶层析法,未见采用PMXB进行有机溶剂离心分相来去除内毒素的报导或试剂盒。而且,至今尚未有PMXB与内毒素结合形成的复合物更易溶于有机溶剂的报导。
为了解决上述技术问题,达到临床级质粒纯化去除内毒素到100EU/mg以下标准,急需获得一种有效去除内毒素且质粒回收得率高的方法。本发明者根据已建立的Triton X-114有机溶剂离心分相法原理,利用本发明者对于PMXB与内毒素结合形成的复合物更易溶于有机溶剂的发现创立了PMXB有机溶剂分相法,或先用分相离心去除质粒液中的大部分内毒素,再结合PMXB亲和层析法去除残余内毒素;并利用本发明者对于PMXB和Triton X-114联用能更有效去除内毒素的发现,采用更简单的Triton X-114联合PMXB的有机溶剂分相法彻底去除内毒素。同时,对于可与水分相的有机溶剂的选择,本发明者也进行了研究,分别尝试了氯仿和无 毒无害的肉豆蔻酸异丙酯、乙酸乙酯、二乙二醇单甲醚及苯甲酸苄酯等等,从中筛选到乙酸乙酯和苯甲酸苄酯,进一步完善了本发明,使本发明方法可有效地应用于核酸疫苗和基因治疗用质粒产品的生产制备和蛋白质中内毒素的去除,从而完成了本发明。
因此,本发明第一个目的是提供两种去除初纯质粒或蛋白质中内毒素的方法。
本发明第二个目的是提供一种去除初纯质粒或蛋白质中内毒素的试剂盒。
发明概述
本发明第一方面提供一种用PMXB去除初纯质粒或蛋白质中内毒素的方法,包括将质粒或蛋白质与PMXB,按质粒与PMXB的重量比为1000∶100-800或蛋白质与PMXB的重量比为1000∶2.5-30,于室温下混合均匀形成混合液;加入与水混合时不能互溶可与水分相的有机溶剂混匀后分层,水相用所述有机溶剂洗涤后得到去除内毒素的含质粒或蛋白质的水相。
本发明第二方面提供一种PMXB和TritonX-114联用去除初纯质粒或蛋白质中内毒素的方法,包括将质粒与PMXB和TritonX-114液,按质粒与PMXB的重量比为1000∶50-600、质粒与Triton X-114液的重量体积比为1000μg∶20-400μl,或将蛋白质与PMXB和Triton X-114液,按蛋白质与PMXB的重量比为1000∶1.5-20、蛋白质与Triton X-114液的重量体积比为1000μg∶0.5-15μl,4-20℃下混合均匀形成混合液;加入与水混合时不能互溶可与水分相的有机溶剂混匀后分层,水相用所述有机溶剂洗涤后得到去除内毒素的含质粒或蛋白质的水相。
本发明提供的去除内毒素的方法还包括用PMXB凝胶去除剩余内毒素的PMXB凝胶法步骤,包括PMXB凝胶混合法和/或凝胶层析法。
本发明提供的有机溶剂选白氯仿、苯甲酸苄酯和乙酸乙酯。
本发明提供的混合液还含有最终浓度为0.1-1.0M的NaCl。
本发明第三方面提供的一种去除初纯质粒或蛋白质中内毒素的试剂盒,包括PMXB及使用说明书,所述说明书上记载采用权利要求1所述方法去除初步纯化的质粒或蛋白质溶液中内毒素的方法。
试剂盒中还可包含TritonX-114,所述PMXB及TritonX-114为分置于多个独立包装的无内毒素小管中的溶液,可为单独用于去内毒素的试剂盒,或为质粒或蛋白质纯化全套试剂盒中的组成部分。
发明详述
本发明第一方面提供一种去除初纯质粒或蛋白质中内毒素的方法,包括以下步骤:将质粒或蛋白质液与PMXB溶液,按质粒与PMXB的重量比为1000∶100-800,优选1000∶350-450;或蛋白质与PMXB的重量比为1000∶2.5-30,优选1000∶5-15,混合均匀形成混合液,然后在混合液中加入有机溶剂,离心或静置分层后获得含有质粒或蛋白质的水相,和含有内毒素的有机相。
本发明第二方面提供一种PMXB和TritonX-114联用去除初纯质粒或蛋白质中内毒素的方法,包括将质粒液与PMXB液和TritonX-114液,按质粒与PMXB的重量比为1000∶50-600,优选1000∶350-450,质粒与Triton X-114液的重量体积比为1000μg∶20-400μl,优选1000μg∶70-90μl混合均匀形成混合液;或将蛋白质液与PMXB液和Triton X-114液,按蛋白质与PMXB的重量比为1000∶1.5-20,优选1000∶4-10,蛋白质与Triton X-114液的重量体积比为1000μg∶0.5-15μl,优选1000μg∶4-10μl,混合均匀形成混合液;然后在混合液中加入有机溶剂,离心或静置分层后获得含有质粒或蛋白质的水相,和含有内毒素的有机相。
术语“混合液”指质粒或蛋白质与具有去除内毒素作用的试剂混合后形成的溶液,除含有质粒或蛋白质外,还含有PMXB或PMXB和TrintonX-114。
当混合液中含有TrintonX-114时,与TritonX-114的混合在4-20℃,优选4-10℃下进行,Triton X-114可以和PMXB同时或先后与质粒混合。优选先将PMXB与质粒混合,混合时间优选20分钟,再加入Triton X-114液,混合时间优选15分钟。
本发明还包括采用上述第一方面或第二方面的方法去除大部分内毒素后,再联合使用PMXB凝胶法进一步去除内毒素的方法,包括使用PMXB凝胶混合法和/或层析法去除剩余内毒素的步骤。其中,PMXB凝胶与质粒的体积比可以为1-3∶1。所述PMXB凝胶可用1%胆酸钠溶液再生、平衡后重复使用。
术语“初纯质粒或蛋白质”是指从基因工程大肠杆菌提取的基本上已纯化或部分纯化但没有去除内毒素的质粒或蛋白质。可采用含0.1-1.0M NaCl的纯水、生理盐水、浓度为0.01-0.15M、pH6.5-8.5的各种缓冲液如磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、Tris/HCl等进行配制,其中NaCl浓度优选0.3M。可将质粒或蛋白质配制成各种浓度,优选1mg/ml以上浓度。
本发明中选用的PMXB,优选其硫酸盐溶液。可用与质粒液相同或不同的含0.1-1.0M NaCl的纯水、生理盐水、浓度0.01-0.15M、pH6.5-8.5的各种缓冲液如磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、Tris/HCl等缓冲液进行配制,可将PMXB配制成各种浓度,优选5mg/ml浓度,缓冲液优选含50-80%甘油,便于保存在零下20-25℃。
术语“有机溶剂”是任何与水混合但不能互溶,离心或静置后可分离形成有机 相和水相两相的有机溶剂。本发明中有机溶剂是本领域技术人员熟知的,优选氯仿、苯甲酸苄酯或乙酸乙酯,更优选无毒性且不被怀疑有致癌作用的苯甲酸苄酯或乙酸乙酯。有机溶剂洗涤次数为1-5次,优选3-4次,每次用量优选约等于混合液体积。
本发明提供的去除初纯质粒或蛋白质中内毒素的方法可用于小量或规模化去除初纯质粒液或初纯蛋白质液中的内毒素,或成为质粒提取纯化整个工艺中的一个组成部分。
本发明第三方面提供一种去除初纯质粒或蛋白质中内毒素的试剂盒,包括PMXB、TritonX-114及使用说明书,其中PMXB及TritonX-114为分置于一个或多个独立包装的无内毒素小管中的溶液。该试剂盒可以是独立的去内毒素试剂盒,用于实验室小量去除初纯质粒或蛋白质中的内毒素,或用于规模化去除初纯质粒中的内毒素,也可成为质粒或蛋白质大规模纯化全套试剂盒中的组成部分。
本发明提供的试剂盒中PMXB优选其硫酸盐,可用含0.1-1.0M NaCl的纯水、生理盐水、浓度0.01-0.15M、pH6.5-8.5的各种缓冲液如磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、Tris/HCl等缓冲液进行配制,可配制成各种浓度,优选5mg/ml浓度,其中NaCl浓度优选0.3M。其中Triton X-114液优选不稀释的原液。其中有机溶剂为与水混合时不能互溶,离心或静置后可分离形成有机相和水相二相的任何有机溶剂,优选氯仿、苯甲酸苄酯或乙酸乙酯,更优选氯仿或苯甲酸苄酯原液。
本发明的优点是:操作简便快速、成本低,可将质粒液或蛋白液中的内毒素降低至10EU/mg以下,符合临床用药要求,而且不影响去除内毒素后质粒或蛋白液的浓度。
附图的简单说明
图1是内毒素(脂多糖LPS)的分子结构图。
图2是多粘菌素B的分子结构图。
图3是有机溶剂离心分相法去内毒素后质粒的琼脂糖凝胶电泳结果。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施例,更具体地说明本发明的内容,并对本发明作进一步阐述,但这些实施例绝非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将属于本发明权利要求书的范围内。
实验材料和仪器
初纯质粒:HG43、PSW、PSA43和Ag85A重组蛋白质液得自上海海规生物科技有限公司。
有机溶剂:肉豆蔻酸异丙酯(isopropyl myristate)、乙酸乙酯(ethyl acetate)、二乙二醇单甲醚(dietylene glycol monomethyl ether)、苯甲酸苄酯(benzyl benzoate)、氯仿(chloroform),分析纯,均购自中国医药集团上海化学试剂公司。硫酸多粘菌素B(PMXB)和Triton-X-114购自Sigma(P1004和93428),PMXB亲和凝胶购自Sigma(P-1411)和北京卓冠生物技术公司。脱氧胆酸钠购自Aldrich。
以下实施例中肉豆蔻酸异丙酯、乙酸乙酯、二乙二醇单甲醚、苯甲酸苄酯、氯仿和Triton X-114均以不稀释的原液使用。硫酸多粘菌素B(PMXB)先用0.1M PBS缓冲液溶解,再加入甘油配制成浓度为5mg/ml、含80%甘油的溶液,保存于-20℃至-25℃冰箱中。
洁净的(即无内毒素的)1.5ml或2.0ml离心管(microtubes Clear),200μl和1000μl吸嘴购自AXYGEN公司;一次性灭菌注射器和超纯水或注射用生理盐水购自上海医药公司。分液漏斗、旋转瓶等玻璃器皿先用0.5M NaOH溶液浸泡24-48小时,大量蒸馏水洗涤后于250℃烘烤2小时除去内毒素。
HS-3垂直混合仪和旋涡振荡器购自宁波新芝公司,LXS-11B低速大容量离心机及TGL-16B小型台式离心机购自上海安亭科学仪器厂,RE-52B型旋转蒸发仪购自上海博通公司。鲎试剂及洁净的玻璃小试管购自湛江安度斯生物有限公司,灵敏度为0.25EU/ml,按说明书操作采用胶凝法半定量测定质粒液的内毒素含量。
实施例1应用鲎试剂胶凝半定量法测定质粒液中的内毒素含量
1.鲎试剂灵敏度复核:采用湛江安度斯公司生产的鲎试剂盒(灵敏度为0.25EU/ml)和内毒素标准品(10EU/ml),按厂家说明书进行操作,复核结果见表1。
表1鲎试剂灵敏度复核
上述实验结果说明所用鲎试剂的灵敏度与标示值相符合,按标示值使用。
2.质粒样品的系列稀释和鲎试剂检测:所用器材均应洁净,如医用注射用水、塑料吸头、玻璃小管等另准备好试管架和37℃水浴箱。
1)取20μl质粒液加入到装有780μl注射用水的第1号玻璃小管中(1:40稀释),旋涡振荡20分钟,以使聚集成团的内毒素均匀分散;
2)从第1号小管中取20μl液体加入到装有980μl注射用水的第2号玻璃小管中(1:2000稀释),旋涡振荡1分钟;
3)从第2号小管中取20μl液体加入到装有980μl注射用水的第3号玻璃小管中(1:10万稀释),旋涡振荡1分钟;
4)从第3号小管中取20μl液体加入到装有980μl注射用水的第4号玻璃小管中(1:500万稀释),旋涡振荡1分钟;或
从第1号小管中取20μl液体至装有180μl注射用水的第3号玻璃小管中稀释10倍(1:400稀释),旋涡振荡1分钟。如此可制备1:4,000,1:40,000等不同稀释度的质粒液;
5)各小管保留100μl质粒液,弃去其余液体,旋涡振荡1分钟。另设置阳性对照管和阴性对照(100μl洁净水)管。各管加入100μl鲎试剂,混合5-10秒,37℃水浴静置1小时。小心取出各官,将其倒置并观察胶凝结果。
第一次倒置时管底有胶凝物不流下为阳性,若流下为阴性。阴性和阳性对照管均成立才记录其它各管结果。本实验中所用鲎试剂的灵敏度为0.25EU/ml,故最高稀释度为阳性的稀释液,将其稀释度除以4即为该质粒液残留的内毒素浓度(EU/ml),再除以质粒原液的浓度即为每mg质粒中残留的内毒素含量(EU/mg(质粒))。此试验为半定量法,所得结果用每mg质粒所含内毒素大于、小于多少个EU表示,为近似值。
实施例2Triton雾点离心分相法去除质粒液中的内毒素
此实施例是重复文献所述步骤操作(Cotten,Baker A,Sallik M等:GeneTherapy,1:239-46,1994),目的是验证该法去除内毒素的效果。
取1ml浓度为1.2mg/ml的初纯HG43质粒液(用0.1M PBS缓冲液液配制)加至洁净的离心小管中,在4-10℃下按1ml质粒液:20μl TritonX-114液的比例加入TritonX-114(不稀释)。4-10℃混合15分钟,然后移至35-37℃静置5分钟后混合液出现云雾样混浊,在同一温度的台式离心机中13,000rpm离心5分钟,小管底部有油状 液沉积(为TritonX-114与内毒素形成的复合物)。小心吸取含质粒的上层水相(不可触及油状液),移至另一洁净小管中,加入20μl TritonX-114,于4-10℃混合30分钟,然后移至35-37℃静置5分钟后混合液出现云雾样混浊,在同一温度的台式离心机中13,000rpm离心5分钟。小心吸取上层水相移至另一洁净小管中。如此重复3次,随后用鲎试剂测定质粒液中残留内毒素量,测定结果见表2。
表2Triton雾点离心分相法去除内毒素
质粒液浓度:去内毒素前为1.2mg/ml,去内毒素后为1.15mg/ml。质粒液残留内毒素含量约为10-20万EU/mg。按1ml质粒液:40或60μl TritonX-114液的二种比例重复此实验,残留内毒素含量仍在10-20万EU/mg,表明用量加大效果仍如此。此实施例表明应用Triton X-114雾点法可去除质粒污染内毒素至10万EU/mg左右。
实施例3:有机溶剂离心分相法去除质粒液中内毒素的基本步骤
1.试剂的选用:
1)初纯质粒液可用纯水、生理盐水、浓度0.01-0.15M、pH6.5-8.5的各种缓冲液如磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、Tris-HCl等缓冲液配制。
2)PMXB可用与质粒液相同或不相同的溶液配成5mg/ml或1-50mg/ml浓度,一般加入50-80%的甘油,以便在负20-25℃长期保存活性且使用方便。由于高浓度时用量少不易精确,低浓度时会带入水份导致稀释质粒液,故常用5mg/ml浓度。
3)TritonX-114的原液较粘稠,可用与质粒液相同或不相同的溶液作1:1、1:2或1:3稀释。但其稀释液用量应相应增加,虽稀释液不粘稠,使用较方便,然而会稀释质粒液,故仍常用其原液。由于TritonX-114在4-20℃时水溶性好,利于结合内毒素,因此使用时需在4-20℃环境下。
4)各有机溶剂采用不稀释的原液。
2.步骤:
1)取浓度为1mg/ml以上的初纯质粒液加至2ml洁净的离心小管中;加入PMXB和/或TritonX-114液;
2)在4-20℃或室温下,于垂直混合器中缓慢混合20-35分钟,或混合20分钟后再置4-20℃混合15分钟;随后加入大约等体积的有机溶剂混合2分钟,于台式离心机中10,000--13,000rpm离心3-4分钟。离心后两相之间形成的一层薄膜,此膜为PMXB和/或TritonX-114与内毒素形成的复合物;
3)小心吸取含质粒的水相(不可触及薄膜)并移至另一洁净小管中,再加入等体积有机溶液,按步骤2)所述混合后离心(此步简称为用有机溶剂洗去内毒素);
4)如此重复洗涤3-4次,随后取质粒液样品测定体积,按常规用紫外分光光度计测OD260值计算质粒液浓度,由凝胶电泳观察纯度和用鲎试剂测定残留内毒素量。
实施例4TritonX-114有机溶液离心分相法去除质粒液中的内毒素
此法已为许多商品化质粒纯化试剂盒所采用。这里主要是验证其去除内毒素能到何种水平,并作为本发明的对照。
各取1ml浓度1.2mg/ml的PSW初纯质粒液(内毒素含量大于500万EU/mg),加至3个洁净的离心小管中,按1mg质粒:80μl、120μl或200μl TritonX-114的比例分别加入TritonX-114;有机溶剂采用氯仿,洗涤3次;按实施例3所述步骤操作。结果见表3。
表3TritonX-114有机溶液离心分相法去除内毒素
本实施例中Triton X-114仅使用1次,实施例2中使用3次。结果表明,TritonX-114的用量为80μl时,去除内毒素效果较差;为120μl时,内毒素含量降至2.5-5万EU/ml;为200μl时,内毒素含量降至1-2.5万EU/ml;为350μl时,效果与200μl时的相似。本发明者重复此实验几十次,证实该法可将内毒素降至10,000EU/mg左右,此类质粒已可用于要求不太高的动物实验、细胞转染等。
实施例5PMXB有机溶液离心分相法去除质粒液中的内毒素
各取1ml浓度为1.32mg/ml的PSA43质粒液(内毒素含量大于500万EU/mg),加至3个洁净的2ml小管中,按质粒量:PMXB(5mg/ml)体积比为1000:80或60或40的比例;有机溶剂采用氯仿,洗涤3次;如实施例3所述步骤操作。结果见表4。
表4PMXB有机溶液离心分相法去除内毒素
结果显示,PMXB用量高,去内毒素后质粒浓度降低较多、回收率损失较大,但去除内毒素的效果较好。当此比例为1000:80时,内毒素降低至500-1,000Eu/mg。当PMXB用量降低时,去除内毒素的效果降低。本发明者在上百次试验中观察到,即使加大PMXB用量至质粒对PMXB的比例1000:120时,内毒素仍只能降低至500-1,000Eu/mg。
实施例6加盐对降低PMXB去除内毒素时质粒损失的影响
取0.95mg/ml PSA43质粒液(内毒素含量大于500万EU/ml),在该质粒液中加入NaCl至如下表5所示浓度,采用每mg质粒:80μl PMXB的比例;用氯仿洗涤3次去除内毒素;按实施例3所述步骤操作。结果见表5。
表5加盐对降低PMXB去除内毒素时质粒损失的影响
结果显示,PMXB可能会结合一些质粒将其去除,NaCI的加入对去除内毒素效果没有影响,且一定浓度的NaCl可以有效避免质粒的损失,但并不是盐浓度越高效果越好。根据上述结果,当NaCl浓度为0.5M时,质粒回收率提高至92%左右;当NaCl浓度为1.0M时,回收率不再提高。经多次试验后,本发明者摸索到, 采用2%(约0.3M)的NaCl较适当,回收率可保持在90%以上,故以下实施例中的质粒液均用含2%NaCl、pH8.0的PBS缓冲液配制。此法去除内毒素效果达到99%以上,内毒素可降至500-1000EU/mg,但离人用疫苗100EU/mg以下的标准尚有距离。
实施例7PMXB和TritonX-114联用离心分相法去除质粒液中的内毒素
上述实施例结果表明,单独使用PMXB或TritonX-114进行有机溶剂离心分相,内毒素含量无法降至100EU/mg以下。因此本发明者将二者联用,检测其效果。
各取1ml浓度为1.28mg/ml的初纯HG43质粒液(含0.3M NaCl),加至6个洁净的2ml离心管中;先加不同量(如下表6所示)的PMXB(5mg/ml)垂直混合20分钟后,再加不同量(如下表6所示)的TritonX-114混合15分钟,于4-10℃静置15分钟,然后用氯仿洗涤3次;按实施例3所述步骤操作。结果见表6。
表6PMXB和TritonX-114联用离心分相法去除内毒素
结果显示,PMXB和TritonX-114联用,在适当的用量和比例下,内毒素可降至100EU/mg以下,甚至10EU/mg以下。本发明者重复此试验几十次,只要PMXB和Triton X-114的用量足够、比例适当,都可以达到此结果,可见此方法重复性非常好。经几十次试验确定,质粒量与加入的PMXB(5mg/ml)或TritonX-114(原液)体积比例是质粒1000μg:PMXB或TritonX-114各70-100μl为佳(质粒与PMXB的质量比=1000μg质粒:350-450μgPMXB),内毒素可降至100EU/mg以下,甚至10EU/mg以下。如果某些初纯质粒污染的内毒素极高(如7000万EU/mg以上)时,若此用量还不能去除干净,可再用此剂量的1/5-1/4量重复上述去内毒素操作一次,仍可使内毒素降低至10EU/mg以下。
实施例8PMXB和TritonX-114联用的顺序对分相离心法去除内毒素的影响
各取1ml浓度为1.5mg/ml的初纯HG43质粒液(含0.3M NaCl),加至3个洁净 的2ml离心管中,第1管先加105μl PMXB、第2管先加105μl Triton X-114,垂直混合20分钟后,第1管再加入105μl Triton X-114、第二管再加入105μl PMXB,再次混合20分钟,共1小时。第3管同时各加105μl PMXB和Triton X-114,混合40分钟。然后用氯仿洗涤3次。按实施例3所述步骤操作。结果见表7。
表7PMXB和TritonX-114联用的顺序对分相离心法去除内毒素的影响
结果表明,PMXB和TritonX-114同时加入时效果略差,而二者分别先后加入效果相似,因此以下实施例均按实施例7所述步骤操作。
实施例7、8的结果分析:不想受现有理论的束缚,本发明者推测PMXB和Triton X-114联用取得如此优良的效果可能是如下原因。
1.内毒素(LPS)本身不是一种非常均一的分子,而且在细胞裂解时有些LPS分子可能碎裂成较小片段。而PMXB和Triton X-114各自与LPS选择性结合的基团有所不同。细胞裂解产生的大部分LPS可与PMXB和Triton X-114二者同时结合,但可能一小部分LPS片段(根据实施例5-6约占内毒素的万分之一)不能结合PMXB,而另一小部分LPS片段(根据实施例4约占内毒素的千分之一)不能结合Triton X-114。故单用PMXB或Triton X-114都有不能完全去除干净质粒中的内毒素,只有二者联用才能达到此目的。
2.内毒素分子中虽也有疏水基团,但通常内毒素分子聚集成团,其疏水基团包在内部,表面为亲水基团,故内毒素分子溶于水而不溶于有机溶剂。PMXB或/和Triton X-114与LPS紧密结合后可能使成团的LPS内部疏水部分暴露,产生的二重或三重复合物疏水性大大增强而易溶于有机溶剂中,因而可用不与水混溶的有机溶剂将此种复合物分相除去。
3.PMXB或Triton X-114先后加入质粒液中时,先加的先与内毒素结合,后加的可能与形成的复合物再结合,最后形成三重复合物。而二者同时加入质粒液中时,可能有一部分PMXB和Triton X-114先互相发生结合而不能再与内毒素结合。因此同时加入PMXB和Triton X-114去除内毒素效果较差。
实施例9无毒无害有机溶剂的选择
上述实施例中洗涤用有机溶剂均采用氯仿,且取得了很好效果,但氯仿被怀疑有致癌作用,因此生物制品制备工艺中应尽量避免使用。为此本发明者选择了几种文献显示不会与水混溶且安全无毒性无害的有机溶剂:肉豆蔻酸异丙酯、乙酸乙酯、二乙二醇单甲醚、苯甲酸苄酯,并从中进行筛选。筛选的原理是利用TritonX-114的水溶液中OD260与OD280测定值都很高,若有机溶剂能洗涤去除TritonX-114则水相OD260与OD280测定值将降低,若不能去除则测定值保持高水平。
先配制含有10%TritonX-114的PBS缓冲液,每只离心小管中各装1ml,分别加入等体积的上述4种有机溶剂,以氯仿作对照。混合4分钟,13,000rpm离心3-4分钟,分别取水相和有机相测D260与OD280值。结果见表8。
表8无毒无害有机溶剂的选择结果
结果表明,苯甲酸苄酯和乙酸乙酯类似氯仿,可洗涤去除Triton X-114,但效果较氯仿略差。而肉豆蔻酸异丙酯和二乙二醇单甲醚达不到氯仿的效果。因此选择苯甲酸苄酯和乙酸乙酯进行以下实施例。
实施例10苯甲酸苄酯和乙酸乙酯分相法去除质粒中的内毒素
1.单独使用PMXB或TritonX-114:
分别单独使用PMXB或TritonX-114去除质粒液中的内毒素,有机溶剂采用苯甲酸苄酯或乙酸乙酯洗涤4次,以氯仿洗涤三次作对照,按实施例3所述步骤操作。结果见表9。
表9单独使用PMXB或TritonX-11结合苯甲酸苄酯和乙酸乙酯分相法去除内毒素
结果表明,单独使用PMXB或TritonX-114结合苯甲酸苄酯或乙酸乙酯洗涤都能去除质粒中的90%以上的内毒素,使其残留量降至1-2.5万,但无法降至100EU/mg以下,而PMXB加氯仿可降低至1000EU/mg左右。苯甲酸苄酯或乙酸乙酯的溶剂强度比氯仿略差,需洗涤4次(氯仿洗涤三次)。根据实施例7所得结果,PMXB和TritonX-114联用效果好,因此本发明者再次将二者联用试验。
2.PMXB和TritonX-114联用:
各取1ml浓度为1.5mg/ml的初纯HG43质粒液,加至2个洁净2ml离心管和一支医用一次性注射器(5ml,下端出口用封端堵住,用于下步乙酸乙酯洗涤)中,各管先加105μl PMXB,垂直混合20分钟后再加入105μl TritonX-114,4-10℃再混合15分钟,以三种有机溶剂洗涤,按实施例3操作,用乙酸乙酯洗涤时注射器不离心而是垂直静置分相分层,每次洗涤将含质粒的下层水相从下部出口放到另一干净注射器中。结果见表10。
表10PMXB和TritonX-114联用结合苯甲酸苄酯和乙酸乙酯分相法去除质粒污染的内毒素
结果表明,当PMXB和TritonX-114联用时,苯甲酸苄酯或乙酸乙酯与氯仿一样可有效去除质粒污染的内毒素,只是洗涤增加一次而已。
实验过程中苯甲酸苄酯和氯仿比水重,离心分相后有机相位于下部,第1、2 次洗涤时两相界面形成复合物薄膜,第3、4次洗涤时此薄膜逐渐消失,表明已逐渐去除。第1次洗涤,苯甲酸苄酯形成的水相较混浊,而氯仿形成的水相澄清。洗涤第2次时苯甲酸苄酯形成的水相已澄清。乙酸乙酯比水轻,不用离心而是静置几分钟自行分相,形成的水相位于下部,两相界面无薄膜,下部水相含质粒。去除内毒素的质粒液浓度不降低反而略升高但体积也相应略减少,可能因这二种有机溶剂能吸附少量水而致。
有机溶剂离心分相法去内毒素后质粒的琼脂糖凝胶电泳结果见图3。其中,泳道1是去内毒素前的质粒;泳道2是去内毒素后的质粒,其中有机溶剂为氯仿;泳道3是去内毒素后的质粒,其中有机溶剂为苯甲酸苄酯;泳道4是去内毒素后的质粒,其中有机溶剂为乙酸乙酯;采用氯仿、苯甲酸苄酯和乙酸乙酯所获得的去除内毒素的质粒与去内毒素前相比,电泳图相似,超螺旋质粒条带无显著变化,也无二聚体或多聚体条带形成。
上述结果表明,联用PMXB和TritonX-114及无毒的苯甲酸苄酯或乙酸乙酯可去除质粒污染的内毒素至10EU/mg以下,达到了临床人用标准。此实施例是小量去除内毒素,可配备相应的洁净离心小管(乙酸乙酯比水轻应配备无菌注射器那样有下部出口加封帽的小管,不用离心),用于实验室小规模纯化质粒的内毒素去除,相对而言,采用比水重的苯甲酸苄酯作为有机溶剂更适合此用途。
实施例11规模化苯甲酸苄酯或乙酸乙酯分相法去除质粒污染的内毒素
1.苯甲酸苄酯分相:
取200ml浓度为1.64mg/ml的初纯HG43质粒液(共含质粒328mg)平均分装至8个洁净50ml离心管中,每管25ml。各管先加入2900μl PMXB(5mg/ml)(88μlPMXB/mg质粒),室温(8-10℃)、10rpm转速垂直缓慢混合20分钟,再各加入2900μlTritonX-114,混合15分钟。随后用LXS-11B低速大容量离心机室温3,000rpm离心5分钟。分别吸取上部含质粒的水相,转移到新的洁净离心管中,加入25ml苯甲酸苄酯混合5分钟。室温3,000rpm离心5分钟,吸取上部水相转移到新的洁净离心管中。按此步骤,用苯甲酸苄酯洗涤4次。
合并各管上部水相得175ml质粒液,经测定其浓度为1.70mg/ml(总量297.5mg,回收率91%)、内毒素含量<10EU/mg。其中回收率达不到100%的原因主要是在每次吸取水相质粒液时,为避免触及二相之间的内毒素复合物而舍弃部分质粒液。
2.乙酸乙酯分相:
乙酸乙酯比水轻,故采用经250℃烘烤2小时去除内毒素的玻璃圆形分液漏斗8个(500ml)和旋转蒸发仪的圆形旋转瓶(1000ml)。将300ml浓度为1.47mg/ml的初纯HG43质粒液(共含质粒441mg)加入旋转瓶中,再加入3528μl PMXB(5mg/ml)(80μl PMXB/mg质粒),在旋转蒸发仪25-28℃水浴中以10rpm转速旋转混合20分钟,再加入3258μl TritonX-114,并在旋转蒸发仪水浴中加入冰块,使水温降至8-10℃,同速旋转混合15分钟。加入300ml乙酸乙酯混合5分钟。将混合液倒入二个分液漏斗中,静置5分钟即分层。将二个分液漏斗中含质粒的下层水相从下部出口放到另二个干净的分液漏斗中,再各加入乙酸乙酯150ml混合5分钟,静置5分钟,随后将下层水相放入另一干净漏斗中。如此用乙酸乙酯重复洗涤4次后,合并水相,测其体积、浓度和内毒素。
结果显示,体积为250ml,浓度为1.65mg/ml(总量412mg,回收率93.5%),内毒素含量<10EU/mg。乙酸乙酯价格是苯甲酸苄酯的1/4,此例表明乙酸乙酯特别适合规模化去除内毒素。
以上实施例结果表明,本发明者已成功建立去除质粒污染内毒素达到临床应用标准的有效方法,即联用PMXB和TritonX-114二种内毒素结合试剂,并采用安全无毒性无害的有机溶剂苯甲酸苄酯或乙酸乙酯进行分相法。此法简便快速,耗时1小时左右,所用材料价格低,适合规模化生产。
实施例12分相法与PMXB凝胶法联用去除质粒污染的内毒素
去内毒素FF凝胶(北京卓冠生物公司,φ1.5cm×68cm)的再生:用100ml1%脱氧胆酸钠液再生此凝胶,再用洁净的pH7.5、0.1M PBS缓冲液100ml充分洗涤使之平衡。
1.凝胶质粒液混合法去除内毒素
取20ml再生的去内毒素FF凝胶置于洁净玻璃三角瓶中,沉降后吸弃上层液体。加入20ml浓度为1.35mg/ml的HG43质粒液,室温摇动48小时(卓冠公司推荐方法)。沉降后吸取上层质粒液,下部凝胶移入洁净大离心管,3,000rpm离心10分钟,吸取压积后挤出的液体与以上质粒液合并,共25ml。
结果显示,质粒浓度为0.75mg/ml,内毒素含量为5000-10000EU/mg。表明利用此法去除内毒素效果不佳。
2.凝胶层析法去除质粒内毒素
准备玻璃层析柱和蠕动泵管道系统,用300ml0.5M NaOH液循环洗涤过夜,再用2000ml超纯水洗涤整个系统去除NaOH。填装20ml再生后的FF胶,加入20ml1.35mg/ml的HG43质粒液,室温循环吸附8小时(卓冠公司推荐方法),收集流出的质粒液,其中当柱顶液体几乎流干时再加入10ml PBS使柱内质粒液尽量流出。共收集得28.5ml质粒液。
结果显示,质粒浓度为0.62mg/ml,内毒素含量为5000-1000EU/mg。本发明者另用Sigma的PMXB凝胶产品重复此实施方式,内毒素最低降至1000-2000EU/mg。表明此法不能有效去除质粒污染的内毒素。
3.分相法与PMXB凝胶混合法联用去除内毒素
取HG43质粒液先用PMXB和/或Triton X-114加氯仿离心分相法去除大部分内毒素后(是本发明者早期摸索PMXB和Triton X-114联用时由于用量不足而使内毒素去除不够的质粒液),再将此质粒液与FF胶按1:1、1:2或1:3的体积比混合摇动4小时,取质粒液样品测浓度和内毒素含量。结果见表11。
表11分相法与PMXB凝胶混合法联用去除内毒素
其中,*:先用Triton X-114加氯仿离心分相法去除大部分内毒素;
**:先用PMXB加氯仿离心分相法去除大部分内毒素;
***:先用PMXB和Triton X-114加氯仿离心分相法去除大部分内毒素。
4.分相法与PMXB凝胶层析法联用去除内毒素
取HG43质粒液,先用PMXB和/或Triton X-114加氯仿离心分相法去除大部分内毒素后,得到60ml浓度为1.39mg/ml的质粒液(内毒素含量为1-2万EU/mg)。 同时取120ml再生后去内毒素FF凝胶装柱,经pH7.5含2%NaCl的0.05M PB缓冲液平衡后,加入上述质粒液,蠕动泵流速1ml/分。待质粒液基本全进入柱内后,关闭层析柱下出口30分钟,让内毒素与柱上的PMXB充分结合。然后从下出口原流速分管收集流出的质粒液,测定各管质粒浓度和内毒素含量。结果见表12。
表12分相法与PMXB凝胶层析法联用去除内毒素
结果表明,去内毒素后质粒液浓度0.622mg/ml(共74.72mg),内毒素含量10-100EU/mg;回收率89.6%。PMXB凝胶的内毒素吸附量不高(卓冠公司说明其内毒素负载量为5,000-7,000EU/ml),单用此凝胶难以去除质粒液中高污染的内毒素,需要先用离心分相法去除内毒素降至1万EU/mg左右,再用PMXB凝胶,可有效去除质粒污染的内毒素;虽然先单用PMXB分相可将内毒素含量降至1000EU/mg左右,但再采用PMXB凝胶却达不到所需效果(见表11的**);而采用分相法,即联用PMXB和Triton X-114分相法之后再用亲和凝胶(见表11的***),内毒素可降至100EU/mg以下。这与实施例7-8的结果分析相一致,即有很少的一小部分内毒素碎片不能与PMXB结合因而二步都采用PMXB时不能将其去除。
单用PMXB凝胶混合或层析法,或与上述分相法联合应用PMXB凝胶混合或层析法去除内毒素的另一缺点是由于在使用过程中凝胶约含一半水份导致质粒液浓度被稀释,当需要较高浓度质粒产品时需要增加浓缩步骤,因此会减少回收率。但规模化制备临床用质粒时,考虑将PMXB凝胶层析步骤放在后面也可能有其好处,因先用的分相法所得质粒液中可能残留有PMXB和/或Triton X-114,因此通常需要再使用分子筛凝胶(一般采用Sepharose CL-4BB或6B)将其除去。而PMXB凝胶大都用Sepharose CL-4B制成,其对内毒素而言是亲和吸附,对不能吸附的质粒而言则起着分子筛作用可去除分子量比质粒小得多的有机分子、蛋白等残留杂质。当然PMXB凝胶的成本比普通分子筛凝胶高,这需要综合考虑。
实施例13离心分相法去除蛋白质污染的内毒素
大规模制备蛋白产品时一般无专门设置去除内毒素的步骤,但实验室小量制备 时一般需要去除其中的内毒素,以利于细胞培养、动物实验等用途。考虑本发明的PMXB或PMXB联用Triton X-114离心分相法简便快速,适合于这种实验室小量制备蛋白质,为此进行了此实施例。
取实验室制备的大肠杆菌表达的初纯结核杆菌保护性抗原Ag85A蛋白液(2.06mg/ml,内毒素含量5,000-10,000EU/ml)各1ml,置于洁净离心小管中。根据蛋白质量分别加入不同量的PMXB(5mg/ml)或PMXB(5mg/ml)和Triton X-114,其中有机溶剂采用苯甲酸苄酯,按实施例3所述步骤操作,获得去除内毒素的Ag85A蛋白液。用BioRad蛋白定量试剂盒按说明书步骤测定所得蛋白浓度,用鲎试剂测其内毒素残留量。结果见表13。
表13离心分相法去除蛋白质污染的内毒素
结果表明,本发明单用PMXB或PMXB与TritonX-114联用,经离心分相能有效去除蛋白质中污染的内毒素。我们重复此实施例多次得出以下用量:单用PMXB时,蛋白质与PMXB的重量比为1000:2.5-30,优选1000:5-15。PMXB与Triton X-114联用时,蛋白质与PMXB的重量比为1000:1.5-20,优选1000:4-10μl,蛋白质与Triton X-114液的重量体积比为1000μg:0.5-15μl,优选1000μg:4-10μl。如背景资料所述蛋白质中内毒素含量不高,一般为1万EU/mg左右,因此单用PMXB已足够将蛋白质中的内毒素去除到所需水平。按实施例7-8结果分析所述,无法与PMXB结合的内毒素片段一般只占万分之一左右,即使不能去除也仅仅残留1EU/mg左右。故该PMXB离心分相法适合于实验室小量蛋白质去除污染的内毒素。
Claims (8)
1.一种用PMXB去除初步纯化质粒或蛋白质溶液中内毒素的方法,所述初步纯化质粒或蛋白质是指从基因工程大肠杆菌提取的基本上已纯化或部分纯化的质粒或蛋白质,所述方法包括以下步骤:将质粒或蛋白质溶液与PMXB液,按质粒与PMXB的重量比为1000∶100-800或蛋白质与PMXB的重量比为1000∶2.5-30,于室温下混合均匀形成混合液;加入选自氯仿、苯甲酸苄酯和乙酸乙酯的有机溶剂混匀后分层,于台式离心机中10,000-13,000rpm离心3-4分钟后两相之间形成一层薄膜,小心吸取含质粒或蛋白质的水相,不可触及薄膜。
2.一种PMXB和Triton X-114联用去除初步纯化质粒或蛋白质溶液中内毒素的方法,所述初步纯化质粒或蛋白质是指从基因工程大肠杆菌提取的基本上已纯化或部分纯化的质粒或蛋白质,所述方法包括以下步骤:将质粒液与PMXB液和TritonX-114液,按质粒与PMXB的重量比为1000∶50-600、质粒与Triton X-114液的重量体积比为1000μg∶20-400μl,于4-20℃下混合均匀形成混合液;或将蛋白质液与PMXB和TritonX-114液,按蛋白质与PMXB的重量比为1000∶1.5-20、蛋白质与Triton X-114液的重量体积比为1000μg∶0.5-15μ1,于4-20℃下混合均匀形成混合液;加入选自氯仿、苯甲酸苄酯和乙酸乙酯的有机溶剂混匀后分层,于台式离心机中10,000-13,000rpm离心3-4分钟后两相之间形成一层薄膜,小心吸取含质粒或蛋白质的水相,不可触及薄膜。
3.如权利要求1或2所述的方法,还包括用PMXB凝胶去除剩余内毒素的PMXB凝胶法步骤。
4.如权利要求3所述的方法,其中所述PMXB凝胶法包括凝胶混合法和/或凝胶层析法。
5.如权利要求1所述的方法,其中所述PMXB选用5mg/ml浓度。
6.如权利要求2所述的方法,其中所述Trinton X-114液采用不稀释的原液。
7.如权利要求1或2所述的方法,其中所述混合液还包括终浓度为0.1-1.0M的NaCl。
8.如权利要求7所述的方法,其中所述NaCl终浓度为0.3M。
Priority Applications (1)
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